Ứng dụng hỗ hợp đệm citrate để làm giảm nồng độ nội độc tố trong công đoạn bất hoạt vi rút cúm b

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG HỖN HỢP ĐỆM CITRATE ĐỂ LÀM GIẢM NỒNG ĐỘ NỘI ĐỘC TỐ TRONG CÔNG ĐOẠN BẤT HOẠT VI RÚT CÚM B/WASHINGTON/02/2019 MÙA DỊCH NAM BÁN CẦU 2020 Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Văn Duy TS Ứng Trọng Thuấn Sinh viên thực hiện: Nguyễn Trung Hiếu Mã số sinh viên: 58131188 Khánh Hòa – 7/2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG HỖN HỢP ĐỆM CITRATE ĐỂ LÀM GIẢM NỒNG ĐỘ NỘI ĐỘC TỐ TRONG CÔNG ĐOẠN BẤT HOẠT VI RÚT CÚM B/WASHINGTON/02/2019 MÙA DỊCH NAM BÁN CẦU 2020 Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Văn Duy TS Ứng Trọng Thuấn Sinh viên thực hiện: Nguyễn Trung Hiếu Mã số sinh viên: 58131188 Khánh Hòa – 7/2020 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Viện: Công nghệ sinh học Môi trường PHIẾU THEO DÕI TIẾN ĐỘ VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỀ TÀI / KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP (Dùng cho CBHD nộp báo cáo ĐA/KLTN của sinh viên) Tên đề tài: Ứng dụng hỗn hợp đệm Citrate để làm giảm nồng độ nội độc tố công đoạn bất hoạt vi rút Cúm B/Washington/02/2019 mùa dịch Nam bán cầu 2020 Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Văn Duy TS Ứng Trọng Thuấn Sinh viên được hướng dẫn: Nguyễn Trung Hiếu Khóa: 2016-2020 Lần KT Ngày MSSV: 58131188 Ngành: Công nghệ sinh học Nội dung Nhận xét của GVHD - Có kĩ tìm tài - Tổng quan tài liệu vi rút cúm, nội độc tố (endotoxin) 6/4/2020 - Đánh giá kết làm thí nghiệm: Tối ưu hóa thành phần hỗn hợp đệm Citrate hàm lượng nội độc tố liệu internet đọc hiểu báo chuyên ngành tiếng anh - Kết thí nghiệm đạt yêu cầu - Viết tổng quan vật liệu phương pháp nghiên cứu 05/5/2020 - Đánh giá kết thí nghiệm: Đánh giá tác động đệm Citrate hàm lượng nội độc tố theo thời gian 09/6/2020 - Đánh giá kết thí nghiệm: - Đạt yêu cầu + Đánh giá ảnh hưởng hỗn hợp đệm Citrate - Đạt yêu cầu nội độc tố công đoạn bất hoạt vi rút cúm B/Washington/02/2019 + Đánh giá ảnh hưởng hỗn hợp đệm Citrate hàm lượng kháng nguyên HA công đoạn bất hoạt vi rút cúm B/Washington/02/2019 - Đánh giá kết thí nghiệm: Đánh giá ảnh hưởng hỗn 06/7/2020 hợp đệm Citrate bất hoạt - Đạt yêu cầu vi rút cúm B/Washington/02/2019 - Tổng hợp kết quả, thảo luận 16/7/2020 - Hoàn thiện báo cáo đề án tốt - Đạt yêu cầu nghiệp Kiểm tra giữa tiến độ của Trưởng BM Đánh giá cơng việc hồn thành: %: Ngày kiềm tra: Được tiếp tục:  Không tiếp tục:  ………………… Ký tên 10 Nhận xét chung (sau sinh viên hoàn thành ĐA/KL): Điểm hình thức: /10 Điểm nội dung: ./10 Điểm tổng kết: ./10 Đồng ý cho sinh viên: Được bảo vệ Khơng bảo vệ Khánh Hịa, ngày .tháng .năm Cán bộ hướng dẫn (Ký ghi rõ họ tên) LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi thực Các số liệu kết nghiên cứu đồ án trung thực chưa công bố cơng trình khác Tất nguồn thơng tin trích dẫn đồ án liệt kê tài liệu tham khảo Nếu có sai sót tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm Sinh viên thực Nguyễn Trung Hiếu LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này, xin cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang (NTU), Ban Lãnh đạo Quý thầy cô Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học Môi trường tận tâm giảng dạy truyền đạt kiến thức quý báu suốt thời gian học tập trường Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Vắc xin Sinh phẩm Y tế Nha Trang (IVAC) tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian thực đồ án Tôi xin chân thành cảm ơn TS Ứng Trọng Thuấn – Phòng sản xuất vắc xin Cúm, IVAC PGS.TS Nguyễn Văn Duy – Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học Mơi trường, NTU hướng dẫn tận tình tạo điều kiện tốt giúp đỡ suốt thời gian thực đồ án Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến anh chị Phòng sản xuất vắc xin Cúm, IVAC giúp đỡ, hướng dẫn, bảo tận tình, chu đáo ln tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành đồ án Và cuối cùng, xin tỏ lịng biết ơn với gia đình, bạn bè, anh chị quan tâm giúp đỡ, động viên, hỗ trợ nhiệt tình chia sẻ suốt thời gian vừa qua Nha Trang, tháng năm 2020 Sinh viên Nguyễn Trung Hiếu TRÍCH ́U ĐỀ TÀI Quy trình sản xuất vắc xin cúm trứng gà có phơi giống điều kiện kỹ thuật bước thực Do đó, nghiên cứu thực hiệc để sử dụng hỗn hợp đệm Citrate công đoạn bất hoạt vi rút cúm B/Washington/02/2019 mùa dịch Nam Bán Cầu 2020 để làm giảm lượng nội độc tố vắc xin cúm B Việc ứng dụng hỗn hợp đệm Citrate vào sản xuất cần phải khảo sát thời gian, thành phần nồng độ hỗn hợp thích hợp để tối ưu với điều kiện trình sản xuất quy mô lớn Kết cho thấy, thời gian 72 lượng nội độc tố giảm so với thời gian giờ, 24 giờ, 48 Hỗn hợp đệm có Tween 20 với nồng độ 0,1% làm giảm lượng nội độc tố 2,17 EU/ ml so với nồng độ 0,01% 0,05% có hàm lượng nội độc tố 20,83; 16,67 EU/ ml Hơn nữa, việc bổ sung 0,1% Tween 20 không bị ảnh hưởng chất bất hoạt vi rút cúm B formalin trình bất hoạt Cuối cùng, hỗn hợp đệm chứa Tween 20 không làm ảnh hưởng đến hàm lượng kháng nguyên HA công đoạn bất hoạt vi rút cúm B/Washington/02/2019 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT i BẢNG MỤC BẢNG .iii DANH MỤC HÌNH iv MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về vi rút cúm 1.1.1 Vi rút cúm phân loại 1.1.2 Vi rút cúm B 1.2 Giới thiệu về nội độc tố (Endotoxin) 1.2.1 Định nghĩa 1.2.2 Cấu trúc chức 1.3 Các bệnh gây bởi nội độc tố (Endotoxin) 10 1.3.1 Cơ chế nội độc tố gây bệnh 10 1.3.2 Nhiễm trùng huyết (Sepsis) 12 1.3.3 Sốc nhiễm trùng (Septic shock) 17 1.4 Hàm lượng nội độc tố (endotoxin) sản phẩm dược 18 1.5 Tình hình nghiên cứu lựa chọn đệm thích hợp quy trình sản xuất vắc xin cúm B nhằm giảm nồng độ nội độc tố 21 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tượng, thời gian địa điểm nghiên cứu 24 2.2 Vật liệu 24 2.2.1 Trứng gà nguyên liệu 24 2.2.2 Hóa chất 25 2.2.3 Thiết bị chuyên dụng 25 2.3 Phương pháp nghiên cứu 25 2.3.1 Phương pháp phá vỡ bất hoạt vi rút cúm 25 2.3.2 Phương pháp kiểm tra chất lượng 27 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Khảo sát ảnh hưởng loại đệm Citrate hàm lượng nội độc tố theo thời gian 40 3.2 Đánh giá ảnh hưởng hỗn hợp đệm Citrate hàm lượng nội độc tố công đoạn bất hoạt vi rút cúm B/Washington/02/2019 44 3.3 Đánh giá ảnh hưởng hỗn hợp đệm Citrate hàm lượng kháng nguyên HA công đoạn bất hoạt vi rút cúm B/Washington/02/2019 45 3.4 Đánh giá ảnh hưởng hỗn hợp đệm Citrate bất hoạt vi rút cúm B/Washington/02/2019 Formalin 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 Kết luận 50 Kiến nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC 54 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Quy trình sản xuất vắc xin cúm trứng gà có phơi giống điều kiện kỹ thuật bước thực Tuy nhiên, cần phải điều chỉnh số điều kiện sản xuất để đạt hiệu suất cao hàm lượng kháng nguyên HA thu việc giảm nồng độ nội độc tố có dịch vi rút Do đó, sử dụng hỗn hợp đệm Citrate công đoạn bất hoạt vi rút cúm B/Washington/02/2019 mùa dịch Nam Bán Cầu 2020 để làm giảm lượng nội độc tố vắc xin cúm B ứng dụng hỗn hợp đệm Citrate vào sản xuất cần phải khảo sát thời gian, thành phần nồng độ hỗn hợp thích hợp để tối ưu với điều kiện q trình sản xuất quy mơ lớn 3.1 Khảo sát ảnh hưởng của loại đệm Citrate hàm lượng nội độc tố theo thời gian a) Khảo sát loại dung dịch đệm Trong nghiên cứu này, loại dung dịch đệm sử dụng để đánh giá tác động lên hàm lượng nội độc tố sau:  Dung dịch đêm S1: Sử dụng dung dịch PBS pH 7,2  Dung dịch đêm S2: Sử dụng dung dịch đệm Citrate 10mM  Dung dịch đêm S3: Sử dụng dung dịch PBS pH 7,2 + dung dịch đệm Citrate 10mM  Dung dịch đêm S4: Sử dụng dung dịch PBS pH 7,2 + dung dịch đệm Citrate 10mM + 0,05 Tween 20% Cụ thể, 250 EU/ml nội độc tố chuẩn (Control Standard Endotoxin – cung cấp hãng Cape-Code) ủ với loại dung dịch đệm theo mốc thời gian từ giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 Sau khoảng thời gian đó, hàm lượng nội độc tố chuẩn xác định lại phương pháp LAL kết thể hình 3.1 Kết cho thấy, hàm lượng nội độc tố chuẩn ủ với dung dịch đệm khác có giảm hàm lượng theo thời gian giảm hàm lượng nội độc tố 40 dung dịch đệm S4 có khác biệt mặt thống kê so với dung dịch lại (S1; S2; S3) đặc biệt giảm mạnh sau ủ 72 cụ thể sau: + Tại thời điểm giờ:  Hàm lượng nội độc tố dung dịch đệm S1 = 75 EU/ml  Hàm lượng nội độc tố dung dịch đệm S2 = 105 EU/ml  Hàm lượng nội độc tố dung dịch đệm S3 = 62,5 EU/ml  Hàm lượng nội độc tố dung dịch đệm S4 = 21,875 EU/ml + Tại thời điểm 24 giờ:  Hàm lượng nội độc tố dung dịch đệm S1 = 33,75 EU/ml  Hàm lượng nội độc tố dung dịch đệm S2 = 55 EU/ml  Hàm lượng nội độc tố dung dịch đệm S3 = 47,5 EU/ml  Hàm lượng nội độc tố dung dịch đệm S4 = 11,25 EU/ml + Tại thời điểm 48 giờ:  Hàm lượng nội độc tố dung dịch đệm S1 = 18,125 EU/ml  Hàm lượng nội độc tố dung dịch đệm S2 = 28,75 EU/ml  Hàm lượng nội độc tố dung dịch đệm S3 = 30,625 EU/ml  Hàm lượng nội độc tố dung dịch đệm S4 = 5,625 EU/ml + Tại thời điểm 72 giờ:  Hàm lượng nội độc tố dung dịch đệm S1 = 21,875 EU/ml  Hàm lượng nội độc tố dung dịch đệm S2 = 28,75 EU/ml  Hàm lượng nội độc tố dung dịch đệm S3 = 25,625 EU/ml  Hàm lượng nội độc tố dung dịch đệm S4 = 5,625 EU/ml Từ kết khảo sát theo thời gian cho thấy, thành phần hỗn hợp dung dịch đệm S4 phù hợp cho hướng nghiên cứu Do đó, đệm S4 lựa chọn cho nghiên cứu 41 Hình 3.1 Ảnh hưởng của dung dịch đệm tới hàm lượng nội độc tố chuẩn theo thời gian (P* 0,1) Kết cho thấy, hàm lượng nội độc 42 tố dung dịch đệm S4 đạt yêu cầu hàm lượng nội độc tố báo cáo mức độ nội độc tố vắc xin Cúm (0,304-380 EU/ ml) Và hàm lượng nội độc tố dung dịch đệm S4 thấp mức độ nội độc tố tối đa mà loại vắc xin bất hoạt yêu cầu (< 500 EU/ ml) Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ Tween 20 tới hàm lượng nội độc tố chuẩn Kết luận Kết thu hình 3.1 3.2 lần củng cố lại giả thiết Reich cộng (2016) dung dịch đệm có chứa chất hoạt động bề mặt (Tween 20) thay đổi hình thành cấu trúc đa phân tử LPS dẫn đến ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính sinh học nội độc tố (LPS) Các kết cho thấy hàm lượng nội độc tố dung dịch đệm S4 (đệm PBS + Citrate 10 mM + 0,1% Tween 20) thích hợp để tiến hành thí nghiệm tiếp 43 theo trình bất hoạt vi rút cúm B/Washington/02/2019 mùa Nam Bán Cầu 2020 3.2 Đánh giá ảnh hưởng của hỗn hợp đệm Citrate hàm lượng nội độc tố công đoạn bất hoạt vi rút cúm B/Washington/02/2019 Để đánh giá ảnh hưởng hỗn hợp đệm Citrate bổ sung 0,1% Tween 20 hàm lượng nội độc tố có dịch vi rút, dịch vi rút thu sau siêu ly tâm pha loãng dung dịch đệm S1 (làm dung dịch đối chứng) dung dịch đệm S4 để nồng độ Sucrose cuối đạt 5% Hàm lượng nội độc tố dịch vi rút kiểm tra phương pháp LAL sau 72 bất hoạt so sánh với thời điểm trước bất hoạt với kết sau: Tại thời điểm trước bất hoạt:  Hàm lượng nội độc tố dung dịch đệm S1 = 18,75 EU/ml  Hàm lượng nội độc tố dung dịch đệm S4 = 7,5 EU/ml Tại thời điểm sau bất hoạt 72 giờ:  Hàm lượng nội độc tố dung dịch đệm S1 = 8,33 EU/ml  Hàm lượng nội độc tố dung dịch đệm S4 = 0,17 EU/ml Theo kết đánh giá trước đây, hàm lượng nội độc tố có mặt dịch vi rút thu sau siêu ly tâm có hàm lượng cao (200 ÷ 1000 EU/ml) Trong q trình bất hoạt 72 giờ, sử dụng đệm S1 S4 làm giảm đáng kể hàm lượng nội độc tố có mặt dịch chứa vi rút đặc biệt thời điểm sau 72 có sử dụng đệm S4 (hình 3.3) Như vậy, hoạt tính chất hoạt động bề mặt Tween 20 hoạt động mạnh không bị ảnh hưởng chất bất hoạt vi rút cúm B formalin trình bất hoạt Kết luận: Những kết bên cho thấy, sử dụng đệm S4 (Đệm PBS + Citrate 10 mM+ 0,1%Tween 20) làm giảm rõ rệt hàm lượng nội độc tố sinh trình sản xuất 44 vắc xin Đồng thời hoạt tính thành phần hỗn hợp đệm S4 không bị ảnh hưởng hóa chất bất hoạt vi rút cúm B (Formalin) Trước bất hoạt Sau bất hoạt Hình 3.3 Ảnh hưởng của hỗn hợp đệm S4 tới hàm lượng nội độc tố mẫu bất hoạt sau 72 3.3 Đánh giá ảnh hưởng của hỗn hợp đệm Citrate hàm lượng kháng nguyên HA công đoạn bất hoạt vi rút cúm B/Washington/02/2019 Để đánh giá ảnh hưởng thành phần Tween 20 có hỗn hợp đệm Citrate (S4) hàm lượng kháng nguyên HA dịch chứa vi rút trước sau bất hoạt 72 giờ, hàm lượng kháng nguyên HA bán định lượng định lượng phương pháp ngưng kết hồng cầu phương pháp khuếch tán miễn dịch vòng đơn (SRID) * Kết xác định hàm lượng kháng HA phương pháp ngưng kết hồng cầu Kết từ hình 3.4 rằng, hàm lượng kháng nguyên HA trước bất hoạt 2880 HAU/50 µl hai loại đệm S1 S4 Từ kết thấy sử dụng hỗn hợp đệm Citrate khơng làm ảnh hưởng đến hàm lượng kháng nguyên HA mẫu trước bất hoạt 45 Sau bất hoạt, hàm lượng kháng nguyên HA hai dung dịch đệm S1 S4 giảm xuống 325 HAU/ 50 µl Kết hàm lượng kháng nguyên HA dung dịch đệm S1 S4 cho thấy điều kiện bất hoạt hỗn hợp đệm Citrate không làm ảnh hưởng đến hàm lượng kháng nguyên HA sau bất hoạt 72 Hình 3.4 Ảnh hưởng của hỗn hợp đệm Tween 20 tới hàm lượng kháng nguyên HA mẫu bất hoạt sau 72 (phương pháp ngưng kết hồng cầu) * Kết xác định hàm lượng kháng HA phương pháp khuếch tán miễn dịch vòng đơn (SRID) Hàm lượng kháng nguyên HA định lượng lại phương pháp khuếch tán miễn dịch vòng đơn (SRID) để kiểm tra ảnh hưởng hỗn hợp đệm Citrate với hàm lượng kháng nguyên HA mẫu bất hoạt sau 72 Từ kết hình 3.5 cho thấy hàm lượng kháng nguyên HA đệm PBS thấp so với hàm lượng kháng nguyên HA hỗn hợp đệm Citrate nhiên thấp khơng có ý nghĩa mặt thống kê (P > 0,5) Có thể khẳng định hỗn hợp đệm Citrate (S4) không làm ảnh hưởng đến hàm lượng kháng nguyên HA có mẫu bất hoạt sau 72 46 PBS Đệm PBS + Citrate + 0,1% Tween 20 Hình 3.5 Ảnh hưởng của hỗn hợp đệm Tween 20 tới hàm lượng kháng nguyên HA mẫu bất hoạt sau 72 (Phương pháp SRID) Kết luận: Những kết bên cho thấy, sử dụng đêm S4 (Đệm PBS + Citrate 10 mM+ 0,1% Tween 20) không ảnh hưởng đến hàm lượng kháng nguyên HA công đoạn bất hoạt vi rút cúm B/Washington/02/2019 3.4 Đánh giá ảnh hưởng của hỗn hợp đệm Citrate bất hoạt vi rút cúm B/Washington/02/2019 Formalin Để đánh giá ảnh hưởng đệm Citrate bất hoạt vi rút cúm B formalin nhiệt độ từ ÷ 8оC từ ÷ 24 Ở thời điểm bất hoạt, dịch vi rút lấy ra, cấy truyền trứng gà 11 ngày tuổi đánh giá phương pháp EID50 RIV * Đánh giá trình bất hoạt vi rút formalin có sử dụng dung dịch đệm Citrate (S4) phương pháp EID50 47 Ở thời điểm bất hoạt, dịch vi rút lấy ra, cấy truyền 0,1 ml trứng gà 11 ngày tuổi Trứng gà cấy truyền dịch vi rút ủ 35оC thời gian 72 Sau thời gian đó, dịch vi rút trứng thu lại để phân tích EID50 Theo kết từ hình 3.6, cho thấy khả sinh trưởng vi rút cúm B giảm dần làm lượng kháng nguyên HA giảm theo Sau 18 giờ, vi rút khơng cịn khả sinh trưởng (EID50 = 0), đồng nghĩa với việc vi rút bị bất hoạt hoàn toàn Tại thời điểm 12 hàm lượng kháng nguyên HA giữ nguyên khoảng 5000 HAU/ml lượng vi rút đệm bị bất hoạt giảm số lượng dần Hình 3.6 Ảnh hưởng của hỗn hợp đệm Tween 20 tới khả bất hoạt chủng vi rút cúm B/Washington/02/2019 formalin * Đánh giá trình bất hoạt vi rút formalin có sử dụng dung dịch đệm Citrate (S4) phương pháp RIV Trong phương pháp RIV, dịch vi rút bất hoạt thời điểm cấy truyền vào trứng 11 ngày tuổi với liều gây nhiễm 0,2 ml Sau gây nhiễm, trứng đưa vào ủ lần 35оC thời gian 72 Sau 72 giờ, thu lại dịch trứng cấy truyền dịch trứng thu lần trứng gà 11 ngày tuổi Ở lần cấy truyền lần 2, trứng ủ 35оC thời gian 72 Sau 72, thu dịch trứng phân tích giá trị RIV Kết RIV thể bảng 3.1 cho thấy hợp đệm Citrate (S4) không 48 làm ảnh hưởng đến khả bất hoạt vi rút cúm B/Washington/02/2019 formalin Bảng 3.1 Bảng so sánh khả bất hoạt chủng vi rút cúm B/Washington/02/2019 formalin sử dụng đệm PBS hỗn hợp đệm PBS + Citrate + 0,1% Tween 20 (S4) Lô sản xuất Phương Tiêu chuẩn áp pháp dụng HA âm tính sau Bv-20/NIB 19/170/13.20 RIV cấy truyền lần Kết Đệm PBS Đệm PBS + Citrate + 0,1% Tween Đạt Đạt Bv-20/NIB19/170/14.20 RIV HA âm tính sau cấy truyền lần Đạt Đạt Bv-20/NIB19/170/15.20 RIV HA âm tính sau cấy truyền lần Đạt Đạt 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết nghiên cứu trên, rút kết luận sau: Lựa chọn dung dịch đệm Citrate thích hợp (S4) với nồng độ chất hoạt động bề mặt Tween 20 0,1% quy trình sản xuất vắc xin cúm B/Washington/02/2019 Đệm Citrate có bổ sung 0,1% Tween 20 làm giảm hàm lượng nội độc tố sinh trình sản xuất cịn 2,17 EU/ ml, đồng thời khơng ảnh hường đến hàm lượng kháng nguyên HA Hỗn hợp đệm S4 khơng ảnh hưởng đến q trình bất hoạt vi rút cúm B formalin Kiến nghị Từ kết đạt được, cho phép kiến nghị sau:  Cần đánh giá hàm lượng Tween 20 tồn dư vắc xin cúm B  Xây dựng tiêu chuẩn sở cho phép sử dụng Tween 20 sản xuất vắc xin  Áp dụng hỗn hợp đệm Citrate có bổ sung Tween 20 vào sản xuất vắc xin cúm chủng vi rút cúm A/H1N1 cúm A/H3N2 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đoàn Thị Thanh Thủy (2017), Nghiên cứu đặc điểm di truyền gen HA NA vi rút cúm A(H1N1)pdm lưu hành miền trung Việt Nam, 2013- 2015, Luận án thạc sĩ Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nha Trang Phạm Văn Ty (2005), Virus học, Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội, trang 205 213 Tài liệu tiếng Anh Angus CD, Linde-Zwirble TW, Lidicker J, Clermont G, Carcillo J, Pinsky RM (2001), "Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome and associated costs of care", Crit Care Med, 29, pp 13031310 Bertani B Ruiz N (2018), "Function and biogenesis of lipopolysaccha-rides", ecosalplus, pp Brandenburg K, Schromm BA, Loppnow H, Koch JHM, Rietschel ThE (1996), "Conformation of lipid A, the endotoxic center of bacterial lipopolysaccharide", Journal of Endotoxin Reseach, 3, pp 173-178 Brito AL (2011), "COMMENTARY: Acceptable Levels of Endotoxin in Vaccine Formulations During Preclinical Research", Journal of Pharmaceutical Sciences, 100(1), pp 34-37 Clowes AHG , Weidner GM, Vucinic M (1966), " Circulatory and metabolic alterations associated with survival or death in peritonitis: clinical analysis of 25 cases", Ann Surg, 163(6), pp 866-885 Dowhan M, Bogdanov M, Mikeykovskaya E (2016), Functional Roles of Lipids in Membrane, Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes, pp 1–40 Francis M, King M, Kelvin A (2019), “Back to the Future for Influenza Preimmunity—Looking Back at Influenza Virus History to Infer the Outcome of Future Infections”, Viruses, 11(2) 51 10 Lamb RA, Krug MR (2001), Fields virology, Orthomyxoviridae: the viruses and their replication, 4th ed Lippincott Williams & Wilkins, pp1487-1531, Philadelphia 11 Magalhães PO, Lopes AM, Mazzola PG, Rangel-Yagui C, Thereza CV, Penna TC & Pessoa AJr (2007), "Methods of Endotoxin Removal from Biological Preparations", Journal of Pharmaceutical Sciences, pp 391 12 Martin GS, Eaton S, Moss M, Mannino MD (2003), " The epidemiology of sepsis in the United States from 1979 through 2000", New England Journal of Medicine, 348, pp 1546-54 13 Medzhitov R (2001), " R Toll-like receptors and innate immunity", Nature Reviews, Immunol.1, pp 135-145 14 Miller IS, Ernst KR, Bader WM (2005), " LPS, TLR4 and infectious disease diversity", Nature Reviews Microbiology, 3(1), pp 36–46 15 Ohno N, Morrison DC (1989), "Lipopolysaccharide interaction with lysozyme: binding of lipopolysaccharide to lysozyme and inhibition of lysozyme enzymatic activity", Journal of Biological Chemmistry, 264, pp 4434–4441 16 Raetz CR, Ulevitch RJ, Wright SD, Sibley CH, Ding A, Nathan CF (1991), " Gram-negative endotoxin: an extraordinary lipid with profound effects on eukaryotic signal transduction", The FASEB Journal, 17 Raetz HRC, Whitfield C (2002), "Lipopolysaccharide endotoxins", Annual Review of Biochemistry, 71, pp 635-700 18 Rakoff-Nahoum S, Eslami-Varzaneh F, Edberg S, Medzhitov R, Paglino J (2004), "Recognition of Commensal Microflora by Toll-Like Receptors Is Required for Intestinal Homeostasis", Cell, 118, pp 229-241 19 Reich J, Grallert H, Motschmann H, Lang P (2016), "Masking of endotoxin in surfactant samples: Effects on Limulus-based detection systems", Biologicals, 44, pp 417-422 52 20 Reich J, Tamura H, Nagaoka I, Motschaman H (2018), “Investigation of the kinetics and mechanism of low endotoxin recovery in a matrix for biopharmaceutical drug products”, Biologicals, 53, pp 1-9 21 Russell JA (2006), "Management of Sepsis", New England Journal of Medicine, 355(16), pp 1699-1713 22 Schrier RW, Wang W (2004), “Acute Renal Failure and Sepsis”, New England Journal of Medicine, 351(2), 159–169 23 Schwarz H, Gornicec J, Neuper T, Parigiani AM,Wallner M, Duschl A & Horejs-Hoeck J (2017), ” Biological Activity of Masked Endotoxin”, Scientific reports 24 Tsuchiya M (2017), "Factors affecting reduction of reference endotoxin standard activity caused by chelating agent/detergent matrices: Kinetic analysis of low endotoxin recovery", PDA Journal of Pharmaceutical Science Technology, 71, pp 478-487 25 Walport JM (2001), " Complement First of two parts", New England Journal of Medicine, 344(14), pp 1058-1066 Tài liệu từ internet 26 Centers for Disease Control and Prevention (2020), ‘2019-2020 Influenza Season Week 29, ending July 18, 2020’, xem 29/7/2020, cdc.gov, < https://www.cdc.gov/flu/weekly/index.htm> 27 FDA (U.S Food & Drug Administration) (1985), ‘Bacterial Endotoxin/ Pyrogen’, FDA.gov, xem 17/6/2020, 28 WHO (World Health Organization) (2019), ‘Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2020 southern hemisphere influenza season’, xem 20/8/2020, 53 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần dung dịch đệm PBS (Phosphate Buffer Saline) 0,01M pH = 7,2 STT Thành phần Số lượng Đơn vị NaCl 8,015 g Na2HPO4.7H2O 2,6807 g KH2PO4 0,0408 g Nước cất 1000 ml * Đo pH, chỉnh pH =7,2 Khử trùng 0,8 atm, 15 phút Bảo quản 4оC Phụ lục 2: Pha dung dịch hồng cầu gà 1% STT Thành phần Số lượng Đơn vị Hồng cầu 10% ml Dung dịch PBS 0.01M + 0.5% BSA 36 ml Phụ lục 3: Thành phần dung dịch PBS 7,2+ 0,5% BSA STT Thành phần Số lượng Đơn vị BSA 0,5 g Dung dịch đệm PBS 0,01M, pH =7,2 100 ml 54 ... hợp đệm Citrate hàm lượng nội độc tố - Đánh giá tác động đệm Citrate hàm lượng nội độc tố theo thời gian - Đánh giá ảnh hưởng hỗn hợp đệm Citrate nội độc tố công đoạn b? ??t hoạt vi rút cúm B/ Washington/02/2019... cứu ? ?Ứng dụng hỗn hợp đệm Citrate để làm giảm nồng độ nội độc tố công đoạn b? ??t hoạt vi rút cúm B/ Washington/02/2019 mùa dịch Nam B? ?n Cầu 2020” Mục tiêu của đề tài: Tối ưu thành phần hỗn hợp đệm. .. thuật b? ?ớc thực Do đó, nghiên cứu thực hiệc để sử dụng hỗn hợp đệm Citrate công đoạn b? ??t hoạt vi rút cúm B/ Washington/02/2019 mùa dịch Nam B? ?n Cầu 2020 để làm giảm lượng nội độc tố vắc xin cúm B Vi? ??c