Đa dạng sinh học thành phần loài của vi nấm ở vùng biển ven bờ tỉnh khánh hòa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG TRẦN THỊ CHÂU LOAN ĐA DẠNG SINH HỌC THÀNH PHẦN LOÀI CỦA VI NẤM Ở VÙNG BIỂN VEN BỜ TỈNH KHÁNH HÒA LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA - 2020 i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG TRẦN THỊ CHÂU LOAN ĐA DẠNG SINH HỌC THÀNH PHẦN LOÀI CỦA VI NẤM Ở VÙNG BIỂN VEN BỜ TỈNH KHÁNH HÒA LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 8420201 Quyết định giao đề tài: 1531/QĐ-ĐHNT ngày 26/12/2018 Quyết định thành lập HĐ: 446/QĐ-ĐHNT ngày 15/5/2020 Ngày bảo vệ: 25/05/2020 Người hướng dẫn khoa học: TS PHẠM THU THỦY PGS TS NGUYỄN VĂN DUY Chủ tịch Hội đồng: TS NGƠ THỊ HỒI DƯƠNG Phịng ĐT Sau Đại học: KHÁNH HỊA – 2020 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết đề tài: “Đa dạng sinh học thành phần loài vi nấm vùng biển ven bờ tỉnh Khánh Hịa” cơng trình nghiên cứu cá nhân tơi với nhóm nghiên cứu chưa cơng bố cơng trình khoa học khác thời điểm Luận văn phần kết đề tài “Nghiên cứu đa dạng sinh học nấm phù du vùng ven biển Khánh Hòa dựa cách tiếp cận phụ thuộc độc lập nuôi cấy ” (Mã số 106-NN,02-2016.70 ) Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ quốc gia (NAFOSTED) tài trợ TS Phạm Thu Thủy làm chủ nhiệm đề tài Nha Trang, Ngày tháng năm Tác giả luận văn (Ký ghi rõ họ tên) iii LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực đề tài, nhận giúp đỡ Quý phòng ban Trường Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học & Môi trường tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành đề tài Đặc biệt hướng dẫn tận tình TS Phạm Thu Thủy PGS.TS Nguyễn Văn Duy giúp tơi hồn thành tốt đề tài Bên cạnh đó, để hồn thành luận văn cịn có hỗ trợ q báu thành viên khác nhóm nghiên cứu: Huỳnh Thị Bích Mai, Nguyễn Minh Tân Ngơ Huỳnh Ý Nhi Qua đây, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến giúp đỡ Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình tất bạn bè giúp đỡ, động viên suốt trình học tập thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn! Nha Trang , ngày tháng năm Tác giả luận văn (Ký ghi rõ họ tên) iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN iv MỤC LỤC v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN x LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan địa điểm thu mẫu 1.1.1 Vịnh Nha Trang 1.1.2 Vịnh Vân Phong 1.2 Tổng quan vi nấm biển 1.2.1 Nấm men 1.2.2 Nấm mốc 1.3 Hệ thống phân loại vi nấm 11 1.4 Chỉ thị phân tử định danh vi nấm biển 14 1.4.1 Tổ chức gen rRNA vi nấm 15 1.4.2 Sử dụng thị phân tử định danh vi nấm 15 1.5 Tình hình nghiên cứu đa dạng vi nấm biển giới Vệt Nam 18 1.5.1 Tình hình nghiên cứu đa dạng vi nấm biển giới 18 1.5.2 Tình hình nghiên cứu nước 20 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tượng, phạm vi, thời gian địa điểm nghiên cứu 22 2.2 Hoá chất 24 2.2.1 Môi trường phân lập nuôi cấy vi nấm biển 24 2.2.3 Thuốc nhuộm 25 2.2.4 Hóa chất tách chiết DNA PCR 25 2.3 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 27 2.4 Phương pháp nghiên cứu 28 2.4.1 Thu mẫu nước biển 28 2.4.2 Phân lập nuôi cấy vi nấm biển 28 2.4.3 Thuần khiết bảo quản chủng vi nấm 29 2.4.4 Quan sát mô tả hình thái vi nấm 31 v 2.4.5 Tách chiết DNA tổng số vi nấm biển 31 2.4.6 Phương pháp PCR khuếch đại đoạn gen ITS1-5,8S-ITS2 vi nấm 32 2.4.7 Giải phân tích trình tự đoạn gen ITS1-5,8S-ITS2 vi nấm 33 2.4.8 Xây dựng phát sinh loài 33 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Phân lập vi nấm từ mẫu nước biển ven bờ Vịnh Nha Trang Vịnh Vân Phong 35 3.2 Mơ tả hình thái vi nấm biển 37 3.2.1 Mô tả hình thái nấm men 37 3.2.2 Kết mô tả hình thái nấm mốc 42 3.3 Kết tách chiết DNA tổng số khuếch đại đoạn gen ITS1 – 5,8S – ITS2 54 3.4 Giải phân tích trình tự đoạn gen ITS1 – 5,8S – ITS2 55 3.5 Xây dựng phát sinh loài 56 3.6 Phân tích đa dạng thành phần loài vi nấm biển Vịnh Nha Trang Vịnh Vân Phong 61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CBS College of Biological Sciences CFU Đơn vị hình thành khuẩn lạc (Colony Forming Unit) CD Cảng Cầu Đá DL Bãi tắm Dốc Lết DM Cảng Sị Đầm Mơn DW Vùng nước sâu Vịnh Nha Trang HMB Vùng đệm Khu bảo tồn Hòn Mun HMC Vùng lõi Khu bảo tồn Hòn Mun NB Bãi tắm trung tâm TP Nha Trang RT Khu bảo tồn thiên nhiên Rạn Trào SC Cửa sông Cái TB Cửa sông Tu Bông VN Vũng Ngán DNA Deoxyribonucleic acid ETS Vùng khơng dịch mã nằm phía ngồi (Externally transcribed spacer) ITS Vùng khơng dịch mã nằm phía (Internally transcribed spacer) LSU Tiểu đơn vị lớn (Large subunit) OTU Đơn vị phân loại vận hành (Operational taxonomic unit) PCR Polymerase Chain Reaction PDA Potato Dextrose Agar RNA Ribonucleic acid SSU Tiểu đơn vị nhỏ (Small subunit) YPD Yeast Extract Peptone Dextrose vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thông tin vị trí thu mẫu 23 Bảng 2.2 Thông tin cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR 26 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR 32 Bảng 3.1 Các chủng vi nấm phân lập từ mẫu nước biển 35 Bảng 3.2 Mô tả đặc điểm hình thái nấm men 37 Bảng 3.3 Mô tả đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào nấm mốc 42 Bảng 3.4 Kết so sánh trình tự gen ITS1- 5,8S- ITS 75 chủng vi nấm nghiên cứu với trình tự Ngân hàng GenBank 57 Bảng 3.5 Vị trí phân loại chủng vi nấm phân lập Vịnh Nha Trang Vịnh Vân Phong 64 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình dạng tế bào nấm men điển hình (A) cấu trúc tế bào nấm men (B) Hình 1.2 Hình thức sinh sản nấm men Hình 1.3 Sợi nấm có vách ngăn sợi nấm khơng có vách ngăn Hình 1.4 Hình dạng bào tử nấm mốc 10 Hình 1.6 Hình dạng số cuống sinh bào tử đính 11 Hình 1.7 Tổ chức cụm gen rDNA nấm 15 Hình 2.1 Bản đồ vị trí địa điểm thu mẫu 22 Hình 2.2 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu đề tài 27 Hình 2.3 Thiết bị lấy mẫu nằm ngang 28 Hình 2.4 Sơ đồ phân lập vi nấm từ mẫu nước biển 29 Hình 3.1 Kết điện di DNA tổng số số mẫu đại diện 54 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR 55 Hình 3.3 Cây phát sinh lồi dựa vào trình tự đoạn gen ITS1- 5,8S- ITS2 44 chủng vi nấm nghiên cứu với chủng gần chúng (Thước tiến hóa 10%) 60 ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Vi nấm biển biết đến nhiều với vai trò phân hủy chất hữu đóng vai trị quan trọng việc tái tạo chất dinh dưỡng hệ sinh thái Các nấm sợi phù du làm tăng đáng kể hàm lượng khoáng nước việc phân hủy hợp chất hữu góp phần có lợi cho phát triển vi sinh vật phù du Theo Kaul cộng (2013), vi nấm biển có khả sản xuất enzyme ngoại bào mạnh nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học terpenoid, steroid, quinon, phenol coumarin có tiềm chống ung thư, chống oxy hóa, hợp chất kháng virus côn trùng cho ngành công nghiệp dược phẩm sản xuất hố chất nơng nghiệp Chính vậy, nghiên cứu vi nấm biển quan tâm nhiều Ở Việt Nam, nhiều nghiên cứu thực nhằm khai thác tiềm vi sinh vật biển Tuy nhiên nghiên cứu đa dạng vi nấm biển ứng dụng nuôi trồng thủy sản, công nghiệp, nông nghiệp cịn hướng Vì chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài “Đa dạng sinh học thành phần loài vi nấm vùng biển ven bờ tỉnh Khánh Hòa” Tổng số 11 mẫu nước biển ven bờ Vịnh Nha Trang Vịnh Vân Phong thu nhận khoảng thời gian từ tháng 4/2017 đến tháng 7/2017 Sau mẫu nước biển sử dụng để phân lập vi nấm phương pháp màng lọc Chủng vi nấm biển phân lập khiết, quan sát hình thái đặc điểm hình thái lưu giữ giống Những chủng vi nấm biển có hình thái khác biệt tách chiết DNA tổng số, PCR giải trình tự đoạn gen ITS1- 5,8S-ITS2 nhằm xác định thành phần loài quan hệ phát sinh loài Kết nghiên cứu phân lập 163 chủng vi nấm biển phương pháp màng lọc, có 115 chủng nấm men 48 chủng nấm mốc Kết xác định 44 loài nấm thuộc ngành Ascomycota, Basidiomycota Mucoromycota, lớp, 14 bộ, 19 họ Trong đó, có chủng DW3M, DW7M, DL11M DL12M loài cần nghiên cứu thêm Kết xây dựng phát sinh lồi dựa trình tự gen ITS1- 5,8S-ITS2 44 loài nghiên cứu 47 loài GenBank cho thấy loài vi nấm nằm nhánh đồng dạng thể mối quan hệ gần gũi với Kết nghiên cứu cung cấp liệu khoa học có giá trị đa dạng sinh học nấm biển khu hệ sinh thái ven biển Khánh Hịa nói riêng Việt Nam nói chung, đồng x 57 Kaul S., Gupta S., Ahmed M.,Dhar M.K., (2013) Endophytic fungi from medicinal plants: a treasure hunt for bioactive metabolites, Phytochem Rev, 11, 487– 505 58 Kelly L J., Hollingsworth P M., Coppins B J., Ellis C J., Harrold P., Tosh J., Yahr R (2011), DNA barcoding of lichenized fungi demonstrates high identification success in a floristic context, New Phytol, 191:00:00 288–300 59 Khalil, A M A., (2016), Variation in conidiophore complexity in Aspergillus versicolor, Current Research in Environmental & Applied Mycology, (3): 150–158 60 Kim J Y., Soo H Y., Sung Y B., Hye S C (2011), Molecular and Morphological Identification of Fungal Species Isolated from Bealmijang Meju, J Microbiol Biotechnol, 21(12), 1270–1279 61 Kiss L (2012) Limits of nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer (ITS) sequences as species barcodes for Fungi, Proc Natl Acad Sci U S A., 109, 1811−1812 62 Landry, B (2016) Biodiversity of marine fungi in Kingsport, Nova Scotia, seawater and their oil degradation potential, Thesis submitted in partial fulfillment of therequirementsfor the Degree ofBachelor of Science with Honours in BiologyAcadia University 63 Li L., Purnima S., Ying L., Shenquan P., Guangyi W (2014), Diversity and biochemical features of culturable fungi from the coastal waters of Southern China, AMB Express, vol 64 Martin K J., Rygiewicz P T (2005), Fungal-specific PCR primers developed for analysis of the ITS region of environmental DNA extracts, BMC Microbiol., 5:00 28 65 McConnaughey M (2014), Physical Chemical Properties of Fungi, The Comprehensive Pharmacology Reference , P 1-3 66 Mireille, F., Mekala, V., Melissa, L., Helene, M., Pascale, C., Laurent, D., (2017), Biodiversity of Pigmented Fungi Isolated from Marine Environment in La Réunion Island, Indian Ocean: New Resources for Colored Metabolites, J Fungi (Basel), 3(3): 36 67 Mitchell, J I., Zuccaro, A -2006 Sequences, the environment and fungi, Mycologist, 20, 62−74 72 68 Mohamed, S A., Hala, H A E., Sahar W M H, Gehan, M A., Ahmed, M G (2019), Characterization of some fungal strains isolated from the Eastern coast of Alexandria, Egypt, and some applications of Penicillium crustosum, The Egyptian Journal of Aquatic Research 8, Vol 45, Issue 3, P211-217 69 Money, N P (2016), Fungal Diversity, The Fungi, 1–36 70 Myung, S P., Ji, E E., Jonathan ,J F., Young, W L (2015), New record and enzyme activity of four species in Penicillium section Citrina from marine environments in Korea, Journal of Microbiology, Vol 53, No 4, pp 219–225 71 Nilsson, R H., Tedersoo, L., Lindahl, B D., Kjøller, R., Carlsen, T., et al 2011 Towards standardization of the description and publication of next-generation sequencing datasets of fungal communities, New Phytol, 191, 314–318 72 Nishida H, Sugiyama J (1993), Phylogenetic relationships among Taphrina, Saitoella, and other higher fungi, Molecular Biology and Evolution, Vol 10, Issue 2, 431–436 73 O’Brien, H E., Parrent, J L., Jackson, J A., Moncalvo, J M., Vilgalys, R 2005 Fungal Community Analysis by Large-Scale Sequencing of Environmental Samples, Appl Environ Microbiol., 71, 5544−5550 74 Pang, K L., Chow, R K K., Chan, C W., Vrijmoed, L L P (2011), Diversity and physiology of marine lignicolous fungi in Arctic waters: a preliminary account, Polar Research, 30:00:00 1-5 75 Pang K L, Overy D P, Gareth Jones E B., Calado M da Luz, Burgaud G., Walker A K., Johnson J A., Kerr R G., Cha H.J, Bills G F -2016 ‘Marine fungi’ and ‘marine-derived fungi’ in natural product chemistry research: Toward a new consensual definition, Fungal Biology Reviews, Volume 30, Issue 4, , P163-175 76 Peter, M., L, , Martha, J P (2019), A taxonomic summary and revision of Rozella (Cryptomycota), IMA Fungus 9:00 383–399 77 Pietryczuk, A, Cudowski, A, Hauschild, T, Świsłocka, M, Więcko, A, Karpowicz, M (2018), Abundance and Species Diversity of Fungi in Rivers with Various Contaminations, Curr Microbiol, 75(5): 630–638 78 Porter, T M., Golding, G B -2011 Are similarity- or phylogeny-based methods more appropriate for classifying internal transcribed spacer (ITS) metagenomic amplicons?, New Phytol, 192,775–782 73 79 Prince, L., Samuel, P., (2015), A Study on the Diversity of Marine Fungi along the South East Coast of Tamilnadu A Statistical Analysis, Int.J.Curr.Microbiol.App.Sci, 4(2): 559-574 80 Taylor J D., Cunliffe M (2016),Multi-year assessment of coastal planktonic fungi reveals environmental drivers of diversity and abundance 81 Toju, H., Tanabe, A S., Yamamoto, S., Sato, H (2012) High-Coverage ITS Primers for the DNA-Based Identification of Ascomycetes and Basidiomycetes in Environmental Samples, PLoS ONE 7(7), 1-11 82 Raja, H A., Miller, A N., Pearce, C J and Oberlies, N H -2017 Fungal Identification Using Molecular Tools: A Primer for the Natural Products Research Community, J Nat Prod., 80, 756−770 83 Raúl, A M., Paola, A P M , Isidro, M Z , José, A C F., Raymundo, S G E y J L (2013), Morphological and Molecular Identification of Penicillium oxalicum Causing Stem and Fruit Rot in Tomato, Revista mexicana de fitopatología/13, Vo 31, 13-18 84 Rodolfo, A., Eric, U S (2013), Neurospora crassa, a Model System for Epigenetics Research, Cold Spring Harb Perspect Biol 5(10) 85 Rossman, A -2007 Report of the planning workshop for all fungi DNA barcoding, Inoculum, 58(6), 1-5 86 Suaad S.A (2016), Molecular identification of fungi isolated from coastal regions of Red Sea, Jeddah, Saudi Arabia, Journal of the Association of Arab Universities for Basic and Applied Sciences, Vol 24, Pages 115-119 87 Samson, R A , Peterson, S W , Frisvad, J C., Varga, J., (2011), New species in Aspergillus section Terrei, Stud Mycol, 69(1): 39–55 88 Samson, R A., Pitt, J I (2000), Integration of Modern Taxonomic Methods for Penicillium and Aspergillus Classification; CRC Press 89 Samson, R A., Visagie, C M., Houbraken, J., Hong, S.-B., Hubka, V., Klaassen, C H., Perrone, G., Seifert, K A., Susca, A., Tanney, J B (2014), Phylogeny, identification and nomenclature of the genus Aspergillus, Stud Mycol., 78, 141−173 90 Samuel, P, Prabakaran, P 2011, Biodiversity of marine fungi recorded from adirampattinam coastal environs, south east coast of tamilnadu, World Journal of Science and Technology, 1(5): 78-82 74 91 Schoch, C L., Seifert, K A., Huhndorf, S., Robert, V., Spouge, J L., Levesque, C A., Chen, W -2012 Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi, Proc Natl Acad Sci U.S.A., 109, 6241−6246 92 Seifert, K A -2009 Progress towards DNA barcoding of fungi, Mol Ecol Res, vol 9, 83–89 93 Sonia A D., Aline B P., Maria C C., Daiane R P., Roberta A M C.,Ana Julia F C de O (2018), Density and diversity of filamentous fungi in the water and sediment of Araỗỏ bay in São Sebastião, São Paulo, Brazil, Biota Neotropica, 18(1) 94 Zhou S.,Wang M., Feng Q., Lin Y., Zhao H (2016), A study on biological activity of marine fungi from different habitats in coastal regions, Springerplus 5(1) 95 Wang Z P., Zhi Z L ,Wang Y L ,Wang H B, Lu L, Wang H Y, Zheng Y (2019), Fungal community analysis in seawater of theMariana Trench as estimated by Illumina HiSeq, RSC Adv ,9, 6956 Tài liệu từ internet 96 http://thuvienkhanhhoa.gov.vn/Default.aspx?ArticleId=d2b2e8ca-d72c4002-94ca-6cfd3ec67a68 Truy cập ngày 9/7/2019 97 http://www.khanhhoainvest.gov.vn/tintuc/user/tintuc_ct.aspx?matt=201417 95657887530 98 Vương Hà (2014), “Xây dựng khu bảo tồn biển Việt Nam phục vụ bảo tồn đa dạng sinh học phát triển kinh tế - xã hội bền vững”, Trang thông tin điện tử tổng cục Thủy sản 99 Sở Kế Hoạch Đầu Tư Tỉnh Khánh Hịa 2016, Thơng tin tỉnh Khánh Hòa 75 PHỤ LỤC STT Phụ lục Nội dung Số trang Quy trình tách chiết nâm mốc theo kit EZ – 10 Column Plant Genomic DNA Purification (BioBasic, Canada) Phụ lục Quy trình tách chiết nấm men theo phương pháp Harju cộng (2013) Phụ lục Trình tự tương đồng loài vi nấm phát sinh loài Phụ lục Các bước tiến hành tách chiết DNA với kit EZ – 10 Column Plant Genomic DNA Purification (BioBasic) sau: Bước 1: Dùng thìa vô trùng cạo nhẹ lấy hệ sợi từ – khuẩn lạc(2 – mg), nghiền nitơ lỏng thành bột mịn Bước 2: Chuyển mẫu sang ống Eppendorf 1,5 ml bổ sung sẵn 600 µl đệm PCB 12 µl β – mercaptoethanol Trộn máy vortex Ủ 65oC mẫu đồng (tan hoàn toàn) Bước 3: Bổ sung 20 µl RNase A (10 mg/ml), trộn máy vortex, ủ phút nhiệt độ phịng Bước 4: Thêm 600 µl chloroform, trộn nhẹ nhàng máy vortex Ly tâm 12000 vòng/phút phút nhiệt độ phòng Chuyển cẩn thận 400 – 500 µl dịch (chứa DNA) vào ống eppendorf 1,5 ml (tránh hút kết tủa protein màu trắng chloroform pha dưới) Bước 5: Thêm 200 µl đệm BD, trộn máy vortex (Lưu ý: Nếu thấy xuất vẩn đục, nhớt bước này, tiến hành ủ mẫu bể ổn nhiệt 70oC 10 phút) Bước 6: Thêm 200 µl ethanol (96%), trộn máy vortex (Lưu ý: Nếu thấy xuất kết tủa bước này, tiến hành trộn kĩ máy vortex) Bước 7: Chuyển hỗn hợp từ bước (lấy kết tủa) vào cột EZ – 10 Column đặt sẵn ống hứng ml Ly tâm 12000 vòng/phút phút Loại bỏ dịch Bước 8: Thêm 450 µl dung dịch PW, ly tâm 12000 vòng/phút phút Loại bỏ dịch Bước 9: Rửa cột 450 µl đệm rửa (Wash solution), ly tâm 12000 vòng/phút phút Loại bỏ dịch Bước 10: Chuyển cột sang ống Eppendorf 1,5 ml ly tâm thêm 12000 vòng/phút phút để làm khô cột EZ – 10 Column Loại bỏ dịch chuyển cột sang ống Eppendorf 1,5 ml (Lưu ý: Cần bảo đảm cột EZ – 10 Column phải thật khô sau ly tâm ethanol cịn sót lại ảnh hưởng đến bước tiếp theo) Bước 11: Thêm 50 µl đệm TE vào lớp màng cột EZ – 10 Column Ủ nhiệt độ phịng phút, sau ly tâm 12000 vịng/phút phút để thơi DNA khỏi cột (Lưu ý: Làm ấm đệm TE 60oC làm tăng hiệu q trình thơi DNA khỏi cột) Phụ lục Bước 1: Hút 1,5 ml dịch ni cấy nấm men Ly tâm 12000 vịng phút Thu cặn Rửa cặn 400 µl đệm TE 1X, trộn đều, thu hồi cặn ly tâm 12000 vòng phút Bước 2: Bổ sung 400 µl đệm ly giải (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, mM EDTA, pH 8,0) Trộn pipet, vortex Bước 3: Nhúng ống vào nitơ lỏng cho đông hoàn toàn, lấy cắm vào Block nhiệt 95°C phút cho tan Vortex đều, nhẹ nhàng vài giây Lặp lại bước thêm chu kì (đơng tan) sau cắm vào đá vào tủ mát để làm lạnh nhanh nhiệt độ phịng Bước 4: Bổ sung 20 µl RNAase (10 mg/ml) Ủ 10 phút nhiệt độ 65°C Bước 5: Bổ sung 420 µl Chloroform Vortex Bước 6: Ly tâm 13000 vòng/phút phút Hút dịch sang ống eppendorf 1,5 ml (dùng tip 100 để hút) Bước 7: Lặp lại bước chiết Chloroform thêm lần nửa Thu dịch Bước 8: Bổ sung ml ethanol 96°C lạnh Trộn cách đảo ngược ống Kết tủa -20°C qua đêm Bước 9: Ly tâm 13000 vòng/phút phút 4°C Đổ nhẹ nhàng để loại bỏ dịch nổi, giữ lại cặn Bước 10: Rửa cặn DNA 500 µl etanol (lặp lần) Thu cặn ly tâm 13000 vòng/phút phút 4°C Bước 11: Đổ nhẹ nhàng để loại bỏ đệm rửa sau dùng tip 100 µl hút hết tồn đệm rửa Bước 12: Làm khơ cặn (trong tủ cấy vi sinh PCR working bench), (cặn tế bào từ màu trắng chuyển sang veo, khoảng 3-5 phút) Bước 13: Hịa tan 50 µl đệm TE, tùy cặn hay nhiều Bước 14: Điện di DNA tổng số Phụ lục ... VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG TRẦN THỊ CHÂU LOAN ĐA DẠNG SINH HỌC THÀNH PHẦN LOÀI CỦA VI NẤM Ở VÙNG BIỂN VEN BỜ TỈNH KHÁNH HỊA LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 8420201 Quyết... khoa học phương pháp phân lập nuôi cấy vi nấm biển Vi? ??t Nam, đa dạng thành phần loài vi nấm vùng ven biển Khánh Hòa dựa mơ tả hình thái phân tích trình tự gen, từ góp phần đánh giá vai trị vi nấm. .. cứu đa dạng vi nấm biển phù du hạn chế Hiện chưa có nghiên cứu đa dạng vi nấm từ nước biển ven bờ vịnh Nha Trang, vịnh Vân Phong ứng dụng chúng Vì tiến hành đề tài ? ?Đa dạng sinh học thành phần loài