Trong công trình này, tác giả nghiên cứu tách galactan từ rau câu Gracilaria verrucosa Việt Nam và khảo sát những tính chất đặc trưng của nó. Rau câu được ngâm trong nước ở các nhiệt độ khác nhau để thu được dung dịch chứa galactan, sau đó đông tụ dung dịch và tinh chế để thu galactan ở dạng bột. Các phương pháp Kjeldahl, phổ hồng ngoại, xác định độ nhớt đặc trưng và đo nhiệt quét vi sai (DSC) được thực hiện để nghiên cứu đặc trưng cấu trúc và tính chất của sản phẩm.
JST: Engineering and Technology for Sustainable Development Vol 1, Issue 1, March 2021, 073-077 Chiết tách nghiên cứu số tính chất galactan từ rau câu Gracilaria verrucosa Việt Nam Extraction and Characterization of Galactan from Seaweed Gracilaria Verrucosa of Vietnam Nguyễn Thu Hà1, Nguyễn Thị Thu Trang1, Toshiaki Ougizawa2, Nguyễn Ngọc Tuệ1* Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, Hà Nội, Việt Nam Viện Công nghệ Tokyo, Nhật Bản * Email: tue.nguyenngoc@hust.edu.vn Tóm tắt Trong cơng trình này, chúng tơi nghiên cứu tách galactan từ rau câu Gracilaria verrucosa Việt Nam khảo sát tính chất đặc trưng Rau câu ngâm nước nhiệt độ khác để thu dung dịch chứa galactan, sau đơng tụ dung dịch tinh chế để thu galactan dạng bột Các phương pháp Kjeldahl, phổ hồng ngoại, xác định độ nhớt đặc trưng đo nhiệt quét vi sai (DSC) thực để nghiên cứu đặc trưng cấu trúc tính chất sản phẩm Kết cho thấy mẫu galactan thu có cấu trúc agar, khơng chứa nhóm sunfat Mẫu tách nước 40 oC có hàm lượng protein cao hơn, độ nhớt độ bền nhiệt cao so với mẫu tách nước 100 oC Từ khóa: Gracilaria verrucosa, galactan, đặc trưng cấu trúc, cấu trúc, độ nhớt đặc trưng, DSC Abstract In this study, we extracted galactan from seaweed Gracilaria verrucosa of Vietnam and investigated its structure and properties The seaweed was immersed in water in different temperatures to obtain a solution of galactan Thereafter, the solution was coagulated and purified to obtain galactan as a powder Kjeldahl method, infrared spectroscopy, viscosity determination and differential scanning calorimetry (DSC) were used to characterize structure and properties of the resulting material It was found that the obtained galactan had agar structure without sulfate as a substitute group Proteins content, intrinsic viscosity and thermal resistance of the galactan extracted in water at 40 oC were higher than those of the galactan extracted in water at 100 oC Keywords: Gracilaria verrucosa, galactan, structural characterization, intrinsic viscosity, DSC Giới thiệu * Thông thường, mạch galactan tạo thành lặp lại G-DG G-LG Nếu chuỗi galactan gồm đơn vị G-DG gọi cấu trúc cacrageenan, gồm đơn vị G-LG gọi cấu trúc agar Đơi khi, mắt xích DG LG tồn dạng anhidrit tương ứng 3,6anhydro-α-D-galactopyranozơ (DA) 3,6-anhydroα-L-galactopyranozơ (LA) Thí dụ, cấu trúc có agar trình bày hình Một đặc điểm quan trọng cấu trúc galactan tách từ Rhodophyta nói chung G verrucosa nói riêng tồn các nhóm xếp ngẫu nhiên mạch galactan Nguyên tử H nhóm OH vịng galactopyranozơ thường bị thay nhóm metyl, sulfat, pyruvat… Tuỳ thuộc điều kiện tự nhiên thời điểm thu hoạch, thời tiết, nhiệt độ, thổ nhưỡng, rau câu cho galactan với số nhóm vịng galactopyranozơ khác biệt Các nhóm định đặc tính hố lý chất lượng galactan Rau câu vàng loại rong phổ biến bờ biển Việt Nam, có tên khoa học Gracilaria verrucosa (G verrucosa), thuộc ngành rong đỏ Rhodophyta [1,2] Từ lâu, loại rau câu người dân dùng làm thức ăn Nhiều ăn quen thuộc chế biến từ rau câu nộm, thạch canh Theo tài liệu công bố, G verrucosa chứa galactan tan tốt nước tạo thành gel [3,4] Loại galactan dùng làm chất tạo đơng thực phẩm ngành kĩ thuật, dùng chế tạo thạch agar làm môi trường nuôi cấy vi khuẩn, chế thuốc nhuận tràng, làm chất nhũ hóa… Cấu trúc galactan tách từ Rhodophyta công bố rộng rãi nhiểu cơng trình nghiên cứu [5-8] Các loại mắt xích thường thấy chuỗi galactan ß-D-galactopyranozơ (G), α-Dgalactopyranozơ (DG) α-L-galactopyranozơ (LG) Các nghiên cứu cấu trúc, tính chất galactan tách từ G verrucosa tiến hành khắp nơi giới Tuy nhiên biết, tính chất cấu trúc loại galactan tách phụ thuộc lớn vào điều kiện sinh trưởng Ở Việt Nam, ISSN 2734-9381 https://doi.org/10.51316/jst.148.etsd.2021.1.1.15 Received: February 14, 2020; accepted: August 01, 2020 73 JST: Engineering and Technology for Sustainable Development Vol 1, Issue 1, March 2021, 073-077 nghiên cứu loài rau câu vàng chủ yếu nhằm phân loại, tìm hiểu ứng dụng thực phẩm, thuốc chữa bệnh [1,9] Trong cơng trình này, chúng tơi tiến hành chiết tách galactan cách ngâm rau câu nước nóng nhiệt độ khác Sau chúng tơi thực quy trình tinh chế để xác định rõ cấu trúc tính chất sản phẩm Thành phần, cấu trúc galactan xác định thông qua phương pháp xác định hàm lượng nitơ phổ hồng ngoại FT-IR Đặc tính nhớt tính chất nhiệt galactan xác định thông qua phương pháp đo độ nhớt nhiệt quét vi sai (DSC) Nghiên cứu nhằm khảo sát đặc điểm cấu trúc số tính chất galactan tách từ G verrucosa, từ góp phần nâng cao giá trị loại rau câu phổ biến RO CH2OR H H H H H O H O H OR O CH2OR H OR OH H giờ, sau lọc, thu dung dịch Đổ từ từ dung dịch vào axeton (lấy dư), lọc thu chất rắn đông tụ Hoà tan chất rắn nước cất để thu dung dịch, tiếp tục đông tụ dung dịch axeton, thu chất rắn đông tụ Lặp lại trình hai lần để làm tạp chất mẫu Cuối rửa chất rắn đông tụ axeton, sau cho vào cối sứ, rót thêm dietyl ete nghiền mịn, thu galactan Sản phẩm dạng bột làm khô 50 o C tuần Quy trình trình bày hình Sản phẩm thu cách đun rau câu 40 oC 100 oC kí hiệu G40 G100 Các mẫu bảo quản bình hút ẩm O H Đơn vị DG – LG RO CH2OR H H H H H O H O O H H OR OH CH2 O H H O Đơn vị DG - LA Hình Các đơn vị cấu trúc agar (R H, nhóm metyl, sunfat, pyruvat) Thực nghiệm 2.1 Nguyên liệu hoá chất Hình Quy trình tách galactan từ rau câu Rau câu vàng G verrucosa thu hoạch vào tháng tháng bờ biển tỉnh Nam Định – Việt Nam Rau câu thu hoạch xong rửa đất cát, ngâm dung dịch NaOH 10% để tẩy trắng Sau đó, rau câu lấy rửa đến nước rửa trung tính, phơi khô ánh sáng mặt trời 24 2.3 Nghiên cứu đặc trưng cấu trúc tính chất Phổ hồng ngoại (FT-IR) G40 G100 đo máy phổ Jasco FT/IR 480 Plus theo kĩ thuật ATR Mẫu trộn với bột KBr, sau ép viên Quá trình đo thực nhiệt độ phòng, số vòng quét 64, tần số quét từ 400 đến 4000 cm-1 Các hoá chất dùng nghiên cứu bao gồm: NaOH (99,9%), axeton (99,5%), dietyl ete (99,5%), than hoạt tính (99,9%) sản phẩm Nacalai Tesque (Nhật Bản) K2SO4 (99,9%), CuSO4 (99,9%), H2SO4 (98%) thuốc thử Nessler hoá chất Merck (Đức) Các hoá chất sử dụng không cần tinh chế lại Hàm lượng niơ mẫu xác định phương pháp Kjeldahl theo TCVN 9937 : 2013 (tương đương với ISO 5378 : 1978) Lấy khoảng 0,5 gam galactan 0,75 gam xúc tác (gồm (K2SO4 CuSO4 với tỉ lệ 97:3 theo khối lượng), trộn cho vào bình hình lê Cho 20 ml dung dịch H2SO4 98% vào bình, đun để đảm bảo vơ hố hồn tồn mẫu, nitơ mẫu chuyển thành dạng (NH4)2SO4 Thêm dung dịch NaOH 40% vào hỗn hợp sau phản ứng chưng cất, NH3 sinh thu vào bình hứng chứa 25 ml dung dịch axit sunfuric 0,1N Lấy V ml dung dịch thu được, thêm nước cất 1,0 ml thuốc thử Nessler để thể tích dung dịch 50 ml Đo mật độ quang dung dịch máy quang phổ V-7200 UV-VIS-NIR bước sóng 430 2.2 Quy trình tách galactan từ rau câu Chúng thử nghiệm tách galactan rau câu G verrucosa theo hai quy trình: tách 40oC 100oC Trước hết, rau câu xay nhỏ mịn, ngâm nước cất giờ, sau đun nóng (ở 40oC 100oC) 30 phút Lọc bỏ xác rau câu, thu dung dịch Thêm than hoạt tính vào dung dịch 1, lắc 74 JST: Engineering and Technology for Sustainable Development Vol 1, Issue 1, March 2021, 073-077 nm Nồng độ nitơ mẫu xác định dựa vào đường chuẩn nồng độ amoni sunfat – mật độ quang xây dựng từ trước Tiến hành thí nghiệm tương tự với mẫu trắng đường saccarozơ Hàm lượng nitơ tổng (% khối lượng) mẫu tính theo cơng thức: m − m2 = N (%) V × 50m o Bảng Hàm lượng nitơ có mẫu Tên mẫu 0,88 G100 0,21 Để xác định rõ thành phần cấu trúc mẫu G40 G100, chúng tơi phân tích phổ FT-IR chúng Phổ FT-IR mẫu G40 G100 trình bày hình Có thể nhận thấy phổ G40 G100 tương đối giống Trên phổ xuất dải tín hiệu rộng khoảng từ 3600 đến 2800 cm-1 Dải tín hiệu quy kết cho dao động kéo dãn liên kết O-H Đây tín hiệu quen thuộc xuất phổ galactan Bên cạnh đó, phổ xuất vân hấp thụ 1083 cm-1, 1056 cm-1 987 cm-1 Theo tài liệu tham khảo [6,11], tín hiệu quy kết cho dao động kéo dãn liên kết C-O, liên kết C-C nhóm C-O-C vịng 3,6-anhydro-α-Lgalactopyranose Thêm vào đó, phổ FT-IR G40 G100 xuất tín hiệu 868 cm-1 779 cm-1 Đây tín hiệu đặc trưng cấu trúc agar [7] Như vậy, kết luận galactan chiết tách thành công từ G verrucosa cấu trúc chúng chủ yếu agar Độ nhớt mẫu đo nhớt kế Ubbelohde 25oC Galactan pha nước cất với nồng độ khác Các dung dịch cho vào nhớt kế, đo thời gian chảy chất lỏng hai vạch cố định nhớt kế Độ nhớt riêng mẫu galactan tính theo cơng thức: t − to to G40 3.2 Cấu trúc galactan (1) Trong đó: V thể tích phần dung dịch chưng cất (ml), mo khối lượng galactan dùng (g); m1 khối lượng nitơ V ml dung dịch chưng cất từ mẫu thử phân hủy; m2 khối lượng nitơ V ml dung dịch chưng cất từ mẫu trắng Giá trị m1 m2 xác định từ đường chuẩn, tính microgram (µg) Mỗi phép đo lặp lại lần với mẫu lấy kết trung bình η= Hàm lượng nitơ (% khối lượng) (2) Trong đó: t thời gian chảy dung dịch galactan (s), to thời gian chảy nước cất (s) Mỗi phép đo lặp lại lần với mẫu lấy kết η = f ( C ) , ngoại suy đến giá C trị C = thu giá trị độ nhớt đặc trưng mẫu trung bình Vẽ đồ thị Nhiệt quét vi sai (DSC) đo máy DSC 7020 (SII NanoTechnology Inc.) Mẫu nén chén nhôm tiêu chuẩn hàn kín Phép đo tiến hành từ nhiệt độ phòng tới 250oC, tốc độ gia nhiệt 10oC/phút Kết thảo luận 3.1 Hàm lượng nitơ mẫu Bảng trình bày kết xác định hàm lượng nitơ tổng có mẫu Kết khảo sát cho thấy mẫu galactan chiết nhiệt độ thấp (mẫu G40) có hàm lượng nitơ cao gấp lần mẫu chiết nhiệt độ cao (mẫu G100) Hàm lượng nitơ tỉ lệ thuận với hàm lượng protein, từ suy mẫu G40 có hàm lượng protein cao G100 Điều giải thích nhiệt độ cao, protein rau câu phân huỷ phần, nên galactan tách từ rau câu có hàm lượng protein thấp Protein rau câu thường đóng vai trị quan trọng, thí dụ chất chống oxy hố [10] Như vậy, từ kết thí nghiệm suy việc đun sôi rau câu nước làm giảm đáng kể giá trị galactan Hình Phổ FT-IR mẫu (a) G100, (b) G40 75 JST: Engineering and Technology for Sustainable Development Vol 1, Issue 1, March 2021, 073-077 Điểm khác biệt quan trọng phổ FT-IR G40 G100 là: phổ G40 xuất hai đỉnh peak 1643 1420 cm-1, phổ G100 khơng thấy tín hiệu Theo tài liệu cơng bố, tín hiệu quy kết cho dao động nhóm amin bậc I bậc II protein [11] Điều chứng tỏ tồn protein G40, phù hợp với kết thu phần xác định hàm lượng nitơ vậy, độ nhớt rút gọn G40 cao gấp lần so với G100 Theo nghiên cứu công bố, dung dịch nước, mạch galactan cuộn lại, thể tích cuộn lớn độ nhớt dung dịch cao [5] Như vậy, từ kết độ nhớt ta suy cuộn polysacarit dung dịch G40 tích lớn so với dung dịch G100 Đặc tính liên quan đến thành phần protein có G40 Khi có protein, cuộn galactan mang điện tích (thường điện tích âm) Do điện tích đẩy dẫn đến thể tích cuộn galactan tăng lên so với cuộn khơng mang điện tích Đặc tính nhớt dung dịch liên quan đến khả tạo gel sản phẩm Có thể suy rằng, G40 dễ dàng tạo gel G100 Tính chất nhiệt đặc tính quan trọng, định phạm vi ứng dụng của loại galactan Chúng tơi nghiên cứu tính chất nhiệt G40 G100 thông qua giản đồ DSC, thể hình 3.4 Tính chất nhiệt galactan Hình Đồ thị biểu diễn mối liên hệ độ nhớt rút gọn nồng độ dung dịch : G100, : G40 Có thể nhận thấy khác biệt tương đối rõ rệt tính chất nhiệt G100 G40 Trên đường DSC G100 thấy peak gây trình toả nhiệt 198,8 oC Có thể suy q trình phản ứng phân huỷ nhiệt G100 Trên đường DSC G40, nhận thấy tín hiệu Tín hiệu thứ gây trình thu nhiệt, xảy nhiệt độ 122,5 oC; tín hiệu thứ hai gây q trình toả nhiệt, có đỉnh peak 223,2 oC Dựa vào đặc điểm thành phần, cấu trúc G40, kết luận tín hiệu thứ 122,5 oC tương ứng với chuyển pha protein G40 Tín hiệu thứ hai có đỉnh peak 223,2oC quy kết cho trình phân huỷ mẫu G40 Điều đáng ý nhiệt độ phân huỷ G40 cao hẳn so với G100 Có thể thấy khác biệt cấu trúc G40 (trong thành phần có hàm lượng protein tương đối cao) làm cho độ bền nhiệt G40 cao hẳn so với G100 Trong phổ G40 G100, tín hiệu đặc trưng nhóm sunfat nhóm pyruvic hồn tồn khơng xuất Như vậy, agar tách từ rau câu theo phương pháp có cấu trúc mắt xích tương đối đồng đều, khơng chứa có nhiều nhóm phức tạp Trong cơng trình cơng bố, Sekkal cộng dùng quy trình tương tự báo để tách galactan từ G verrucosa thu hoạch Pháp Kết từ phổ FT-IR cho thấy sản phẩm galactan có cấu trúc phức tạp, hàm lượng nhóm sunfat cao Trong đó, mẫu galactan chúng tơi tách G verrucosa Việt Nam khơng chứa nhóm sunfat, khả tạo gel cao [13] 3.3 Độ nhớt dung dịch galactan Đồ thị biểu diễn liên hệ độ nhớt rút gọn η (đại lượng ) nồng độ dung dịch galactan C biểu diễn hình Đối với mẫu G40, mối liên hệ có phù hợp tốt với phương trình: η = 25847C + 79, 756 (R2 = 0,9885) C (3) Trong đó, mối liên hệ độ nhớt rút gọn nồng độ dung dịch G100 phù hợp tốt với phương trình trình: η = 14422C + 38,303 (R2 = 0, 0,9897) C (4) Từ đồ thị này, suy độ nhớt rút gọn G40 G100 79,756 38,303 (L/g) Như Hình Giản đồ DSC (a) G100 (b) G40 76 JST: Engineering and Technology for Sustainable Development Vol 1, Issue 1, March 2021, 073-077 Kết luận Chúng thu galactan từ rau câu G verrucosa mọc bờ biển miền bắc Việt Nam cách chiết với nước hai nhiệt độ khác Kết cho thấy galactan thu có cấu trúc agar, khơng chứa nhóm vòng galactopyranozơ Mẫu tách nhiệt độ thấp có chứa nhiều protein hơn, độ nhớt cao độ bền nhiệt tốt so với mẫu tách nhiệt độ cao Lời cảm ơn Nghiên cứu tài trợ Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đề tài mã số T2018-PC-234 V.K Do Status of production and utilization of seaweed in Vietnam Proceedings of the Regional Workshop on the Culture & Utilization of Seaweeds, Philippines FAO 1990 [2] T.V Nguyen, N.H Le, S.M Lin, F Steen, O De Clerck, A checklist of marine seaweeds of Vietnam, Bot Mar 56 (2013) 207-227 [3] E Murano, Chemical structure and quality of agars from Gracilaria, J Appl Phyco (1995) 245-254 [4] R Iyer, O De Clerck, J.J Bolton, V.E Coyne, Morphological and taxonomic studies of Gracilaria and Gracilariopsis species (Gracilariales, Rhodophyta) from South Africa, S Afr J Bot 70 (2004) 521-539 [5] M Lahaye, C Rochas, Chemical structure and physico-chemical properties of agar, Hydrobiologia 221 (1991) 137-148 [7] A.I Usov, Structural analysis of red seaweed galactans of agar and carrageenan groups, Food Hydrocolloids 12 (1998) 301-308 [8] C.A Stortz, A.S Cerezo, Novel findings in carrageenans, agaroids and “hybrid” red seaweed galactans, Curr Top Phytochem (2000) 121-134 [9] D.H Dang, M.H Hoang, N.S Pham, Seaweeds from Vietnam used for functional food, medicine and biofertilizer J Appl Phycol 19 (2007) 817-826 [10] B.W.S Souza, M.A Cerqueira, A I Bourbon, A.C Pinheiro, J.T Martins, J.A Teixeira, M.A Coimbra, A.A Vicente, Chemical characterization and antioxidant activity of sulfated polysaccharide from the red seaweed Gracilaria birdiae, Food Hydrocolloids 27 (2012) 287-292 Tài liệu tham khảo [1] [6] [11] E.G Ordónez, P Rupérez, FTIR-ATR spectroscopy as a tool for polysaccharide identification in edible brown and red seaweeds, Food Hydrocolloids 25 (2011) 1514-1520 [12] M Sekkal, J-P Huvenne, P Legrand, B Sombret, J-C Mollet, A Mouradi-Givernaud, M-C Verdus, Direct structure identification of polysaccharides from red algae by FTIR microspectrometry I: Localization of agar in Gracilaria verruscosa sections, Mikrochim Acta 112 (1993) 1-10 [13] T.T.T Thanh, H Yasunaga, R Takano, H Urakawa, K Kajiwara, Molecular characteristics and gelling properties of carrageenan family Tri-sulfated and tetra-sulfated carrageenans, Polym Bull 47 (2001) 305-312 M Lahaye, Chemistry and physico-chemistry of phycocolloids, Cah Biol Mar 42 (2001) 137-157 77 ... Thực nghiệm 2.1 Ngun liệu hố chất Hình Quy trình tách galactan từ rau câu Rau câu vàng G verrucosa thu hoạch vào tháng tháng bờ biển tỉnh Nam Định – Việt Nam Rau câu thu hoạch xong rửa đất cát,... UV-VIS-NIR bước sóng 430 2.2 Quy trình tách galactan từ rau câu Chúng thử nghiệm tách galactan rau câu G verrucosa theo hai quy trình: tách 40oC 100oC Trước hết, rau câu xay nhỏ mịn, ngâm nước cất giờ,... đo độ nhớt nhiệt quét vi sai (DSC) Nghiên cứu nhằm khảo sát đặc điểm cấu trúc số tính chất galactan tách từ G verrucosa, từ góp phần nâng cao giá trị loại rau câu phổ biến RO CH2OR H H H H H O