Với sự phát triển của công nghệ sinh học hiện đại, công nghệ di truyền, thuật ngữ clone và cloning bao hàm khái niệm mở rộng, dòng gen, tạo dòng và tách dòng gen; là các kỹ thuật phân lậ[r]
(1)CHUYÊN ĐỀ 1: KỸ THUẬT DI TRUYỀN VÀ KỸ THUẬT GENE TRONG TẠO GIỐNG 1 KỸ THUẬT DI TRUYỀN
Kỹ thuật tái tổ hợp ADN thường gọi kỹ thuật di truyền, bao gồm tập hợp gồm nhiều kỹ thuật, vai trò hàng đầu thuộc tư phương pháp di truyền vi sinh vật, sinh học phân tử, hóa học axit nucleic
Về hình thức, kỹ thuật di truyền đời vào năm 1972-1973, nhóm nghiên cứu Berg, Boyer Cohen Mỹ tạo nên phân tử ADN tái tổ hợp invitro từ ba nguồn nguyên liệu khác nhau: nguyên gen virus SV40 gây ung thư khỉ, phần gen phage trung hòa λ gen operon lactose vi khuẩn E coli
Vào năm 1973-1974 nhóm Cohen, Helinski, Boyer lần nhận sản phẩm có hoạt tính từ ADN tái tổ hợp Nhóm giải vấn đề lắp ghép tạo dịng ADN Sau nhiều nhà khoa học lao vào thí nghiệm lắp ghép gen nhanh chóng thu kết có ứng dụng thực tiễn Kỹ thuật di truyền thực qua nhiều công đoạn phức tạp tinh vi, nói cơng nghệ Từ thuật ngữ cơng nghệ sinh học (biotechnology) đời
1.1 Các enzyme hạn chế (cắt giới hạn)
Vào năm 1962, V.Arber lần chứng minh có enzyme đặc biệt hoạt động tế bào vi khuẩn, chúng có khả phân biệt ADN “của mình” với ADN “lạ” phage Các enzyme “hạn chế” khả sinh sản phage tế bào vi khuẩn cách phân hủy chúng cách đặc hiệu, gọi enzyme hạn chế Các enzyme phân cắt ADN gọi nuclease, gồm loại: exonuclease endonuclease Exonuclease cắt ADN từ hai đầu mút endonuclease cắt ADN phân tử Các enzyme hạn chế cắt phân ADN cách đặc hiệu nên gọi endonuclease hạn chế (restriction)
Vào năm 1970, H Smith cộng tách restriction endonuclease từ vi khuẩn Haemophilus influenzae gọi HinII Ngay sau không lâu xác định rằng, phần lớn lồi vi khuẩn có hệ thống chun biệt hạn chế biến đổi (restriction-modification system) để bảo vệ tế bào khỏi xâm nhập ADN lạ Các restriction chia làm nhóm: enzyme nhóm II thường sử dụng kỹ thuật di truyền Các enzyme nhóm II nhận biết ADN mạch kép trình tự nhận biết cắt ADN trình tự Các trình tự nhận biết thường có 4-6 cặp nucleotide đối xứng đảo ngược nhau, gọi palindrom Mỗi restriction endonuclease có trình tự nhận biết đặc trưng
(2)Các enzyme Eco RI BamHI cắt ADN mạch kép tạo đầu lệch “cố kết” hay “dính” base bổ sung dễ bắt cặp để gắn lại với lúc chưa bị cắt rời Nếu có đoạn ADN lạ khác bị cắt loại enzyme hạn chế, ví dụ enzyme Eco RI nhờ đầu “cố kết” đoạn ADN lạ, xen vào sau:
Đoạn ADN I Đoạn ADN lạ II
Tính chất quan trọng dùng để cắt -ghép gen
Ngày có 1200 loại restriction endonuclease phát hiện, chúng có khả cắt ADN tổng cộng với 120 trình tự nhận bíết khác
1.2 Thu nhận gen
(3)với phương pháp vật lý để tách lai phân tử ADN Có thể thu nhận gen để thực kỹ thuật tái tổ hợp ADN ba phương pháp khác
1.2.1 Tách đoạn ADN từ gen
Đây phương pháp sử dụng rộng rãi từ buổi đầu phát triển kỹ thuật tái tổ hợp ADN Toàn ADN sinh vật cắt đoạn nhỏ dài khoảng 15.000 đến 20.000 cặp base lắc học hay enzyme endonuclease gắn vào vector mang gen, tạo plasmid tái tổ hợp Phương pháp mang tinh chất mò mẫm, ngun gen tồn phân tử ADN sinh vật khác chứa nhiều gen Tuy nhiên, phương pháp sử dụng có hiệu việc lập ngân hàng hay thư viện gen sinh vật, gọi ngân hàng ADN gen (genomic ADN libraries)
1.2.2 Tổng hợp gen phương pháp hóa học
Năm 1969, Khorana thực việc tổng hợp nhân tạo gen Đó gen mã hóa việc tổng hợp t.RNA, vận chuyển aminoacid alanine nấm men, hoạt tính Về sau nhóm tổng hợp gen có hoạt tính, gen mã hóa cho chất ức chế t.RNA vận chuyển thyrosine E coli, có chiều dài khoảng 200 cặp nucleotid
Muốn tổng hợp gen phương pháp hóa học phải biết trình tự nucleotid gen Kỹ thuật di truyền nhanh chóng đưa gen tổng hợp hóa học vào sản xuất Lần vào năm 1977, K Itakura Boyer thành cơng việc tổng hợp nhân tạo gen, mã hóa cho việc tổng hợp hormone somatostatin động vật có vú biểu tế bào E coli Sau nịi E coli mang gen tổng hợp hóa học tạo ra, chúng sản sinh hormone tăng trưởng người hormone peptid như: bradikinie, anginotensine, neuropeptid leuencephalin Các tế bào E coli mang plasmid tái tổ hợp tạo khoảng triệu phân tử hormone tế bào Polypeptid thử nghiệm kiểm định chuột bị lấy tuyến yên, hoàn toàn tương tự hormone tăng trưởng người Phương pháp tổng hợp hóa học gen đựoc sử dụng để tạo nòi vi khuẩn sản sinh insulin, hormone quan trọng để chữa bệnh tiểu đường Gen insulin tổng hợp dạng gồm từ 40 đoạn oligonucleotid, đoạn có nucleotid Các đoạn ligase nối lại thành cấu trúc thống Các mạch kép polynucleotid có chiều dài 271-286 cặp base gắn vào plasmid Plasmid gắn thêm đoạn gen điều hòa Tế bào chứa plasmid mang gen insulin tổng hợp proinsulin, sau xử lý hóa học để biến thành insulin có hoạt tính Phân tử insulin cấu tạo gồm mạch A (21 amino acid) mạch B (30 amino acid) Hai mạch nối lại với nhờ cầu nối disulfit
1.2.3 Sự tổng hợp gen từ m.RNA gen tương ứng
(4)sao chép RNA restovirus gây ung thư Nó có khả tổng hợp nên ADN mạch, gọi c-ADN từ khuôn mRNA từ đoạn polyribonucleotid tổng hợp hóa học Nhờ enzyme reverse transcriptase tổng hợp tất gen, miễm có mặt mRNA gen Các c-ADN mạch đơn biến thành mạch kép nhờ ADN-polymerase gọi c-ADN kép Đoạn c-ADN kép gắn vào plasmid biến nạp vào vi khuẩn để tạo dòng c-ADN Các dòng ADN gen đoạn ngẫu nhiên trình tự nucleotid dọc theo ADN sinh vật không phụ thuộc vào loại tế bào dùng để lấy ADN Ngược lại dòng c-ADN chứa đoạn gen phiên mã m.RNA, tế bào mơ biệt hóa có loại mRNA khác nên ngân hàng c-ADN nhận đựoc phụ thuộc vào kiểu tế bào sử dụng Sử dụng ngân hàng c-ADN có nhiều ưu thế:
- Thứ nhất, dịng c-ADN chứa trình tự mã hóa liên tục gen
- Thứ hai, nhiều protein tổng hợp với số lượng lớn tế bào chuyên hóa tế bào mRNA protein giàu có tỷ lệ cao ngân hàng c-ADN tạo từ tế bào có nhiều c-ADN mã hóa cho protein tương ứng Sự dồi c-ADN vài loại làm giảm nhẹ đáng kể việc xác định dòng mong muốn từ ngân hàng gen Bằng đường nhận tạo dịng gen mã hóa cho globuline người, động vật chim, cho globuline thủy tinh thể mắt bò, cho ovalbumine (protein lòng trắng trứng), cho fibroin tơ tằm Phương pháp sử dụng để thu nhận, tạo dòng biểu gen interferon người vi khuẩn
Hiện số lượng ngân hàng gen ADN nhiễm sắc thể c-ADN không ngừng tăng, chúng nguồn cho nhà nghiên cứu, đồng thời số đáng kể trở thành hàng hóa Năm 1972 nhà khoa học Mĩ tạo dòng c-ADN 2375 gen não người
1.3 Các vector chuyển gen
1.3.1 Thế vector chuyển gen
Để thu nhận gen dạng tinh với hàm lượng lớn, người ta phải tạo dòng (clon) gen Tạo dịng nhằm gắn trình tự ADN cần thu nhận vào vector Vector phân tử ADN thường có dạng vịng, mang nhiều đặc tính, có khả tự tái sinh, tồn độc lập, mượn máy tế bào vi khuẩn để tạo nhiều khác giống hệt vector ban đầu mang gen cần chuyển Các vector chuyển gen cần thỏa mãn điều kiện sau:
- Có trình tự khởi chép để tự chép, tồn độc lập
- Có trình tự nhận biết, nơi mà enzyme hạn chế nhận biết để cắt hở làm chổ ráp gen lạ vào Các trình tự thường nằm xa điểm xuất phát chép để tránh bị cắt nhầm
- Các trình tự điều hịa tạo điều kiện thuận lợi cho phiên mã gen lạ
- Đảm bảo cho di truyền bền vững ADN tái tổ hợp dạng độc lập hay gắn vào nhiễm sắc thể tế bào chủ
(5)Ngồi chúng cịn phải có đặc tính bổ sung khác việc tạo dòng thuận lợi
- Chứa gen làm vô hiệu hóa đoạn ADN khơng mong muốn bị gắn vào
- Có nhiều để tách khỏi tế bào với số lượng lớn đảm bảo khuyếch đại gen gắn vào
- Có trình tự nucleotid cần thiết cho biểu gen promotor, trình tự gắn với ribosome để dịch mã Khơng có vector tồn cho chuyển gen, mà cần có chọn lựa tùy đối tượng, tùy kích thước đoạn gen tạo dịng Các vector chuyển gen có ứng dụng:
- Tạo dịng khuyếch đại trình tự ADN (nhiều giống nhau) - Nghiên cứu biểu đoạn trình tự ADN
- Đưa gen vào tế bào vi sinh vật (vkhuẩn, nấm men) hay động vật, thực vật - Sản xuất RNA
- Sản xuất protein từ gen tạo dịng
Do có tầm quan trọng nên vector chuyển gen hồn thiện khơng ngừng, từ vector plasmid tự nhiên vi khuẩn vào đầu năm 70, tiến tới nhiều loại vector phức tạp, đến nhiễm sắc thể nhân tạo
1.3.2 Các vector chuyển gen plasmid
Plasmid đoạn ADN ngắn (2-5), dạng vịng, nằm ngồi nhiễm sắc thể, tìm thấy lần vi khuẩn Sự chép plasmid không phụ thuộc vào chép nhiễm sắc thể vi khuẩn Mỗi vi khuẩn chứa hàng trăm plasmid Ở sinh vật procaryotae, vector chuyển gen thường sử dụng plasmid vi khuẩn bacteriophage Chúng cải tiến để ngày thuận tiện cho kỹ thuật tái tổ hợp ADN, qua hệ
- Thế hệ thứ plasmid tự nhiên, đến khơng cịn sử dụng - Thế hệ thứ hai plasmid cấu tạo phức tạp Một plasmid sử dụng rộng rãi ρBR 322 Plasmid có khả chép độc lập với tế bào E coli tồn với số lượng trung bình 20-30 cho tế bào Trong điều kiện nuôi cấy định khuyếch đại có chọn lọc làm tăng số plasmid đến 1000 cho tế bào
- Thế hệ thứ ba plasmid đa chuyên dụng Các plasmid vi khuẩn chứa đoạn ADN lạ có chiều dài khoảng 3-10 kb
1.3.3 Các vector chuyển gen phage λ
Phage (thực khuẩn thể) virus xâm nhiễm làm phân giải vi khuẩn Các phage, virus vi khuẩn dùng làm vector chuyển gen nhiều phage có khả thực tải nạp mang gen từ tế bào vi khuẩn cho sang tế bào vi khuẩn nhận Vector phage λ sử dụng rộng rãi để lập ngân hàng gen, mang đoạn ADN lớn hơn, dễ bảo quản, dễ tách để phân tích Ưu điểm bật phage chúng có hệ thống tự động xâm nhập sinh sản tế bào vi khuẩn với hiệu cao nhiều so với việc đưa plasmid vào tế bào vi khuẩn biến nạp Tuy nhiên thao tác ban đầu có phức tạp
1.4 Tạo plasmid tái tổ hợp (tạo dòng)
(6)- Chọn xử lý vector: Việc chọn xử lý vector phụ thuộc vào nhiều yếu tố: kích thước đoạn ADN muốn tạo dịng, mục đích tạo dịng Trước hết, vector cắt vị trí xác định enzyme giới hạn Sau đầu chổ nối cắt xử lý để chúng nối trở lại; vecto trở lại dạng vịng ban đầu hai đầu chổ mối cắt nối với trình tự ADN lạ
- Xử ADN cần tạo dòng (insert): Trước hết cần chọn lọc sơ khởi ADN có kích thước gần tương ứng với loại vector chọn Sau dó hai đầu đoạn ADN cần xử lý cho phù hợp với hai đầu chổ mối cắt vector (bằng cách cắt enzyme giới hạn để tạo đầu so le tương hợp)
- Tạo vecto tái tổ hợp: Vecto ADN cần tạo dòng xử lý trộn chung theo tỷ lệ định với tham gia ligase Ligase xúc tác phản ứng nối vector với insert tạo thành vector tái tổ hợp (recombinant) Vector tái tổ hợp sau tinh qua tách chiết kết tủa
- Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ: Nhằm mục đích sử dụng máy tế bào chủ để chép vector tái tổ hợp thành số lượng lớn Tùy thuộc loại tế bào chủ, người ta sử dụng kỹ thuật chuyển thích hợp
- Phát dịng cần tìm thư viện gen: Sự phát dịng cần tìm, người ta sử dụng mẫu dị, mẫu dị kháng thể đặc trưng cho protein mã hóa gen cần tìm trình tự ADN bổ sung cho gen cần tìm
Do chất ADN cần tạo dòng (được gọi insert) người ta phân biệt hai loại thư viện gen: thư viện gen (genomic library) thư viện c-ADN (cADN library) 1.4.2 Thư viện gen (genomic library)
Thư viện gen sinh vật tập hợp tất trình tự ADN cấu thành gen gắn vào vector Về nguyên tắc, thư viện gen thiết lập từ loại tế bào sinh vật nghiên cứu Để thiết lập thư viện gen, trước hết người ta tách chiết ADN gen sinh vật đó, cắt ADN thành đoạn có kích thước xác định enzyme giới hạn; gắn đoạn vào vector tạo vector tái tổ hợp Các vector tái tổ hợp sau đưa vào tế bào chủ Các tế bào chủ nuôi cấy môi trường đặc hình thành nên dịng (clone) Ứng dụng thư viện gen cần:
- Giải mã thông tin di truyền chứa gen, đặc biệt cấu trúc intron-exon gen xác định
- Tạo dịng trình tự ADN khơng mã hóa nằm cạnh gen địng vai trị định điều hòa biểu gen
1.4.3 Thư viện cADN
Thư viện cADN tập hợp cADN từ tất mRNA tế bào Như vậy, không giống với thư viện gen, thư viện cDN thiết lập từ loại tế bào xác định gen nghiên cứu phải biểu thành mRNA Thư viện cADN mang tính đặc trưng tế bào cao loại tế bào thể biệt hóa có số gen phiên mã thành mRNA Việc thiết lập thư viện cADN có số điểm đặc trưng: Trước hết mRN tế bào tách chiết chuyển thành cADN nhờ enzyme phiên mã ngược (Reverse transcriptase)
Thư viện cADN thiết lập chủ yếu nhằm mục đích nghiên cứu biểu gen xác định với vấn đề liên quan điều hòa biểu gen, mối tương tác gen trình sống
(7)- Việc chọn vector tương đối dễ dàng kích thước cADN lớn kb Ngày người ta thường sử dụng plasmid hệ thứ ba Plasmid cắt enzyme giới hạn hai đầu mối cắt loại phosphate để tránh tượng tự nối trở lại
- Bên cạnh đó, mRNA tách chiết từ tế bào chuyển thành cADN nhờ enzyme phiên mã ngược Vector tái tổ hợp hình thành kết hợp plasmid cADN
- Sau đó, vector tái tổ hợp đưa vào tế bào vi khuẩn phương pháp biến nạp (transformation) Sau tế bào vi khuẩn nhận vector tái tổ hợp, người ta lại nuôi chúng môi trường lỏng thời gian ngắn trước đem trải chúng mơi trường đặc Các dịng vi khuẩn hình thành nên khuẩn lạc mặt thạch
1.5 Biến nạp ADN tái tổ hợp vào tế bào
- Sau ADN tái tổ hợp, việc biến nạp, đưa vào lại tế bào Có thể đưa vào nhiều cách
1.5.1 Hóa biến nạp
- ADN tái tổ hợp (plasmid mang đoạn gen lạ) ủ với số lượng lớn tế bào vi khuẩn chưa có plasmid Đối với vi khuẩn xử lý CaCL2 lạnh, kèm sốc
nhiệt độ (42oC phút) ADN tái tổ hợp xâm nhập vào tế bào nhiều hơn.
- Đối với tế bào động vật có vú, để thực biến nạp dùng phương pháp hấp thụ ADN qua trung gian phosphate calcium Phương pháp cho hiệu thấp
1.5.2 Điện biến nạp
- Sử dụng dòng điện cao cục theo xung làm tế bào hấp thụ ADN nên gọi điện biến nạp Lúc đầu phương pháp sử dụng động vật có vú, sau cho tế bào thực vật Hiệu biến nạp cao, gấp 10-20 lần so với xử lý hóa chất, đoạn ADN biến nạp có kích thước lớn Tuy nhiên tỷ lệ tế bào chết đáng kể (50-70%) Khó khăn khác phải chế dụng cụ chun biệt tạo dịng điện có điện cao cho khối lượng xử lý nhỏ
1.5.3 Vi tiêm
- Đối với tế bào động vật có vú (thường hợp tử) tiêm thẳng ADN tái tổ hợp vào tế bào Đây phương pháp thơng dụng có hiệu chuyển gen tế bào động vật có vú, tạo động vật nhiễm gen
1.5.4 Bắn ADN vào tế bào.
- Đối với tế bào thực vật, muốn thực biến nạp phải tạo tế bào trần (mất vách tế bào) ADN ngấm vào Việc tạo tế bào trần không đơn giản, tốn công sức thường sức sống tế bào giảm, khó phân chia để tự tái sinh Để khỏi phải làm công việc trên, phương pháp bắn ADN tái tổ hợp trực tiếp vào tế bào thực vật sử dụng Các hạt kim loại (đường kính khoảng micromet) mang ADN RNA bắn với tốc độ nhanh xuyên thủng vách tế bào đưa vào Phương pháp có nhiều ưu dùng nhiều thực vật nhiễm gen Ngoài nhiều phương pháp khác đưa ADN tái tổ hợp vào tế bào:
- Sử dụng màng lipid bao ADN để đưa vào tế bào
(8)- Các vector virus tự động thực tải nạp đưa ADN tái tổ hợp vào tế bào với hiệu suất cao nhiều nên sử dụng rộng rãi tế bào người, động vật thực vật
1.6 Phương pháp PCR
- Vào năm 1985, K Mullis phát phương pháp đơn giản khuyếch đại nhanh nhiều đoạn ADN mà không cần sử dụng tế bào Kỹ thuật gọi polymerase chain reaction (PCR), hiểu phản ứng polymer dây chuyền Sự khuyếch đại PCR thực invitro ống nghiệm plastic nhỏ, khác hẵn với tạo dòng đoạn ADN invitro gắn vào plasmid tế bào vi khuẩn hay nấm men Kỹ thuật ứng dụng nhanh có ý nghĩa cách mạng phát triển sinh học phân tử kỹ thuật di truyền Thực chất phương pháp tạo dịng invitro khơng cần có diện tế bào
1.6.1 Nguyên tắc thực
PCR trình khuyếch đại trình tự ADN đặc hiệu invitro xúc tác enzyme ADN polymerase Sự khuyếch đại nói chung thực nhờ chu trình nhiệt lặp lại (có thể đến 35 lần) gồm: đun nóng (95oC) vịng 30
giây đến phút Đây giai đoạn biến tính; Làm nguội (37 - 65oC), vòng 30 giây
đến phút, cho phép mồi bắt cặp với khuôn, giai đoạn lai; Ủ lâu 72oC
giúp cho ADN polymerase hoạt động tổng hợp Thời gian tùy thuộc vào độ dài trình tự ADN cần khuyếch đại, thường kéo dài 30 giây đến nhiều phút, giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (elongation) Trong dung dịch có primer (đoạn mồi) P1
P2,mỗi loại bắt cặp bổ sung với đầu mạch đơn tương ứng Như vậy, mạch kép
ADN, sau phản ứng ADN polymerase thực thành mạch ADN kép thực chu trình khuyếch đại thành 4, thành theo cấp số nhân
Hình Sơ đồ nguyên tắc phương pháp PCR
(9)Phản ứng thực ống plastic nhỏ, có mẫu ADN, primer ADN polymerase, gắn vào hệ thống nung nóng điều chỉnh thành chu kỳ nung nóng, làm nguội theo chương trình định sẵn, gọi thermocycler (máy PCR)
1.6.2 Các ứng dụng phương pháp PCR - Sản xuất mẫu dò
Trước để sản xuất mẫu dị, cơng cụ khơng thể thiếu phương pháp lai, người ta phải tiến hành qua nhiều giai đoạn-tạo dịng, ni cấy để tạo nhiều sao, đánh dấu mẫu dò Với phương pháp PCR, người ta sản xuất nhanh lượng mẫu dò đánh dấu thực phản ứng với cặp mồi chuyên biệt nucleotid đánh dấu
- Khuyếch đại số lượng RNA
Do Taq polymerase không hoạt động RNA nên người ta sử dụng kỹ thuật phối hợp RT-PCR (Reverse transcriptase-PCR) Trước hết RNA chuyển thành c-ADN nhờ enzyme phiên mã ngược Sau cc-ADN khuyếch đại nhờ Taq polymerase Người ta sử dụng Taq polymerase cho hai giai đoạn
- Định lượng phương pháp PCR
Thường sử dụng để nghiên cứu trình tự (ADN hay RNA) có số lượng thấp, định lượng phương pháp lai phân tử cổ điển Về nguyên tắc người ta xác định số lượng mẫu ban đầu qua tính tốn dựa vào sản phẩm cuối cùng, số chu Nhưng thực tế, người ta định lượng tương đối trình tự đích, tức so sánh hàm lượng nhiều nguồn khác
1.6.3 Các hạn chế phương pháp PCR - Kích thước trình tự cần khuyếch đại
Trừ vài trường hợp cá biệt, phương pháp PCR không hoạt động với đoạn ADN lớn 3kb Việc sử dụng PCR độ dài 1,5 kb cho kết tốt
- Sự ngoại nhiễm
Vấn đề đặc biệt cấp thiết ứng dụng chẩn đốn, dự phịng hậu nghiêm trọng Nguồn ngoại nhiễm lớn sản phẩm khuyếch đại lần trước Người ta chứng minh việc mở nắp ống nghiệm sau lần khuyếch đại khoảng khơng gian kín phịng thí nghiệm sẽ.khiến cho phân tử khuyếch đại thoát khỏi ống nghiêm bay lơ lửng khơng khí, bám vào tường, cửa, thiết bị dụng cụ nhiễm vào phản ứng tiến hành sau
- Các sai sót gây Taq polymerase
Sự chép Taq polymerase cho tỷ lệ sai cao (10-4), có nghĩa 1000
(10)2 KỸ THUẬT GENE TRONG TẠO GIỐNG CÂY TRỒNG, VẬT NUÔI.
Các phương pháp chọn giống lai tạo cổ điển góp phần hình thành nên giống vật nuôi, trồng đa dạng có hiệu kinh tế cao Kỹ thuật gen phát triển tảng hiểu biết sinh học vật nuôi trồng, bao gồm hai hướng chính:
- Phân tích di truyền vật nuôi trồng nhờ ADN marker (các trình tự đánh dấu gen liên kết với tính trạng cần quan tâm)
- Tạo sinh vật chuyển gen
Các ADN marker sử dụng vào việc hình thành đồ gen với vị trí gen mã hóa cho tính trạng mong muốn vật nuôi trồng nhằm phục vụ cho chiến lược lai tạo chọn giống lai tạo theo phương pháp cổ điển Việc tạo sinh vật chuyển gen cho phép đưa vào vật nuôi, trồng tính trạng q mà khơng phải qua q trình chọn lọc lâu dài; phương pháp khơng giúp cải thiện đặc tính sẵn có mà cịn bổ sung dặc tính hồn tồn sinh vật Việc hình thành thư viện gen biện pháp bảo tồn có hiệu nguồn gen tự nhiện giới
2.1 Sử dụng ADN marker phân tích di truyền
Trong phương pháp chọn giống cổ điển, tiêu chọn lọc thuộc kiểu hình, dựa vào tiêu hình thái, sinh hóa tiêu thường không ổn định, chịu ảnh hưởng mạnh yếu tố môi trường Sử dụng thành phần kiểu gen, ADN marker, để chọn giống cho phép bỏ qua biến động không di truyền đồng thời theo dõi biến động di truyền khơng thể kiểu hình (vì nằm đoạn khơng mã hóa gen) Phương pháp có nhiều ưu điểm, cho phép sử dụng nguồn gen mà khơng làm ảnh hưởng đến điều hịa biểu tự nhiên gen Các ADN marker đặc biệt có ích tính trạng mong muốn: có tính di truyền thấp, khó định lượng (tính kháng bệnh ), biểu theo giới tính, biểu muộn trình sống (năng suất trứng, sữa ), Các ADN marker sử dụng vào nhiều mục đích:
- Dùng để đánh giá mức độ biến động di truyền quần thể vât nuôi Nếu mức biến động di truyền cịn cao cần phải tiếp tục chọn lọc để ổn định dòng
- Cho phép đánh giá khác biệt di truyền hai cá thể bố mẹ, Sự khác biệt lớn tính dị hợp tử hệ cao
- Theo dõi hiệu chương trình chọn giống định hướng alen đặc biệt
- Xác định marker locus có liên kết chặt chẽ với tính trạng mong muốn, dùng chọn giống số lượng, đặc biệt tính trạng khó chọn lọc Các ADN marker sử dụng lai tạo chọn giống nhiều gia súc gia cầm thường có liên quan đến tính trạng suất, chất lượng thịt, sức sống cao, thích nghi Ví dụ, người ta xác định locus RN qui định chất lượng thịt lợn nằm nhiễm sắc thể 15, cách marker S0088 18cM (Milan cộng sự, 1985); cịn tính trạng kháng bệnh marek gà có liên quan đến marker nhóm máu thuộc MHC (Major Histocompatibility Complex- phức hợp tương hợp mới) Gần người ta phát sử dụng marker VNTR để phân biệt hai lồi hàu có giá trị kinh tế Ostrea edulis Dicentrarchus labax đồng thời để xác định gen kháng kí sinh trùng O edulis
(11)Về nguyên tắc việc chuyển gen qui định tính trạng mong muốn vào động vật ni khơng có khác so với liệu pháp gen người Tuy nhiên, người việc tác động lên tế bào sinh dục không phép thực ngược lại vật ni lại mục đích cần đạt nhằm tạo dịng động vật chuyển gen (transgenic animal) Các động vật chuyển gen, ban đầu truyền cho hệ cháu đặc tính đặc tính biến đổi Các phương pháp dùng chuyển gen vào tế bào động vật đa dạng thay đổi theo đối tượng tế bào Đối với tế bào sinh dưỡng, người ta dùng phương pháp chuyển gen phức hợp ADN-calcium phosphate hay nhờ vector virus Đối với tế bào sinh dục, sử dụng phương pháp vi tiêm tối ưu Ví dụ, động vật có vú, người ta vi tiêm ADN vào trứng thụ tinh cấy trở lại vào mẹ mang
Vấn đề lớn phương pháp chuyển gen không kiểm sốt vị trí gắn xen gen đưa vào Động vật chuyển gen sử dụng vào nhiều mục đích
- Dùng làm mơ hình thí nghiệm cho việc nghiên cứu bệnh người Người ta tạo dòng chuột chuyển gen mang nhiều rối loạn di truyền kiểu với rối loạn di truyền người Việc nghiên cứu mơ hình chuột chuyển gen cho phép hiểu rõ chế sinh hóa rối loạn di truyền tương ứng Hơn việc thử nghiệm liệu pháp người thiết phải thông qua bước thử nghiệm mơ hình động vật
- Dùng để sản xuất protein với số lượng lớn Người ta ghép gen mong muốn với promotor gen mã hóa cho protein sữa (casein) chuyển vào cừu Sản phẩm gen protein sản xuất với số lượng lớn tiết từ sữa cừu Đây mơ hình thử nghiệm
(12)Hình 55 Hai phương pháp tạo động vật chuyển gen Bên trái: Phương pháp vi tiêm
Bên phải: Dùng tái tổ hợp tương đồng
- Việc chuyển gen góp phần đáng kể vào việc chọn giống động vật vì: + Giúp đưa nhiều tính trạng vào động vật mà trước chưa có
+ Đưa tính trạng có sẵn vào động vật nhanh phương pháp chọn giống thông thường (lai chọn lọc)
Một đóng góp quan trọng chuyển gen động vật tạo động vật mang gen bệnh người làm mơ hình nghiên cứu
(13)- Vi tiêm phương pháp thông dụng ADN bơm thẳng vào hợp tử giai đoạn sớm
- Sử dụng vector virus như: SV40, BPV (bovine paoillomavirus, retrovirus)
- Phương pháp dùng tế bào cuống phôi (stem embryonic cells hay stem cell insertion) Trong phơi có tế bào có khả phân chia mạnh, người ta lấy tế bào ra, thực biến nạp rối cấy trở lại vào phôi
- Phương pháp dùng tinh trùng vector mang gen Nếu bơm ADN vào tinh trùng đưa ADN vào tế bào trứng dễ dàng thụ tinh
2.2.2 Các tính trạng chuyển gen - Các tính trạng suất
Người ta chuyển gen để tăng cường tính trạng suất như: khả chuyển đổi thức ăn cao, tăng chất lượng thịt, sữa, lông giảm mỡ
Nhưng tính trạng kinh tế có di truyền đa gen, nên việc chuyển gen khó Người ta hy vọng tương lai xác định trình tự nucleotide gen động vật, cải thiện tính trạng
- Gen hormone tăng trưởng
Nhiều gen mã hóa cho hormone tăng trưởng chuyển vào vật nuôi với hy vọng giúp tăng trọng nhanh Hiệu thấy rõ chuột: chuột mang gen hormone tăng trưởng người lớn gấp đơi chuột bình thường Ở lợn, người ta tạo dòng mang gen mã hóa hormone tăng trưởng bị Lợn có tốc độ tăng trưởng nhanh hơn, mỡ hơn, lại mang nhiều bệnh
- Kích thích tăng trưởng
Ở gà có gen cSKI kích thích tạo tăng mạnh bình thường, giảm mỡ Người ta đưa gen vào lợn tạo nên giống có nhiều thịt mỡ Những lợn có chân yếu trơn yếu nên cần tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện
- Tăng suất tạo lông (ở cừu)
Trong thành phần lơng có nhiều axit amin, chủ yếu cystein chứa lưu huỳnh (S) tạo nhiều cầu disulfite nên protein lơng có độ cao Nếu cho vào thức ăn nhiều cystein suất lơng cừu khơng cao, thức ăn vào thể qua đường ruột bị vi sinh vật tiêu thụ nên lông không hấp thụ Khi tiêm cystein vào da sản lượng lơng tăng lên nhiều (vì khơng bị vi sinh vật tiêu thụ)
- Sản xuất protein trị liệu quan để ghép
Từ năm 1990, nhiều nơi giới thành công việc chuyển gen người vào cừu, dê, bò Đã thu chế phẩm như: t-pA (tissue plasmonogen activator), α-1- antitrypsin Hiệu việc chuyển gen thấp, thường khoảng 1/1000 hợp tử bơm ADN
2.2.3 Thay gen mục tiêu (gen targeting)
Một thành tựu đáng kể chuyển gen động vật sử dụng tái tổ hợp tương đồng để thay gen mục tiêu tế bào Kỹ thuật cho phép thay gen alen vị trí mong muốn nhiễm sắc thể tế bào thực phôi chuột vào giai đoạn túi phôi (blastocyst)
(14)Phương pháp tạo giống đại gia súc chuyển gen như: bò, dê, cừu từ phôi cho nhiều kết sử dụng rộng rãi Có hai cách đưa gen lạ vào hợp tử: vi tiêm dùng tái tổ hợp tương đồng
- Vi tiêm
Tế bào trứng bò thụ tinh in vitro Ở giai đoạn nhân non (pronucleus), thực vi tiêm đưa ADN gen lạ vào Phôi tạo cấy vào ống dẫn trứng bò mẹ mang thai
- Phương pháp dùng tái tổ hợp tương đồng
Các tế bào nuôi đưa ADN mang gen dùng thay đổi mục tiêu vào dịch ni tế bào Sau đó, tiến hành chọn lọc tế bào thay cho dung hợp với tế bào trứng bị loại nhân Tế bào dung hợp cấy vào bò mẹ
2.2.5 Siêu nỗn cấy truyền phơi
Siêu nỗn cấy truyền phơi hai cơng nghệ gắn liền vào q trình nhằm gây rụng trứng đồng loạt vật cho phôi (donor), tạo thành nhiều hợp tử thu nhiều phôi chất lượng cao, sau đưa phơi tạo vào cá thể khác, vật nhận phôi (recipient), mà phơi sống, phát triển bình thường sở trạng thái sinh lỹ, sinh dục vật nhận phôi phù hợp với trạng thái tương ứng vật cho phơi (đồng pha) Q trình kỹ thuật siêu nỗn cấy truyền phơi bao gồm công đoạn chủ yếu sau đây:
- Chọn vật cho phôi
Kỹ thụật nhằm khai thác triệt để tiềm di truyền cao sản Do vậy, việc chọn vật cho phôi (những vật xuất sắc) vô quan trọng Công việc ảnh hưởng tới suất chất lượng phôi thu
Các vật cho phôi chọn từ đàn hạt nhân, có nhiều đặc điểm tốt, biết rõ nguồn gốc
- Chọn vật nhận phôi
Thường không cần vào phẩm giống, suất vật khơng có vai trị kiểu gen đời sau nên chúng vật “ mang thai hộ” Tuy nhiên chúng có ảnh hưởng lớn đến việc tiếp nhận phơi nuôi con, chọn vật nhận phôi phải đảm bảo tiêu chuẩn: không mang bệnh tật, sinh trưởng, phát triển bình thường, sinh lý sinh sản bình thường
- Tạo chu kỳ động dục cho vật cho vật nhận phôi
Vật cho nhận phôi trước đưa vào sử dụng gây siêu noãn gây động dục đồng pha phải biết ngày biểu động dục trước để ấn định ngày gây siêu noãn vật cho gây động dục đồng pha vật nhận phôi
- Thu hoạch phôi
Vật cho phôi siêu nỗn, phối giống sau thời gian định giội rửa ống dẫn trứng để lấy phôi khỏi thể gọi thu hoạch phơi Có thể dùng phương pháp phẩu thuật không qua phẩu thuật Phôi coi tốt kích thước đảm bảo, có dạng cầu đều, ngun vẹn, tế bào xếp đều, liên kết chặt chẽ, có độ sáng phần
Phôi sau đánh giá, phân loại đem cấy truyền cho vật nhận phôi đồng pha (cấy phôi tươi) hay đem đông lạnh để sau sử dụng (cấy phôi đông lạnh)
(15)Nguyên tắc phôi lấy vị trí cấy trả vào vị trí nhờ súng cấy phơi
Vật nhận phôi sau cấy thời gian, tùy thuộc loài khám để đánh giá kết Đối với bò, thời gian tháng
- Lợi ích siêu nỗn cấy truyền phôi công tác giống gia súc
+ Cho phép phổ biến nhân nhanh giống có suất cao, có đặc tính q sản xuất sở khai thác triệt để tiềm di truyền cao sản thông qua siêu nỗn, lấy phơi, bảo quản phơi cấy truyền
+ Cho phép nâng cao cường độ chọn lọc, đẩy mạnh hiệu công tác giống sở tăng nhanh tiến di truyền
+ Nâng cao khả sinh sản sản phẩm thịt, sữa
Siêu noãn cấy truyền phôi làm tăng số sinh từ cao sản, làm thay đổi nhanh chóng chất lượng đàn giống, khắc phục số trường hợp sinh sản khơng bình thường gia súc cao sản
+ Hạn chế đến mức tối thiểu số lượng gia súc làm giống, từ giảm chi phí khác kèm như: chuồng trại, vật tư, nhân lực
+ Giúp dễ dàng, thuận lợi việc xuất nhập khẩu, vận chuyển, trao đổi giống nước, vùng
+ Đây phương pháp giữ gìn, bảo tồn vật liệu di truyền (phương pháp ex situ)
+ Siêu nỗn cấy truyền phơi hạn chế số dịch bệnh nâng cao khả chống chịu bệnh, khả thích nghi vật môi trường phần lớn bệnh gia súc không lây qua phôi
(16)CHUYÊN ĐỀ 2: GIAO PHỐI CẬN HUYẾT VÀ ƯU THẾ LAI.
Trong thực tế công tác giống trồng, vật nuôi, người ta thường áp dụng biện pháp kỹ thuật chọn lọc, nhân giống lai tạo giống Khi tiến hành nhân giống để tăng số lượng cá thể, tăng độ chủng (giống nhau) để ổn định đặc điểm di truyền dòng, giống, đơi nhận thấy có biểu giảm sút (sức sống, suất ) Khi tiến hành lai tạo giống, dòng, người ta nhận thấy tốt so với bố mẹ Trong chuyên đề này, tìm hiểu nguyên nhân dẫn đến tượng trên, phương pháp xác định mức độ biểu để ứng dụng công tác giống trồng, vật nuôi
1 GIAO PHỐI CẬN HUYẾT (INBEEDING) 1.1 Khái niệm
Là giao phối cá thể có quan hệ huyết thống gần gũi tương tự kiểu di truyền
Ví dụ, giao phối bố mẹ với cái, anh chị em với cá thể họ hàng
1.2 Nguyên nhân 1.2.1 Tự nhiên
- Do kích thước quần thể nhỏ
- Do ảnh hưởng chọn lọc sinh dục - Quần thể cách ly
1.2.2 Nhân tạo
- Do số lượng cá thể đực giữ lại làm giống thường cá thể
- Do yêu cầu công tác giống cần phải tiến hành giao phối cận thân, ví dụ nhân giống theo dịng, tạo giống
- Do quản lý giống không chặt chẽ (đặc biệt thụ tinh nhân tạo) 1.3 Hậu giao phối cận huyết
Giao phối cận thân dẫn đến làm xuất thể đồng hợp (trong có đồng hợp trội đồng hợp lặn) Từ làm cho tỷ lệ cá thể có kiểu gen đồng hợp tăng lên tương ứng tỷ lệ cá thể có kiểu gen dị hợp ngày giảm Sự tăng tần số cá thể có kiểu gen đồng hợp lặn, gen lặn gen gây chết, dẫn đến tượng suy giảm sức sống, tăng kỳ hình dị tật, giảm suất đời so với bố mẹ
Giả sử, quần thể bố mẹ ban đầu có gen A a 100% dị hợp (Aa) Sau hệ giao phối cận thân, số cá thể dị hợp giảm 50% tương ứng số cá thể đồng hợp tăng lên 50% Nếu tiếp tục cho phối cận thân, dị hợp lại giảm tiếp 50% đồng hợp lại tăng lên 50%.(xem phần nội phối chương Di truyền quần thể) Khi xét hậu giao phối cận thân, nhận thấy, bên cạnh xuất đặc điểm có lợi, đơi cịn xuất đặc điểm bất lợi Trong công tác giống gia súc, người ta thường áp dụng biện pháp kỹ thuật để phát huy đặc điểm có lợi, đồng thời hạn chế tác hại giao phối cận thân
1.3.1 Lợi ích giao phối cận hưyết
- Cận huyết loại bỏ gen lặn không mong muốn khỏi đàn giống
(17)- Nhờ cận huyết, dịng gia đình riêng biệt phát triển từ đàn hạt nhân Chọn lọc gia đình tính trạng kinh tế gia súc thực sau gia đình phát triển
- Cận huyết kết hợp với chọn lọc tạo nhiều giống gia súc quí giá
- Nhờ cận huyết xác định giá trị di truyền thực tế cá thể, loại gen tính trạng khác vật ni Ví dụ, hiệu cận huyết lớn tính trạng chứng tỏ ảnh hưởng khơng cộng gộp gen lớn ngược lại
- Bằng cận huyết chọn lọc, nhiều dòng động vật thí nghiệm chuột nhắt, thỏ, chuột lang tạo Các dòng cận huyết vật liệu quí giá để nghiên cứu di truyền đặc tính Chẳng hạn, dịng chuột nhắt tạo có ung thư phổi hay leukenun, có dịng khơng bị loại ung thư - Người ta gây dòng cận huyết cao gia súc gia cầm để lai tạo lai có ưu lai cao
1.3.2 Bất lợi giao phối cận huyết
Phần lớn nhà chọn giống nhà sản xuất gia súc thương phẩm tránh cận huyết cao độ lý sau:
- Cùng với việc gia tăng tần số cường độ cận huyết làm xuất tính trạng khơng mong muốn, đặc biệt tính trạng kiểm sốt gen gây chết nửa gây chết
- Tốc độ sinh trưởng gia súc thường bị giảm sút cận huyết Sự giảm sút lớn dòng cận huyết mức độ vừa phải đàn thương phẩm
- Cận huyết hai loại động vật thí nghiệm động vật nông nghiệp làm giảm hiệu suất sinh sản Do cận huyết, số đực phát triển tinh hồn bị chậm lại số trứng rụng giảm Ở hai giới, cận huyết làm chậm tuổi thành thục, tỷ lệ chết phôi tăng
- Các vật cận huyết có khả sống thấp vật khơng cận huyết Nhìn chung vật cận huyết dễ bị ảnh hưởng stress thay đổi điều kiện môi trường vật không cận huyết
- Nếu cận huyết cao độ dẫn đến suy hóa Đó tượng sinh giao phối cá thể bố mẹ có quan hệ huyết thống gần gũi, đời sinh giảm sức sống, giảm suất, xuất kỳ hình, bệnh tật, chí gây chết gọi tượng suy hóa Các yếu tố ảnh hưởng đến suy hóa:
- Mức độ cận thân cá thể giao phối có quan hệ huyết thống gần mức độ suy hóa cao, ngược lại cá thể giao phối có quan hệ huyết thống xa mức độ suy hóa thấp
- Tính trạng xem xét có hệ số di truyền thấp mức độ suy hóa cao, ngược lại tính trạng có hệ số di truyền cao mức độ suy hóa thấp
- Điều kiện ni dưỡng mức độ suy hóa cận huyết cao, ngược lại điều kiện ni dưỡng tốt mức độ suy hóa thấp
(18)Năm 1920, Wright đưa cơng thức tính độ cận thân, gọi hệ số đồng huyết
2 ƯU THẾ LAI (HETEROSIS) 2.1 Khái niệm ưu lai
Ưu lai tượng lai hai bố mẹ khác di truyền (khác giống, dòng ) lai F1 tỏ ưu việt bố mẹ chúng mặt sinh trưởng, sức chống
(19)bên ngồi Tất điều dẫn đến nâng cao tính trạng có lợi, tính trạng kinh tế (tốc độ sinh trưởng, độ hữu thụ, suất )
2.2 Các biểu ưu lai
Trong chăn nuôi gia súc, xuất ưu lai đa dạng phức tạp Có thể liệt kê dạng ưu lai có gặp sau:
- Con lai F1 vượt bố mẹ thể trạng sức sống, khả sinh sản bình
thường đơi cịn tốt bố mẹ Thể lai lạc đà bưới với lạc đà hai bưới; lai loại bò chuyên dụng thịt
- Khi lai giống lợn, gà hướng trứng với gà thịt-trứng gà Leughorn với gà Newhampshire, Plymouth rock, Australop sức sản xuất lai F1
chiếm vị trì trung gian thể trọng, vượt bố mẹ độ hữu thụ khả sống - Con lai F1 vượt bố, mẹ thể chất vững chắc, tuổi thọ, sức làm việc, song lại (hoàn toàn phần) khả sinh sản, điển hình lai ngựa lừa bất dục hoàn toàn Song, lai bò nhà với loại bò rừng Yak, Bison bison số loài thuộc lớp chim có giới dị giao tử bất dục, cịn giới đồng giao tử hồn toàn hữu dục
- Dạng ưu lai đặc biệt, tính trạng tách cách riêng rẽ F1 trung gian, sức sản xuất cuối lại thấy có ưu lai điển hình Ví dụ, lai bị Holstein Friesean (Lang trắng đen) với bò Jersey người ta thấy sản lượng sữa tỷ lệ mỡ sữa, lai F1 chiếm vị trí trung gian, sức sản xuất cuối (tổng lượng mỡ) lại thấy vượt trội bố, mẹ
- Một dạng ưu lai khác vật nuôi sức sản xuất lai không cao cha mẹ loại tốt cao tiêu trung bình hai giống gốc Loại chưa nhiều người thừa nhận
2.3 Cơng thức tính ưu lai
Ưu lai biểu thị theo sơ đồ sau:
Như vậy, d = khơng có ưu lai
d < a trường hợp trội khơng hồn tồn d = a trường hợp trội hoàn toàn
(20)X F1 giá trị trung bình tính trạng lai F X p1 giá trị trung bình tính trạng bố, mẹ X p2 giá trị trung bình tính trạng bố, mẹ
2.4 Cơ sở di truyền ưu lai
Như biết ưu lai tượng sinh học phức tạp loài người biết sử dụng từ lâu, song sở sinh học chưa hoàn toàn sáng tỏ Sau số giả thuyết giải thích sở di truyền tượng
2.4.1 Thuyết tập trung gen trội có lợi
Theo thuyết này, tiến hóa quần thể xẩy tác động chọn lọc tự nhiên mà nhân tố di truyền tác động có lợi lên sinh trưởng, sức sản xuất trội trội khơng hồn tồn, cịn nhân tố tác động bất lợi lên chúng lặn Trong quần thể ngẫu phối, gen trội có lợi thường trạng thái dị hợp Nhưng tự thụ phấn hay giao phối cận huyết, quần thể bị phân hóa thành dịng mà gen hay gen khác chuyển sang trạng thái đồng hợp Lúc đó, dịng khác đồng hợp theo gen trội có lợi khác Nếu lai dịng dẫn đến lai F1 có số nhân tố trội điều khiển tính trạng lớn so với dịng cha mẹ, nhờ xuất ưu lai
Giả sử, có locus gen tham gia vào hình thành tính trạng kinh tế Cho alen lặn đóng góp đơn vị alen trội đóng góp đơn vị vào kiểu hình Phép lai dịng cận huyết tạo lai F1 có suất cao so với dịng cha mẹ (ưu lai) sau:
P Kiểu gen AabbCCddEE x aaBBccDDee Giá trị kiểu hình + + + + = + + + + = F1 Kiểu gen AaBbCcDdEe
(21)Như vậy, ưu lai hiệu việc tập trung gen trội có lợi khơng alen lai F
1
2.4.2 Thuyết dị hợp siêu trội
Một quan niệm khác mà theo tính dị hợp theo nhiều gen sở ưu lai (Shull, 1908, 1952, East, 1908, 1919, Hayes, 1952 ) Người ta cho rằng, alen khác gen thể dị hợp quan trọng trình tổng hợp hóa sinh tốt so với alen đồng hợp, đảm bảo tính đa dạng cần thiết chức sinh lý cho phát triển thể
Giả thuyết siêu trội Shull đưa vào năm 1914 phát triển thuyết dị hợp Theo thuyết này, tương tác alen trạng thái dị hợp mạnh so với alen trạng thái đồng hợp, kết hiệu ứng ưu lai lai F1 lớn tất hiệu ứng alen hai bố mẹ Bởi vì, alen q trình tổng hợp hóa sinh thực chức khác nhau, thể dị hợp (có alen khác nhau) chức khác gây nên hiệu ứng bổ sung lẫn Hiện tượng bổ sung thể rõ di truyền học thực nghiệm di truyền học hóa sinh Emerson (1952) sở nghiên cứu nấm Neurospora crasa đưa mơ hình chất hóa sinh ưu lai Neurospora crasa sinh vật đặc trưng đơn bội vật chất nhân, song cấy chung chủng khác thành phần nhân tế bào chuyển sang tế bào khác tạo nên tế bào có hỗn hợp hai thành phần nhân gọi thể dị nhân Emerson so sánh sinh trưởng hai tập đoàn xuất phát môi trường tối thiểu: đột biến thiếu sulphamid (sfo, +) đột biến thiếu paraamino benzoic acid (+, pab) với thể lai dị nhân chúng Chủng đột biến thứ tổng hợp methionine paraamino benzoic acid không tổng hợp đủ số lượng cần thiết treonine Chủng kia, ngược lại tổng hợp đủ threonine không tống hợp đủ methionine paraamino benzoic acid, chủng phát triển môi trường tối thiểu Song thể dị nhân, thu từ việc “lai” hai chủng hai dạng chất nhân bổ sung cho nên chúng sinh trưởng hoàn toàn tốt mơi trường
Một ví dụ khác biết rộng rãi di truyền y học nhiều vùng Châu Phi Ấn Độ có xuất đột biến làm thay đổi amino acid phân tử hemoglobin làm hồng cầu có dạng hình lưỡi liềm Ở trạng thái đồng hợp, đột biến dẫn tới dạng thiếu máu đặc biệt có hiệu gây chết Song người mang đột biến trạng thái dị hợp khơng hồn tồn có khả sống mà cịn có tính bền vững cao, chống lại dạng có hại sốt rét địa phương
(22)Kết khảo nghiệm tiến hành động vật thực vật cho thấy khác lai phép lai tương hổ (thuận nghịch)
Ví dụ, lai ngựa lừa cho lai khác Những sai khác do:
+ Hợp tử lai lai tương hổ khác chất, phụ thuộc chủ yếu vào cấu trúc tế bào chất xác định thể mẹ
+ Do đặc điểm đặc thù ảnh hưởng sinh lý lên đời từ phía mẹ Nhìn chung, mối quan hệ vai trị nucleic acid quan tử bào chất ty thể, lạp thể đóng vai trị quan trọng Chúng tham gia trực tiếp vào biểu ưu lai, đồng thời tương tác với gen nhân bào việc làm xuất ưu lai
2.4.4 Ưu lai khả phối hợp
Ưu lai tượng sinh học phức tạp mà loài người biết sử dụng sản xuất từ lâu, song nay, khoa học cịn chưa hồn thiện phương pháp dự đoán trước tổ hợp cặp cha mẹ cho kết tốt Chính mà mạng lưới lớn quan khoa học nước khác xây dựng để tìm tổ hợp giống, dòng động vật cho ưu lai cao (có khả phối hợp cao) cho địa phương
Như vậy, khái niệm khả phối hợp di truyền cặp bố mẹ có liên quan chặt chẽ đến tượng ưu lai Những nghiên cứu vấn đề bắt đầu Mỹ ngô vào năm 1952 Các tác giả phân chia thành hai khái niệm khác nhau:
+ Khả phối hợp chung (General combining ability) khả dịng, gia đình cá thể cho ưu lai với tất dịng, gia đình khác Vì tính giá trị ưu lai trung bình tất tổ hợp lai với tham gia dịng, gia đình
+ Khả phối hợp đặc biệt (Special combining ability) khả dịng, gia đình cho ưu lai lai với dịng, gia đình định Khả phối hợp biểu thị biểu thức toán học sau:
H (AB) = GC (A) + GC (B) + SC (AB) Trong đó,
H (AB) sức sản xuất xác định di truyền lai AB GC khả phối hợp chung
SC khả phối hợp đặc biệt
Trong nhân tố di truyền gen có tác dụng cộng gộp át chế có ảnh hưởng mạnh mẽ lên GC, SC phụ thuộc vào ảnh hưởng át chế nhân tố trội Ngồi gen khơng cộng gộp khác có ý nghĩa ảnh hưởng SC Nhiều thí nghiệm cho thấy vai trị SC tăng với việc tăng mức cận huyết phân hóa di truyền dịng cha mẹ ban đầu Điều có liên quan chặt chẽ với khả dự đoán kết lai sở tiêu dạng cha mẹ
2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến ưu lai
Mức độ biểu ưu lai phụ thuộc vào yếu tố sau:
(23)- Hệ số di truyền tính trạng nghiên cứu, nhìn chung tính trạng có hệ số di truyền cao mức độ biểu ưu lai thấp ngược lại, tính trạng có hệ só di truyền thấp mức độ biểu ưu lai cao
(24)CHUYÊN ĐỀ 3:
TẠO GIỐNG BẰNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT. 1 Tế bào lai kháng thể đơn dòng
Kỹ thuật tế bào lai mở đường miễn dịch học, để sản xuất hàng loạt vacxin Kỹ thuật tế bào lai tạo phịng thí nghiệm cách cho lai hai loại tế bào sinh kháng thể với loại tế bào ung thư
Trước phương pháp cổ truyền để sản xuất vacxin dùng tiêm chủng, tức tiêm kháng nguyên vào thể động vật thu kháng thể tạo thành huyết thanh, làm thành kháng huyết Chất lượng kháng huyết phụ thuộc vào hàm lượng kháng thể tạp chất lại
Gần người ta tạo kháng thể nuôi cấy tế bào, theo hướng phải định kỳ làm lại sau lần thu hoạch, điều kiện ni cấy, tình trạng tế bào dễ tiếp giáp nên thường tế bào phân chia số lần sau khơng tiếp tục Hiện với công nghệ di truyền, người ta giải khó khăn nêu trên, phát sử dụng loại tế bào ni cấy có khả phân chia khơng ngừng
Như biết, phân ly nhiễnm sắc thể q trình sinh sản tế bào ni cấy tiến hành qua nguyên phân Thường dòng tế bào cháu sinh từ tế bào, gọi dịng hay từ số tế bào loại tổ chức
Để có dịng tế bào có khả phân chia liên tục, người ta dã sử dụng loại tế bào ung thư Cho lai tế bào ung thư với loại tế bào động vật có vú với chức sản sinh kháng thể, tạo tế bào lai ni cấy, sinh sản liên tục để tạo khối lượng lớn kháng thể So với loại kháng thể thu thông qua vật nuôi cừu, ngựa, thỏ , loại kháng thể tuyệt đối tinh khiết
Hiện nhiều phịng thí nghiệm sử dụng phương pháp cho lai tế bào lách chuột nhắt miễn dịch (tạo kháng thể) với tế bào u tủy xương Tế bào lai sinh có khả phân chia bình thường, liên tục, tạo loại kháng thể có khối lượng lớn, đặc trưng cho dịng tế bào, gọi kháng thể đơn dòng
Sử dụng kháng thể đơn dịng nhanh chóng thay phương pháp miễn dịch huyết học thông thường Nhờ tính đặc hiệu xác cao, sử dụng dễ dàng, kháng thể đơn dòng tạo hướng phát triển mạnh mẽ công nghệ tế bào
2 Lai khác loài tế bào soma động vật
Năm 1960, người ta chứng minh, ni cấy chung tế bào thuộc hai dịng khác nhau, chúng kết hợp với tạo thành tế bào lai, chứa gen hai tế bào ban đầu Những tế bào lai thu thí nghiệm kết hợp ni cấy tế bào dịng khác thể chuột Sau đó, ngồi tế bào lai lồi, người ta cịn thu tế bào khác loài lai chuột nhắt với chuột cống, chuột nhắt với gà chuột nhắt với người
(25)chủ, tiểu phần có kích thước nhỏ nên chúng làm cầu nối hai tế bào từ hình thành thể lưỡng hạch hai nhân Sau hai hạch hịa với nhau, tạo thành nhân hợp chứa nhiễm sắc thể hai tế bào gốc ban đầu Gần người ta sử dụng xung điện cao áp thúc đẩy dung hợp hai tế bào
3 Tạo dòng vơ tính vấn đề nhân động vật 3.1 Khái niệm
Vấn đề tạo dịng vơ tính phát triển ngày cơng nghệ sinh học đại, công nghệ di truyền, công nghệ xuất phát từ khái niệm sinh học
Sinh sản hữu tính hình thức sinh sản phổ biến sinh giới, sinh sản vơ tính tồn thể có cấu trúc tương đối đơn giản, thấy nhiều thực vật, sinh sản sinh dưỡng, dâm cành
Ở động vật bậc cao, sinh sản vơ tính tồn giai đoạn phát triển sớm hình thức biến dạng sinh sản hữu tính, hình thức đơn tính sinh, trinh sinh
3.2 Tạo dịng vơ tính động vật
Nói cách đơn giản kỹ thuật nhân nhiều cá thể từ tế bào vơ tính Năm 1952, Robert Briggs Thomas King thành cơng thí nghiệm, nhân trứng (nỗn bào) ếch thay nhân lấy từ tế bào phôi ếch khác Trứng tiếp tục lớn lên, phát triển ếch trưởng thành, di truyền giống hệt ếch cho nhân Bằng kỹ thuật này, người ta sản xuất số lượng lớn ếch giống hệt mặt di truyền Thành cơng thực nghiệm nói chứng minh cho giả thuyết tế bào phôi sớm, hình thành chứa đựng nhân tố cần cho phát triển đầy đủ cá thể Nhưng với động vật bậc cao (có vú) vấn đề cịn khó khăn, khơng phải đơn giản lưỡng thê, không đơn giản cà rốt, phong lan mọc lên từ tế bào nuôi cấy Tạo dịng vơ tính (clon) bao hàm tồn kỹ thuật nêu trên, tạo tập hợp thể giống hệt mặt di truyền
3.2.1 Cơng trình tạo cừu Dolly
(26)
Hình Cừu Dolly
Sống tử cung “của mẹ nuôi hộ” lông đen, cừu Dolly có lơng trắng Các phân tích, kiểm tra di truyền xác nhận, cừu Dolly cừu Finn Dorset, cừu cung cấp tế bào tuyến vú Cừu Dolly sinh ngày 5-7-1996, có trọng lượng bình thường, khơng có biểu dị dạng thực nghiệm trước Thành công chứng tỏ, thực nghiệm có động vật có vú lớn nhân từ tế bào soma mà khơng cần có tác động tế bào sinh dục , ngồi sinh chất nỗn bào
Về chất lượng nói chung, nhân từ tế bào soma tạo đực, ưu việt theo ý muốn Tuy nhiên vấn đề cần tiếp tục kiểm tra vai trò bào chất trứng (noãn) dung hợp với tế bào soma (tuyến vú) Bản chất trứng nhận nhân chuyển vào khởi động cho phát triển phôi, phải làm rõ chuyển genom mẹ vào genom phôi diễn Vai trị tế bào chất nỗn thực nghiệm dung hợp Hiện cần phải làm rõ, có chuyển đổi phân tử bào chất noãn với nhân chuyển đến Với phát triển công nghệ sinh học đại, công nghệ di truyền, thuật ngữ clone cloning bao hàm khái niệm mở rộng, dòng gen, tạo dòng tách dòng gen; kỹ thuật phân lập gen quan trọng, cần thiết, qua vector đưa gen vào thể vật chủ, vi khuẩn, nấm men biến vật chủ thành nhà máy tổng hợp sản phẩm gen trên, enzym, hormon để sản xuất sản phẩm sinh học insulin, interferon, somatostatin
3.2.2 Chuột nhân
Các nhà khoa học thuộc Viện nghiên cứu nông nghiệp quốc gia Pháp tuyên bố nhân thành công chuột lẫn chuột đực Như vậy, loài gặm nhấm thức gia nhập danh sách động vật nhân từ tế bào trưởng thành
(27)Chuột tiến hoá để sinh sản nhanh trứng chúng bắt đầu kích hoạt rời buồng trứng Điều có nghĩa trứng chín q nhanh nên chun gia khơng có đủ thời gian để rút nhân Họ buộc phải tìm kỹ thuật vượt qua trở ngại
Để nhân chuột, nhà nghiên cứu lấy trứng số cá thể chuột cho trứng tiếp xúc với loại protein Protein dừng trình kích hoạt trứng để trứng khơng chín q nhanh Bằng cách đó, họ rút ADN (nhân) trứng thay ADN lấy từ tế bào trưởng thành Tế bào trưởng thành chích từ phơi chuột
Kỹ thuật gọi chuyển nhân tế bào xoma sử dụng để nhân cừu Dolly Kết họ thu 129 phơi sống
Hình 2. Chuột nhân
bản
Việc nhân chuột nhằm mục đích hồn thiện kỹ thuật nhân người Theo nhóm nghiên cứu, thành cơng giúp giới khoa học dễ dàng tạo chuột bị mắc bệnh giống người, phục vụ trình nghiên cứu nhằm tìm phương pháp điều trị hiệu hơn, cụ thể thử nghiệm thuốc liệu pháp Sau đó, phơi sống phân chia cấy vào tử cung chuột (65 phôi vào cá thể chuột 64 phơi cịn lại vào khác)
Tuy nhiên, việc nhân động vật khác, tỷ lệ thất bại cao Hai bà mẹ sinh chuột Một chết sau chào đời Chuột sống sót giống hệt tế bào trưởng thành mặt di truyền
Kỹ thuật lặp lại tạo chuột khoẻ mạnh Theo Fraichard, thành viên nhóm nghiên cứu, chuột nhân ''phát triển bình thường trưởng thành'' Hai hệ chuột khỏe mạnh chào đời sau nhóm nghiên cứu cho cặp chuột nhân giao phối với
(28)truyền người Tuần trước, nhà khoa học Mỹ tuyên bố nhân người vào cuối năm
3.2.3 Hươu nhân
Con hươu đặt tên ''Dewey'' Nó chào đời vào tháng 5, năm 2004 Tuy nhiên, hơm (23/12), nhóm nghiên cứu tuyên bố thành công họ phải tiến hành phân tích ADN để khẳng định có gen giống hệt gen hươu cho tế bào
Mark Westhusin, trưởng nhóm nghiên cứu thuộc Đại học Texas A and M, cho biết: ''Dewey phát triển bình thường dường khoẻ mạnh'' Nó hươu nhân thành công
Hình Hươu nhân bản
Hươu trắng động
vật lớn, sinh sống nhiều phạm vi rộng lớn Bắc Mỹ Trước đây, nhóm nghiên cứu nhân bò
Angus kháng bệnh, bò Brahma, dê Boer, lợn mèo Với lồi nhân bản, nhóm hiểu thêm nhiều điều cơng nghệ mục đích học làm cho hiệu
Để tạo Dewey, nhà khoa học trích da hươu đực Nam Texas tiêm ADN vào trứng rút nhân hươu khác Sau đó, họ cấy phơi vào tử cung hươu Theo Westhusin, ông đặc biệt quan tâm theo dõi phát triển Dewey gạc Ơng nói: ''Sự phát triển gạc hươu độc vơ nhị''
3.2.4 Bị nhân
Các nhà khoa học Australia khẳng định họ người nhân bò theo phương pháp mới, nhằm cho phôi khoẻ mạnh Sản phẩm Brandy, bê tháng tuổi giống Holstein-Fresian chào đời hồi tháng 12 vừa qua
Cơng trình Viện Nghiên cứu Y học Monash Melbourne hợp tác với Cơ quan gen học Australia thực Trưởng nhóm Vanessa Hall cho biết lần họ sử dụng kỹ thuật chuyển nhân chuỗi để nhân bò
Các nhà khoa học trộn chất dinh dưỡng lấy từ trứng thụ tinh vào phôi nhân bản, trước đặt phôi vào tử cung bà mẹ thay thế, nhờ thúc đẩy việc tái tổ chức ADN "Bằng việc bổ sung thêm chất dinh dưỡng vào phôi nhân bản, cải thiện chất lượng phôi"
(29)thai Phương pháp dùng việc nhân nhiều động vật, cừu Dolly vào năm 1997, phơi cấy ghép sống sót qua thời kỳ thai nghén Nguyên nhân tượng trục trặc việc tái lập trình, ảnh hưởng đến phát triển bào thai
Nhóm nghiên cứu cho kỹ thuật thích hợp để nhân rộng gen tốt bầy, cải thiện chất lượng sữa bò
3.2.5 Ngựa nhân
Các nhà khoa học thuộc Phịng thí nghiệm cơng nghệ sinh sản Milan, Italia, thành công việc nhân ngựa giới Con ngựa tên gọi Prometea chào đời cách 10 tuần dường hoàn toàn khoẻ mạnh
Để tạo Prometea, nhà khoa học sử dụng kỹ thuật chuyển hạt nhân, phương pháp dẫn tới đời cừu Dolly - động vật có vú nhân giới Họ lấy tế bào da từ ngựa Ảrập chủng, trưởng thành, kết hợp ADN tế bào với trứng rút nhân ngựa khác Tiếp đến, phôi cấy trở lại tử cung ngựa Ảrập sau nuôi phịng thí nghiệm vài ngày
Trong số 841 phơi tạo ra, có phơi đực, 14 phôi phát triển tới giai đoạn ''túi phôi'' sơ khai sau ngày ni phịng thí nghiệm 17 phôi cấy vào tử cung ngựa song có ca mang thai Prometea, chào đời sau 336 ngày, ngựa sống sót
Hình 4.
Ngựa nhân
bản
(30)Cesare Galli, trưởng nhóm nghiên cứu, nhận xét đời tình trạng khoẻ mạnh Prometea làm họ ngạc Các động vật nhân trước đây, bao gồm cừu Dolly, nhận ADN từ cá thể trưởng thành song lại nuôi động vật mang thai hộ, khơng có quan hệ với chúng (ADN lấy từ động
vật cần nhân tiêm vào trứng rút nhân cá thể lồi Sau đó, phơi cấy vào tử cung động vật cho trứng - bà mẹ mang thai hộ) Điều có nghĩa gene động vật nhân hoàn toàn khác biệt với mẹ sinh chúng Tuy nhiên, Prometea lại nuôi tử cung ngựa cho ADN
Thành cơng thách thức quan điểm để phôi thai sống sót, phơi cần hệ miễn dịch bà mẹ thừa nhận khác biệt Sự kiện có ý nghĩa quan trọng giới khoa học nhân thêm loài động vật ngồi cừu, chuột, bị, dê, thỏ, mèo, lợn, lừa Nhân ngựa khó khăn chuyên gia bỏ nhiều công sức nghiên cứu Con la nhân có tên Idaho Gem chào đời đầu năm Mỹ, nhiều năm sau giới khoa học nhân thành cơng bị, dê lợn Galli cho biết, kỹ thuật tạo Prometea, giới khoa học nhân ngựa thiến đoạt giải vơ địch đua Ơng nói:
''Mọi người quan tâm tới việc nhân động vật chúng sinh sản bị thiến trẻ'' Tuy vậy, quy định cấm ngựa nhân tham gia đua Ngoài ra, khơng có đảm bảo hệ ngựa nhân đoạt chức vô địch
Sự kiện Prometea chào đời làm dấy lên lo ngại phụ nữ sinh giống hệt họ Nếu kỹ thuật thành công ngựa, hiệu người Tuy nhiên, không nên lo lắng nhân người hành vi bất hợp pháp nhiều quốc gia
3.2.6 Lợn nhân
Cơng trình nghiên cứu Trường Đại học Missouri Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ cho thấy lợn choai nhân (cloning) khơng có hệ miễn dịch tự nhiên để chống bệnh lợn không cloning
Các nhà khoa học cho lợn cloning (chúng nhân Trường Đại học Missouri) tiếp xúc với độc tố phát sinh tự nhiên (có tên lipopolysaccharide) lúc với 11 lợn nguồn gen khơng cloning
Hình Lợn nhân bản
Những lợn không cloning đáp ứng
(31)protein tự nhiên (gọi cytokine) để đề kháng lây nhiễm (con vật cần phải sản sinh đủ cytokine để sống vượt qua lây nhiễm)
Những lợn, bò cloning, có tỉ lệ chết lúc sơ sinh cao so với vật khơng cloning, nhiều chết nhiễm khuẩn
Lúc sinh, lợn cloning khơng cloning, tiếp nhận khả phịng bệnh thông qua tiêu thụ sữa đầu, vật chất tự nhiên sữa mẹ truyền cho con Sữa đầu giúp cho non phòng vệ hệ miễn dịch thân bắt đầu hoạt động
Các nhà khoa học khuyến cáo lợn cloning dùng nghiên cứu không dùng làm thực phẩm
3.2.7 Mèo nhân giới
Một cô mèo nhà tháng tuổi, ngộ nghĩnh, xinh xắn với biệt danh “Cc”, vừa chào đời Mỹ Đây thành cơng chương trình thí nghiệm nhằm giúp người có vật yêu quý họ.“ Cô bé chào đời khỏe mạnh dường hồn tồn bình thường”, nhà nghiên cứu Mark Westhusin cộng ĐH Texas A&M cho biết Mèo ta làm dài thêm danh sách động vật nhân từ tế bào trưởng thành, bắt đầu với cừu Dolly, lợn, dê, bò, chuột sinh vật giống bò - ming
Các nhà khoa học tạo Cc cách cấy ADN từ mèo tam thể vào tế bào trứng ã bỏ nhân Sau đó, họ cấy phơi vào tử cung mèo mướp thay Cc đời với màu lơng sản phẩm nhân Nó trơng gần giống bà mẹ di truyền (bà mẹ thực), lại khác với mèo mướp sinh (mẹ thay thế) Các nhà khoa học cho rằng, nguyên nhân tượng màu lơng khơng yếu tố gene quy định, mà ảnh hưởng điều kiện tử cung Trong số 87 phôi nhân cấy ghép, Cc sống sót
Hình Mèo nhân bản.
Con mèo bên trái (1) bà mẹ di truyền (cho nhân) Bên phải (2) Cc mẹ thay
3.2.7 Chó nhân
(32)khoẻ mạnh sau 16 ngày Chú cún Snuppy gia nhập danh sách động vật nhân toàn giới, bao gồm cừu Dolly, mèo CC chuột Ralph Các nhà khoa học hy vọng việc nhân chó giúp họ tìm cách điều trị số bệnh nguy hiểm người
"Chó có nhiều tính cách giống người", nhà nghiên cứu đứng đầu Woo Suk Hwang Đại học Quốc gia Seoul, phát biểu "Một số bệnh chúng tương tự Vì nhân chó thành cơng giúp ích nhiều việc tìm phương pháp chữa bệnh cho người Đây mục tiêu nghiên cứu chúng tơi"
Hình Chó nhân bản.
Snuppy tạo từ tế bào tai chó săn đực tuổi Các nhà khoa học lấy chất liệu gene từ tế bào tai đặt vào tế bào trứng rỗng Trứng kích thích để phân chia phát triển thành phơi thai Khi đó, đưa vào thể mẹ, chó tha mồi lơng vàng Chú chó Afghan sinh sau 60 ngày nằm bụng mẹ
Nhiều loài động vật khác nhân thành công, việc nhân chó vơ khó khăn Nhóm Hàn Quốc giữ bào thai số 1.000 phôi thai chuyển sang 123 bà mẹ thay Trong số đó, bị sảy thai, chết sau sinh, Snuppy cịn sống sót