Nghiên cứu tạo đột biến khử độc và biểu hiện gen mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp taphylococcal enterotoxin b (seb) phục vụ cho việc chế tạo kít phát hiện tụ cầu vàng trong thực phẩm ”

i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC -* - PHAN THỊ HOÀNG HẢO NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN KHỬ ĐỘC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) PHỤC VỤ CHO VIỆC CHẾ TẠO KÍT PHÁT HIỆN TỤ CẦU VÀNG TRONG THỰC PHẨM Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 604280 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS NCVC Chu Hoàng Hà Thái Nguyên, Năm 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu nhóm cộng nghiên cứu phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học thực từ tháng tới tháng năm 2010 Hà Nội, ngày 27 tháng 09 năm 2010 Học viên ký tên Phan Thị Hồng Hảo Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii LỜI CẢM ƠN Trước hết tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS NCVC Chu Hoàng Hà, TS Nguyễn Hữu Cường, TS Phạm Bích Ngọc phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học tận tình hướng dẫn dìu dắt tơi q trình nghiên cứu hồn thành khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn TS Nghiêm Ngọc Minh cho phép tham gia thực đề tài “Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B (SEB) phục vụ cho tạo kít phát nhanh ngộ độc thực phẩm độc tố tụ cầu vàng” Trong q trình nghiên cứu vừa qua, tơi nhận giúp đỡ bảo tận tình TS Lê Văn Sơn, TS Lâm Đại Nhân, CN Hoàng Hà, Ths Lê Thu Ngọc cán phòng Công nghệ tế bào thực vật bạn sinh viên phịng Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học, Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên, Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu Trường Viện Bên cạnh đó, tơi xin cảm ơn người thân gia đình bạn bè tạo điều kiện động viên giúp đỡ vật chất tinh thần để tơi hồn thành luận văn Một lần xin chân thành cảm ơn! Phan Thị Hồng Hảo Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv MỤC LỤC Trang CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC HÌNH xi MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình bệnh ngộ độc thực phẩm Saphylococcus aureus độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B giới Việt Nam 1.1.1 Khái quát bệnh ngộ độc thực phẩm 1.1.2 Tình hình dịch bệnh ngộ độc thực phẩm Saphylococcus aureus độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B giới Việt Nam 1.2 Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus 1.2.1 Đặc điểm phân loại 1.2.2 Đặc điểm vi khuẩn học 1.2.2.1 Hình dạng kích thƣớc 1.2.2.2 Độc tố khả gây bệnh 1.2.3 Hệ gen tụ cầu vàng Staphylococcus aureus 10 1.3 Nội độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B 10 1.3.1 Cấu trúc phân tử staphylococcal enterotoxin B 10 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v 1.3.2 Cơ chế gây độc staphylococcal enterotoxin B 12 1.3.3 Staphylococcal enterotoxin B tái tổ hợp tiềm ứng dụng 14 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Vật liệu, trang thiết bị dụng cụ nghiên cứu 16 2.1.1 Chủng vi khuẩn plasmid 16 2.1.2 Các kít 16 2.1.3 Hóa chất, máy móc thiết bị 16 2.1.4 Môi trƣờng đệm 17 2.1.5 Cặp mồi sử dụng 17 2.1.6 Phần mềm 17 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 17 2.2.2 Các phƣơng pháp nghiên cứu 18 2.2.2.1 Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 18 2.2.2.2 Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) 20 2.2.2.3 Phƣơng pháp xử lý enzym hạn chế 20 2.2.2.4 Phƣơng pháp tinh ADN từ gel agarose 22 2.2.2.5 Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào vector 23 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vi 2.2.2.6 Phƣơng pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào vi khuẩn Escherichia coli DH5α 24 2.2.2.7 Phƣơng pháp tách ADN plasmid từ tế bào vi khuẩn Escherichia coli DH5α 24 2.2.2.8 Biểu protein staphylococcal enterotoxin B tái tổ hợp tế bào vi khuẩn Escherichia coli chủng BL21(DE3) 26 2.2.2.9 Phƣơng pháp điện di protein gel polyacrylamide 26 2.2.2.10 Phƣơng pháp tinh protein 27 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Kết nhân gen seb phục vụ cho thiết kế vector biểu 29 3.1.1 Thiết kế mồi 30 3.1.2 Kết PCR nhân gen seb 31 3.1.3 Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le gen seb 32 3.2 Kết thiết kế vector biểu pET21a+ mang gen seb đột biến 34 3.2.1 Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le pET21a+ 34 3.2.2 Phản ứng gắn đoạn gen đích seb vào vector biểu 36 3.2.3 Kết kiểm tra vector tái tổ hợp phản ứng colony-PCR 37 3.2.4 Kết kiểm tra plasmid tái tổ hợp enzym hạn chế 38 3.2.5 Kết giải trình tự gen seb đột biến vector biểu …… ……….……40 3.3 Kết biểu gen mã hóa cho protein SEB tái tổ hợp 39 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vii 3.3.1 Biến nạp vector tái tổ hợp pET21a+/SEB vào Escherichia coli chủng BL21(DE3) 40 3.3.2 Kiểm tra biểu gen seb 41 3.3.3 Tối ƣu điều kiện biểu gen seb 43 3.3.4 Tinh protein tái tổ hợp SEB 47 KẾT LUẬN 49 KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn viii CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Deoxyribonucleic acid APS Ammonium persulphate ARN Ribonucleic Acid bp Base pair cs Cộng dH2O Nước khử ion dNTP Deoxyribonucleotide EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit IPTG Isopropylthio--D-galactoside Kb Kilobase LB Luria and Bertani PBS Phosphate buffer saline PCR Polymerase Chain Reaction S aureus Staphylococcus aureus SDS Sodium dodecyl sulfate SEB Staphylococcal enterotoxin B SEs Staphylococcal enterotoxins v/p Vòng / phút Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ix Bảng Tên bảng Trang 1.1 Sơ tình hình nhiễm độc tụ cầu vàng toàn quốc từ 2007 – 2009 2.1 Chu kì phản ứng PCR 20 2.2 Cơng thức pha gel tách (12%) 27 2.3 Công thức pha gel cô (5%) 27 3.1 Trình tự cặp mồi nhân đoạn gen seb đột biến từ vector GS45350 31 DANH MỤC BẢNG Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn x Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 41 Hình 3.11 Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen seb cặp mồi mSEB- F R M: thang ADN chuẩn kb; – 8: Sản phẩm PCR từ plasmid dòng khuẩn lạc BL21(DE3) từ tới 8; (-): Đối chứng (-); 9: Đối chứng (+) sản phẩm PCR cặp mồi đặc hiệu khuôn mẫu plasmid pET21a+/SEB tách từ dòng số DH5α Kết thu hình 3.11 cho thấy tất giếng kiểm tra (trừ giếng đối chứng âm) xuất băng đường chạy với kích thước khoảng 800 bp tương ứng với kích thước gen seb Như vậy, biến nạp thành công plasmid tái tổ hợp pET21a+/SEB vào chủng E coli BL21(DE3) Từ kết này, định lựa chọn ngẫu nhiên dòng khuẩn lạc số để kiểm tra khả biểu gen seb tái tổ hợp 3.3.2 Kiểm tra biểu gen seb Gen seb vector biểu hoạt động điều khiển T7 lac promoter kiểm sốt chặt chẽ chất cảm ứng IPTG (isopropyl-β-Dthiogalactoside) có mơi trường Do đó, để nghiên cứu biểu protein tái tổ hợp, vi khuẩn sau biến nạp thành công nuôi cấy môi trường LB lỏng có kháng sinh ampicillin chất cảm ứng IPTG Trước thực cảm ứng biểu IPTG, tế bào vi khuẩn E.coli BL21(DE3) chứa plasmid tái tổ hợp cần phải hoạt hoá cách nuôi lắc nhiệt độ 37oC môi trường LB chứa kháng sinh ampicillin 100mg/l Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 42 tế bào bước vào pha sinh trưởng (OD600 nằm khoảng 0,4 đến 0,6) Sau cảm ứng IPTG 1mM nhiệt độ 37oC, tiến hành ly tâm 8000 vòng phút để thu sinh khối tế bào Đối với mẫu đối chứng âm, tế bào E.coli BL21(DE3) chứa plasmid tái tổ hợp pET21a+/SEB tế bào E.coli BL21(DE3) không chứa plasmid tái tổ hợp pET21a+/SEB hoạt hóa mơi trường chứa kháng sinh ampicillin 100mg/l nhiệt độ 37 oC mật độ tế bào thích hợp Sau tế bào biểu nhiệt độ 37oC không bổ sung IPTG ( với đối chứng (-) có vector biểu hiện), bổ sung 1mM IPTG (với đối chứng (-) khơng có vector biểu hiện) trước thu sinh khối tế bào Sau đó, chúng tơi tiến hành pha lỗng sinh khối tế bào dung dịch đệm PBS 1X Tween 20 (0,05%), phá vỡ tế bào cách siêu âm khô, thu protein tổng số chạy điện di protein gel polyacrylamide mục 2.2.2.9 để kiểm tra biểu Kết kiểm tra protein tổng số dòng tế bào mang plasmid pET21a+/SEB tái tổ hợp trình bày hình 3.12 Hình 3.12 Điện di so sánh protein tổng số tế bào E.coli BL21(DE3) mang gen seb tái tổ hợp M: Thang protein chuẩn (Prestained protein molecular weight marker - Fermentas); 1: Đối chứng âm (protein tổng số dịch chiết dòng khuẩn lạc BL21(DE3); 2: Protein tổng số dịch chết BL21(DE3)/pET21a+/SEB cảm ứng IPTG; 3: Protein cặn dòng khuẩn lạc BL21(DE3)/pET21a+/SEB cảm ứng IPTG; 4: Đối chứng âm (protein tổng số dịch chiết dịng khuẩn lạc BL21(DE3)/pET21a+/SEB khơng cảm ứng IPTG Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 43 Từ kết hình 3.12 cho thấy giếng vi khuẩn BL21(DE3) mang vector biểu pET21a+/SEB có cảm ứng IPTG xuất băng protein lạ so với đối chứng âm có kích thước khoảng 28 kDa tương ứng với kích thước protein SEB theo tính tốn lí thuyết Kết giải thích có mặt chất cảm ứng IPTG lac repressor thay đổi cấu hình khơng thể gắn vào lac operator Sự loại bỏ lac repressor khỏi operator cho phép ARN polymerase bám vào lac promoter khởi động q trình phiên mã Dịng vi khuẩn đối chứng (-) cịn lại khơng mang vector có gen seb tái tổ hợp nên dù cảm ứng IPTG giống với dịng vi khuẩn mang vector có cảm ứng IPTG khơng biểu băng có kích thước Năm 2003, Korolev cs tạo thành cơng protein SEB khơng mang đoạn tín hiệu diện vùng chu chất tế bào Trong thí nghiệm Korolev cs, sử dụng vector biểu pET22b+ có mang trình tự tín hiệu signal peptide có tác dụng dẫn protein ngoại lai vùng khoang chu chất tế bào biểu [22] Trong nghiên cứu này, vector pET21a+ không mang trình tự tín hiệu gen seb tái tổ hợp thiết kế khơng có trình tự mã hóa cho đoạn polypeptide đặc biệt Do đó, để thu protein SEB ngoại lai dạng tan phù hợp mục tiêu thử hoạt tính kháng nguyên sau này, tiến hành tối ưu điều kiện biểu gen 3.3.3 Tối ƣu điều kiện biểu gen seb Sự tổng hợp protein phụ thuộc nhiều yếu tố việc xác định điều kiện tối ưu cho tổng hợp protein quan tâm điều quan trọng Để xác định điều kiện tối ưu tiến hành thử biểu gen điều kiện nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng IPTG thời gian cảm ứng khác Kết tối ưu nhiệt độ cảm ứng Thơng thường, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng vi khuẩn E coli 37oC Tuy nhiên, protein tái tổ hợp thường bị ức chế protein vật chủ, bị phân hủy nhiệt độ cao gây độc với tế bào vật chủ v.v nhiệt độ nhiều trường hợp không phù hợp Về mặt lý thuyết, điều Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 44 giải thích sinh trưởng nhiệt độ tối ưu protein tái tổ hợp điều khiển promoter mạnh T7 promoter tổng hợp ạt lượng lớn thời gian ngắn Trong đó, protein chức khác tham gia vào trình tạo cấu trúc protein bậc cao lại không tổng hợp với tốc độ tương ứng, ảnh hưởng đến cấu trúc thứ cấp protein tái tổ hợp thông thường làm cho protein tổng hợp dạng khơng tan, có hoạt tính thấp chí hoạt tính Thêm vào 37oC nhiệt độ tối thích cho protease nội bào hoạt động, protein ngoại lai bị phân cắt sau tổng hợp, ảnh hưởng đến hiệu suất biểu chất lượng protein [1] Để thu protein SEB với lượng lớn có hoạt tính mà không lẫn nhiều protein thân E.coli, tăng hiệu trình tinh protein sau này, định tiến hành khảo sát khả tổng hợp protein SEB tái tổ hợp điều kiện nhiệt độ khác 28oC 37oC với nồng độ chất cảm ứng IPTG 1mM thời gian cảm ứng Sau nuôi cảm ứng tế bào thu lại để kiểm tra mức độ biểu tính chất protein tái tổ hợp Dịch chiết phần cặn tế bào kiểm tra điện di gel polyacrylamide 12% Kết trình bày hình 3.13 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 45 Hình 3.13 Điện di so sánh khả biểu protein SEB nhiệt độ khác M: Thang protein chuẩn; 2: Không cảm ứng 37oC; 3: Cảm ứng 37oC, dịch; 4: Cảm ứng biểu 37oC, cặn; 5: Cảm ứng 28oC C, cặn; 6: Cảm ứng 28oC C, dịch; 7: Không cảm ứng 28oC Kết thu hình 3.13 cho thấy đường chạy giếng số xuất băng protein SEB đậm hẳn băng protein giếng số Chứng tỏ protein SEB tái tổ hợp điều kiện 28oC tan tốt so với điều kiện nhiệt độ 37oC Vì vậy, chúng tơi lựa chọn nhiệt độ cảm ứng 28oC cho nghiên cứu Kết tối ưu nồng độ chất cảm ứng IPTG thời gian cảm ứng gen seb Protein ngoại lai điều khiển tổng hợp promoter T7 vector pET21a+ Promoter cảm ứng có mặt IPTG môi trường nuôi cấy Nồng độ chất ảnh hưởng đến mức độ biểu protein ngoại lai tế bào Ở nồng độ cao gây độc cho tế bào, nồng độ thấp protein ngoại lai thường tổng hợp [1] Chúng tiến hành khảo sát khả biểu protein SEB tái tổ hợp nồng độ chất cảm ứng IPTG khác từ 0,4 - mM (0,4 mM; 0,6 mM; 0,8 mM mM) 28oC thu mẫu sau cảm ứng Kết thí nghiệm thể tổng quát qua hình 3.14 Theo đó, lượng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 46 protein SEB tái tổ hợp tổng hợp nhiều tương ứng với nồng độ chất cảm ứng IPTG 1mM Do đó, chúng tơi chọn nồng độ chất cảm ứng IPTG 1mM cho nghiên cứu Thời gian cảm ứng có liên quan chặt chẽ đến số lượng chất lượng protein tái tổ hợp biểu Do chúng tơi tiến hành khảo sát thời điểm thu mẫu khác từ đến sau bổ sung chất cảm ứng IPTG với nồng độ mM nuôi cấy 28oC Protein tổng số giai đoạn kiểm tra gel điện di polyacrylamide 12% kết thí nghiệm thống kê hình 3.14 Sau cảm ứng, protein SEB tái tổ hợp biểu băng đậm, rõ nét so với băng thu thời điểm khác Từ kết này, lựa chọn khoảng thời gian cảm ứng cho trình tổng hợp protein SEB Hình 3.14 So sánh khả biểu SEB điều kiện khác Như vậy, điều kiện tối ưu để cảm ứng biểu protein SEB chủng biểu BL21(DE3) nhiệt độ 28oC, nồng độ chất cảm ứng IPTG 1mM sau cảm ứng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 47 3.3.4 Tinh protein tái tổ hợp SEB Theo thiết kế vector biểu pET21a+/SEB, protein SEB tổng hợp, nối thêm axit amin Histidin phần - COOH Đây đặc điểm thuận lợi cho việc tinh sản phẩm, đồng thời tín hiệu để nhận biết sản phẩm tổng hợp Western blot Trong thí nghiệm tinh trực tiếp thu protein SEB dựa kết luận điều kiện cảm ứng Sau trình biểu hiện, tế bào được phá vỡ sóng siêu âm tiến hành ly tâm 13000 vòng 15 phút để tách riêng pha cặn pha dịch Kiểm tra gel polyacylamide thấy protein SEB biểu dạng hòa tan đủ lượng tiến hành tinh (hình 3.15) Hình 3.15 Điện di kiểm tra protein SEB dạng tan trước tinh 1: Protein tổng số pha cặn; 2: Protein tổng số mẫu đối chứng (-) không cảm ứng IPTG; M: Thang protein chuẩn; 4: Protein tổng số pha dịch Phương pháp tinh cột HisTrap dựa vào liên kết lực ion niken (Ni2+) với vòng imidazol histidin Khi axit amin histidin gần liên kết chúng với ion niken mạnh Protein tái tổ hợp gen seb mã hố có His - tag với axit amin histidin liên tục liên kết đặc hiệu với ion niken Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 48 Các phân tử protein tế bào tổng hợp khơng có His - tag khơng gắn với ion niken Mặt khác ion niken cột lại liên kết với hạt Sepharose phức cua nên protein tái tổ hợp không bị rửa trôi đệm rửa protein khác Protein tái tổ hợp giữ lại cột tách cho qua dung dịch đệm có chứa nồng độ imidazol thích hợp Việc thu mẫu tiến hành theo phân đoạn liên tục để kiểm tra protein ngoại lai bắt đầu tách khỏi cột từ phân đoạn kết thúc phân đoạn Trong trình tinh thu mẫu protein tiến hành kiểm tra sản phẩm trước sau tinh gel polyacrylamide 12% Kết tinh protein SEB sau cảm ứng 1mM IPTG, nhiệt độ 28oC thể hình 3.16 Hình 3.16 Điện di kết tinh protein SEB tái tổ hợp M: Thang protein chuẩn; 1: Đối chứng (-): Không cảm ứng IPTG; 2: Cảm ứng IPTG; Phân đoạn Flow; 4: Phân đoạn Washing; 5-Protein sau tinh Kết điện di đồ cho thấy, sản phẩm tinh có băng protein với trọng lượng khoảng 28 kDa tương đương trọng lượng băng biểu trước tinh Chúng kiểm tra phân đoạn thu mẫu khác Từ phân đoạn thứ bắt đầu thu protein ngoại lai đến phân đoạn thứ khơng thấy xuất Như chúng tơi thu hồn tồn lượng protein ngoại lai tinh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 49 KẾT LUẬN Thiết kế thành công vector biểu mang gen mã hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp staphylococcal enterotoxin B gây đột biến loại độc tính Đã xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu để tăng khả biểu protein staphylococcal enterotoxin B đột biến dạng tan tế bào vi khuẩn Escherichia coli chủng BL21(DE3) điều kiện: nhiệt độ 28oC, nồng độ IPTG 1mM thời gian cảm ứng Tinh thành công protein staphylococcal enterotoxin B đột biến để sử dụng làm nguyên liệu tạo kít phát vi khuẩn tụ cầu vàng Staphylococcus aureus thực phẩm KIẾN NGHỊ Kiểm tra độc tính protein staphylococcal enterotoxin B đột biến đối tượng thử nghiệm (chuột thỏ) Xác định nồng độ protein staphylococcal enterotoxin B, chuẩn bị nguồn nguyên liệu cho việc tạo kháng thể đơn dòng để chế tạo kít chuẩn đốn nhanh ngộ độc thực phẩm độc tố tụ cầu vàng gây giai đoạn sau Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO I - Tài liệu tiếng Việt Đỗ Thị Huyền, Bùi Hồng Vân, Văn Thị Như Ngọc, Trương Văn Dung, Trương Nam Hải (2009), Biểu gen ha5 mã hoá kháng nguyên Hemagglutinin (HA) virus cúm A/H5N1 Escherichia coli, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 7(2), 185-192 Đơng Phương (2008), Đề phòng ngộ độc thực phẩm tụ cầu vàng, http://news.restaurants.com.vn/?page=tintuc&code=home&id=587 Lâm Quốc Hùng (2009), Phòng chống ngộ độc Việt Nam năm 2008, dự báo giải pháp phòng chống ngộ độc thực phẩm năm 2009, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm, http://vfa.gov.vn/news.asp?ID=21322 Lê Huy Chính (2003), Vi sinh y học, Nxb Y học, Hà Nội Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thanh Yến, Phan Thị Kim, Nguyễn Thị Sợt, Nguyễn Thị Khánh Sâm (2005), Tình hình nhiễm vi khuẩn nhận thức vệ sinh an toàn thực phẩm người kinh doanh thức ăn đường phố Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, www.vfa.gov.vn Nguyễn Thị Liên Hạnh, Huỳnh Hồng Quang (2009), Các nguyên nhân gây bệnh ỉa chảy nhiễm khuẩn Tụ cầu vàng Virus, http://www.impeqn.org.vn/impe-qn/vn/portal/InfoDetail.jsp?area=58&cat=1101&ID=2745 II - Tài liệu tiếng Anh Baba T., Bae T., Schneewind O., Takeuchi F., Hiramatsu K (2008), Genome sequence of Staphylococcus aureus strain Newman and comparative analysis of staphylococcal genomes: polymorphism and evolution of two major pathogenicity islands, J Bacteriol, 190(1), 300-310 Baba T., Takeuchi F., Kuroda M., Yuzawa H., Aoki K., Oguchi A., Nagai Y., Iwama N., Asano K., Naimi T., Kuroda H., Cui L.,Yamamoto K., Hiramatsu K Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 51 (2002), Genome and virulence determinants of high virulence communityacquired MRSA, Lancet, 359(9320), 1819-1827 Bean N H., Griphin P M., Goulding J S., Ivey C B (1990), Foodborne disease outbreaks, year summary, 1983-1987, J Food Prot, 53, 711-728 10 Bergdoll M S (1989), Staphylococcus aureus, Foodborne Bacterial Pathogens (Doyle, M.P., ed.), Marcel Dekker, Inc., New York, NY, USA, 463-523 11 Bruce A G., Kermit D H (2009), CBRNE - Staphylococcal Enterotoxin B, http://emedicine.medscape.com/article/830715-overview 12 CAST (1994), CAST Report: Foodborne Pathogens: Risks and Consequences, Task Force Report No 122, Washington, DC: Council for Agricultural Science and Technology 13 Christopher L J., Saleem A K (1986), Nucleotide Sequence of the Enterotoxin B Gene from Staphylococcus aureus, Journal of bacteriology, 166(1), 29-33 14 Evenson M L., Hinds M W., Bernstein R S., Bergdoll M S (1988), Estimation of human dose of staphylococcal enterotoxin A from a large outbreak of staphylococcal food poisoning involving chocolate milk, Int J Food Microbiol, 7, 311-316 15 Gill S R., Fouts D E., Archer G L., Mongodin E F., Deboy R T., Ravel J., Paulsen I T., Kolonay, J F., Brinkac L., Beanan M., Dodson R J., Daugherty S C., Madupu R., Angiuoli S V., Durkin A S., Haft D H., Vamathevan J., Khour I H., Utterback T., Lee C., Dimitrov G., Jiang L., Qin H., Weidman J., Tran K., Kang K., Hance I R., Nelson K E., Fraser C M (2005), Insights on evolution of virulence and resistance from the complete genome analysis of an early methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain and a biofilm-producing methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis strain, J Bacteriol, 187, 2426-2438 16 Greenfield R A., Brown B R., Huntchins J B., Iandolo J J., Jackson R., Slater L N., Bronze M S (2002), Microbiological, biological, and chemical weapons Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 52 of warfare and terrorism, The American Journal of the Medical Science, 323(6), 326-340 17 Haeghebaert S., Le Q F., Gallay A., Bouvet P., Gomez M., Vaillant V (2002), Les toxi-infections alimentaires collectives en France, en 1999 et 2000, Bull Epidémiol Hebdo, 23, 105-109 18 Herron O L., Fitzgerald J R., Musser J M., Kapur V (2007), Molecular correlates of host specialization in Staphylococcus aureus, PLoS ONE, 2(10), E1120 19 Holden M T.,Feil E J., Lindsay J A., Peacock S J., Day N P., Enright M C., Foster T J., Moore C E., Hurst L., Atkin R.,Barron A., Bason N., Bentley S D., Chilling W C., Chilling W.T., Churcher C., Clark L., Corton C., Cronin A.,Doggett J., Dowd L., Feltwell T., Hance Z., Harris B., Hauser H.,Holroyd S., Jagels K., James K D., Lennard N., Line A., Mayes R.,Moule S., Mungall K., Ormond D., Quail M A., Rabbinowitsch E., Rutherford K., Sanders M., Sharp S., Simmonds M., Stevens K.,Whitehead S., Barrell B G., Spratt B G., Parkhill J (2004), Complete genomes of two clinical Staphylococcus aureus strains: evidence for the rapid evolution of virulence and drug resistance, Proc Natl Acad Sci USA, 101(26), 9786-9791 20 Huang L Y., Bergdoll M S (1970), The primer structure of staphylococcal enterotoxin B, J Biol Chem, 245, 3518-3525 21 Kọferstein F K., Motarjemi Y., Bettcher D W (1997), Foodborne disease control: a transnational challenge, Emerging Infect, Dis, 3, 503-510 22 Korolev S., Pinelis D., Savransky V., Komisar J., Vogel P., Fegeding K (2003), Toxicity of the staphylococcal enterotoxin B mutants with histidine-to-tyrosine substitutions, Toxicology, 187(2/3), 229–238 23 Kuroda M., Ohta T., Uchiyama I., Baba T., Yuzawa H., Kobayashi I., Cui L., Oguchi A., Aoki K., Nagai Y., Lian J., Ito T., Kanamori M., Matsumaru H., Maruyama A., Murakami H., Hosoyama A., Mizutani U Y., Takahashi N K., Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 53 Sawano T., Inoue R., Kaito C., Sekimizu K., Hirakawa H., Kuhara S., Goto S., Yabuzaki J., Kanehisa M., Yamashita A., Oshima K., Furuya K., Yoshino C., Shiba T., Hattori M., Ogasawara N., Hayashi H., Hiramatsu K (2001), Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus Aureus, Lancet, 357(9264), 1225-1240 24 Lee J S., Dyas B K., Nystrom S S., Lind C M., Smith J F., Ulrich R G (2002), Immune protection against staphylococcal enterotoxin-induced toxic shock by vaccination with Venezuelan equine encephalitis virus replicon, J Infect Dis, 185, 1192-1196 25 Lowell G H., Colleton C., Frost D., Kaminski R W., Hughes M., Hatch J., Hooper C., Estep J., Pitt L., Topper M., Hunt R E., Baker W., Baze W B (1996), Immunogennicity and efficacy agains lethal aerosol staphylococcal enterotoxin B challenge in monkeys by intramuscular and respiratory delivery of proteosome – toxoid vaccines, Infect Immun, 64(11), 4686-4693 26 Nema V., Agrawal R., Kamboj D V., Goel A K., Singh L (2007), Isolation and characterization of heat resistant enterotoxigenic Staphylococcus aureus from a food poisoning outbreak in Indian subcontinent, Int J Food Microbiol, 117(1), 29-35 27 Ono H K., Omoe K., Imanishi K., Iwakabe Y., Hu D L., Kato H (2008), Identification and characterization of two novel staphylococcal enterotoxins, types S and T, Infect Immun, 76(11), 4999-5005 28 Reck B., Scheuber P H., Londong W., Sailer-Kramer B., Bartsch K., Hammer D K (1988), Protection against the staphylococcal enterotoxin-induced intestinal disorder in the monkey by anti-idiotypic antibodies, Proc Natl Acad Sci USA, 85(9), 3170-3174 29 Rosec J P., Gigaud O (2002), Staphylococcal enterotoxin genes of classical and new types detected by PCR in France, Int J Food Microbiol, 77, 61-70 30 Rosec J P., Guiraud J P., Dalet C., Richard N (1997), Enterotoxin production by staphylococci isolated from foods in France, Int J Food Microbiol, 35, 213-221 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 54 31 Savransky V., Pinelis D., Korolev S., Ionin B., Fegeding K (2004), Immunogenicity of the histidine-to-tyrosine staphylococcal enterotoxin B mutant protein in C3H/HeJ mice, Toxicon, 43, 433–438 32 Savransky V., Rostapshov V., Pinelis D., Polotsky Y., Korolev S., Komisar J., Fegeding K (2003), Murine lethal toxic shock caused by intranasal administration of staphylococcal enterotoxin B, Toxicol Pathol, 31(4) 33 Stelma G N., Bergdoll M S (1982), Inactivation of staphylococcal enterotoxin A by chemical modification, Biochem Biophys Res Commun, 105(1), 121-126 34 Steven R G., Derrick E F., Gordon L A (2005), Insights on Evolution of Virulence and Resistance from the Complete Genome Analysis of an Early Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Strain and a Biofilm-Producing Methicillin-Resistant Staphylococcus epidermidis Strain, J Bacteriol, 187(7), 2426–2438 PMCID: PMC1065214 35 Swaminathan S., Furey W., Pletcher J., Sax M (1992), Crystal structure of staphyloccocal enterotoxin B, a superantige, Nature, 359, 801 – 806 36 Thibodeau J., Cloutier I., Lavoie P M., Labrecque N., Mourad W., Jardetzky T., Sekaly R P (1994), Subsets of HLA-DR1 molecules defined by SEB and TSST-1 binding, Sciences, 266(5192), 1874-1878 37 Wallace D J., Van G T., Shallow S., Fiorentino T., Segler S D., Smith K E., Shiferaw B., Etzel R., Garthright W E., Angulo F J and the Food Net Working Group (2000), Incidence of Foodborne Illnesses Reported by the Foodborne Diseases Active Surveillance Network (FoodNet)-1997, J Food Prot, 63, 807-809 38 Wieneke A A., Roberts D., Gilbert R J (1993), Staphylococcal food poisoning in the United Kingdom, 1969-90, Epidemiol Infect, 110, 519-531 39 Woody M A., Krakauer T., Stiles B G (1997), Staphylococcal enterotoxin B mutants (N23K and F44S): biological effects and vaccine potential in a mouse model, Vaccine, 15, 133-139 40 Yarwood J M., McCormick J K., Paustian M L., Orwin P M., Kapur V., Schlievert P M (2002), Characterization and expression analysis of Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 55 staphylococcus aureus pathogenicity island Implications for the evolution of staphylococcal pathogenicity islands, J Biol Chem, 277(15), 13138-13147 41 Yves L L., Florence B., Michel G (2003), Staphylococcus aureus and food poisoning, Genet Mol Res, 2(1), 63-76 III - Tài liệu internet 42 http://frodo.wi.mit.edu/primer3/ 43 http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/dai-cuong-an-toan-thuc-pham.271194.html 44 http://vi.wikipedia.org/wiki/Cơ_chế_độc_lực_của_vi_khuẩn 45 http://vi.wikipedia.org/wiki/Tụ_cầu_khuẩn 46 http://www.uniprot.org/uniprot/P01552 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... ? ?Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B (SEB) phục vụ cho tạo kít phát nhanh ngộ độc thực phẩm độc tố tụ cầu vàng? ?? Trong trình nghiên cứu vừa qua, tơi nhận giúp đỡ b? ??o tận... vector biểu gen mã hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp SEB gây đột biến loại độc tính - Biểu tinh protein SEB tế b? ?o vi khuẩn E coli tạo nguyên liệu tạo kít phát vi khuẩn tụ cầu vàng thực phẩm Nội... tạo kháng thể IgG đặc hiệu cấp thiết Xuất phát từ lý trên, tiến hành đề tài: ? ?Nghiên cứu tạo đột biến khử độc biểu gen mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B (SEB) phục vụ