Rapid sex determ ination of chick embryos using the Polymerase chain reaction, Anim.. Sex-specific expression of an evolutionarily conserved male regulatory gene, DM RT1, in bi[r]
(1)TAP CHÍ KHOA HOC DHQGHN KHTN & CN T XX So 2PT 2004
X Á C Đ Ị N H G I Ớ I T Í N H G À B A N G K Ỹ T H U Ậ T P C R P h a n T u â n N g h ĩa , N g u y ễ n M ộng H ù n g , N g u y ế n T h ị V â n A n h , N g u y ế n Q u ố c T r u n g , N g u y ễ n T h ị T h ả o , N g u y ễ n T u ấ n A n h , V ũ P h n g Ly
K hoa S in h học, Trường Đ ại học Khoa học T ự n hiên, Đ H Q G H N M đ ầ u
Gà nói riêng hay gia cầm nói chung nhóm vật ni đóng vai trị q u a n trọng bậc n h ất việc cung cấp th ịt cho người Xác định sớm giới tín h gia cầm có ý nghĩa quan trọng nghiên cứu phôi học ứng d ụ n g sản x u ấ t dê chủ động diều khiên tỷ lộ đực /cái theo hướng mong muốn Đê xác đ ịnh sớm giới tín h gia cầm có m ột sô phương ph áp khác n hau áp dụng phân tích h ình th i lỗ h u y ệ t hay phán biệt kiểu n hân Tuy vậy, phương p háp vừa nêu có hạn c h ế chỗ m ất nhiều thịi gian chi’ áp dụng dược cho sơ’ đơi tượng C hính vậy, n h ũ n g n ăm gần phương p háp sinh học ph ân tử dựa trê n sai khác m ức ADN cá th ể đực dược áp dụng [2.3,4,6,7,8,9,11] Mặc dầu vậy, áp d ụ n g m ột sơ’ qui trìn h kỹ th u ậ t cơng bơ' [3,9] để xác định giới tính gà không th u k ế t q u ả thực tin cậy Hơn thê nữa, Việt N am việc áp dụng kỹ th u ậ t sinh học p hân tử để xác dịnh giới tính gia cầm chưa dược quan tâm Nghiên cứu n hằm bước th iết lập qui trìn h xác định giói tín h gia cầm từ giai đoạn phôi đ ến trư ng th ành kỹ th u ậ t PCR cỏ độ n hạy độ tin cậy cao, góp phần hỗ trợ cho cơng tác nghiên cửu phôi sinh học củng p h t triển chản nuôi ỏ nước
2 N g u y ê n liệ u v p h n g p h p n g h i ê n u 2.1 N guyên liệu
Nguyên liệu sử dụng để tách ADN m áu lấy từ gồ (G alus dom esticus), chim cút {Turnix tanki), bồ câu (Colum ba livià), vịt (Anas platyrhincha) phôi gà M ẫu phôi Phịng Cơng nghệ t ế bào động v ật, thuộc T ru n g tâm S inh học p hán tử Công nghệ tế bào cung cấp
Các cập mồi dược m ua từ hãng In tegrated DNA Technology (IDT, Mỹ), th a n g chuẩn ADN klH in d ĩĩỉ kb h ãng F erm entas (Lithoania) Các hố ch ấ t cịn lại đểu đ t mức tinh khiết cho nghiên cứu s in h học p hân tử
2.2 P h ng p h p
ADN m áu gà hay gia cầm khác phôi gà tách bằn g kit GFX hãng Pharm acia (Thuỵ Điển) Ngồi ADN cịn tách theo phương ph áp củ a Albarino Romanowski [1] có cải tiến ADN định lượng cách đo dộ hấp th ụ bước sóng 260 nm (AMn) kiểm tra b ăng điện di gel agarose
P hản ứng chuỗi polym erase (PCR) thực m ột th ể tích 25^1 có chứa 10- 70 ng ADN khuôn, mồi xuôi mồi ngược nồng độ 0,5 nM, 2,5 đơn vị T aq ADN
(2)X.R ill nil JJII'I hull ;j I h.m ;■ k\ [hu.'H l’( k 157
polym erase v dN TP 0.4 mM C hẽ độ nh iệt bao gồm bước khởi dộng nóng ỏ 94°c p hút, biến tín h ADN khuón 94"C 30 giây, gắn mồi ớ 65"C 15 giây, kéo dài chuỗi 72"C 25 giây, với 35 chu kv lặp lại giũ phán ứng 72"C phút, s n phấm dược ph àn tích điện di gel agarose nhuộm băng bang ethidium bromide K ết q u n g h i ê n cử u
3.1 T ch A D N từ m u p h ô i gà
Để tác h ADN từ m áu gà sử dụng kit tinh ADN từ m áu ký hiệu CrFX h ã n g P h arm ac ia, lượng m áu sử dụng 2j.ll R iêng với phơi phải có thêm bước nghiền tế bào trước lấy m ẫu tách ADN, Lượng ADN th u từ khoảng 2-6 ng K ết kiểm tra độ bằn g điện di gel agarosel% dược trìn h bày ỏ hìn h Có dễ dàng nhận th rà n g ch ế phẩm ADN m ẫu máu gà (A), chim cút (B; hai cột đầu) hay bồ cảu (B: hai cột tiếp theo) thuộc hai giới đực dều cho băng ngun vẹn có kích thước lớn khõng lần ARN ng tỏ chế phấin thu có độ cao
Bẽn cạ n h việc tách ADN kit GFX, liến h àn h tách ADN từ m áu gà theo phương pháp A lbarino Romanowski []] Đây phương pháp áp dụng cho tách ADN lừ m áu người không dùng chất chống dông Tuv vậy, áp dụng phưrlng p háp đè' tách ADN từ m áu gà thấy rằ n g m áu gà dông r ấ t n h an h chúng tỏi bơ su n g thêm vào m áu the tích tương điíơng dung dịch muôi sinh lý (NaCl 0.9%) sứ d ụ n g hỗn hợp phenol: chloroform: isoamyl alcohol (ti lệ 25:24:1 vê th ế tích) thay cho việc sử dụng chiết hai bước phenol chloroform: isoam yl alcohol qui trìn h gốc Kết qu ả phân tích cho th lượng ADN th u tương tự sử dụng kit, n h iên để tách ADN theo phương pháp này, lượng m ẫu cần lấy ban đổu từ 20 ị.il trỏ lên Kết diện di chế phẩm ADN th u đươe hình 1D cho thấy ADN thu từ máu gi1! trông gà m cho m ột bâng, kích thưốc lớn, khơng lẫn ARN Dể tách ADN từ phôi, chúng Lôi nghiền m ẫu ủ 37°c phút Sau ly tâm để th u tế bào tiếp tục tách chiết với qui trìn h tương tự n hu với m ẫu máu Ngồi , qui trìn h tách ADN từ phơi cẩn có thâm bưỏc xứ lỹ bảng ARNase dê loại ARN C hế phẩm thu dược có ch ấ t lượng không sai khác với ch ế phàm lách b ằn g kit
Hình 1: Điện di agarose chè phãm ADN m u g ia c ắ m ph ô i gà A: ADN cùa mâu gà B: ADN cùa m u c h im c ú t (2 cột đẩu tiê n ) v bố câu (2 cột cuối cùng) C: ADN củạ phõi, D: ADN máu sà tách băng phương pháp không dùng kit M: thang chuân kb (A, B C) hay HindiII (D), P: Phôi.
3.2 X c đ ịn h g iớ i t in h b ằ n g k ĩ th u ậ t PCR
Đe xác tlịnh giới lín h gà PCR sử dụng cặp mồi có ký hiệu NP/M P2 N P8/M P3 (b ả n g l) th iết kế dụa cặp mồi NP/M P nghiên cứu Ito tập thê [7] đ ẽ xác dịnh giới lín h sơ' lồi thuộc họ chim cát (Falconìformes) PCR Các cặp mồi dểu dựa vào sai khác trìn h tụ nucleotit vùng intron gen
A B c D
(3)158 Phan Tuẫn Nghĩa Nguyẻn M ộng Hùng Nguyen Thi Vân Anh CDH1W CD H 1Z nằm tương ứng nhiễm sắc th ể w z đặc trư ng cho giới tín h đực gà Trong cặp mồi NP/M P2 NP8/MP3 (bảng 1) th ì N P có trin h tự giơng nh au gen CHD1 loài chim cắt gà MP2 M P3 chúng tơi th iết kê dựa trìn h tự đặc trư n g CDH1W MP2 lựa chọn để k ế t thúc b ằng adenin đầu 3’-OH nên không th ể gắn bô su n g vào trìn h tự gen C D H 1Z (giới tín h đực) vốn a cytosine Ngoài , tro n g trìn h tự M P2 cịn có m ột nucleotit sai kh ác (A) CDH1Z so với CDH1W (T)
Qua nghiên cửu th ấ y rà n g sử dụng cặp mồi NP/M P2 cho PCR với lượng ADN khuôn từ 50-70 ng chế độ nhiêt: biến tín h ban đ ầu â 94°C-5\ 35 chu ký gồm 94°C-30”, 64°C-15”, 72°C-25” 72°C-1' cho phép th u bảng n h ân với kích thước 286 bp r ấ t rõ n é t với m ẫu ADN khuôn m ột b ăng mị n h t có kích thước 269 bp với m ẫu ADN đực (đoạn gen C D H 1Z ngắn CDH1W 17 nucleotit) Theo chúng tôi, sử dụng kỹ th u ậ t PCR với cặp mồi NP/M P2 đú cho phép xác đ inh giới tín h ỏ gà Qui trìn h th nghiệm trê n m ẫu ADN tách từ phôi cho bảng n h ân b ản 286 bp, chứng tỏ phơi cho có kích thước gần tương đương mờ n h ạt, ng tị đỏ phơi đực Toàn thời gian đê thực việc xác định giới tính m ẫu khoảng 3,5 giờ, bao gồm việc tách ADN (khoảng 40 phút), chạy PCR ( khoảng 130 p hút) chạy điện di, phân tích kết (khoảng 40 phút)
Cặp mồi NP8/M P3 chúng tơi sử dụng nhằm làm tă n g tín h đặc hiệu n hư độ tin cậy phương pháp Trong MP3 trìn h tự gen C DH1W n h ng lùi sau 37 nucleotit so với MP2 để có tới nucleotit sai khác so với trìn h tự tươ ng ứng gen CDH1Z đực [7] N P chửa m ột p hần trìn h tự N8 tồn trìn h tự NP Việc kéo dài N P th n h N P để h mồi N P M P3 có n h iệ t độ tách chuỗi (Tm) gẩn nhau, cho phép sử dụng nh iệt độ gắn mồi cao n hư đôi với M P3 (65°C)
B ả n g Trình tự cặp mồi dùng để xác đinh giới tín h gà, vịt, chim cút bồ câu
TT Ký hiệu
của cặp mồí T rình tự
B ăng nh ân đặc hiệu giới tín h s
1 NP
MP2
5’-GAG AAA CTG TGC AAA ACG A 5’-CGT TTT CTT TCT GAT ATG GAA
286 bp
2 N P
MP3
5’-GAG AAT GAG AAA CTG TGC AAA ACAG 5’-ACG GGG AAT AGT TCG TGG TCG
328 bp
(4)I'.I I IL' k\ lhu.ll I’CR
(hình 3B) cho thấy, m ẫu phịi P l P3 khơng có bảng 328 bp, tương tự s ứ dụng m ầu ADN gã trống trướng thành, chứng tó chúng phơi đực cịn m ẫu P2 P-l P5 có b ăng 328 hp tương tự m ẫu gà m trướng th n h chứng tó m ẫu phơi
C húng dã tiến hàn h thí nghiệm xác định giới tin h gà với nồng độ ADN khuôn khác n hau dã phát ràng nồng độ ADN khuôn tối th iểu dế có th ể thu b ằng n hãn b án rõ n é t 10 ng Theo tín h tốn thi lượng ADN 10 n g có th ế tách từ khoang nanolit m áu hay từ khống vài t ế bào phơi ban đẩu
M í .t 1
H in h 2: Điện di g d agarose sán phẩm PCR xác ilịnh giới lính gà sứ dụng cặp NP MP2 M: Thang chuẩn ADN (5(}-20(X)hp) * tương ứng vrti màu ADN khn máu gà tríína mái irướng thành
IIin h ỉ : ĐiỌii Ui gcl agarose s;in phẩm PCR xác định giỏi lính gii sir dụng cặp mói NPH/MP.V A : Sán phàm PCR VỚI until ADN khn lừ máu gia cám truitng Ihìrnh B: Síin phẩin l’CR v«ïi inAu ADN
khn cùa phói (P) M: Ihang chuẩn ADN Ikb
4 T h ả o lu ậ n
(5)160 Phan Tuán N ghĩa Nguvỏn M òng Hùng Nguyèn Thị V an Anh
CDH1Z ỏ gà có n h ũ n g sai khác so vỏi trìn h tự C D H lW CDH1Z loài chim cắt nên không th ế dùng cặp mồi đế xác định giới tín h gà PCR Vối nguyên tắc th iế t k ế mồi tương tự ch ú n g th iế t kê cặp mồi NP/M P2 dặc trư n g cho gen C D H l ỏ gà nhờ vậv cho phép dễ d àng n h ận dạn g giới tín h gà PCR Nhằm m ột bước p h át triển tín h đặc hiệu phương pháp, th iế t k ế cặp mồi N P M P3, NP8 chửa p h ần trìn h tự có m ặ t C D H lW v CDH1Z cịn M P3 dựa ph ần trìn h trìn h tự có sa i khác tỏi nucleotit gen CDH1W CDH1Z, nhờ làm cho phép ph ân biệt xác giới tín h đực-cái m ẫu vối lượng ADN khuôn rả't th ấ p (10 ng) loại trừ hoàn toàn x u ấ t (các) g không đặc hiệu
Qui trìn h th iế t lập với cặp mồi NP8/M P3 cho phép dễ dàng p h t giới tính vịt, chim cú t bồ câu, ng tỏ loài nàv có vùng gen CDH1 chọn n ghiên cứu rấ t giống vói trìn h tự gen C D H l gà Q ui trìn h cho phép p h t ch ính xác giới tín h gà giai đoạn phôi Với thời gian thực gắn, s ố lượng m ẫu mồi lần phân tích từ vài chục trở lên, qui trìn h chắn có ý nghĩa cho việc nghiên CÛU phôi cho việc phát triển ch ả n nuôi gia cầm
T À I L IỆ U T H A M K H Ả O
1 Albarifto C.G and Romanowski, V, Phenol extraction revisited: A rapid method for the isolation and preservation of hum an genomic DNA from whole blood Mol (6 Cell Probes 1994 pp 423- 427
2 Clinton, M, A rapid protocol for sexing chick embryos (Gallus g domesticus), Anim Genet 25, 1994 pp 361- 162
3 D’Costa, S and P etitte, J N, Sex identification of turkey embryos using a multiplex Polymerase chain reaction, Poultry Sci, 77, 1998, pp 718- 721
4 E'llegren, H., Hens, cocks and avian sex determ ination, A quest for genes on z or w? EM BO Rep, 2, 2001, pp 192-196.
5 Ellegren, H, Evolution of the avian chromosomes and th eir role in sex determination Trends Ecol Evol, 25, 2000, pp 188- 192.
6 Griffiths, R., Daan, s , Dijkstra, c Sex identification in birds using two CDH genes Proc R Soc Lond, 263, 1996, pp 1249-1254.
7 Ito H., Sudo-Yamaji, A Abe, M., M urase, T., Tsubota, T Sex identification by alternative polymerase chian reaction methods in Falconiformes, Zool Sci, 20, 2003, pp 339-344 O'Neill, M., Binder M., Smith, c , Andrews, J., Reed, K., Sm ith M Millar, C-, Lambert,
D Sinclair A ASW: a gene with conserved avian W-linkage and female specific expression in chick embryonic gonad Dev Genes Evol, 210, 2000, pp 243- 249
9 P etitte, J N and Kegelmeyer, A Rapid sex determ ination of chick embryos using the Polymerase chain reaction, Anim Biotechnol, ,1995, pp 119- 130
10 Shan, z., N anda, I., Wang, Y., Schmid, M., Vortkamp, A Haaf, T Sex-specific expression of an evolutionarily conserved male regulatory gene, DM RT1, in birds, Cytogen Cell Genet, 89 2000, pp 252-257
(6)Xác tlịnh giói linh gà bảng kỷ ihuặt PCR 161
12 Stevens, L., Sex chromosomes and sex determ ining m echanism in birds, Sci Program 80, 1997, pp 197-216
Đi' lài dược thực với líó n ợ kinh phi đề tài cấp nhà nước KC.04.24 VNU JOURNAL OF SCIENCE, Nai, Sci & Tech., T.xx Nọ2AP 2004
D E T E R M I N A T I O N O F C H I C K E N S E X B Y P C R T E C H N I Q U E P h a n T u a n N g h ia , N g u y e n M o n g H u n g , N g u y e n T h i V a n A n h , N g u y e n Q u o c T r u n g , N g u y e n T h i T h a o , N g u y e n T u a n A n h , V u P h u o n g Ly
D epartm ent o f Biology, College o f Science, V N U