Tổng quan về vi rút viêm gan B, hiện trạng của bệnh HBV mạn tính, quy trình định lượng HBVRNA và ứng dụng trong đánh giá đáp ứng điều trị VGBMT, kỹ thuật real time RTPCR, phương pháp tách chiết axit nucleic; đối tượng và phương pháp nghiên cứu; kết quả và bàn luận.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Hoàn thiện kiểm định sinh phẩm Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA huyết người ĐỖ THỊ PHƯỢNG dothiphuong1224@gmail.com Ngành Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: Viện TS Lê Quang Hịa Cơng nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm HÀ NỘI, 2020 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Hoàn thiện kiểm định sinh phẩm Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA huyết người ĐỖ THỊ PHƯỢNG dothiphuong1224@gmail.com Ngành Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: Viện TS Lê Quang Hịa Chữ kí GVHD Cơng nghệ sinh học Cơng nghệ thực phẩm HÀ NỘI, 2020 CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên tác giả luận văn : Đỗ Thị Phượng Đề tài luận văn: “Hoàn thiện kiểm định sinh phẩm Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA huyết người” Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số SV: CB170122 Tác giả, Người hướng dẫn khoa học Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên họp Hội đồng ngày 28/10/2020 với nội dung sau: STT Nội dung Hội đồng yêu cầu chỉnh sửa Phản hồi học viên Đã bổ sung làm rõ tính kế thừa kết nghiên cứu trước Chương sau: - Mục 1.4.2; dòng thứ 1-13 từ xuống; trang 23 với nội dung kế thừa quy trình định lượng HBV- Làm rõ tính kế thừa RNA sử dụng hai sinh phẩm thương mại luận văn từ SuperScript™ III Platinum™ One-Step qRT-PCR kết trước Kit QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen) - Mục 1.5.2; phần b; dòng 7-13 20-23 từ xuống; trang 28 với nội dung kế thừa quy trình sản xuất hai enzyme MMLV RTase Hotstart Taq DNA polymerase Bổ sung phần tổng Đã bổ sung Quyết định số 3310/QĐ-BYT việc quan thơng tin ban hành hướng dẫn chẩn đốn, điều trị bệnh liên quan đến quy viêm gan vi rút B, bệnh nhân viêm gan định kiểm định B mãn tính Chương 1; mục 1.2; dịng thứ HBV nhà nước 19-25 từ xuống; trang STT Nội dung Hội đồng yêu cầu chỉnh sửa Phản hồi học viên Đã bổ sung phần thảo luận so sánh kết khoảng So sánh với định lượng độ đặc hiệu phản ứng Real-time nghiên cứu kế RT-PCR toàn quy trình phân tích với thừa nghiên cứu trước Chương 3, trang 63, 64, 68, 69, 70 81 - Trong phần tổng quan đề tài, học viên có đề cập đến kết tham khảo từ Bộ sinh phẩm HBV-SAT Rendu, Thượng Hải, Trung Quốc công bố ngưỡng phát (LOD) 100 phiên bản/ mL - Sản phẩm luận văn sinh phẩm HBVRNALOAD có mục đích sử dụng để định lượng HBV-RNA huyết người có khoảng định lượng (LOQ) từ 10 phiên bản/µL trở lên Trong khn khổ luận văn học viên Cải thiện độ nhạy khảo sát hai tiêu: LOQ độ đặc hiệu sinh phẩm - Hai tiêu LOD LOQ không so sánh với chưa thể kết luận sinh phẩm HBV-SAT nhạy so với sinh phẩm HBV-RNALOAD - Để cải thiện độ nhạy sinh phẩm có cách tiếp cận sau: + Tăng lượng thể tích đầu vào RNA khuôn phản ứng Real-time RT-PCR lên 20 µL; + Tăng lượng thể tích mẫu bệnh phẩm dùng cho q trình tách chiết RNA (ví dụ: dùng mL thay 200 µL quy trình nay) STT Nội dung Hội đồng yêu cầu chỉnh sửa Phản hồi học viên Các phương pháp tiêu chuẩn xác định hoạt độ hai enzyme MMLV RTase Hotstart Taq DNA polymerase có sử dụng đồng vị phóng xạ 32P nên Đơn vị hoạt độ điều kiện phịng thí nghiệm Viện Công enzyme nên quy đổi nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm chưa đơn vị U thực Do vậy, khuôn khổ luận văn học viên xác định hoạt tính tương đối thơng qua lượng thể tích hai enzyme phản ứng Real-time RT-PCR Ngày 15 tháng 11 năm 2020 Giáo viên hướng dẫn Tác giả luận văn TS Lê Quang Hòa Đỗ Thị Phượng CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG PGS TS Tơ Kim Anh ĐỀ TÀI LUẬN VĂN Đề tài: “Hồn thiện kiểm định sinh phẩm Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA huyết người” Giáo viên hướng dẫn Ký ghi rõ họ tên Lời cam đoan Tôi Đỗ Thị Phượng, học viên cao học khoá 2017B, mã số học viên: CB170122, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, chuyên ngành Công nghệ Sinh học, xin cam đoan: Đây luận văn thân trực tiếp thực hướng dẫn TS Lê Quang Hịa Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Học viên Đỗ Thị Phượng Lời cảm ơn Lời đầu tiên, em xin bày tỏ kính trọng lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Quang Hòa, người thầy hướng dẫn, động viên, giúp đỡ em q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Những nhận xét, đánh giá gợi ý hướng giải vấn đề suốt thời gian nghiên cứu thực học quý giá em khơng q trình viết luận văn mà q trình cơng tác sau Em xin bày tỏ lời biết ơn chân thành đến ThS Phạm Tiến Dũng anh, chị, em sinh viên học tập nghiên cứu phòng thí nghiệm thuộc Trung tâm Nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội tận tình dẫn, truyền đạt ý kiến chuyên môn kinh nghiệm quý báu suốt trình thực đề tài nghiên cứu Em xin bày tỏ lời biết ơn sâu sắc đến gia đình người thân ln ủng hộ, động viên, tạo điều kiện cho em suốt thời gian học tập Tóm tắt nội dung luận văn Viêm gan vi rút (VR) xem nhóm bệnh truyền nhiễm phổ biến nguy hiểm Tải lượng HBV-DNA dấu ấn chủ yếu để đánh giá bệnh nhân VGBMT làm sở để đưa biện pháp chống VR hiệu Kock cộng lần phát HBV-RNA huyết vào năm 1996 Cho đến nay, có nhiều nghiên cứu cho thấy HBV-RNA xem dấu ấn tiềm việc tối ưu hóa q trình điều trị Với kết nhóm nghiên cứu cơng bố vai trị tiềm việc định lượng HBV-RNA, tơi đề xuất đề tài: “Hoàn thiện kiểm định sinh phẩm real-time RT-PCR định lượng HBVRNA huyết người” với hai mục tiêu: Hồn thiện quy trình phân tích định lượng HBV-RNA huyết người dựa kỹ thuật real-time RT-PCR; Sản xuất thử nghiệm kiểm định sinh phẩm real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA huyết người Kết luận văn hoàn thiện quy trình phâm tích định lượng HBVRNA huyết thnah dựa kỹ thuật Real-time RT-PCR Bộ sinh phẩm gồm hợp phần tách chiết hợp phần Real-time RT-PCR xây dựng quy trình sản xuất sản xuất thử nghiệm với số lượng 10 kit (10 test/kit), với khoảng định lượng từ 10 phiên bản/µL trở lên khơng có phản ứng chéo với vi rút viêm gan A vi rút viêm gan C Bộ sinh phẩm có độ ổn định tháng với hợp phần tách chiết bảo quản nhiệt độ phòng hợp phần Real-time bảo quản -300C đến -180C Kết luận văn phù hợp với mục tiêu ban đầu đề tài Đề tài có tính khoa học thực tiễn cao HỌC VIÊN MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi rút viêm gan B 1.1.1 Cấu tạo vi rút viêm gan B 1.1.2 Cơ chế xâm nhiễm nhân vi rút viêm gan B 1.2 Hiện trạng bệnh VGB phương pháp điều trị 1.3 Theo dõi kiểm sốt nhiễm HBV mạn tính 1.3.1 Các dấu ấn vi rút học bệnh nhân viêm gan B mạn tính 1.3.2 Các xét nghiệm định lượng dấu ấn vi rút học 11 1.3.3 Vai trò dấu ấn phân tử HBV-RNA huyết 13 1.4 Các nghiên cứu quy trình định lượng HBV-RNA ứng dụng đánh giá đáp ứng điều trị VGBMT 17 1.4.1 Các nghiên cứu quy trình định lượng HBV-RNA giới 17 1.4.2 Các nghiên cứu quy trình định lượng HBV-RNA Việt Nam 22 1.5 Kỹ thuật Real time RT-PCR 23 1.5.1 Nguyên lý chung thiết kế kỹ thuật Real-time PCR 23 1.5.2 Phản ứng Real-time RT-PCR bước (one step RT-qPCR) 24 1.6 Phương pháp tách chiết axit nucleic 31 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Đối tượng nghiên cứu 35 2.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 35 2.3 Vật liệu nghiên cứu 35 2.3.1 Trang thiết bị, dụng cụ 35 2.3.2 Hóa chất 35 2.4 Phương pháp nghiên cứu 36 2.4.1 Phương pháp RT-qPCR bước 36 2.4.3 Phương pháp tách chiết RNA từ huyết 38 2.4.2 Phương pháp sản xuất enzyme Hotstar Taq DNA polymerase MMLV reverse transcriptase 39 2.5 Thiết kế nghiên cứu 40 i 2.5.1 Tối ưu hóa phản ứng Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA với Hotstart Taq DNA polymerase MMLV reverse transcriptase tự sản xuất 43 2.5.2 Tối ưu hóa quy trình tách chiết HBV-RNA từ huyết 48 2.5.3 Xác định đặc tính sinh phẩm định lượng HBV-RNA huyết xây dựng 48 2.5.4 Xây dựng quy trình bảo quản kit Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA 49 2.5.5 Thiết kế xây dựng quy trình chế tạo sinh phẩm Real-time RTPCR định lượng HBV-RNA 50 2.5.6 Ứng dụng quy trình xây dựng để chế tạo kit Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA 50 2.5.7 Xác định độ ổn định sinh phẩm Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA huyết người 51 2.5.8 Kiểm định thử nghiệm sinh phẩm Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA huyết người 52 2.6 Phương pháp xử lý số liệu 53 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 54 3.1 Thiết lập quy trình chế tạo sinh phẩm Real-time RT-PCR định lượng HBVRNA huyết người 54 3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng lượng enzyme Hotstart Taq DNA polymerase MMLV reverse transcriptase tự sản xuất đến hiệu khếch đại 54 3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng thành phần phản ứng tới hiệu khuếch đại phản ứng Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA 56 3.1.3 Tối ưu hóa quy trình tách chiết HBV-RNA từ huyết 64 3.1.4 Khảo sát đặc tính tồn quy trình phân tích định lượng HBV-RNA huyết người 68 3.1.5 Thử nghiệm khả bảo quản phản ứng Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA dạng đông khô dạng dung dịch 70 3.1.6 Quy trình chế tạo sinh phẩm Real-time RT-PCR định lượng HBVRNA huyết người 72 ii phẩm xác định qua phản ứng chéo với vi rút viêm gan A viêm gan C nhiễm chủ động vào mẫu huyết âm tính Kết phân tích mẫu giả nhiễm quy trình xây dựng cho thấy mẫu nhiễm chủ động với RNA HVA HCV cho kết âm tính (Cq > 40); mẫu nhiễm chủ động với RNA HBV cho giá trị Cq = 22,73 + 0,14 (Bảng 3.33) Như sinh phẩm Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA khơng có phản ứng chéo với HAV HCV Bảng 3.33 Độ đặc hiệu toàn quy trình phân tích kiểm định Mẫu tách chiết chứa RNA Cq Trung bình ± Độ lệch chuẩn HBV 22,73 ± 0,14 HAV > 40 HCV > 40 86 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ Kết luận Đã tối ưu yếu tố ảnh hưởng tới phản ứng Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA sử dụng enzyme Hotstar Taq DNA polymerase MMLV reverse transcriptase tự sản xuất, cụ thể: Lượng enzyme Hotstar Taq DNA polymerase : MMLV reverse transcriptase 0,25:0,5 µL/phản ứng 25 µL Nồng độ ion Mg2+: mM Nồng độ muối (NH4)2SO4: 10 mM Nồng độ muối KCl: 40 mM 75 mM Tris HCl: pH 8,8 Nhiệt độ trình bắt cặp kéo dài: 600C Đã tối ưu quy trình tách chiết HBV-RNA sử dụng Trizol để ly giải mẫu giả nhiễm, kết hợp với cột silica, đệm rửa WI WII tự sản xuất Đã xây dựng quy trình chế tạo kit Real-time RT-PCR định lượng HBVRNA dựa thông số tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA quy trình tách chiết HBV-RNA Đã sản xuất thử nghiệm mẻ sinh phẩm HBV-RNALOAD định lượng HBV-RNA với quy mô 10 kit 10 test/kit Đã xây dựng hướng dẫn sử dụng sinh phẩm HBV-RNALOAD Bộ sinh phẩm có khoảng định lượng từ 10 phiên bản/µL trở lên khơng có phản ứng chéo với HAV HCV Đã xây dựng quy trình bảo quản sinh phẩm Real-time RT-PCR định lượng HBV-RNA với hợp phần: Hợp phần tách chiết bảo quản nhiệt độ thường hợp phần Real-time RT-PCR bảo quản nhiệt độ -300C đến -180C Đã đánh giá đặc tính độ ổn định sau tháng bảo quản kit HBVRNALOAD cho kết khoảng định lượng từ 10 phiên bản/µL trở lên khơng có phản ứng chéo với HAV HCV Đã bước đầu thử nghiệm sinh phẩm HBV-RNALOAD định lượng HBV-RNA mẫu huyết giả nhiễm cho kết định lượng đạt u cầu khơng có phản ứng chéo với HAV HBV 87 Khuyến nghị Tiếp tục theo dõi độ ổn định sinh phẩm HBV-RNALOAD tới tháng định kỳ hàng tháng lấy mẫu để đánh giá Thử nghiệm sinh phẩm HBV-RNALOAD mẫu bệnh phẩm lâm sàng bệnh nhân viêm gan B mãn tính q trình điều trị với mức tải lượng HBV-DNA thấp Đánh giá hiệu sinh phẩm HBV-RNALOAD tiên lượng việc dừng thuốc ức chế trình phiên mã ngược HBV 88 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] World Health Orginazation, (WHO/CDS/CSR/LYO/2002.2:Hepatitis B)," 2002 "Hepatitis B [2] World Health Organization, "World Health OrganizationIntroduction of hepatitis B vaccine into childhood immunization services, WHO/V&B/01.31," 2001 [3] Bùi Xuân Trường Nguyễn Văn Bàng, “Tỷ lệ nhiễm virus viêm gan B/C kiểu gen virus viêm gan B thuộc khu vực biên giới Việt-Trung huyện Bát Xát tỉnh Lào Cai,” Tạp chí nghiên cứu Y học, tập 64(5), pp 52-59, 2009 [4] Nguyen CH and Azumi Ishizaki, "Prevalence of HBV infection among different HIV-risk groups in Hai Phong, Viet Nam," Journal of Medical Virology, vol 83(3), pp 399-404, 2011 [5] B Rehermann C Ferrari C Pasquinelli F V Chisari, "The hepatitis B virus persists for decades after patients' recovery from acute viral hepatitis despite active maintenance of a cytotoxic T-lymphocyte response," Nature Medicine, vol 2(10), pp 1104-8, 1996 Oct [6] Kock J Theilmann L Galle P Schlicht HJ, "Hepatitis B virus nucleic acids associated with human peripheral blood mononuclear cells not originate from replicating virus," Hepatology, vol 23, p 405–413, 1996 [7] L Jansen Neeltje A Kootstra Karel A van Dort R Bart Takkenberg Hendrik W Reesink Hans L Zaaijer, "Hepatitis B Virus Pregenomic RNA Is Present in Virions in Plasma and Is Associated With a Response to Pegylated Interferon Alfa-2a and Nucleos(t)ide Analogues," The Journal of Infectious Diseases, vol 213:224–32, 2016 [8] Ivana Carey Jeffrey Gersch Bo Wang Christiana Moigboi Mary Kuhns Gavin Cloherty Geoffrey Dusheiko Kosh Agarwal, "Pregenomic HBV RNA and Hepatitis B Core-Related Antigen Predict Outcomes in Hepatitis B e Antigen-Negative Chronic Hepatitis B Patients Suppressed on Nucleos(T)ide Analogue Therapy," Pubmed.gov, vol 72(1), pp 42-57, 2020 July [9] Tsuyoshi Hatakeyama Chiemi Noguchi Nobuhiko Hiraga Nami Mori Masataka Tsuge et al, "Serum HBV RNA is a predictor of early emergence of the YMDD mutant in patients treated with lamivudine," HEPATOLOGY , vol 45, p 1179–1186, 2007 [1 S L B Z J D V J S H Guo, "Serum HBV RNA: a New Potential 0] 89 Biomarker for Chronic Hepatitis B Virus Infection," Hepatology, 2018 [1 Andreas LaraJohn Koskinas Evangelini Dimou Ageliki Kostamena 1] Stephanos J Hadziyannis, "Intrahepatic levels and replicative activity of covalently closed circular hepatitis B virus DNA in chronically infected patients," Hepatology, vol 44(3), pp 694-702, 2006 Sep [1 Yayun Liu Meng Jiang Jianya Xue Hongli Yan & Xuesong Liang, "Serum 2] HBV RNA quantification: useful for monitoring natural history of chronic hepatitis B infection," BMC Gastroenterology, vol 19, no 53, 2019 [1 Alter HJ and Blumberg BS, "Further studies on a "new" human isoprecipitin 3] system (Australia antigen).," BLOOD, vol 27, no 3, pp 297-309, 1966 [1 C a B Dane, "VIRUS-LIKE PARTICLES IN SERUM OF PATIENTS 4] WITH AUSTRALIA-ANTIGEN-ASSOCIATED HEPATITIS," The Lancet, vol 295, no 7649, p 695–698, 1970 [1 Bộ môn vi sinh vật trường Đại học Y Hà Nội, Vi sinh vật y học, Hà 5] Nội, Nhà xuất Y học, 2013, pp 325-328 [1 Lee WM, "Hepatitis B virus infection," N Engl J Med, vol 337, pp 1733-45, 6] 1997 [1 Fung S K and Lok A S, "Hepatitis B virus genotypes: they play a role in 7] the outcome of HBV infection," Hepatology, vol 40(4), pp 790-792, 2004 [1 Liu C J and Kao J H, "Global perspective on the natural history of chronic 8] hepatitis B: role of hepatitis B virus genotypes A to J," Semin Liver Dis, vol 33(2), pp 97-102, 2013 [1 Ito K Yotsuyanagi H Yatsuhashi H et al, "Risk factors for long-term 9] persistence of serum hepatitis B surface antigen following acute hepatitis B virus infection in Japanese adults," Hepatology, vol 59(1), p 89–97, 2014 [2 Kapoor R and Kottilil S, "Strategies to eliminate HBV infection," Future 0] Virol, vol 9(6), p 565–85, 2014 [2 Mohube B Maepa Ilke Roelofse Abdullah Ely and Patrick Arbuthnot, 1] "Progress and Prospects of Anti-HBV Gene Therapy Development," International Journal of Molecular Sciences, vol 16, pp 17589-17610, 2015 [2 Christoph Seeger William S Mason, "Molecular biology of hepatitis B virus 2] infection," Virology, Vols 672-86, pp 479-480, 2015 May [2 S L a Z L Franco E Bagnato B Marino MG Meleleo C, "Hepatitis B: 3] Epidemiology and prevention in developing countries," World J Hepatol , 90 vol 4, pp 74-80, 2012 [2 Sharma SK Saini N and Chwla Y, "Hepatitis B virus: inactive carriers," Virol 4] J, vol 2:82, 2005 [2 Schweitzer A Horn J Mikolajczyk RT Krause G and Ott JJ, "Estimations of 5] worldwide prevalence of chronic hepatitis B virus infection: a systematic review of data published between 1965 and 2013," Lancet, vol 386, pp 1546-1555, 2015 [2 B Y t - V Nam, “Điểm tin y tế ngày 30/3/2019,” 2019 6] [2 World Health Orginazation, "Guidelines for the prevention, care and 7] treatment of persons with chronic hepatitis B infection," 2015 [2 World Health Orginazation, “Implementation of hepatitis B birth dose 8] vaccination – worldwide,” 2016 [2 Nguyễn Trần Chính cộng (Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí 9] Minh), Bệnh truyền nhiễm, Thành phố Hồ Chí Minh: Nhà xuất y học , 2006 [3 World Health Organization, "Hepatitis B," 18 July 2019 0] [3 Cục Y tế Dự phòng, “Tiêm vắc xin viêm gan b 24 sau sinh – 1] cách tốt phòng lây truyền viêm gan b từ mẹ sang con,” Cục Y tế Dự phòng, 15/03/2017 [3 Cục Y tế Dự phòng - Viêm Gan B [Trực tuyến] Available: 2] http://vncdc.gov.vn/vi/danh-muc-benh-truyen-nhiem/1102/benh-viem-ganvi-rut [3 Stevan A Gonzalez M D M S, "Hepatitis B Virus," E-Sun Technologies, Inc, 3] 2010-2017 [3 Fabien Zoulim and David Durantel, "Antiviral Therapies and Prospects for a 4] Cure of Chronic Hepatitis B," Cold Spring Harb Perspect Med, vol 5(4), p a021501, 2015 Apr [3 Jie Wang Tao Shen Xiangbo Huang et al, "Serum hepatitis B virus RNA is 5] encapsidated pregenome RNA that may be associated with persistence of viral infection and rebound," Journal of Hepatology, 2016 [3 Florian van Bömmel Anne Bartens Alena Mysickova Jörg Hofmann Detlev 6] H Krüger Thomas Berg Anke Edelmann, "Serum hepatitis B virus RNA levels as an early predictor of hepatitis B envelope antigen seroconversion during treatment with polymerase inhibitors," Hepatology, vol 61(1), pp 6691 76, 2015 Jan [3 J Jean-Michel Pawlotsky, "Molecular diagnosis of viral hepatitis," 7] Gastroenterology, vol 122(6), pp 1554-68, 2002 [3 J.Weiss H.Wu B.Farrenkopf T.Schultz G.Song S.Shah J.Siegel, "Real time 8] TaqMan PCR detection and quantitation of HBV genotypes A–G with the use of an internal quantitation standard," Journal of Clinical Virology, vol 30, no 1, pp 86-93, May 2004 [3 Lok AS Heathcote EJ Hoofnagle JH, "Management of hepatitis B: 2000, 9] summary of a workshop," 2001 [4 Chi-Jen Chu Anna Suk-Fong Lok, "Clinical utility in quantifying serum 0] HBV DNA levels using PCR assays," Journal of Hepatology, vol 36, no 4, pp 549-551, 2002 [4 F Bernard G Raymond B Willems J P Villeneuve, "Quantitative assessment 1] of serum hepatitis B e antigen, IgM hepatitis B core antibody and HBV DNA in monitoring the response to treatment in patients with chronic hepatitis B," J Viral Hepat, vol 4(4), pp 265-72, 1997 [4 Diepersloot RJ van Zantvliet-van Oostrom Y Gleaves CA, "Comparison of a 2] chemiluminescent immunoassay with two microparticle enzyme immunoassays for detection of hepatitis B virus surface antigen," Clin Diagn Lab Immunol, vol 7, p 865–866, 2000 [4 Cheng L Guan Q Zhang J Sun Z, "Discrepancies between two automated 3] immunoassay systems in determining hepatitis B virus markers in serum samples with concomitant presence of antigens and antibodies," Ann Clin Lab Sci, vol 40, p 49–52, 2010 [4 M Deguchi N Yamashita M Kagita S Asari Y Iwatani T Tsuchida et al, 4] "Quantitation of Hepatitis B surface Antigen by an automated chemiluminescent microparticle immunoassay," J Virol Methods, vol 115 , pp 217-222, 2004 [4 Gerin JL Ford EC Purcell RH, "Biochemical characterization of Australia 5] antigen Evidence for defective particles of hepatitis B virus," Am J Pathol, vol 8, pp 651-668, 1975 [4 Kaplan PM Ford EC Purcell RH Gerin JL, "Demonstration of subpopulations 6] of Dane particles," J Virol, vol 17, pp 885-893, 1976 [4 Sakamoto Y Yamada G Mizuno M Nishihara T Kinoyama S Kobayashi T et 7] al, "Full and empty particles of hepatitis B virus in hepatocytes from patients 92 with HBsAg-positive chronic active hepatitis," Lab Invest, vol 48, pp 678682, 1983 [4 Butler E Gersch J McNamara A et al, "Hepatitis B virus serum DNA and 8] RNA levels in nucleos(t)ide analog-treated or untreated patients during chronic and acute infection," Hepatology, vol 68(6), pp 2106-2117, 2018 Dec [4 Yutang Li Lingyuan He Yao Li et al, "Characterization of Serum HBV RNA 9] in Patients with Untreated HBeAg-Positive and -Negative Chronic Hepatitis B Infection," Hepatitis Monthly, vol 18 (2), p e62079, 2018 [5 M.J van Campenhout et al, "Serum hepatitis B virus RNA level is associated 0] with hepatitis B virus genotype and BCP mutations in untreated patients with HBeAg positive chronic hepatitis B," Journal of Hepatology, vol 66, no 1, pp S253-S254, 2017 [5 Yuhua Gao Yutang Li Qinghua Meng et al, "Serum Hepatitis B Virus DNA, 1] RNA, and HBsAg: Which Correlated Better with Intrahepatic Covalently Closed Circular DNA before and after Nucleos(t)ide Analogue Treatment?," Journal of Clinical Microbiology , vol 55(10), p 2972–2982, 2017 Oct [5 Masataka Tsuge & Kazuaki Chayama, "Availability of monitoring serum 2] HBV DNA plus RNA during nucleot(s)ide analogue therapy," Journal of Gastroenterology, vol 48, p 779–780, 2013 [5 Ming-Lun Yeh Cheng-Yuan Peng Chia-Yen Dai et al, "Pegylated-Interferon 3] Alpha Therapy for Treatment-Experienced Chronic Hepatitis B Patients," PLoS One, vol 10(4), p e0122259, 2015 [5 Patrick Marcellin and Tarik Asselah, "Long‐term therapy for chronic 4] hepatitis B: Hepatitis B virus DNA suppression leading to cirrhosis reversal," Journal of Gastroenterology and Hepatology , vol 28, no 6, pp 912-923, 2013 [5 Werle-Lapostolle B et al, "Persistence of cccDNA during the natural history 5] of chronic hepatitis B and decline during adefovir dipivoxil therapy," Gastroenterology, vol 126, p 1750–1758, 2004 [5 Stéphane Chevaliez Christophe Hézode Stéphane Bahrami Marion Grare and 6] Jean-Michel Pawlotsky, "Long-term hepatitis B surface antigen (HBsAg) kinetics during nucleoside/nucleotide analogue therapy: finite treatment duration unlikely," J Hepatol, vol 58(4), pp 676-83, 2013 Apr [5 T Gerelsaikhan J E Tavis and V Bruss, "Hepatitis B virus nucleocapsid 7] 93 envelopment does not occur without genomic DNA synthesis," J Virol, vol 70(7), pp 4269-74, 1996 Jul [5 Alan M Roseman John A Berriman Samantha A Wynne P Jonathan G Butler 8] and R Anthony Crowther, "A structural model for maturation of the hepatitis B virus core," Proc Natl Acad Sci U S A, vol 102(44), p 15821–15826, 2005 Nov [5 Zoulim F Locarnini S, "Hepatitis B virus resistance to nucleos(t)ide 9] analogues," Gastroenterology, vol 137(5), pp 1593-608.e1-2., 2009 Nov [6 Gish R Jia JD Locarnini S Zoulim F, "Selection of chronic hepatitis B 0] therapy with high barrier to resistance," Lancet Infect Dis, vol 12(4), pp 341-53, 2012 Apr [6 Sun J Xie Q Tan D Ning Q Niu J et al, "The 104-week efficacy and safety of 1] telbivudine-based optimization strategy in chronic hepatitis B patients: a randomized, controlled study," Hepatology, vol 59(4), pp 1283-92, 2014 Apr [6 Gane EJ Deray G Liaw YF et al, "Telbivudine improves renal function in 2] patients with chronic hepatitis B," Gastroenterology, vol 146(1), pp 138146.e5, 2014 Jan [6 Masataka Tsuge Eisuke Murakami Michio Imamura et al, "Serum HBV 3] RNA and HBeAg are useful markers for the safe discontinuation of nucleotide analogue treatments in chronic hepatitis B patients," Journal of Gastroenterology , vol 48, p 1188–1204, 2013 [6 Wei Zhang Hans Jörg Hacker et al, "Detection of HBV RNA in serum of 4] patients," Methods in molecular medicine , vol 95, pp 29-40, 2004 [6 Ni Lin Aizhu Ye Jinpiao Lin Can Liu et al, "Diagnostic Value of Detection 5] of Pregenomic RNA in Sera of Hepatitis B Virus-Infected Patients with Different Clinical Outcomes," J Clin Microbiol, 2019 [6 Paterlini P and Bréchot C, "The detection of hepatitis B virus (HBV) in 6] HBsAG negative individuals with primary liver cancer," Digestive Diseases and Sciences, vol 36(8), pp 1122-1129, 01 Aug 1991 [6 Sallie R, "Selective detection of hepatitis B virus RNA by PCR," PCR 7] Methods Appl, vol 3, p 376‐377, 1994 [6 Lai KN Ho RT Tam JS Lai FM, "Detection of hepatitis B virus DNA and 8] RNA in kidneys of HBV related glomerulonephritis," Kidney Int, vol 50, p 1965‐1977, 1996 94 [6 Su Q Wang SF Chang TE Breitkreutz R Hennig H Takegoshi K et al, 9] "Circulating hepatitis B virus nucleic acids in chronic infection: representation of differently polyadenylated viral transcripts during progression to nonreplicative stages," Clin Cancer Res , vol 7, p 2005‐2015, 2001 [7 Kairat A Beerheide W Zhou G Tang ZY Edler L and Schroder CH, 0] "Truncated hepatitis B virus RNA in human hepatocellular carcinoma: its representation in patients with advancing age," Intervirology, vol 42, p 228‐ 237, 1999 [7 van Bommel F Bartens A Mysickova A Hofmann J Kruger DH Berg T et al, 1] "Serum hepatitis B virus RNA levels as an early predictor of hepatitis B envelope antigen seroconversion during treatment with polymerase inhibitors," Hepatology , vol 61, p 66‐76, 2015 [7 Gao Y Li Y Meng Q Zhang Z Zhao P Shang Q et al, "Serum hepatitis B 2] virus DNA, RNA, and HBsAg: which correlated better with intrahepatic covalently closed circular dna before and after nucleos(t)ide analogue treatment?," J Clin Microbiol , vol 55, p 2972‐29, 2017 [7 van Campenhout MJH van Bommel F Pfefferkorn M Fischer J Deichsel D 3] Boonstra A et al, "Host and viral factors associated with serum hepatitis B virus RNA levels among patients in need for treatment," Hepatology , vol 68, p 839‐847, 2018 [7 Rokuhara A Matsumoto A Tanaka E Umemura T Yoshizawa K Kimura T et 4] al, "Hepatitis B virus RNA is measurable in serum and can be a new marker for monitoring lamivudine therapy," J Gastroenterol , vol 41, p 785‐790, 2006 [7 Prakash K Rydell GE Larsson SB Andersson M Norkrans G Norder H et al, 5] "High serum levels of pregenomic RNA reflect frequently failing reverse transcription in hepatitis B virus particles," Virol J , vol 15:86, 2018 [7 Huang YW Takahashi S Tsuge M Chen CL Wang TC Abe H et al, "On‐ 6] treatment low serum HBV RNA level predicts initial virological response in chronic hepatitis B patients receiving nucleoside analogue therapy," Antivir Ther , vol 20, p 369‐375, 2015 [7 Lam AM Ren S Espiritu C Kelly M Lau V Zheng L et al, "Hepatitis B virus 7] capsid assembly modulators, but not nucleoside analogs, inhibit the production of extracellular pregenomic rna and spliced rna variants," Antimicrob Agents Chemother , vol 61, p e00680‐17, 2017 95 [7 Ying Liu Munira Hussain Stephen Wong Scott K Fung Hyung Joon Yim and 8] Anna S F Lok, "A Genotype-Independent Real-Time PCR Assay for Quantification of Hepatitis B Virus DNA," JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, vol 45, no 2, p 553–558, 2007 [7 Abraham TM and Loeb DD, "The topology of hepatitis B virus pregenomic 9] RNA promotes its replication," J Virol, vol 81(21), p 11577–84, 2007 [8 Takara Bio Blog Team, "One-step vs two-step RT-qPCR—tips for choosing 0] the right protocol," website for Clontech, Takara and Cellartis products, 2018 [8 NEB Choice of One-Step RT-qPCR or Two-Step RT-qPCR 1] [8 Elena Hidalgo Ashrafi Joyclyn Yee and Natasha Paul, "Selective control of 2] primer usage in multiplex one-step reverse transcription PCR," BMC Molecular Biology, vol 10:113, 2009 [8 Michael J Wacker and Michael P Godard, "Analysis of One-Step and 3] TwoStep Real-Time RT-PCR Using SuperScript III," Journal of Biomolecular Techniques, vol 16, p 266–271 © 2005 ABRF, 2005 [8 One-step Vs Two-step real-time RT PCR Bioline meridian bioscience 4] [8 Roberts JD Bebenek K Kunkel TA, "The accuracy of reverse transcriptase 5] from HIV-1," p Science 242:1171, 1988 [8 Gerard G F Fox D K Nathan M & D Alessio J M, "Reverse 6] Transcriptase:The Use of Cloned Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptaseto Synthesize DNA from RNA," Molecular Biotechnology, vol 8(1), p 61–77, 1997 [8 Invitrogen Reverse Transcriptase Attributes—Six Key Considerations 7] [8 Gerard G F DAlessio J M and Kotewicz M L, "cDNA synthesis by cloned 8] Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase lacking RNase H activity," 1989 [8 Bahram Arezi and Holly Hogrefe, "Novel mutations in Moloney Murine 9] Leukemia Virus reverse transcriptase increase thermostability through tighter binding to template-primer," Nucleic Acids Res, vol Feb; 37(2), p 473–481, 2009 [9 Gary F Gerard a R Jason Potter Michael D Smith Kim Rosenthal Gulshan 0] Dhariwal Jun Lee and Deb K Chatterjee, "The role of template-primer in protection of reverse transcriptase from thermal inactivation," Nucleic Acids 96 Res, vol 30(14), Jul 15, 2002 [9 Yuta katano et al, "Generation of thermostable Moloney murine leukemia 1] virus reverse transcriptase variants using site saturation mutagenesis library and cell-free protein expression system," Bichemistry and Molecular Biology , pp 2339-2345, 2017 [9 Baranauskas A Paliksa S Alzbutas G et al, "Generation and characterization 2] of new highly thermostable and processive M-MuLV reverse transcriptase variants," Protein Eng Des Sel, vol 25(10), p 657–668, 2012 [9 Thermofisher, "https://assets.thermofisher.com," 3] https://assets.thermofisher.com/TFS- [Online] Available: Assets/LSG/manuals/MAN0012016_TaqDNAPolymerase_5_UuL_500U_U G.pdf [9 Promega, "https://worldwide.promega.com," [Online] Available: 4] https://worldwide.promega.com/-/media/files/resources/protocols/productinformation-sheets/g/m-mlv-reverse-transcriptase-protocol.pdf?la=en [9 Ampliqon, "https://ampliqon.com," [Online] 5] https://ampliqon.com/download.ashx?sku=A102103 Available: [9 Qiagen Outstanding performance in real-time PCR Sample & Assay 6] Technologies, 2010 [9 Invitrogen™ SuperScript™ III Platinum™ One-Step qRT-PCR Kit Thermo 7] Fisher Scientific 11732-020 11732-088 [9 Integrated DNA Technologies (2005,2011) The Polymerase Chain Reaction 8] [9 Tan SC and Yiap BC, "Review: DNA, RNA, and protein extraction: the past 9] and the present," J Biomed Biotechnol, vol 2009():574398, 2009 [1 00 ] [1 01 ] [1 02 ] Doyle K, "The Source of Discovery: Protocols and Applications Guide," Madison, Wis, USA: Madison, 1996 Lesk AM, "Why does DNA contain thymine and RNA uracil?," J Theor Biol, vol 22(3), pp 537-40, 1969 Mar Chacon-cortes D Griffiths L Chacon-Cortes D, "Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples: current perspectives," Journal of Biorepository Science for Applied Medicine, vol 2, p 1–9, 2014 [1 Price CW Leslie DC and Landers JP, "Nucleic acid extraction techniques and 03 application to the microchip," Lab Chip, vol 9(17), pp 2484-94, 2009 Sep ] 97 [1 04 ] [1 05 ] Goldberg S, "Review: Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization," Methods Mol Biol, vol 424, pp 3-22, 2008 Mitra S, "Sample preparation techniques in analytical chemistry," In: Winefordner J D., editor Chemical Analysis - A Series of Monographs on Analytical Chemistry and Its Applications, Hoboken, NJ, USA: John Wiley & Sons, Inc, vol 162, 2003 [1 06 ] [1 07 ] Burden D, "Guide to the Disruption of Biological Samples," Random Prim., [1 08 ] [1 09 ] Salazar O and Asenjo JA, "Review: Enzymatic lysis of microbial cells," Biotechnol Lett, vol 29(7), pp 985-94, 2007 Jul vol 25(12), p 25, 2012 Flahaut S Frere J Boutibonnes P and Auffray Y, "Comparison of the bile salts and sodium dodecyl sulfate stress responses in Enterococcus faecalis," Appl Environ Microbiol, vol 62(7), pp 2416-20, 1996 Jul Chomczynski P and Sacchi N, "Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.," Anal Biochem, vol 162(1), pp 156-9, 1987 Apr [1 Chomczynski P and Sacchi N, "The single-step method of RNA isolation by 10 acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty] something years on," Nat Protoc, vol 1(2), pp 581-5, 2006 [1 Terry CF Harris N and Parkes HC, "Detection of genetically modified crops 11 and their derivatives: critical steps in sample preparation and extraction," J ] AOAC Int , vol 85(3), pp 768-74, 2002 May-Jun [1 Demeke T and Jenkins GR, "Review: Influence of DNA extraction methods, 12 PCR inhibitors and quantification methods on real-time PCR assay of ] biotechnology-derived traits," Anal Bioanal Chem, vol 396(6), pp 1977-90, 2010 Mar [1 Vogelstein B and Gillespie D, "Preparative and analytical purification of 13 DNA from agarose," Proc Natl Acad Sci U S A., vol 76(2), pp 615-9, 1979 ] Feb [1 Esser K H Marx W H Lisowsky T maxXbond, "First regeneration system for 14 DNA binding silica matrices," Nature Methods, vol 3(1), pp 2005-2006, ] 2006 [1 V Padhye V York C and Adam B, "Nucleic acid purification on silica gel and 15 glass mixture," United States patent US 5658548 Promega Corporation, ] 98 1997 [1 16 ] [1 17 ] Mutiu AI and Brandl CJ, "RNA isolation from yeast using silica matrices," J Biomol Tech, vol 16(4), pp 316-7, 2005 Dec Archer MJ Lin B Wang Z and Stenger DA, "Magnetic bead-based solid phase for selective extraction of genomic DNA," Anal Biochem, vol 355(2), pp 285-97, 2006 Aug 15 [1 Azimi S M Nixon G Ahern J Balachandran W, "A magnetic bead-based 18 DNA extraction and purification microfluidic device," Microfluidics and ] Nanofluidics, vol 11(2), p 157–165, 2011 [1 Berensmeier S, "Review: Magnetic particles for the separation and 19 purification of nucleic acids," Appl Microbiol Biotechnol, vol 73(3), pp ] 495-504, 2006 Dec [1 Franzreb M Siemann-Herzberg M Hobley TJ and Thomas OR, "Review: 20 Protein purification using magnetic adsorbent particles," Appl Microbiol ] Biotechnol, vol 70(5), pp 505-16, 2006 May [1 R-Biopharm AG, "https://clinical.r-biopharm.com," [Online] Available: 21 https://clinical.r-biopharm.com/wp] content/uploads/sites/3/2017/10/K7421_Toxocara_2016-06-10_GB.pdf [1 Qiagen, "RNeasy Mini Kit," [Online] Available: 22 https://www.qiagen.com/vn/products/discovery-and-translational] research/dna-rna-purification/rna-purification/total-rna/rneasy-minikit/?clear=true#orderinginformation [1 23 ] [1 24 ] Thermo Fisher [Online] Available: https://www.fishersci.com/shop/products/trizol-reagent/15596018 Thermo Fisher, "https://www.thermofisher.com/," PCR Setup—Six Critical Components to Consider, [Online] Available: https://www.thermofisher.com/vn/en/home/life-science/cloning/cloninglearning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/pcr-education/pcrreagents-enzymes/pcr-component-considerations.html [1 GE Healthcare Group, "mRNA Purification Kit," [Online] Available: 25 https://www.cytivalifesciences.co.jp/tech_support/manual/pdf/27925801pl.p ] df?fbclid=IwAR3kyv4TN6aPK1CqrHXVrQB1wDgp4ym5siTvuxv5HlXth3iZDevUa6hCPs [1 M M Blanchard P Taillon-Miller P Nowotny and V Nowotny, "PCR buffer 26 optimization with uniform temperature regimen to facilitate automation," 99 ] Genome Research, vol 2, pp 234-240, 1993 [1 Merck, "Nucleases (DNases and RNases)," [Online] Available: 27 https://www.sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics/enzyme] explorer/learningcenter/nucleases.html?fbclid=IwAR3LcrB48CZgg180xnvFBAcO3QG64oRu jpW02aixP4hDM4UduvONV33BfQ#:~:text=The%20pH%20range%20for%20activity,8.5%20at%2030%20% C2%B0C [1 Donald C Rio Manuel Ares Jr Gregory J Hannon and Timothy W Nilsen, 28 "Protocol: Purification of RNA Using TRIzol (TRI Reagent)," Cold Spring ] Harbor Laboratory Press-The University of Edinburgh, 2019 [1 29 ] [1 30 ] [1 31 ] Invitrogen™ SuperScript™ III Reverse Transcriptase Thermo Fisher Scientific 18080093 Thermofisher [Online] Available: https://assets.thermofisher.com/TFSAssets/LSG/manuals/superscriptIII_man.pdf “Applied Biosystems™ AmpliTaq Gold™ DNA Polymerase with Buffer II and MgCl2 Thermo Fisher Scientific N8080241,” [Trực tuyến] Available: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/N8080241#/N8080241 100 ... định lượng HBV- RNA, đề xuất đề tài: ? ?Hoàn thiện kiểm định sinh phẩm Real- time RT- PCR định lượng HBV- RNA huyết người? ?? với hai mục tiêu: Hồn thiện quy trình phân tích định lượng HBV- RNA huyết người. .. dựa kỹ thuật real- time RT- PCR; Sản xuất thử nghiệm kiểm định sinh phẩm real- time RT- PCR định lượng HBV- RNA huyết người Kết luận văn hồn thiện quy trình phâm tích định lượng HBVRNA huyết thnah... lượng HBV- RNA, tơi đề xuất đề tài: “Hồn thiện kiểm định sinh phẩm real- time RT- PCR định lượng HBVRNA huyết người? ?? với hai mục tiêu: Hoàn thiện quy trình phân tích định lượng HBV- RNA huyết người dựa