Xây dựng quy trình chiết tách HCA từ vỏ bứa khô ở qui mô pilot

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA HÓA -   - XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH AXIT HYDROXYCITRIC TỪ VỎ BỨA KHƠ QUI MƠ PILOT KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KHOA HỌC SVTH : Trần Lê Anh Vũ Lớp : 08CHD GVHD: ThS Trần Thị Ngọc Bích PHẦN MỞ ĐẦU Trong xu tìm hiểu khai thác nguồn nguyên liệu thực phẩm, dược liệu có nguồn gốc từ thiên nhiên, tơi tìm đến với loại bứa Cây bứa có tên khoa học Garcinia Cambogia, thuộc họ Bứa Clusiaceae, có nguồn gốc từ Ấn Độ sống phổ biến Đông Nam Á, Nam Mỹ, Tây Trung Phi… Tại Việt Nam, loại phân bố phổ biến vùng núi thấp từ Khánh Hịa đến Bà Rịa-Vũng Tàu, Kon Tum, Cơn Đảo… Lá bứa biết đến từ lâu bữa ăn người Ấn Độ, xem gia vị khơng thể thiếu bữa ăn có vị chua đặc trưng Tuy nhiên ngày người ta hướng đến việc nghiên cứu ứng dụng bứa lĩnh vực khác thực phẩm, y học… Theo tài liệu nước ngồi vỏ bứa có chứa hàm lượng lớn axit hydroxy citric (HCA) có tác dụng ngăn chặn q trình tích mỡ cải thiện bilance máu, kìm hãm trình chuyển hóa lượng đường thừa thể thành mỡ, giúp ngăn chặn trình béo phì Đặc biệt, HCA đạt hiệu cao người dư cân có chế độ ăn q nhiều bột đường Ngồi HCA cải thiện giảm loại mỡ xấu cho sức khỏe tryglicerid, CDL cholesterol, cholesterol toàn phần tăng HDL cholesterol loại mỡ có tác dụng bảo vệ thành mạch Bên cạnh đó, HCA làm tăng nồng độ serotonin, chất dẫn truyền thần kinh chủ yếu có vai trị kiểm sóat thèm ăn cảm xúc, làm tăng trình tổ hợp glycogen tăng độ oxi hóa, đốt cháy mỡ thừa Mặc dù giới việc nghiên cứu bứa để tinh chế HCA trọng, nước ta khơng nhiều Tất cũng dừng lại qui mơ phịng thí nghiệm Với nguồn ngun liệu tương đối lớn bứa nước ta, không phát triển lên thành quy mô sản xuất công nghiệp thật lãng phí Nhưng trước hết, cần nghiên cứu triển khai mơ hình trung gian mơ hình pilot Thành cơng bước phát triển lên thành quy mơ cơng nghiệp Với qui mơ lớn dùng vỏ bứa khô tối ưu Với tất lí trên, định chọn đề tài: “Xây dựng quy trình chiết tách HCA từ vỏ bứa khô ở qui mô pilot” CHƯƠNG - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Công nghệ chiết xuất - Vấn đề thiết Hiện số lượng dược phẩm sản xuất nước, thuốc thực phẩm chức năng, phong phú Theo báo cáo Bộ Y tế, tính đến năm 2011 có tới 1086 chế phẩm thuốc Ðông y lưu hành thị trường Tuy nhiên chất lượng sản phẩm trở thành vấn đề thiết Yếu tố định chất lượng Ở tất khâu từ trồng trọt, thu hái, bào chế, bảo quản để đảm bảo dược liệu có đủ tiêu chuẩn: đúng, tốt, tinh khiết có bất cập, có vấn đề cơng nghệ chiết xuất dược liệu Hình 1.1 Cơng nhân Cơng ty Dược liệu Sìn Hồ (Lai Châu) thu hái thuốc Cơng nghệ chiết xuất dược liệu có vai trị quan trọng việc định đến chất lượng, độ an toàn hiệu dược phẩm Đây khác tân dược mà nguyên liệu biết rõ thành phần hóa học với Đơng dược có nguồn gốc cỏ, thành phần phức tạp nhiều trường hợp chưa xác định thành phần có tác dụng Mỗi Đơng dược thành phẩm có đạt yêu cầu tiêu chuẩn hóa hay không cũng liên quan tới việc định lượng hoạt chất hay chất đặc trưng dược liệu Điều thực hai cách: thiết lập phổ hay sắc ký đồ đối chiếu thành phẩm tiêu chuẩn để so sánh tiến hành kiểm tra, kiểm sốt tồn q trình sản xuất Chưa đầu tư mức Có nghịch lý là, nguồn dược liệu nước ta phong phú với gần 4000 thuốc trực tiếp làm thuốc để tách chiết số hoạt chất bào chế Đông dược thành phẩm ngành dược lại phải phụ thuộc nhiều vào nguyên liệu nhập Năm 2008, theo thống kê Cục Quản lý dược Việt Nam cho thấy, thuốc sản xuất nước đáp ứng 50,18% nhu cầu sử dụng với 90% nguyên liệu sản xuất phải nhập từ nước người Báo cáo Bộ Y tế hội nghị tổng kết chính sách quốc gia y dược học cổ truyền 2003 - 2010 cũng rõ: công tác phát triển dược liệu mang tính tự phát, chất lượng dược liệu chưa kiểm soát thường xuyên, hệ thống cung ứng dược liệu thuốc thành phẩm cịn nhỏ lẻ Trung bình tỉnh sử dụng khoảng 42 dược liệu/năm, nguồn dược liệu nước chiếm 51,56%, nước chiếm 48,44% (nhiều thời điểm nước dược liệu phải nhập đến 90%) Hình 1.2 Sản xuất thuốc đông dược Công ty cổ phần dược phẩm Trung ương Theo ý kiến số chuyên gia, tình trạng phụ thuộc nước ta chưa đầu tư mức vào công nghệ tách chiết tinh khiết để khai thác nguồn dược liệu q giá sẵn có Trên thực tế, cơng nghiệp chiết xuất chưa phát triển, hầu chưa có nhà máy chiết xuất lớn theo nghĩa Các sở thường tự xây dựng phân xưởng chiết xuất nhỏ phục vụ cho nhu cầu riêng Phương pháp chiết xuất chủ yếu nấu cao, cô cao trực tiếp áp suất thường không khí điều kiện nhiệt độ không chuẩn xác Các sở chiết dược liệu vùng trồng (nếu có) cũng chủ yếu sở nhỏ chế biến loại cao định với trang thiết bị thô sơ Một vài doanh nghiệp nắm bắt phát triển thị trường bắt đầu đầu tư nhà máy chiết xuất vùng nguyên liệu Tuy nhiên, phần lớn trang thiết bị nhà máy dùng để “nấu cao” quy mơ lớn có hỗ trợ máy móc Một số sở nhỏ có thiết bị đại (chiết có gia nhiệt với dung môi cồn, cồn - nước, cô thu hồi dung môi áp suất giảm…) lại thiếu quy trình chiết, sản phẩm chiết có chất lượng cao đặc trưng cho sở, có sản lượng đủ lớn cạnh tranh với nước Việc đầu tư thiết bị chiết xuất, dây chuyền chiết xuất đại với quy trình chiết xuất dược liệu tiên tiến, hiệu ý tưởng hay mơ ước 1.2 Phương pháp nghiên cứu sản xuất thuốc Sự đòi hỏi thường xuyên điều trị bệnh có tác dụng thúc đẩy mạnh mẽ việc nghiên cứu sản xuất thuốc Đối với quốc gia, vấn đề vô quan trọng chiến lược bảo vệ sức khỏe người Hiện việc nghiên cứu đưa thuốc vào sản xuất thường có hai xu hướng: 1.2.1 Nghiên cứu tìm kiếm hợp chất dùng làm thuốc Trên sở phát minh nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác sinh học, dược lí…về hợp chất tự nhiên có tác dụng sinh học, nhà hóa học xác định cấu trúc phân tử tổng hợp chất với dẫn xuất Kết có loạt hợp chất cho nhà sinh học, dược lí…tiến hành thử tác dụng sinh học, dược lí nhằm tạo dược chất đáp ứng yêu cầu điều trị Con đường khó hàng trăm chí hàng ngàn hợp chất điều chế có vài chất chọn để điều trị 1.2.2 Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất Nhiệm vụ chủ yếu tìm phương pháp tổng hợp mới, sở xây dựng quy trình tiện lợi hơn, kinh tế để sản xuất hợp chất sử dụng điều trị Xu hướng nghiên cứu thường thực trường hợp sau: - Các phương pháp tổng hợp quy trình sản xuất cũ lạc hậu, khơng kinh tế, khơng có khả sản xuất quy mô công nghiệp Đến nhờ phát triển cơng nghệ tổng hợp hữu cơ, có khả thay đổi phương pháp tổng hợp đại hơn, kinh tế - Các hợp chất chiết xuất từ tự nhiên có hoạt tính sinh học cao, dùng làm thuốc, nguồn nguyên liệu tự nhiên cạn kiệt, không đáp ứng đủ nhu cầu điều trị cần phải nghiên cứu phương pháp tổng hợp, bán tổng hợp - Do nguyên nhân khơng mua quyền sáng chế, phải nghiên cứu tìm phương pháp khác để sản xuất dược chất biết (Hiện nước phát triển mua lại phát minh hết quyền để tiết kiệm chi phí nghiên cứu rút ngắn thời gian đưa thuốc sử dụng vào sản xuất) Việc đưa thuốc vào sản xuất theo xu hướng cũng gồm bước sau: + Nghiên cứu tổng hợp qui mơ phịng thí nghiệm: R (Research) + Nghiên cứu triển khai qui mô pilot: D (Develop) + Nghiên cứu sản xuất quy mô công nghiệp: P (Production) 1.2.3 Nghiên cứu tổng hợp ở quy mơ phịng thí nghiệm - Đầu tiên cần tra cứu, thu thập tài liệu đầy đủ tốt hợp chất cần nghiên cứu tổng hợp như: phương pháp tổng hợp, phương pháp xác định cấu trúc, số hóa lí, phương pháp kiểm nghiệm, tác dụng sinh học… - Trên sở tài liệu tra cứu được, phân tích chọn lọc nội dung phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm, điều kiện sản xuất nước Sau tiến hành thí nghiệm quy mơ nhỏ để khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất sản phẩm (tác nhân phản ứng, xúc tác dung môi, nhiệt độ, tỷ lệ mol chất tham gia phản ứng, nồng độ, thời gian phản ứng…), khảo sát phương pháp xử lí sau phản ứng, phương pháp tinh chế, khả thu hồi dư chất, phương pháp xác định cấu trúc, độ ổn định quy trình,… - Sau có sản phẩm tinh khiết, tiến hành thử hoạt tính sinh học (in vitro, in vivo), thử tác dụng dược lí, độc tính động vật thí nghiệm, thử tiền lâm sàng lâm sàng - Xây dựng quy trình điều chế hoạt chất đạt tiêu chuẩn dược dụng (theo tiêu chuẩn ngành tiêu chuẩn Dược điển) Nội dung quy trình phịng thí nghiệm: Trên sở kết nghiên cứu, viết thành quy trình phịng thí nghiệm để nhà chun mơn dựa vào thực nghiên cứu triển khai qui mô pilot Một quy trình phịng thí nghiệm Hóa dược gồm nội dung sau: Tên đề tài: cần ghi rõ tên đề tài, bước phản ứng, chất trung gian sản phẩm tạo thành Tên sản phẩm: cần viết tên khoa học theo tài liệu tên gọi sử dụng nhà máy xí nghiệp sản xuất Các số hóa học, vật lí: cần nêu cơng thức cấu tạo, công thức nguyên, phân tử lượng, màu sắc, dạng tinh thể, điểm chảy, độ sôi sản phẩm Riêng độ hịa tan cần nêu kỹ loại dung mơi lượng chất hịa tan nhiệt độ khác Các điều cần biết độ bền vững, điều kiện bảo quản sản phẩm số liệu liên quan tác dụng sinh học Yêu cầu chất lượng sản phẩm: cần đưa yêu cầu tài liệu tham khảo kết thân đạt tiêu chất lượng sản phẩm màu sắc, mùi vị, tính chất vật lí… Ví dụ điểm chảy tài liệu ghi 1300C, phản ứng điểm chảy cần 1250C đạt yêu cầu quy trình cũng ghi điểm chảy Lịch sử tóm tắt sản phẩm: phương pháp sản xuất, nơi sản xuất, người phát minh thời gian làm sản phẩm Các phương trình phản ứng điều chế, phân tử lượng, tỷ lệ mol thực dùng, điểm sôi, điểm chảy, số tính chất chất tham gia phản ứng… Quy trình tóm tắt: ghi quy trình cách tóm tắt điểm cần lưu ý Liệt kê tên nguyên liệu, phụ liệu cần thiết cho quy trình, ghi rõ yêu cầu chất lượng số lượng Quy trình chi tiết: mô tả chi tiết cách tiến hành, liệt kê thiết bị, nêu chi tiết số liệu để nhà chuyên môn biết cách thực thí nghiệm 10 An toàn bảo hộ lao động: cần ghi rõ điểm cần ý an toàn lao động trình tiến hành thí nghiệm 11 Một số kinh nghiệm thực thí nghiệm: cần ghi lại kinh nghiệm cá nhân trình tiến hành thí nghiệm ngồi mơ tả quy trình chi tiết 12 Chỉ tiêu nguyên liệu phụ liệu: cần phải tính tóan tiêu nguyên liệu, phụ liệu, dung môi cần thiết cho kg sản phẩm 13 Các tài liệu tham khảo: cần trích dẫn tài liệu tham khảo liên quan đến đề tài thu thập 14 Thời gian, địa điểm, họ tên người tham gia tiến hành đề tài nghiên cứu chữ ký (có ghi rõ họ tên) người viết qui trình 1.2.4 Nghiên cứu triển khai ở qui mô pilot Nhiệm vị chính giai đoạn giải vấn đề kỹ thuật “to hóa: qui trình tối ưu điều kiện thí nghiệm Đặc biệt lưu ý đến vấn đề nảy sinh mở rộng qui mơ thí nghiệm an tồn sản xuất, chất lượng sản phẩm, hiệu kinh tế…để tránh sai phạm khơng thấy qui mơ phịng thí nghiệm Cần nghiên cứu giải vấn đề cụ thể sau: - Vấn đề dung mơi: tìm cách thay dung môi dễ cháy nổ, độc hại dung mơi an tồn hơn, thay dung mơi đắt tiền dung môi rẻ - Vấn đề phương thức nạp liệu: tối ưu hóa cách thức nạp liệu cho phù hợp cho thiết bị toàn dây chuyền sản xuất - Vấn đề liên tục hóa q trình: nghiên cứu thay cơng đoạn sản xuất gián đoạn thành trình liên tục - Vấn đề phân lập tinh chế sản phẩm: nghiên cứu phương pháp phân lập tinh chế sản phẩm cho phù hợp với qui mô sản xuất lớn - Về theo dõi điểm kết thúc phản ứng - Về vấn đề phương pháp thao tác, gia nhiệt - Vấn đề thiết bị: yêu cầu vật liệu làm thiết bị loại thiết bị cần sử dụng - Vấn đề thu hồi, xử lý dung môi sản phẩm phụ - Vấn đề định mức nguyên liệu vật tư, thời gian cho qui trình sản xuất 1.2.5 Xây dựng qui trình sản xuất ở qui mô công nghiệp Từ kết nghiên cứu trên, tổng kết viết thành qui trình qui mơ sản xuất cơng nghiệp Qui trình bao gồm giai đoạn sản xuất cụ thể Mỗi giai đoạn có thao tác kỹ thuật để tạo sản phẩm trung gian thành phẩm Cụ thể hóa định mức vật tư nguyên liệu, lượng, thời gian sản xuất, lựa chọn bố trí thiết bị, phương pháp xử lý, thu hồi dung môi sản phẩm phụ…Với qui trình chi tiết người cơng nhân sản xuất sản phẩm theo yêu cầu Mơ hình thí nghiệm quy mơ pilot nhằm phục vụ hoạt động đào tạo tiến hành nghiên cứu, thí nghiệm chuyển giao công nghệ để phục vụ ứng dụng vào thực tiễn sản xuất 1.3 CÂY BỨA (garcinia CAMBOGIA): 1.3.1 Phân bố Cây Bứa thuộc họ Bứa Clusiaceae, loại sống phổ biến vùng Đông Nam Á, Ấn Độ, Thái Lan, Bắc Mỹ… Ở Việt Nam, loại thường mọc hoang vùng đồi núi thấp từ Khánh Hòa đến Tây Ninh, Kon Tum, Côn Đảo, Bà Rịa-Vũng Tàu số vùng núi khác Bứa có nhiều loại Trên giới, người ta phân loại 180 loại Bứa khác mà đặc trưng như: Garcinia cambogia, Garcinia indica, Garcinia mantosgia, Kokum, Kola, Garcinia Villerisiana Pierre, Garcinia Harmandi Pierre, Garcinia Benthami Pierre,… Còn Việt Nam, cũng tồn nhiều loại Bứa như: Bứa vàng mọi, Bứa Băng Tâm, Bứa núi, Bứa vàng nhựa… 1.3.2 Đặc điểm Mô tả: Cây gỗ thường xanh cao 6-7 m Cành non thường vng, x ngang rủ xuống Lá hình thuẩn, dài, nhọn, chóp dài, mép ngun, nhẵn bóng, có nhiều điểm mờ Hoa đực mọc thành cụm 3-5 hoa nách lá, đài cánh hoa, 20 nhị có nhị ngắn Hoa lưỡng tính có đài cánh hoa hoa đực, màu vàng trắng; bầu (6-10) ô, hình cầu, vịi ngắn Quả mọng mang đài tồn tại; vỏ dày, có khía múi, chín màu vàng, phía đỏ chứa 6-10 hạt Mùa hoa tháng 3-6 Bộ phận dùng: Vỏ Cortex Garciniae Nơi sống thu hái: Cây mọc hoang rừng thứ sinh tỉnh từ Hà Tuyên, Vĩnh Phúc đến Quảng Nam - Đà Nẵng Cũng thường trồng lấy tươi nấu canh chua Thu hái vỏ quanh năm, cạo bỏ lớp vỏ ngồi, thái nhỏ, phơi khơ Tính vị, tác dụng: Vỏ có tính săn da đắng, mát, độc, có tác dụng tiêu viêm, hạ nhiệt, làm săn da, hàn vết thương Công dụng: Lá có vị chua thường dùng thái nhỏ nấu canh chua Hạt có áo hạt chua, ăn được, dùng nấu canh chua Vỏ thường dùng trị: Loét dày, loét tá tràng; Viêm dày ruột, tiêu hoá; Viêm miệng, bệnh cặn răng; Ho máu Dùng trị bỏng, mụn nhọt, sâu quảng, eczema, dị ứng mẫn ngứa, rút vết đạn đâm vào thịt 10 màu nâu đỏ Trộn dịch chiết với gam than hoạt tính ngâm nước ấm 30 phút, sau lọc than hoạt tính, rửa lại lần, lần 10ml nước để thu hồi hết axit Dịch chiết sau xử lý than hoạt tính bị màu hoàn toàn Trộn lẫn dịch lọc rửa, cô đặc đến 50ml, xử lý với 100ml etanol, để yên 15 phút để kết tủa hết pectin (kết tủa màu trắng sữa) Lọc bỏ kết tủa Phần kết tủa rửa lần để thu hồi hết axit Trộn dịch chiết, cô đặc đến thể tích 50ml lưu giữ 40C tủ lạnh đến sử dụng để chuẩn độ, kiểm tra HPLC Hình 3.9 Nồi áp suất Hình 3.10 Dung dịch đem Hình 3.11 Dịch Hình 3.12 Dịch chiết Hình 3.13 Dịch chiết chiết chưa tẩy màu sau tẩy màu sau đặc 29 Hình 3.14 Phễu Buchne Hình 3.15 Máy li tâm 3.2.6 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN TỔNG LƯỢNG AXIT PHƯƠNG PHÁP CHƯNG NINH QUI MƠ PHỊNG THÍ NGHIỆM 3.2.6.1 Khảo sát theo thời gian chưng ninh Để khảo sát phụ thuộc tổng lượng axit thu vỏ bứa khô vào thời gian chưng ninh, ta cố định thông số nhiệt độ áp suất tỉ lệ rắn/lỏng, thông số chuẩn đề tài nghiên cứu trước tìm ra, với giá trị sau: Nhiệt độ: 1270C Tỉ lệ rắn/lỏng: 10g/200ml Áp suất: 0,15MPa Đối với thông số thời gian, giá trị biến thiên: 30, 60, 90, 120 150 phút Thời gian tính từ cho vào nồi, nồi áp suất điện tử, có chế độ tự hâm nóng, cần cài đặt thời gian, hết tự động báo Kết khảo sát phụ thuộc tổng lượng axit thu vỏ bứa khô vào thời gian chưng ninh thực nồi áp suất biểu diễn bảng 3.4 30 Bảng 3.4 Kết khảo sát phụ thuộc tổng lượng axit thu vỏ bứa khô vào thời gian chưng ninh khối lượng 10g Thời gian Mẫu Dịch (phút) (g) chuẩn độ (ml) N (ml) 7,2 4,981 7,3 4,981 7,3 5,086 16,7 11,500 16,7 11,500 17 11,700 13,8 9,528 14,0 9,670 14,2 9,813 11,5 7,920 10,8 7.431 10,7 7,372 7,2 4,996 7,3 5,065 7,4 5,135 30 60 90 120 150 10, 000 10, 020 10, 000 10,030 9,950 hút NaOH 0,1 Tổng lượng axit (g/100g) Tổng lượng axit TB (g/100g) 5,016 11,570 9,670 7,391 5,065 Nhận xét: Từ kết bảng 3.4 cho thấy thời gian chưng ninh 60 phút tổng lượng axit thu cao Nếu tiếp tục tăng thời gian chưng ninh lượng axit có xu hướng giảm Điều giải thích lượng axit vỏ bứa chiết hết nên dù có tăng thời gian chưng ninh lượng axit cũng khơng thể tăng lên nữa, trái lại cịn giảm vỏ bứa chủ yếu axit hữu cơ, để thời gian chưng ninh lâu axit hữu phần bị phân 31 hủy, dẫn đến lượng axit thu giảm Vì chúng tơi chọn thời gian chưng ninh 60 phút 3.2.6.2 Khảo sát theo tỉ lệ rắn/lỏng (R/L) Tại nhiệt độ 1270C thời gian chưng ninh 60 phút, ta tiến hành khảo sát ảnh hưởng tổng lượng axit thu phụ thuộc vào tỉ lệ rắn/lỏng Lần lượt lấy thể tích nước 100ml, 150ml, 200ml, 250ml 300ml; ta tiến hành chưng ninh vỏ bứa khô nồi áp suất Kết khảo sát phụ thuộc tổng lượng axit thu vào tỉ lệ rắn/lỏng biểu diễn bảng 3.5: Bảng 3.5 Kết khảo sát phụ thuộc tổng lượng axit thu vào tỉ lệ R/L khối lượng 10g Nước(ml) Mẫu(g) 100 150 200 250 300 Dịch chuẩn NaOH chuẩn Tổng lượng độ (ml) (ml) axit (g/100g) 15, 10, 568 10, 257 15, 10, 568 15, 10, 635 16, 10, 899 10, 135 16, 10, 967 16, 11, 035 20, 15, 004 10, 087 20, 15, 004 20, 15, 102 16, 11, 353 10, 216 16, 11, 286 16, 11, 286 16, 11, 311 10, 315 17, 11, 378 17, 11, 378 Tổng lượng axit TB (g/100g) 10, 590 10, 967 15, 037 11, 308 11, 355 32 Nhận xét: Khi chưng ninh vỏ bứa khô nước, tổng lượng axit thu lớn 15,037g /100g mẫu (tức 100g mẫu vỏ bứa khô có 15,037g axit), điều kiện ứng với tỉ lệ rắn/ lỏng tối ưu 10g/200ml 3.2.7 Xác định hàm lượng HCA mẫu phương pháp HPLC Phương pháp chuẩn độ axit - bazơ sử dụng để xác định axit hữu dịch chiết, phương pháp giúp ta xác định tổng lượng axit có dịch chiết Tuy nhiên, phương pháp định lượng axit (-) hyđroxy xitric axit xitric cách riêng biệt Ta cũng xác định axit phương pháp sắc kí khí, phương pháp sắc kí khí ta phải sấy mẫu Nhưng axit HCA bị lacton hố có tác nhân nhiệt Trong phương pháp sắc kí lỏng cao áp, ta định lượng HCA axit hữu khác mà khơng cần phải đặc, sấy, hố dung dịch chiết Đây điểm thuận lợi để định lượng (-)-HCA axit hữu cách riêng biệt 3.2.7.1 Chuẩn bị HCA tự Chất chuẩn: (-)-Calcium threo-hydroxyxitrat tribasic hydrate, cung cấp hãng Sigma-Aldrich, công thức C12H10Ca3O16.xH2O Thông tin chi tiết chất chuẩn sau: Tên sản phẩm : (-)-Calcium threo-hydroxyxitrat tribasic hydrate, BioChemika, Garcinia Cambogia Extract, ~19,5% Ca Số sản phẩm : 55128 Văn phịng sản xuất : Fluka Cơng thức phân tử : C12H10Ca3O16.xH2O Khối lượng phân tử : 530,43 (cơ khan) Màu sắc : Hơi nâu Dạng tồn : Bột Chuẩn độ (trao đổi ion) : Axit threo-hidroxi xitric 67,3% Hàm lượng cacbon : 24,11% Hàm lượng Hiđro : 2,82% 33 Phổ 1HNMR : Phù hợp Toàn thông tin ghi Giấy chứng nhận chất lượng ngày tháng năm 2005 hãng Sigma-Aldrich Hình 3.16 Lọ chất chuẩn Chuẩn bị HCA tự do: Calcium threo-hydroxyxitrat tribasic hydrate (50mg) cho vào cốc 50ml chứa 5ml nước, xử lý với 500mg Dowex 50 [H+] Hỗn hợp khuấy thời gian 10 phút, sử dụng khuấy từ Tách lấy phần dung dịch, nhựa rửa với nước có pH trung tính Nước rửa dung dịch trộn lẫn tới thể tích 25ml, khuấy trộn lọc giấy lọc Chuẩn bị dung dịch chuẩn HCA có nồng độ thay đổi từ 10ppm đến 320ppm 3.2.7.2 Xây dựng đường chuẩn Hệ thống sắc ký lỏng cao áp sử dụng để nghiên cứu gồm máy sắc kí lỏng cao áp hãng Knauer trang bị với bơm loại áp suất thấp hãng Knauer, lắp cột sắc kí Knauer C18: 250 mm x 4,6 ID x 5m Bộ tổng hợp dung môi: quaternary LP Gradient, hãng Knauer Q trình dị thực đetectơ Knauer UV: khoảng bước sóng 190- 740 nm Pha động gồm (A) metanol MeOH (B) H3PO4 0,01 M với tốc độ dòng 1,5 ml/m Quá trình tách pic tốt chất A B thay đổi từ 10-30% thời gian 0-25 phút, 90% A B thời gian 30 phút, sau phút cân với 90% A Chất chuẩn mẫu lọc qua Millipore lọc 0,45 m tiêm vào HPLC Phương pháp xây dựng đường chuẩn thực cách dựa vào kết phân tích chuỗi mẫu HCA chuẩn Năm mẫu dung dịch chuẩn chứa 10- 32ppm HCA tự tiêm vào HPLC, thao tác rửa giải thực phần thảo luận trên, kết thu diện tích pic Đường cong HCA 34 vẽ dựa biểu diễn phụ thuộc nồng độ HCA diện tích pic (trung bình lần chạy) Khoảng nồng độ mẫu chuẩn cần để xây dựng đường chuẩn xác định dựa vào nồng độ thực HCA có mẫu Khoảng nồng độ tính từ giá trị giới hạn (LLOQ) đến giá trị giới hạn (ULOQ) Xác định giá trị giới hạn: Giá trị giới hạn (LOQ) định nghĩa nồng độ thấp HCA mà xác định với độ tin cậy chính xác