Nghiên cứu phát triển hệ thống kháng sinh đồ helicobacter pylori bằng phương pháp vi pha loãng kháng sinh

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG KHÁNG SINH ĐỒ HELICOBACTER PYLORI BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI PHA LỖNG KHÁNG SINH Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: KHOA ĐIỀU DƯỠNG - KTYH Chủ trì nhiệm vụ: PHẠM THÁI BÌNH Thành phố Hồ Chí Minh - 2019 ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG KHÁNG SINH ĐỒ HELICOBACTER PYLORI BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI PHA LOÃNG KHÁNG SINH (Đã chỉnh sửa theo kết luận Hội đồng nghiệm thu ngày 28 / 11 / 2019) Cơ quan chủ quản (ký tên đóng dấu) Chủ trì nhiệm vụ (ký tên) Phạm Thái Bình Cơ quan chủ trì nhiệm vụ (ký tên đóng dấu) Nguyn Văn B - CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2019 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC I THÔNG TIN CHUNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG KHÁNG SINH ĐỒ HELICOBACTER PYLORI BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI PHA LOÃNG KHÁNG SINH Thuộc lĩnh vực: Chủ nhiệm nhiệm vụ: Họ tên: PHẠM THÁI BÌNH Ngày, tháng, năm sinh: 05/02/1974 Học hàm, học vị: Thạc sĩ Chức danh khoa học: Điện thoại: Nam/ Nữ: Nam Chức vụ: Giảng viên Tổ chức: Fax: Nhà riêng: Mobile: 0903866915 E-mail: phamthaibinh@ump.edu.vn Tên tổ chức công tác: Bộ môn Xét nghiệm, Khoa ĐD - KTYH Địa tổ chức: 131 Nguyễn Chí Thanh, P 2, Q.5, TP HCM Địa nhà riêng: 335/9 Nơ Trang Long, P 13, Q BT, TP HCM Tổ chức chủ trì nhiệm vụ(1): Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Khoa Điều dưỡng – Kỹ thuật Y Học Điện thoại: Fax: Tên Khoa Trung tâm, đơn vị - nơi quản lý trực tiếp cá nhân làm chủ nhiệm đề tài - E-mail: Website: Địa chỉ: 201 Nguyễn Chí Thanh, Q 5, TP Hồ Chí Minh Tên quan chủ quản đề tài: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực nhiệm vụ: - Theo Hợp đồng ký kết: từ tháng 07 năm 2018 đến tháng 07 năm 2019 - Thực tế thực hiện: từ tháng 09 năm 2018 đến tháng 10 năm 2019 - Được gia hạn (nếu có): Từ tháng… năm… đến tháng… năm… Kinh phí sử dụng kinh phí: a) Tổng số kinh phí thực hiện: 60 tr.đ, đó: - Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học nhà trường: tr.đ - Kinh phí từ nguồn khác: 55 tr.đ b) Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học: Số TT Theo kế hoạch Thời gian (Tháng, năm) Thực tế đạt Thời gian (Tháng, năm) Kinh phí (Tr.đ) 10/2018 Ghi (Số đề nghị tốn) Kinh phí (Tr.đ) 12/2018 c) Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi: Đơn vị tính: Triệu đồng Số TT Nội dung khoản chi Theo kế hoạch Thực tế đạt Tổng NSKH Nguồn khác Tổng Trả công lao động (khoa học, phổ thông) 15 15 10 10 Nguyên, vật lượng 35 30 40 35 liệu, - Nguồn khác NSKH Thiết bị, máy móc Xây dựng, chữa nhỏ 0 0 0 0 0 0 Chi khác 10 10 10 10 Tổng cộng 60 55 60 55 sửa Lý thay đổi (nếu có): nguyên vật liệu tăng nên giảm lại chi phí trả cơng lao - động thực Tổ chức phối hợp thực nhiệm vụ: Số TT Tên tổ chức đăng ký theo Thuyết minh Tên tổ chức Nội dung tham gia thực tham gia chủ yếu Sản phẩm chủ yếu đạt Đơn vị Xét nghiệm Vi sinh – SHPT lâm sàng, Bệnh viện Nguyễn Tri Phương Đơn vị Xét nghiệm Vi sinh – SHPT lâm sàng, Bệnh viện Nguyễn Tri Phương Chủng vi khuẩn dùng cho đánh giá thông số chất lượng Công ty Nam Khoa Công Nam Khoa Cung cấp chủng vi khuẩn H pylori cho thử nghiệm kháng sinh đồ Ghi chú* ty Cung cấp thiết bị Hệ thống máy móc cho thực kháng sinh thử nghiệm đồ dùng cho thử nghiệm Lý thay đổi (nếu có): - Cá nhân tham gia thực nhiệm vụ: (Người tham gia thực đề tài thuộc tổ chức chủ trì quan phối hợp, không 10 người kể chủ nhiệm) Số TT Tên cá nhân đăng ký theo Thuyết minh Tên cá nhân tham gia thực Phạm Thái Bình Phạm Thái Bình Chủ nhiệm đề tài Phạm Hùng Vân Phạm Hùng Vân Cố vấn chuyên môn Lê Thị Kiều Thảo Thực thử nghệm - Nội dung tham gia Sản phẩm chủ yếu đạt Ghi chú* Lý thay đổi ( có): Bổ sung Lê Thị Kiều Thảo tham gia thực đề tài với công việc thực thử nghiệm kháng sinh đồ Tình hình hợp tác quốc tế: - Số TT Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Theo kế hoạch (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Ghi chú* Lý thay đổi (nếu có): - Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị: Số TT Theo kế hoạch (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm ) Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm ) Ghi chú* Lý thay đổi (nếu có): - Tóm tắt nội dung, cơng việc chủ yếu: (Nêu mục .của đề cương, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát nước nước ngoài) Số TT Thời gian (Bắt đầu, kết thúc - tháng … năm) Các nội dung, công việc chủ yếu (Các mốc đánh giá chủ yếu) Theo kế hoạch Thực tế đạt Số lượng Theo kế hoạch Người, quan thực Lý thay đổi (nếu có): - III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI Sản phẩm KH&CN tạo ra: a) Sản phẩm Dạng I: Số TT Tên sản phẩm tiêu chất lượng chủ yếu Đơn vị đo - Thực tế đạt Lý thay đổi (nếu có): - b) Sản phẩm Dạng II: Yêu cầu khoa học cần đạt Số TT Tên sản phẩm Theo kế hoạch Phương pháp sản xuất hệ Thực thống kháng sinh đồ H pylori kháng sinh đồ H pylori phương pháp vi pha loãng Thực tế đạt Ghi Thực kháng sinh đồ H pylori phương pháp vi pha loãng Lý thay đổi (nếu có): - c) Sản phẩm Dạng III: Yêu cầu khoa học cần đạt Số TT Tên sản phẩm Thực tế đạt Theo kế hoạch Số lượng, nơi cơng bố (Tạp chí, nhà xuất bản) Lý thay đổi (nếu có): - d) Kết đào tạo: Số TT Cấp đào tạo, Chuyên ngành đào tạo Số lượng Theo kế hoạch Thực tế đạt Thạc sỹ 0 Tiến sỹ 0 Ghi (Thời gian kết thúc) Lý thay đổi (nếu có): - đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp: Số TT Tên sản phẩm đăng ký Kết Theo kế hoạch Thực tế đạt - Lý thay đổi (nếu có): e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN ứng dụng vào thực tế - Ghi (Thời gian kết thúc) Số TT Tên kết ứng dụng Thời gian Địa điểm (Ghi rõ tên, địa nơi ứng dụng) Kết sơ Đánh giá hiệu đề tài mang lại: a) Hiệu khoa học công nghệ: Nắm vững công nghệ cố định kháng sinh kỹ thuật đông khơ Đây cơng nghệ mà hãng nước ngồi áp dung để sản xuất hệ thống định danh kháng sinh đồ Tìm kiếm thành phần mơi trường chất phát để áp dụng cho kháng sinh đồ vi khuẩn H pylori b) Hiệu kinh tế xã hội: Tạo sản phẩm áp dụng thường quy phịng xét nghiệm Tình hình thực chế độ báo cáo, kiểm tra đề tài: Số TT Thời gian thực Nội dung I Báo cáo tiến độ II Báo cáo giám định kỳ Ghi (Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…) Chủ nhiệm đề tài Thủ trưởng tổ chức chủ trì (Họ tên, chữ ký) (Họ tên, chữ ký đóng dấu) Phạm Thái Bình - MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU - CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG – HÌNH – BIỂU ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ TỔNG QUAN Y VĂN 1 TỔNG QUAN VỀ H pylori 1 Lịch sử phát H pylori 1 Đặc điểm vi sinh vật H pylori 1 Dịch tễ chế lây truyền H pylori 1 Cơ chế sinh bệnh H pylori PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN H pylori .10 Phương pháp huyết học 10 2 Phương pháp thở 10 Phương pháp mô học .11 Phương pháp urease nhanh .11 Phương pháp nuôi cấy .11 Phương pháp sinh học phân tử 12 PHƯƠNG PHÁP KHÁNG SINH ĐỒ H pylori .12 Phương pháp đĩa kháng sinh .12 Phương pháp pha lỗng kháng sinh mơi trường thạch 13 3 Phương pháp vi pha loãng kháng sinh môi trường lỏng 13 Phương pháp E – test 14 Phương pháp sinh học phân tử phát kiểu gen đề kháng 14 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 VẬT LIỆU .15 1 Chủng vi khuẩn 15 2 Hóa chất nguyên vật liệu 15 - 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2 Phương pháp đánh giá hiệu môi trường kháng sinh đồ .16 2 Phương pháp kháng sinh đồ pha loãng kháng sinh thạch 17 2 Phương pháp kháng sinh đồ vi pha loãng kháng sinh môi trường lỏng 18 Phương pháp phân tích số liệu 20 KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 22 KẾT QUẢ 22 1 Kết xác định môi trường thử nghiệm kháng sinh đồ 22 Kết kháng sinh đồ xác định MIC phương pháp pha loãng kháng sinh thạch 22 3 Kết xây dựng hệ thống kháng sinh đồ phương pháp vi pha loãng 23 Kết xác định thông số chất lượng hệ thống kháng sinh đồ vi pha loãng 25 BÀN LUẬN .26 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO 29 - Ni ủ 37oC, 72 điều kiện khí trường – 10% O2 Sau nuôi ủ cho vào 25µL dung dịch HPS Đọc kết dựa thay đổi màu sắc dung dịch có giếng Nếu có H pylori phát triển, dung dịch chuyển từ màu vàng sang đỏ vi khuẩn sinh urease tác dụng phân hủy nhanh urea (có chất) thành hydroxid amonium, làm kiềm hóa mơi trường nhận diện nhờ chất thị pH 2 Phương pháp kháng sinh đồ pha loãng kháng sinh thạch Pha chế môi trường đĩa thạch Mueller Hinton Agar có 5% máu cừu kháng sinh (Clarithromycin, Levofloxacin, Amoxicillin, Metronidazole, Tetracycline) theo dãy nồng độ kháng sinh giảm dần với hệ số pha lỗng ½ (Bảng 2.1) Bảng 1: Hàm lượng kháng sinh đĩa thạch (µg/mL) Đĩa thạch Hàm lượng 128 64 32 16 kháng sinh 10 11 12 13 14 0.5 0.25 0.12 0.06 0.03 Đánh dấu vị trí cấy vi khuẩn thạch cách kẽ vịng trịn có 10 tương ứng với 14 vòng tròn Mỗi 11 12 13 14 15 16 vịng trịn kẻ 32 ơ, kính thước 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 đường kính 90mm giấy trắng Một kháng sinh đồ 14 đĩa thạch  1cm (Hình 1) Dán vòng tròn lên đáy đĩa thạch môi trường[7] Pha huyền dịch vi khuẩn nước muối sinh lý có độ đục tương Hình 2.1: Bản vẽ đánh dấu vị trí điểm cấy đĩa thạch đương 2,0 Mc Farland (hàm lượng vi khuẩn huyền dịch 107 – 108 cfu/mL) Dùng micropipet lấy 1µL huyền dịch vi khuẩn chấm vào điểm cấy mặt thạch đánh dấu Mỗi điểm cấy mặt thạch tương ứng với chủng vi khuẩn thử nghiệm Nuôi ủ 37oC, 72 điều kiện khí trường – 10% - 17 O2 Đọc kết đĩa thạch đối chứng (đĩa thạch số 14, khơng có kháng sinh) với yêu cầu tất chủng vi khuẩn mọc Dấu hiệu vi khuẩn mọc xuất khúm khuẩn bề mặt thạch Tiếp tục đọc kết đĩa thạch lại để xác định giá trị MIC chủng vi khuẩn Mỗi lô thử nghiệm thực kháng sinh đồ (gồm 14 đĩa thạch, tương ứng với 14 nồng độ kháng sinh) thực cho 05 chủng vi khuẩn chuẩn 59 chủng vi khuẩn H pylori thử nghiệm Dựa vào giá trị MIC để biện luận kết kiểm tra chất lượng kết kháng sinh đồ theo tiêu chuẩn CLSI EUCAST[9, 22] Bảng 2: Tiêu chuẩn kiểm tra chất lượng biện luận kháng sinh đồ Tiêu chuẩn kiểm tra chất lượng (µg/mL) Kháng sinh SA EC PA 29213 25922 27853 0.12 Clarithromycin 0.5 0.06 Levofloxacin ≤ 0.06 0.5 - 0.5 Amoxicillin - - - Metronidazole - - - Tetracycline 0.12 0.5 - - 32 Tiêu chuẩn biện luận (µg/mL) SP HP S 49619 43504 0.03 ≤ 0.12 ≤ 0.25 0.12 0.5 - - ≤1 0.03 ≤ 0.12 ≤ 0.12 0.12 64 ≤8 256 0.06 0.12 ≤1 0.5 I R 0.5 ≥1 - ≥2 - ≥ 0.25 - ≥ 16 - ≥2 2 Phương pháp kháng sinh đồ vi pha lỗng kháng sinh mơi trường lỏng Kháng sinh pha với chất cố định trực tiếp giếng bảng nhựa làm khô công nghệ đông khô Hàm lượng kháng sinh cố định giếng giá trị điểm gãy nồng độ ức chế tối thiểu (MIC breakpoints) theo tiêu chuẩn biện luận kháng sinh đồ (Bảng 2.3)[9, 22] - 18 Vi khuẩn pha thành huyền dịch nước muối sinh lý với độ đục tương đương với 0,5 Mc Farland Lấy 30µL huyền dịch vi khuẩn cho vào 3mL môi trường thử nghiệm kháng sinh đồ Bảng 3: Kháng sinh hàm lượng kháng sinh giếng (µg/mL) Giếng số Clarithromycin 0,25 0,5 Levofloxacin Amoxicillin Metronidazole Tetracycline 0,5 8 10 0,5 11 12 0,06 0,12 Từ giếng – 11 cho vào giếng 100µL huyền dịch vi khuẩn (đã pha lỗng mơi trường, giếng số 11 khơng có chưa kháng sinh dùng làm chứng dương Giếng 12 cho vào 100µL mơi trường (khơng có chứa vi khuẩn) dùng chứng âm Nuôi ủ 37oC, 72 điều kiện khí trường – 10% O2 Sau ni ủ cho vào 25µL dung dịch HPS Đọc kết dựa thay đổi màu sắc dung dịch có giếng Nếu có H pylori phát triển, dung dịch chuyển từ màu vàng sang đỏ vi khuẩn sinh urease tác dụng phân hủy nhanh urea (có chất) thành hydroxid amonium, làm kiềm hóa mơi trường nhận diện nhờ chất thị pH Biện luận kết kháng sinh đồ (R / I/ S) dựa vào mức độ mọc vi khuẩn giếng (Bảng 4) Bảng 4: Kháng sinh Clarithromycin Levofloxacin Amoxicillin Metronidazole Tetracycline Tiêu chuẩn biện luận kết kháng sinh đồ Kết theo giếng Giếng (-) Giếng (-) Giếng (+) Giếng (-) Giếng (+) Giếng (+) Giếng ( - ) / ( + ) Giếng (-) Giếng (+) Giếng (+) Giếng ( - ) / ( + ) Giếng (-) Giếng (+) Giếng (+) Giếng ( - ) / ( + ) Giếng (-) Giếng (+) Giếng (+) Giếng ( - ) / ( + ) Giếng 10 (-) Giếng (+) Giếng 10 (+) Kết luận S I S S R S R S R S R (+): có mọc, huyền dịch có màu đỏ hồng; (-): khơng mọc, huyền dịch có màu vàng cam; R: kháng; I: trung gian; S: nhạy - 19 Phương pháp phân tích số liệu Đánh giá giá trị thử nghiệm kháng sinh đồ vi pha loãng dựa theo chuẩn vàng kết kháng sinh đồ phương pháp pha loãng kháng sinh thạch Các thông số để đánh giá độ tương đồng độ phù hợp Độ tương đồng (hay gọi độ phù hợp quan sát được: agreement degree) tỷ lệ (%) mà hai phương pháp kháng sinh đồ cho kết giống nhau[2] Khả phù hợp (hoặc không phù hợp) hai nghiệm pháp chẩn đoán khác thể qua hệ số Kappa Hệ số Kappa tỷ lệ tương đồng hai phương pháp kháng sinh đồ sau loại bỏ vai trò yếu tố ngẫu nhiên Hệ số Kappa khả phù hợp mà đạt cố gắng nhằm khai thác tối đa phù hợp tiềm ẩn[2] Bảng 5: Biện luận độ phù hợp theo hệ số Kappa Hệ số Kappa < 0,0 0,0 – 2,0 Độ phù hợp Không phù hợp Rất phù hợp 0,21 – 0,40 Ít phù hợp 0,41 – 0,60 Phù hợp trung bình 0,61 – 0,80 Khá phù hợp 0,81 – 1,0 Gần phù hợp hoàn toàn Độ tương đồng hệ số Kappa xác định theo cơng thức[2]: Phương pháp pha lỗng kháng sinh thạch Phương pháp vi pha loãng (+) (-)  (+) a b (a + b) (-) c d (c + d)  (a + c) (b + d) n = (a + b + c + d) Độ 𝑡ươ𝑛𝑔 đồ𝑛𝑔 (%) = Độ 𝑡ươ𝑛𝑔 đồ𝑛𝑔 (%) = (𝑃ℎù ℎợ𝑝 𝑞𝑢𝑎𝑛 𝑠á𝑡 ) − (𝑃ℎù ℎợ𝑝 𝑛𝑔ẫ𝑢 𝑛ℎ𝑖ê𝑛) (𝑃ℎù ℎợ𝑝 ℎ𝑜à𝑛 𝑡𝑜à𝑛) − (𝑃ℎù ℎợ𝑝 𝑛𝑔ẫ𝑢 𝑛ℎ𝑖ê𝑛) - 20- (𝑎 + 𝑐 ) × 100 𝑛 Trong đó:  Phù hợp quan sát = (𝑎+𝑑) 𝑛  Phù hợp ngẫu nhiên = ( × 100 (𝑎+𝑐) 𝑛 × (𝑎+𝑏) 𝑛 × 100) + ( 100)  Phù hợp hồn tồn = 100 Phân tích liệu phần mềm SPSS 22.0 - 21 (𝑏+𝑑) 𝑛 × (𝑐+𝑑) 𝑛 × Chương KẾT QUẢ - BÀN LUẬN KẾT QUẢ 1 Kết xác định môi trường thử nghiệm kháng sinh đồ Kết thử nghiệm mơi trường kháng sinh đồ (Bảng 3.1, Hình 1) vi khuẩn H pylori Bảng 1: Kết thử nghiệm môi trường kháng sinh đồ Vi HP HP HP HP HP HP HP HP HP HP HP ĐC khuẩn 43504 10 HPM (+) (+) ( - ) (+) (++) (+) (+) (+) (+) (-) (++) ( - ) HPM (+) (++) (++) ( + ) (++) (+) (+) (++) (++) (++) (+) ( - ) HPM (+) (+) (+) (+) (+) ( - ) (+) (+) (+) (++) (+) ( - ) HPM (++) (+++) (++) (+++) (++) (+++) (++) (++) (+++) (++) (+) ( - ) HP 43504: H pylori ATCC 43504); HP – 10: chủng H pylori phân lập từ bệnh phẩm nội soi dày; ĐC: môi trường tương ứng HPM 1, HPM 2, HPM 3, HPM 4; ( - ): khơng có thay đổi màu; ( + ), (++), (+++)thay đổi màu sắc với mức độ tăng dần Hình 1: Kết thử nghiệm môi trường kháng sinh đồ Kết kháng sinh đồ xác định MIC phương pháp pha loãng kháng sinh thạch Thực kháng sinh đồ phương pháp pha loãng kháng sinh thạch vi khuẩn chuẩn vi khuẩn có nguồn gốc phân lập từ bệnh phẩm nội soi dày Kết giá trị MIC chủng vi khuẩn chuẩn theo lô thử nghiệm kháng sinh đồ (Bảng 2) - 22 Bảng 2: Vi khuẩn Kết thử nghiệm kháng sinh đồ chủng vi khuẩn chuẩn Ch Lô Lô Lv Lô Lô Ax Lô Lô Mt Lô Lô Te Lô Lô SA 29213 0.25 0.12 0.12 0.25 0.25 0.25 EC 25922 0.03 ≤ 0.03 0.5 PA 27853 16 16 SP 49619 0.03 0.06 0.5 0.03 0.12 0.25 0.12 HP 43504 0.03 0.06 0.06 0.06 64 128 0.5 0.5 Ch (Clarithromycin); Lv (Levofloxacin); Ax (Amoxiciilin); Mt (Metronodazole); Te (Tetracycline) Kết thử nghiệm kháng sinh đồ xác định giá trị phương pháp pha loãng kháng sinh thạch (Bảng 3) Bảng 3: Kết giá trị MIC phương pháp pha loãng kháng sinh thạch (số chủng) Kháng sinh ≥128 64 32 16 0.5 0.25 0.12 0.06 ≤0.03 Ch 1 19 46 19 3 Lv 0 23 14 13 13 20 18 Ax 0 0 94 Mt 12 39 12 14 11 1 Te 0 18 45 11 12 15 Ch (Clarithromycin); Lv (Levofloxacin); Ax (Amoxiciilin); Mt (Metronodazole); Te (Tetracycline);  (kháng);  (trung gian);  (nhạy) Biểu đồ 3.1: Mơ hình phân bố giá trị MIC H pylori 3 Kết xây dựng hệ thống kháng sinh đồ phương pháp vi pha loãng Thực kháng sinh đồ phương pháp vi pha loãng 118 chủng vi khuẩn H pylori theo quy trình: - 23 • Vi khuẩn thử nghiệm pha nước muối sinh lý vô trùng với độ đục tương đương với độ đục chuẩn 0,5 Mc Farland • Dùng micropipet vơ trùng lấy 100µL mơi trường HPM (chọn mơi trường HPM 4) cho vào giếng số 12 • Pha lỗng huyền dịch vi khuẩn 1/100 cách lấy 30µL huyền dịch vi khuẩn cho vào lọ môi trường HPM (sử dụng lọ môi trường lấy 100µL cho vào giếng số 12) • Từ giếng số đến 11, cho vào giếng 100µL huyền dịch vi khuẩn pha lỗng (ngoại trừ giếng số 12 cho 100µL mơi trường HPM) • Nuôi ủ 37oC, 72 giờ, – 10% O2 • Cho vào giếng giọt dung dịch HPS đọc kết - 15 phút • Chứng ( - ) giếng số 12 với kết vi khuẩn, huyền dịch có màu vàng cam Chứng ( + ) giếng số 11 với kết có vi khuẩn mọc, huyền dịch có màu đỏ hồng Đọc kết giếng lại (giếng – 10) để xác định vi khuẩn có mọc ( + ) không mọc ( - ) giếng:  ( - ) vi khuẩn không mọc, huyền dịch có màu vàng cam  ( + ) vi khuẩn mọc, huyền dịch có màu đỏ hồng • Biện luận kết kháng sinh đồ dựa vào mức độ mọc vi khuẩn (Bảng 2.4) Hình 2: Quy trình thực kháng sinh đồ phương pháp vi pha loãng - 24 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Clarithromycin (R) Amoxicillin (S) Levofloxacin (R) Tetracycline (S) Metronidazole (R) (-) (+) Hình 3: Hệ thống kháng sinh đồ vi pha pha loãng Kết kháng sinh đồ 118 chủng vi khuẩn H pylori hệ thống vi pha loãng (Bảng 4) Bảng 4: Kết kháng sinh đồ hệ thống vi pha loãng Nhạy 17 (14,41%) 66 (55,93%) 108 (91,53%) 61 (51,69%) 47 (39,83%) Kháng sinh Clarithromycin (Ch) Levofloxacin (Lv) Amoxicillin (Ax) Metronidazole (Mt) Tetracycline (Te) Trung gian (3,39 (%) - Kháng 97 (82,20%) 52 (44,07%) 12 (10,17%) 57 (48,31%) 71 (60,17%) Kết xác định thông số chất lượng hệ thống kháng sinh đồ vi pha loãng Kết độ tương đồng độ phù hợp hệ thống kháng sinh đồ vi pha loãng so với kháng sinh đồ pha loãng kháng sinh thạch trình bày Bảng Bảng Kết độ tương đồng độ phù hợp hệ thống kháng sinh đồ vi pha loãng so với kháng sinh đồ pha loãng kháng sinh thạch Ch Lv AD (S) / BMD (S) 14 AD (I) / BMD (S) AD (I) / BMD (I) AD (R) / BMD (I) AD (R) / BMD (R) 97 Ax Mt Te 63 106 56 47 43 12 56 65 AD (S) / BMD (R) AD (R) / BMD (S) 2 94,92% 90,06% 98,3% 94,49 % 94,92% 0,91  0,05 0,79  0,06 0,91  0,06 0,95  0,03 0,90  0,04 Độ tương đồng (%) Hệ số Kappa Ch (Clarithromycin); Lv (Levofloxacin); Ax (Amoxicillin); Mt (Metronidazole); Te (Tetracycline); AD (phương pháp pha loãng kháng sinh thạch); BMD (phương pháp vi pha loãng); R (kháng); I (trung gian); S (nhạy) - 25 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh BÀN LUẬN Kháng sinh đồ phương pháp vi pha loãng chưa sử dụng rộng rãi với H pylori nguyên nhân khó xác định vi khuẩn mọc Vi khuẩn H pylori mọc môi trường lỏng làm đục môi trường mà không làm đục hồn tồn có tượng lắng cạn đáy giếng vi khuẩn khác[16, 22, 24] Tuy nhiên, H pylori có đặc điểm khả tiết urease phân hủy nhanh urea Nếu môi trường có thị pH nhận diện vi khuẩn mọc nhờ vào thay đổi màu sắc môi trường Từ đó, khắc phục nhược điểm kháng sinh đồ phương pháp vi pha loãng thực H pylori Các chủng vi khuẩn H pylori xác định tính chất đề kháng phương pháp pha loãng kháng sinh thạch Đây xem “chuẩn vàng” thực kháng sinh đồ H pylori Mỗi lô môi trường đĩa thạch kháng sinh đồ thực nội kiểm theo chuẩn mực CLSI EUCAST[9, 22] nên đảm bảo kết kháng sinh đồ xác tin cậy Kháng sinh cố định bảng nhựa công nghệ đông khô với nồng độ kháng sinh điểm gãy MIC (MIC breakpoint) giúp cho việc thực kháng sinh đồ H pylori đơn giản tiện dụng Từ đó, phịng xét nghiệm vi sinh thực thường quy kháng sinh đồ H pylori Kháng sinh đồ H pylori thực phương pháp pha loãng kháng sinh thạch phương pháp E-test Phương pháp pha loãng kháng sinh thạch vốn phức tạp chuẩn bị môi trường lần phải thực kháng sinh đồ số lượng lớn chủng vi khuẩn Do đó, phương pháp thích hợp nghiên cứu xét nghiệm thường quy Phương pháp E-test thực chủng vi khuẩn có giá thành cao đọc kết khó đọc kết Do vi khuẩn H pylori mọc với khúm khuẩn nhỏ li ti nên khó xác định điểm cắt vùng vô khuẩn với que E-test Hệ thống kháng sinh đồ phương pháp vi pha lỗng có hệ số Kappa từ 0,79 – 0,95 nên kết hoàn toàn phù hợp với phương pháp chuẩn vàng kháng sinh đồ pha loãng kháng sinh thạch Độ tương đồng hai phương pháp - 26 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh từ 90,06 – 94,92% Chính thế, phương pháp kháng sinh đồ hệ thống vi pha loãng hồn tồn thay phương pháp pha loãng kháng sinh thạch phương pháp E-test Phương pháp thực chủng vi khuẩn, việc đọc kết tương đối dễ dàng nhờ xác định thay đổi màu sắc huyền dịch sau thêm chất urea có thị pH Từ đó, áp dụng thành xét nghiệm thường quy phòng xét nghiệm vi sinh - 27 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Phát triển hệ thống để thực kháng sinh đồ cho H pylori theo phương pháp vi pha loãng Hệ thống kháng sinh đồ gồm bảng nhựa có chứa kháng sinh đơng khơ điểm gãy MIC tiêu chuẩn biện luận, môi trường thực kháng sinh đồ (HPM) dung dịch chất phát (HPS) Hệ thống kháng sinh đồ thực với loại kháng sinh thường sử dung điều trị tiệt trừ H pylori Clarithromycin, Levofloxacin, Amoxicillin, Metronidazole Tetracycline Kết kháng sinh đồ hệ thống hoàn toàn phù hợp với phương pháp kháng sinh đồ pha loãng kháng sinh thạch với độ tương đồng 90,06 – 94,92% - 28 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh TÀI LIỆU THAM KHẢO Benjamin C Y Wong, Eilene Kwok, S K Lam (1997) "Diagnosis of Helicobacter pylori infection" JHKMTA 1997/98, (17) Dương Đình Thiện (2002) "Dịch tể học lâm sàng" NXB Y Học, Trang 90 -131 Lê Đình Minh Nhân, Võ Thị Chi Mai (2006) "Tính đề kháng kháng sinh Helicobacter pylori bệnh viêm loét dày- tá tràng" Y Học TP Hồ Chí MInh, Tập 10 (Phụ số 1), Trang 73-75 Bùi Khắc Hậu, Lê Huy Chính (2007) Helicobacater pylori, NXB Y Học, Trang 183 - 187 Trần Thiện Trung (2008) Bệnh dày tá tràng nhiễm Helicobacter pylori, Nhà xuất Y Học TP Hồ Chí Minh, Trần Thiện Trung, Lê Châu Hồng Quốc Chương, Trần Anh Minh, Lý Kim Hương, Hồ Huỳnh Thùy Dương, Nguyễn Tuấn Anh (2010) "Kết nghiên cứu týp gen cagA vacA Helicobacter pylori ung thư dày" Tạp chí Y Học TP Hồ Chí Minh Tập 14 (Số 4), Trang 25-34 Phạm Hùng Vân, Phạm Thái Bình (2013) Kháng sinh đồ kỹ thuật khuếch tán kháng sinh thạch từ đĩa giấy tẩm kháng sinh Kháng sinh - Đề kháng kháng sinh - Kỹ thuật kháng sinh đồ Các vấn đề thường gặp NXB Y Học, Trang 51 - 75 Đặng Ngọc Quý Huệ, Trần Văn Huy, Nguyễn Sĩ Tuấn, Lê Nguyễn Đăng Khoa, Nguyễn Thị Minh Thi, Phạm Thị Thu Hằng, et al (2014) "Đánh giá Helicobacter pylori đề kháng với clarithromycin levofloxacin Epsilometer test Đồng Nai, năm 2013 " Y Học Thực Hành 903 (Số 1/2014 ), trang 89 -94 CLSI (2015) M45 - Methods for Antimicrobial Dilution and Disk Susceptibility Testing of Infrequently Isolated or Fastidious Bacteria 10 Đặng Ngọc Quý Huệ (2018) Nghiên cứu tỷ lệ kháng clarithromycin,levofloxacin Helicobacter pylori epsilometer hiệu phác đồ EBMT bệnh nhân viêm dày mạn, Đại Học Huế, 11 Đào Việt Hằng, Vũ Thị Vựng, Ngô Thị Thu Hiền, Nguyễn Thị Hảo, Đào Văn Long (2018) "Khảo sát tình trạng nhiễm Helicobacter pylori (H.p) gia đình có người nhiễm H.p" Tạp chí Nghiên cứu Y Học, TCNCYH 117 (1) - 2019 trang 52 - 59 - 29 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 12 G Cederbrant, G Kahlmeter, A Ljungh (1993) "The E test for antimicrobial susceptibility testing of Helicobacter pylori" J Antimicrob Chemother, 31 (1), 65-71 13 S Chattopadhyay, R Patra, T Ramamurthy, A Chowdhury, A Santra, G K Dhali, et al (2004) "Multiplex PCR assay for rapid detection and genotyping of Helicobacter pylori directly from biopsy specimens" J Clin Microbiol, 42 (6), 2821-4 14 S Chaves, M Gadanho, R Tenreiro, J Cabrita (1999) "Assessment of metronidazole susceptibility in Helicobacter pylori: statistical validation and error rate analysis of breakpoints determined by the disk diffusion test" J Clin Microbiol, 37 (5), 1628-31 15 D Y Graham (2014) "History of Helicobacter pylori, duodenal ulcer, gastric ulcer and gastric cancer" World J Gastroenterol, 20 (18), 5191-204 16 S H Hartzen, L P Andersen, A Bremmelgaard, H Colding, M Arpi, J Kristiansen, et al (1997) "Antimicrobial susceptibility testing of 230 Helicobacter pylori strains: importance of medium, inoculum, and incubation time" Antimicrob Agents Chemother, 41 (12), 2634-9 17 J K Y Hooi, W Y Lai, W K Ng, M M Y Suen, F E Underwood, D Tanyingoh, et al (2017) "Global Prevalence of Helicobacter pylori Infection: Systematic Review and Meta-Analysis" Gastroenterology, 153 (2), 420-429 18 M Kidd, I M Modlin (1998) "A century of Helicobacter pylori: paradigms lost-paradigms regained" Digestion, 59 (1), 1-15 19 J Li, L Wu, C Feng, Y Gao, F Tang, F Duan (1999) "[A brief history of discovery of Helicobacter pylori]" Zhonghua Yi Shi Za Zhi, 29 (4), 203-6 20 B J Marshall, J R Warren (1984) "Unidentified curved bacilli in the stomach of patients with gastritis and peptic ulceration" Lancet, (8390), 1311-5 21 F Megraud, P Lehours, F F Vale (2016) "The history of Helicobacter pylori: from phylogeography to paleomicrobiology" Clin Microbiol Infect, 22 (11), 922-927 22 F Megraud, P Lehours (2007) "Helicobacter pylori detection and antimicrobial susceptibility testing" Clin Microbiol Rev, 20 (2), 280-322 23 S K Ogata, A C Gales, E Kawakami (2014) "Antimicrobial susceptibility testing for Helicobacter pylori isolates from Brazilian children and adolescents: comparing agar dilution, E-test, and disk diffusion" Braz J Microbiol, 45 (4), 1439-48 - 30 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 24 F Sisto, M M Scaltrito, G Russello, A Bonomi, F Dubini (2009) "Antimicrobial susceptibility testing of Helicobacter pylori determined by microdilution method using a new medium" Curr Microbiol, 58 (6), 559-63 25 S Suerbaum, P Michetti (2002) "Helicobacter pylori infection" N Engl J Med, 347 (15), 1175-86 26 CLSI (2010) M100 S20 - Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Informational Supplement 2010 20th edition ed.,Clinical and Laboratory Standards Institute 27 CLSI (2019) M100 - Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Informational Supplement 28th edition ed.,Clinical and Laboratory Standards Institute 28 D Basso, M Plebani, J G Kusters (2010) "Pathogenesis of Helicobacter pylori infection" Helicobacter, 15 Suppl 1, 14-20 29 D Basso, C F Zambon, D P Letley, A Stranges, A Marchet, J L Rhead, et al (2008) "Clinical relevance of Helicobacter pylori cagA and vacA gene polymorphisms" Gastroenterology, 135 (1), 91-9 30 L N Meurer, D J Bower (2002) "Management of Helicobacter pylori infection" Am Fam Physician, 65 (7), 1327-36 - 31 ... pháp pha loãng kháng sinh thạch 23 Bảng Kết kháng sinh đồ hệ thống vi pha loãng 25 Bảng Kết độ tương đồng độ phù hợp hệ thống kháng sinh đồ vi pha loãng so với kháng sinh đồ pha loãng kháng sinh. .. (-) (+) Hình 3: Hệ thống kháng sinh đồ vi pha pha loãng Kết kháng sinh đồ 118 chủng vi khuẩn H pylori hệ thống vi pha loãng (Bảng 4) Bảng 4: Kết kháng sinh đồ hệ thống vi pha loãng Nhạy 17 (14,41%)... Theo kế hoạch Phương pháp sản xuất hệ Thực thống kháng sinh đồ H pylori kháng sinh đồ H pylori phương pháp vi pha loãng Thực tế đạt Ghi Thực kháng sinh đồ H pylori phương pháp vi pha loãng Lý thay