Nghiên cứu điều chế thuốc tiêm chứa natri hyaluronat tác dụng kéo dài

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - PHẠM PHAN THÔNG NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ THUỐC TIÊM CHỨA NATRI HYALURONAT TÁC DỤNG KÉO DÀI LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - PHẠM PHAN THÔNG NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ THUỐC TIÊM CHỨA NATRI HYALURONAT TÁC DỤNG KÉO DÀI Ngành: Công nghệ dược phẩm bào chế thuốc Mã số: 8720202 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS LÊ HẬU Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Phạm Phan Thông Luận văn thạc sĩ dược học – Khóa học 2017-2019 NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ THUỐC TIÊM CHỨA NATRI HYALURONAT TÁC DỤNG KÉO DÀI Phạm Phan Thông Người hướng dẫn: PGS TS Lê Hậu Đặt vấn đề Acid hyaluronic polyme sinh học thể người có vai trị chất bơi trơn cho mơ liên kết Vì chế phẩm chứa natri hyaluronat – dạng muối acid hyaluronic thường định điều trị viêm khớp, giữ ẩm cho da mắt,… Tuy nhiên, chế phẩm chứa acid hyaluronic tự nhiên phân hủy nhanh enzyme thể nên mục tiêu đề tài nghiên cứu điều chế thuốc tiêm chứa natri hyaluronat tác dụng kéo dài Đối tượng Nguyên liệu natri hyaluronat đạt tiêu chuẩn EP 7.0 Các tá dược khác đạt tiêu chuẩn Dược điển tiêu chuẩn nhà sản xuất phù hợp với đường tiêm truyền Phương pháp Xây dựng quy trình điều chế thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml:  Hòa tan natri hyaluronat dung môi  Tạo gel natri hyaluronat liên kết chéo  Rửa gel làm giảm kích thước tiểu phân gel natri hyaluronat liên kết chéo  Điều chỉnh hàm lượng natri hyaluronat có gel  Đóng gel vào bơm tiêm thủy tinh tiệt trùng Kết Quy trình định lượng natri hyaluronat thành phẩm thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml theo phương pháp UV-Vis đạt yêu cầu độ đặc hiệu, tính tuyến tính, độ đúng, độ xác khoảng xác định Quy trình xác định nồng độ BDDE cịn lại sau phản ứng hàm lượng BDDE tồn dư thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml theo phương pháp quang phổ huỳnh quang đạt yêu cầu độ đặc hiệu, tính tuyến tính, giới hạn phát Quy trình điều chế thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo xây dựng, phương pháp bay áp suất giảm áp dụng để tạo gel natri hyaluronat liên kết chéo với tỉ lệ BDDE phản ứng > 60% Các thành phẩm thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo đạt tiêu định lượng, hàm lượng BDDE tồn dư tiêu chung thuốc tiêm Tiêu chuẩn kĩ thuật cho thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml xây dựng Kết luận Đã nghiên cứu điều chế thành công thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml THESIS ABSTRACT Thesis for the Degree of Master Pharmaceutical Sciences – Period 2017 - 2019 ESTABLISHING PREPARATION OF INJECTION OF CROSS-LINKED SODIUM HYALURONATE Thong Pham Phan Supervisors: Assoc Prof Le Hau, Ph D Introduction Hyaluronic acid is a polyanionic natural polymer in the human body It functions as an agent which increases the viscosity of body fluids and acts as a lubricant to tissue Therefore, products contain sodium hyaluronate - a salt form of hyaluronic, are popularly applicated in the treatment of arthritis, alleviating dry skin and eyes In fact, hyaluronic acid in ordinary products rapidly dissolves during the enzymatic hydrolysis, so the main objective of the study is to establish preparation of injection of cross-linked sodium hyaluronate Materials Sodium hyaluronate meets EP 7.0 specification Other excipients comply with Pharmacopoeia standard or manufacturer’s specification and are suitable for injectable grade Methods Establish preparation of injection of cross-linked sodium hyaluronate 24 mg/ml:  Dissolution of sodium hyaluronate in solvent  Produce cross-linked sodium hyaluronate gel  Washing gel and control gel particles at smaller size  Adjustment of sodium hyaluronate concentration  Filling into glass syringes and sterilizing Results The assay procedure in finish product is validated by UV-Vis method and met requirements in terms of specificity, linearity, accuracy, precision and range The procedure for determining the BDDE content remaining after reaction and the detection residual BDDE in finish product was validated by fluorescence spectroscopy method and met requirements in terms of specificity, linearity, limit of detection and limit of quantitation Preparation of injection of cross-linked sodium hyaluronate is established, in which the method of evaporation under reduced pressure is applied to create cross-linked sodium hyaluronate gel with the BDDE content after reaction > 60% Finish products met requirement interms of assay, the residual BDDE and the general criteria of injection Technical specification of finish product was established Conclusion Preparation of injection of cross-linked sodium hyaluronate 24 mg/ml was successfully established MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH x MỞ ĐẦU .1 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Hoạt chất acid hyaluronic 1.1.1 Giới thiệu 1.1.2 Cấu trúc hóa học 1.1.3 Tính chất lý hóa 1.1.4 Cấu trúc dung dịch 1.2 Vai trò sinh lý HA 1.2.1 Ứng dụng HA điều trị viêm khớp .5 1.2.2 Ứng dụng HA chống lão hóa da 1.2.3 Chống định 1.3 1,4-butanediol diglycidyl ete (BDDE) 1.3.1 Cấu trúc phân tử tính chất lý hóa 1.3.2 Cơ chế phân hủy BDDE thể 1.4 HA liên kết chéo .10 1.4.1 Tác nhân liên kết chéo 10 1.4.2 Các sản phẩm thị trường 10 1.4.3 Quy trình điều chế natri hyaluronat liên kết chéo .11 1.4.4 Dạng gel natri hyaluronat liên kết chéo đồng pha 13 1.4.5 Dạng gel natri hyaluronat liên kết chéo dị pha 14 Chương PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Nguyên liệu trang thiết bị 16 2.2 Phương pháp nghiên cứu .17 2.2.1 Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng natri hyaluronat thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml 17 2.2.2 Xây dựng thẩm định phương pháp xác nồng độ BDDE lại sau phản ứng hàm lượng BDDE tồn dư thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml .23 2.2.3 Công thức cho bơm tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml 26 2.2.4 Xây dựng quy trình điều chế thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml .27 2.2.5 Khảo sát độ nhớt dung dịch natri hyaluronat dung môi NaOH có nồng độ khác 29 2.2.6 Khảo sát tỉ lệ BDDE phản ứng điều kiện phản ứng tạo natri hyaluronat liên kết chéo 29 2.2.7 Khảo sát phương pháp tạo gel natri hyaluronat liên kết chéo 30 2.2.8 Khảo sát giai đoạn rửa gel để loại lượng BDDE lại sau phản ứng tạp chất khác nước cất pha tiêm đệm phosphat 31 2.2.9 Lựa chọn công thức làm giảm kích thước tiểu phân gel natri hyaluronat liên kết chéo 31 2.2.10 Điều chỉnh hàm lượng natri hyaluronat thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 31 2.2.11 Đóng bơm tiêm tiệt trùng thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 32 2.2.12 Xác định tính lặp lại quy trình 32 2.2.13 Xây dựng tiêu chuẩn sở cho thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml .32 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .33 3.1 Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng natri hyaluronat thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml 33 3.1.1 Độ đặc hiệu .33 3.1.2 Tính tuyến tính 35 3.1.3 Độ .37 i 3.1.4 Độ xác .38 3.2 Xây dựng thẩm định phương pháp xác định nồng độ BDDE lại sau phản ứng hàm lượng BDDE tồn dư thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml 42 3.2.1 Độ đặc hiệu .42 3.2.2 Tính tuyến tính 45 3.2.3 Giới hạn phát (LOD) 47 3.3 Xây dựng quy trình điều chế thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml 48 3.4.1 Khảo sát độ nhớt dung dịch natri hyaluronat dung mơi NaOH có nồng độ khác 48 3.4.2 Khảo sát tỉ lệ BDDE phản ứng điều kiện phản ứng tạo natri hyaluronat liên kết chéo 49 3.4.3 Khảo sát phương pháp tạo gel natri hyaluronat liên kết chéo 55 3.4.4 Khảo sát giai đoạn rửa gel để loại lượng BDDE lại sau phản ứng tạp chất khác nước cất pha tiêm đệm phosphat 57 3.4.5 Lựa chọn cơng thức làm giảm kích thước tiểu phân gel natri hyaluronat liên kết chéo 59 3.4.6 Điều chỉnh hàm lượng natri hyaluronat thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 61 3.4.7 Xác định độ lặp lại quy trình 64 3.4 Xây dựng tiêu chuẩn sở cho thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml 67 3.5.1 Tiêu chuẩn kĩ thuật 67 3.5.2 Phương pháp kiểm nghiệm .68 Chương BÀN LUẬN 73 4.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình điều chế thuốc tiêm chứa natri hyaluronat tác dụng kéo dài 73 4.1.1 Dung mơi hịa tan 73 4.1.2 Phương pháp tạo gel natri hyaluronat liên kết chéo 73 4.1.3 Giai đoạn rửa gel natri hyaluronat liên kết chéo .74 4.1.4 Giai đoạn giảm kích thước gel natri hyaluronat liên kết chéo 76 4.1.5 Giai đoạn điều chỉnh hàm lượng natri hyaluronat, đóng thuốc vào bơm tiêm tiệt trùng 77 4.1.6 Kết độ lặp lại quy trình 77 4.2 Ứng dụng quy trình điều chế thuốc tiêm chứa natri hyaluronat tác dụng kéo dài vào quy mô sản xuất công nghiệp 78 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .79 KẾT LUẬN 79 ĐỀ NGHỊ .80 TÀI LIỆU THAM KHẢO .81 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa đầy đủ BDDE 1,4-butanediol diglycidyl ete BĐM Bình định mức BP British Pharmacopoeia Dược điển Anh CD44 Cluster of differentiation-44 Nhóm biệt hóa 44 DEO 1,2,7,8-diepoxyoctan DVS Divinyl sulfon EP European Pharmacopoeia Dược điển châu Âu FDA Food and Drug Administration Cục quản lý thực phẩm dược phẩm Hoa Kỳ FI Fluorescence Intensity Cường độ huỳnh quang HA Hyaluronic acid Acid Hyaluronic kl/kl khối lượng khối lượng kl/tt khối lượng thể tích LOD Limit of detection Giới hạn phát NASHA Non-Animal Stabilised Hyaluronic Acid Acid Hyaluronic ổn định có nguồn gốc khơng phải động vật OBT Optimal Balance Technology Công nghệ để đạt độ đồng tối ưu RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 71 L: Hàm lượng natri hyaluronat nhãn (24 mg/ml) Kết định lượng natri hyaluronat thành phẩm giá trị định lượng trung bình dung dịch mẫu thử thành phẩm Yêu cầu:  Hệ số tương quan R2 ≥ 0,998  % định lượng natri hyaluronat mẫu thành phẩm nằm khoảng 90 – 110% hàm lượng nhãn tương ứng với 21,6 mg/ml – 26,4 mg/ml 3.5.2.6 Hàm lượng BDDE tồn dư Điều kiện phương pháp quang phổ huỳnh quang - Dung dịch thuốc thử: dung dịch nicotinamid 0,125 M, dung dịch acetophenon 15% (tt/tt) ethanol khan, dung dịch KOH M, dung dịch acid formic - Dung dịch chuẩn gốc: dung dịch 0,4 mg/ml natri hyaluronat nước cất Cân xác khoảng 40 mg BDDE cho vào BĐM 100 ml, thêm nước cất vừa đủ đến vạch, lắc - Dung dịch chuẩn: từ dung dịch chuẩn gốc, pha loãng để đạt dung dịch chuẩn 1,0 µg/ml BDDE (dung dịch chuẩn C2) - Mẫu trắng: nước cất - Dung dịch mẫu thử: Cân xác khoảng 0,55 g gel natri hyaluronat cho vào lọ ml, thêm xác ml nước cất, lắc tốc độ 50 vòng/phút máy lắc vòng 24 Lọc qua màng lọc 0,22 µm Lặp lại lần để thu dung dịch mẫu thử thành phẩm thứ hai Hút 200 µL dung dịch chuẩn, dung dịch mẫu thử, mẫu trắng cho vào ống nghiệm có nắp đậy Thêm vào ống nghiệm 100 µL dung dịch nicotinamid 0,125 M, đóng nắp lại lắc Đặt ống nghiệm vào bồn cách thủy đun 37 C Thêm vào ống nghiệm 100 µL dung dịch nicotinamid 0,125 M, đóng nắp lại lắc Đặt ống nghiệm vào bồn cách thủy 37 C Thêm vào ống nghiệm ml dung dịch acetophenon 15% (tt/tt) ethanol khan ml dung dịch KOH 1M Sau đó, làm lạnh ống nghiệm bồn nước đá 20 phút thêm vào ống nghiệm ml acid Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 72 formic, đóng nắp lại lắc Tiếp theo, đặt ống nghiệm vào lại bồn cách thủy đun phút 60 C Sau đó, ống nghiệm làm lạnh bồn nước đá 15 phút để ổn định nhiệt độ phòng 15 phút trước đo - Bước sóng kích thích: 370 ± 2,5 nm - Bước sóng phát xạ: 430 ± 2,5 nm Dùng mẫu trắng để hiệu chỉnh cường độ huỳnh quang, tiến hành đo cường độ huỳnh quang dung dịch chuẩn C2 dung dịch mẫu thử - Yêu cầu: Cường độ huỳnh quang dung dịch mẫu thử phải bé cường độ huỳnh quang dung dịch mẫu chuẩn 3.5.2.7 Độ vô khuẩn Chuẩn bị môi trường Tryptone casein soya broth (TSB) môi trường thioglycolat khơng có thạch Tiến hành thử theo phương pháp cấy trực tiếp cách đẩy 0,5 ml gel bơm tiêm cấy trực tiếp vào môi trường lắc để mẫu thử phân tán môi trường Ủ môi trường TSB 20-25°C 14 ngày ủ mơi trường thioglycolat khơng có thạch 30-35°C 14 ngày u cầu: Khơng có vi khuẩn, nấm mốc mọc suốt thời gian ủ Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 73 Chương BÀN LUẬN 4.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình điều chế thuốc tiêm chứa natri hyaluronat tác dụng kéo dài 4.1.1 Dung mơi hịa tan Đề tài sử dụng dung mơi sau để hịa tan natri hyaluronat: dung dịch NaOH 0,1% (kl/tt), dung dịch NaOH 0,2% (kl/tt), dung dịch NaOH 0,3% (kl/tt), dung dịch NaOH 0,4% (kl/tt), dung dịch NaOH 0,5% (kl/tt) Do tính chất tạo thành dung dịch nhớt tạo lớp áo bảo vệ kết tụ lại với q trình hịa tan gây khó khăn giai đoạn hịa tan phân tán tác nhân liên kết chéo BDDE Kết dung dịch NaOH 0,5% (kl/tt) hòa tan natri hyaluronat tạo thành dung dịch có nồng độ cao 50 mg/ml dễ dàng phân tán tác nhân liên kết chéo BDDE giai đoạn tiếp Ngồi vai trị dung mơi hịa tan natri hyaluronat, dung dịch NaOH 0,5% (kl/tt) cịn tạo mơi trường phản ứng natri hyaluronat với tác nhân liên kết chéo BDDE giai đoạn 4.1.2 Phương pháp tạo gel natri hyaluronat liên kết chéo Tác nhân liên kết chéo BDDE thêm vào sau giai đoạn hòa tan natri hyaluronat dung môi NaOH 0,5% (kl/tt), với nồng độ khảo sát khác 1,049 mg/ml, 2,098 mg/ml, 3,147 mg/ml tỉ lệ (%) BDDE phản ứng giống nhau, phụ thuộc vào nhiệt độ thời gian phản ứng Sau tác nhân liên kết chéo BDDE phân tán dung dịch natri hyaluronat, BDDE phản ứng với natri hyaluronat điều kiện khác nhau: 40 C giờ, 40 C giờ, 50 C giờ, 50 C giờ, 50 C giờ, 50 C giờ, 50 C Để đạt tỉ lệ natri hyaluronat liên kết chéo so với natri hyaluronat không liên kết chéo 60:40 hay tỉ lệ (%) BDDE phản ứng 60% điều kiện phản ứng 50 C thời gian phản ứng giờ, Trong phương pháp tạo gel natri hyaluronat liên kết chéo bao gồm: phương pháp đề khô tự nhiên nhiệt độ phòng, phương pháp bay áp suất giảm phương pháp đơng khơ có phương pháp bay áp suất giảm tạo gel natri hyaluronat liên kết chéo sau hoàn nguyên lại với nước cất pha tiêm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 74 Dung dịch natri hyaluronat phương pháp để khơ tự nhiên nhiệt độ phịng khơng không loại nước mà dung dịch từ không màu chuyển thành màu vàng nhạt sau 12 ngày chuyển sang màu vàng đậm sau 15 ngày Nguyên nhân gây chuyển màu dung dịch có mặt tác nhân NaOH thời gian dài, NaOH cần phải loại bỏ sau giai đoạn tạo gel natri hyaluronat liên kết chéo Chính giai đoạn tạo gel natri hyaluronat, trình loại nước phải thực thời gian ngắn Việc loại bỏ tác nhân NaOH sau giai đoạn tạo gel natri hyaluronat liên kết chéo phương pháp rửa gel dễ dàng việc loại bỏ tác nhân NaOH dạng bào chế dung dịch Kết giai đoạn tạo gel natri hyaluronat liên kết chéo phương pháp đông khô thu khối bánh hình vàng nhạt hồn nguyên với nước cất pha tiêm tạo thành dung dịch vàng nhạt khơng hình thành dạng bào chế gel Ngun nhân phương pháp đơng khô giữ vững cấu trúc bảo quản hàm lượng hoạt chất trước đông khô mà không thay đổi cấu trúc dạng bào chế Bên cạnh đó, thời gian hồn tất quy trình đơng khơ ngày ml dung dịch natri hyaluronat Kết giai đoạn tạo gel natri hyaluronat liên kết chéo phương pháp bay áp suất giảm thu lớp màng mỏng màu trắng màu vàng nhạt sau hoàn nguyên lại với nước cất pha tiêm thu gel natri hyaluronat liên kết chéo Không phương pháp tạo gel natri hyaluronat liên kết chéo phương pháp khảo sát mà phương pháp bay áp suất giảm phương pháp loại bỏ nước nhanh với khoảng thời gian để loại nước tạo thành lớp màng mỏng 45-70 phút thể tích dung dịch ml 4.1.3 Giai đoạn rửa gel natri hyaluronat liên kết chéo Để loại tác nhân liên kết chéo BDDE lại sau phản ứng NaOH gel natri hyaluronat liên kết chéo, tiến hành rửa gel natri hyaluronat liên kết chéo nước cất pha tiêm đệm phosphat Một tính chất gel natri hyaluronat trương nở nước cất pha tiêm gel cứng khả trương nở nước cất pha tiêm gel mềm khả Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 75 trương nở nước cất pha tiêm nhiều Tính chất gel cứng hay gel mềm phụ thuộc vào nhiệt độ thời gian phản ứng giai đoạn tạo gel natri hyaluronat liên kết chéo Nhiệt độ cao thời gian phản ứng dài gel natri hyaluronat liên kết chéo mềm Giai đoạn rửa gel natri hyaluronat liên kết chéo chia thành công đoạn nhỏ: công đoạn rửa gel natri hyaluronat nước cất pha tiêm với cách tiến hành ngâm gel nước cất pha tiêm loại bỏ nước dư, lặp lại lần; công đoạn rửa gel natri hyaluronat liên kết chéo đệm phosphat với cách tiến hành tương tự quy trình rửa gel natri hyaluronat nước cất pha tiêm với số lần rửa lần Kết thu gel natri hyaluronat liên kết chéo có pH = 7,0 ± 0,1 Mặc dù thể tích gel natri hyaluronat sau rửa lần nước cất pha tiêm tăng lên đáng kể (8 - 12 lần so với thể tích gel ban đầu) thể tích sau rửa với lần đệm phosphat gần với thể tích gel ban đầu trước rửa với nước (0,8 - 1,2 lần so với thể tích gel ban đầu) Có nghĩa tiểu phân gel natri hyaluronat liên kết chéo có tính chất trương nở nước cất pha tiêm co lại đệm phosphat Tuy nhiên, công thức gel natri hyaluronat tạo thành từ cơng thức CT11 CT14 có tính chất gel q mềm thể tích gel thu sau rửa 0,4 lần so với thể tích gel ban đầu nồng độ natri hyaluronat gel giảm nhiều Gel natri hyaluronat liên kết chéo tạo thành sau giai đoạn bay áp suất giảm khối gel lớn, đồng Tuy nhiên, công đoạn rửa gel natri hyaluronat liên kết chéo với nước cất pha tiêm, gel cứng giữ hình dạng khối gel ban đầu gel mềm phân tán thành tiểu phân gel có kích thước nhỏ hơn, gel mềm tiểu phân gel có kích thước nhỏ Và kích thước hạt gel nhỏ sau rửa gel với đệm phosphat Vì vậy, giai đoạn rửa gel natri hyaluronat liên kết chéo gel tạo thành từ công thức CT11 CT14, tiểu phân gel có kích thước q nhỏ bị thất q trình loại nước dư Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 76 4.1.4 Giai đoạn giảm kích thước gel natri hyaluronat liên kết chéo Gel natri hyaluronat liên kết chéo sau rửa nước cất pha tiêm đệm phosphat để loại bỏ tác nhân liên kết chéo BDDE tác nhân NaOH làm giảm kích thước cách ép qua lưới thép với kích thước 50 mesh (300 µm) 200 mesh (75 µm) Kết thu có gel natri hyaluronat tạo thành từ công thức CT10, CT11 CT14 qua lưới thép với kích thước 200 mesh (75 µm) có nghĩa tiểu phân gel natri hyaluronat có kích thước nhỏ 75 µm Mặc dù gel natri hyaluronat tạo thành từ công thức CT13 có điều kiện phản ứng giống với gel natri hyaluronat tạo thành từ công thức CT10 hàm lượng tác nhân liên kết chéo BDDE đầu vào khác (nồng độ BDDE 2,098 mg/ml công thức CT10 3,147 mg/ml công thức CT13) kết gel natri hyaluronat tạo thành từ công thức CT13 ép qua lưới thép với kích thước 50 mesh (300 µm) mà khơng ép qua lưới thép với kích thước 200 mesh (75 µm) Vì vậy, yếu tố ảnh hưởng đến giai đoạn giảm kích thước gel natri hyaluronat liên kết chéo bao gồm: điều kiện phản ứng natri hyaluronat tác nhân liên kết chéo BDDE, lượng tác nhân liên kết chéo BDDE đầu vào Gel natri hyaluronat tạo thành từ công thức CT11 CT14 sau ép qua lưới thép với kích thước 200 mesh (75 µm) có hàm lượng natri hyaluronat gel thấp (nhỏ mg/ml) Trong gel natri hyaluronat tạo thành từ công thức CT10 sau ép qua lưới thép với kích thước 200 mesh (75 µm) có hàm lượng natri hyaluronat gel 5-8 mg/ml Trong giai đoạn giảm kích thước gel natri hyaluronat liên kết chéo, công đoạn ép gel natri hyaluronat tạo thành từ công thức CT11 CT14 qua lưới thép với kích thước 200 mesh (75 µm) dễ dàng thực gel natri hyaluronat tạo thành từ cơng thức CT10 Vì vậy, gel có hàm lượng natri hyaluronat thấp cơng đoạn ép gel qua lưới thép với kích thước 200 mesh (75 µm) dễ dàng thực Tuy nhiên, hàm lượng natri hyaluronat q thấp khó thực giai đoạn điều chỉnh hàm lượng natri hyaluronat Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 77 4.1.5 Giai đoạn điều chỉnh hàm lượng natri hyaluronat, đóng thuốc vào bơm tiêm tiệt trùng Gel natri hyaluronat tạo thành từ công thức CT10 sau ép qua lưới thép với kích thước 200 mesh (75 µm) có hàm lượng natri hyaluronat gel có khoảng dao động lớn (5-8 mg/ml) khơng thể kiểm soát khả trương nở gel giai đoạn rửa gel natri hyaluronat liên kết chéo với nước cất pha tiêm đệm phosphat Tuy nhiên, vấn đề khắc phục cách: ghi nhận thể tích hàm lượng natri hyaluronat gel natri hyaluronat liên kết chéo sau ép qua lưới thép với kích thước 200 mesh (75 µm) để xác định thể tích đệm phosphat dùng để hồn ngun sau để khơ gel nhiệt độ phịng Để khơ gel natri hyaluronat liên kết chéo điều kiện nhiệt độ phòng đến thu lớp màng mỏng, thêm đệm phosphat tích tính tốn được, phân tán lớp màng mỏng đệm phosphat để yên 5-10 phút để khối gel hấp thụ hoàn tồn dung dịch đệm phosphat Đóng gel natri hyaluronat liên kết chéo vào bơm tiêm thủy tinh tiệt trùng 121°C 20 phút phương pháp nhiệt ẩm 4.1.6 Kết độ lặp lại quy trình Cơng thức CT10 lựa chọn để thực lô liên tiếp với số lô PT-CT109507510, PT-CT10-9507610, PT-CT10-9507710 Kết quả: Gel trong, không màu đựng bơm tiêm, gắn sẵn pít-tơng nhựa, khơng có vật thể lạ; phổ đồ dung dịch mẫu thử tương đương với dung dịch chuẩn khoảng bước sóng 350800 nm phương pháp UV-Vis tiêu định tính; tiêu: pH, thể tích, hàm lượng BDDE tồn dư độ vô khuẩn đạt yêu cầu quy định; kết định lượng lô PT-CT10-9507510 104,39%, lô PT-CT10-9507510 104,22%, lô PT-CT10-9507510 99,18% so với hàm lượng natri hyaluronat nhãn (24 mg/ml) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 78 4.2 Ứng dụng quy trình điều chế thuốc tiêm chứa natri hyaluronat tác dụng kéo dài vào quy mô sản xuất công nghiệp Mặc dù quy trình điều điều chế thuốc tiêm chứa natri hyaluronat tác dụng kéo dài có độ lặp lại quy mơ phịng thí nghiệm cịn nhiều giới hạn ứng dụng vào quy mô pilot quy mơ sản xuất Bên cạnh đó, hiệu suất quy trình vấn đề cần nghiên cứu Hiệu suất quy trình thấp thất tiểu phân gel có kích thước nhỏ bị loại bỏ với nước dư sau rửa giai đoạn rửa gel natri hyaluronat liên kết chéo nước cất pha tiêm đệm phosphat Vấn đề khắc phục việc sử dụng màng lọc thẩm tích giai đoạn rửa gel natri hyaluronat liên kết chéo Tuy nhiên để thực giai đoạn rửa gel natri hyaluronat liên kết chéo màng lọc thẩm thích phải thực quy mơ lớn tối thiểu quy mơ pilot vận hành hệ thống lọc thẩm tích Ngồi ra, tính chất nhớt natri hyaluronat làm cho dung dịch natri hyaluronat gel natri hyaluronate liên kết chéo dính dụng cụ, trang thiết bị quy trình nhiều làm cho hiệu suất quy trình thấp Vấn đề khác phục việc hạn chế thay đổi dụng cụ, trang thiết bị quy trình pha chế thật cần thiết Một vấn đề khác nâng cấp cỡ lô lên quy mô pilot quy mô sản xuất giai đoạn đóng gel natri hyaluronat liên kết chéo vào bơm tiêm thủy tinh Bởi tính chất nhớt gel dạng bào chế dạng gel nên khó khăn cho việc đóng thuốc vào bơm tiêm để đạt thể tích xác hệ thống máy tự động Tuy nhiên, vấn đề nghiên cứu giải quy mô pilot Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 79 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Sau trình thực hiện, đề tài thu số kết sau:  Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng natri hyaluronat thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml Phương pháp định lượng hoạt chất natri hyaluronat thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml phương pháp UV-Vis xây dựng thẩm định Kết phương pháp kiểm nghiệm đạt yêu cầu độ đặc hiệu, tính tuyến tính, độ đúng, độ xác, khoảng xác định  Xây dựng thẩm định phương pháp xác nồng độ BDDE lại sau phản ứng hàm lượng BDDE tồn dư thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml Phương pháp xác nồng độ BDDE lại sau phản ứng hàm lượng BDDE tồn dư thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml phương pháp quang phổ huỳnh quang xây dựng thẩm định Kết phương pháp kiểm nghiệm đạt yêu cầu độ đặc hiệu, tính tuyến tính, giới hạn phát  Xây dựng quy trình điều chế thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml Cơng thức, quy trình điều chế thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml khảo sát xây dựng Kết thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml đạt tiêu định lượng hàm lượng BDDE tồn dư Độ lặp lại quy trình theo cơng thức CT10 thực lô liên tiếp Kết lô đạt đạt tiêu định lượng hàm lượng BDDE tồn dư Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 80  Xây dựng tiêu chuẩn sở cho thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml Tiêu chuẩn kĩ thuật thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml xây dựng bao gồm tiêu: cảm quan, định tính, thể tích, pH, định lượng, hàm lượng BDDE tồn dư độ vô khuẩn ĐỀ NGHỊ Do thời gian thực đề tài có hạn, hoạt chất natri hyaluronat có giá thành cao, trang thiết bị quy mô pilot không đầy đủ,… nên đề tài dừng lại phương pháp nêu đề nghị nghiên cứu sau đề tài thực sau: - Nâng cấp lên cỡ lô pilot tối ưu hóa quy trình cỡ lơ pilot - Thẩm định quy trình lơ liêp tiếp cỡ lơ pilot - Nghiên cứu đầy đủ độ ổn định thành phẩm điều kiện lão hóa cấp tốc dài hạn - Triển khai sản xuất quy mô cơng nghiệp Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Anh [1] Allemann I B., Baumann L (2008), "Hyaluronic acid gel (Juvéderm™) preparations in the treatment of facial wrinkles and folds", Clinical interventions in aging (4), pp 629 [2] Ballin A C., Cazzaniga A., Brandt F S (2013), "Long-term efficacy, safety and durability of Juvéderm® XC", Clinical, cosmetic and investigational dermatology 6, pp 183 [3] Bezzola A., Micheels P (2005), "Esthélis®, acide hyaluronique de conception suisse Première étude complète des caractéristiques physicochimiques et essais cliniques", Journal de médecine esthétique et de chirurgie dermatologique 32 (125), pp 11-20 [4] Chun C., Lee D Y., Kim J T., Kwon M K., Kim Y Z., Kim S S (2016), "Effect of molecular weight of hyaluronic acid (HA) on viscoelasticity and particle texturing feel of HA dermal biphasic fillers", Biomaterials research 20 (1), pp 24 [5] Costa A., Della Coletta L., Talarico A (2013), "Rheological characteristics of hyaluronic acid based dermal fillers before and after flowing through needles", Surg Cosmet Dermatol (1), pp 88-91 [6] De Boulle K., Glogau R., Kono T., Nathan M., Tezel A., Roca‐Martinez J X., Paliwal S., Stroumpoulis D (2013), "A review of the metabolism of 1, 4‐ Butanediol Diglycidyl ether–crosslinked hyaluronic acid dermal fillers", Dermatologic Surgery 39 (12), pp 1758-1766 [7] Edsman K., Nord L I., Öhrlund Å., Lärkner H., Kenne A H (2012), "Gel properties of hyaluronic acid dermal fillers", Dermatologic Surgery 38 (7pt2), pp 1170-1179 [8] Fakhari A., Berkland C (2013), "Applications and emerging trends of hyaluronic acid in tissue engineering, as a dermal filler and in osteoarthritis treatment", Acta biomaterialia (7), pp 7081-7092 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 82 [9] Falcone S J., Berg R A (2008), "Crosslinked hyaluronic acid dermal fillers: a comparison of rheological properties", Journal of Biomedical Materials Research Part A: An Official Journal of The Society for Biomaterials, The Japanese Society for Biomaterials, and The Australian Society for Biomaterials and the Korean Society for Biomaterials 87 (1), pp 264-271 [10] Feng H., Zhang G (2012), "Determination of free 1, 4-butanediol diglycidyl ether in cross-linked hyaluronic acid gel by fluorospectrophotometry", Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis 32 (4), pp 654-657 [11] Flynn T C., Sarazin D., Bezzola A., Terrani C., Micheels P (2011), "Comparative histology of intradermal implantation of mono and biphasic hyaluronic acid fillers", Dermatologic Surgery 37 (5), pp 637-643 [12] Gold M H (2007), "Use of hyaluronic acid fillers for the treatment of the aging face", Clinical interventions in aging (3), pp 369 [13] Iannitti T., Bingưl A Ư., Rottigni V., Palmieri B (2013), "A new highly viscoelastic hyaluronic acid gel: rheological properties, biocompatibility and clinical investigation in esthetic and restorative surgery", International journal of pharmaceutics 456 (2), pp 583-592 [14] Kablik J., Monheit G D., Yu L., Chang G., Gershkovich J (2009), "Comparative physical properties of hyaluronic acid dermal fillers", Dermatologic Surgery 35, pp 302-312 [15] Longas M O., Russell C S., He X Y (1987), "Evidence for structural changes in dermatan sulfate and hyaluronic acid with aging", Carbohydrate research 159 (1), pp 127-136 [16] Meyer L J., Stern R (1994), "Age-dependent changes of hyaluronan in human skin", Journal of Investigative Dermatology 102 (3), pp 385-389 [17] Micheels P., Besse S., Flynn T C., Sarazin D., Elbaz Y (2012), "Superficial dermal injection of hyaluronic acid soft tissue fillers: comparative ultrasound study", Dermatologic Surgery 38 (7pt2), pp 1162-1169 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 83 [18] Necas J., Bartosikova L., Brauner P., Kolar J (2008), "Hyaluronic acid (hyaluronan): a review", Veterinarni medicina 53 (8), pp 397-411 [19] Papakonstantinou E., Roth M., Karakiulakis G (2012), "Hyaluronic acid: A key molecule in skin aging", Dermato-endocrinology (3), pp 253-258 [20] Park K., Kim H., Kim B (2014), "Comparative study of hyaluronic acid fillers by in vitro and in vivo testing", Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology 28 (5), pp 565-568 [21] Rebecca Kleinerman M., Gary Goldenberg M., Emanuel P O (2010), "Histopathologic identification of dermal filler agents", Journal of Drugs in Dermatology (9) [22] Redbord K P., Busso M., Hanke C W (2011), "Soft‐tissue augmentation with hyaluronic acid and calcium hydroxyl apatite fillers", Dermatologic therapy 24 (1), pp 71-81 [23] Rhodes J M., Simons M (2007), "The extracellular matrix and blood vessel formation: not just a scaffold", Journal of cellular and molecular medicine 11 (2), pp 176-205 [24] Robinson D M., Aasi S Z (2011), "Cosmetic concerns and management strategies to combat aging", Maturitas 70 (3), pp 256-260 [25] Romagnoli M., Belmontesi M (2008), "Hyaluronic acid–based fillers: theory and practice", Clinics in dermatology 26 (2), pp 123-159 [26] Sadick N S., Karcher C., Palmisano L (2009), "Cosmetic dermatology of the aging face", Clinics in dermatology 27 (3), pp S3-S12 [27] Santilli V., Paoloni M., Mangone M., Alviti F., Bernetti A (2016), "Hyaluronic acid in the management of osteoarthritis: injection therapies innovations", Clinical Cases in Mineral and Bone Metabolism 13 (2), pp 131 [28] Schanté C E., Zuber G., Herlin C., Vandamme T F (2011), "Chemical modifications of hyaluronic acid for the synthesis of derivatives for a broad Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 84 range of biomedical applications", Carbohydrate polymers 85 (3), pp 469489 [29] Scott J E (1995), "Extracellular matrix, supramolecular organisation and shape", Journal of anatomy 187 (Pt 2), pp 259 [30] Stern R., Maibach H I (2008), "Hyaluronan in skin: aspects of aging and its pharmacologic modulation", Clinics in dermatology 26 (2), pp 106-122 [31] Stuhlmeier K M., Pollaschek C (2004), "Differential effect of transforming growth factor β (TGF-β) on the genes encoding hyaluronan synthases and utilization of the p38 MAPK pathway in TGF-β-induced hyaluronan synthase activation", Journal of Biological Chemistry 279 (10), pp 87538760 [32] Tezel A., Fredrickson G H (2008), "The science of hyaluronic acid dermal fillers", Journal of Cosmetic and Laser Therapy 10 (1), pp 35-42 [33] The European Directorate for the Quality of Medicines (2017), The European Pharmacopoeia 9.0, pp 3583-3585 [34] Tran C., Carraux P., Micheels P., Kaya G., Salomon D (2014), "In vivo biointegration of three hyaluronic acid fillers in human skin: a histological study", Dermatology 228 (1), pp 47-54 [35] Zawko S A., Suri S., Truong Q., Schmidt C E (2009), "Photopatterned anisotropic swelling of dual-crosslinked hyaluronic acid hydrogels", Acta biomaterialia (1), pp 14-22 [36] Zhong S., Campoccia D., Doherty P., Williams R., Benedetti L., Williams D (1994), "Biodegradation of hyaluronic acid derivatives by hyaluronidase", Biomaterials 15 (5), pp 359-365 Trang web [37] https://www.alfa.com/en/catalog/L12632/ Truy cập ngày 03 tháng 04 năm 2018 [38] https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/1_4-Butanediol-diglycidylether#section=3D-Conformer Truy cập ngày 08 tháng 04 năm 2018 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 85 [39] https://reference.medscape.com/drug/orthovisc-synvisc-hyaluronic-acid-andderivatives-999526#5 Truy cập 26 tháng 06 năm 2019 [40] https://restylane.co.uk/overview/technology Truy cập ngày 12 tháng 05 năm 2019 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... việc điều chế natri hyaluronat liên kết chéo thực cần thiết Mục tiêu đề tài nghiên cứu quy trình điều chế thuốc tiêm natri hyaluronat tác động kéo dài hay tạo liên kết chéo phân tử natri hyaluronat. .. NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu trang thiết bị Các ngun liệu, tá dược, hóa chất, dung mơi, trang thiết bị bào chế kiểm nghiệm sử dụng nghiên cứu điều chế thuốc tiêm natri hyaluronat tác dụng kéo dài. .. DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - PHẠM PHAN THÔNG NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ THUỐC TIÊM CHỨA NATRI HYALURONAT TÁC DỤNG KÉO DÀI Ngành: Công nghệ dược phẩm bào chế thuốc Mã số: 8720202 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC