Điều chế hệ tiểu phân nano chứa cao linh chi (ganoderma lucidum) hướng tác dụng kháng cholinesterase

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRẦN THỊ NGUYÊN ĐĂNG ĐIỀU CHẾ HỆ TIỂU PHÂN NANO CHỨA CAO LINH CHI (Ganoderma lucidum) HƯỚNG TÁC DỤNG KHÁNG CHOLINESTERASE Ngành: Công nghệ dược phẩm bào chế thuốc Mã số: 8720202 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS TRẦN PHI HOÀNG YẾN TS TRẦN LÊ TUYẾT CHÂU Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Người cam đoan Trần Thị Nguyên Đăng i Luận văn Thạc sĩ Dược học – Năm học 2016-2018 “Điều chế hệ tiểu phân nano chứa cao Linh chi (Ganoderma lucidum) hướng tác dụng kháng cholinesterase” Trần Thị Nguyên Đăng Người hướng dẫn: PGS TS Trần Phi Hoàng Yến TS Trần Lê Tuyết Châu TÓM TẮT Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) dược liệu quý sử dụng từ lâu Các nghiên cứu gần cho thấy triterpenoid nấm Linh chi có tác dụng chống suy giảm trí nhớ, hỗ trợ điều trị bệnh Alzheimer Tuy nhiên, thành phần thân dầu nên khó hấp thu vào thể chưa có sản phẩm thị trường thiên hướng điều trị Nghiên cứu đặt mục tiêu điều chế hệ tiểu phân nano chứa triterpenoid nấm Linh chi để hoạt chất hấp thu dễ dàng Nghiên cứu thực nguyên liệu nấm Linh chi đỏ (Ganoderma lucidum) giống Việt Nam Nghiên cứu sơ dự thảo tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao Linh chi, xây dựng quy trình điều chế hệ tiểu phân nano chứa cao Linh chi dùng làm nguyên liệu bào chế viên nang mềm Đồng thời, sản phẩm tạo thành chứng minh có hoạt tính ức chế cholinesterase phương pháp Ellman Hệ tiểu phân nano chứa cao Linh chi sau điều chế theo dõi độ ổn định tháng điều kiện nhiệt độ 30 ± oC độ ẩm 75 ± 5% Kết nghiên cứu cho thấy tiểu phân nano Linh chi đạt kích thước trung bình 143,940 ± 2,525 nm (PdI = 0,338 ± 0,002), zêta trung bình -34,767 ± 0,153 mV ổn định sau tháng theo dõi Hệ tiểu phân có hoạt tính ức chế cholinesterase với IC50 = 0,094 µg/mL, gấp 2,59 lần so với cao Linh chi (IC50 = 0,244 µg/mL) (tính theo hàm lượng acid ganoderic A) Nghiên cứu sở cho nghiên cứu sâu nhằm bào chế dược phẩm có nguồn gốc tự nhiên sử dụng điều trị bệnh suy giảm trí nhớ Từ khóa: Ganoderma lucidum, acid ganoderic A, hệ tiểu phân nano, Alzheimer Final thesis for the Master degree of Pharmacy – Academic year: 2016 - 2018 “Preparation of nanodispersion loaded Lingzhi extract (Ganoderma lucidum) having the potential to inhibit cholinesterase activity” Tran Thi Nguyen Dang Supervisor: Tran Phi Hoang Yen, Assoc Prof, Ph.D Tran Le Tuyet Chau, Ph.D SUMMARY Lingzhi (Ganoderma lucidum) has been considered as a herbal medicine for a long time Recent studies have shown that triterpenoids in the Lingzhi (Lz) have targeting for treatment of dementia-related diseases such as Alzheimer However, this ingredient is hydrophobic so it is difficult to be absorbed by cells Moreover, there are limited products based on Lingzhi for the treatment to these diseases This research aimed to formulate nanodispersion containing triterpenoids uptaked by cells easily In this study, the experiments were performed on Red Lingzhi from Vietnam This study has drafted the standards of Lingzhi extract, and constructed process of nanodispersion containing Lingzhi extract (ND-Lz) In addition, ND-Lz inhibited the cholinesterase activity by the Ellman method ND-Lz were conducted the stability for months at 30 ± oC/75% RH ± 5% RH The results showed that ND-Lz had average particle size about 143.940 ± 2.525 nm (PdI = 0.338 ± 0,002), the zeta potential was -34.767 ± 0.153 mV ND-Lz was stable at least in months ND-Lz inhibited 50% of the cholinesterase activity at 0.094 μg/mL (IC50 = 0.094 μg/mL) It was higher 2.59 times than that of using Lingzhi extract (IC50 = 0.244 μg/mL) This study was the basic knowledge for further researches on using herbal in pharmaceuticals, especially in the treatment of memory disfunction Keywords: Ganoderma lucidum, acid ganoderic A, nanoparticle, Alzheimer MỤC LỤC Mục Trang Lời cam đoan… ii Bản tóm tắt toàn văn luận văn tiếng Việt iii Bản tóm tắt toàn văn luận văn tiếng Anh iv Mục lục……… v Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt viii Danh mục bảng .x Danh mục hình vẽ, sơ đồ, đồ thị xii MỞ ĐẦU…… .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 NẤM LINH CHI 1.1.1 Đặc điểm phân bố .3 1.1.2 Thành phần hóa học .4 1.1.3 Tác dụng dược lý .6 1.1.4 Tình hình nghiên cứu nấm LC nước 1.2 HỆ TIỂU PHÂN NANO 10 1.2.1 Khái niệm tiểu phân nano 10 1.2.2 Phân loại 10 1.2.3 Kỹ thuật bào chế HTP nano 13 1.2.4 Phương pháp đánh giá tính chất độ ổn định HTP nano .16 1.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM ACETYLCHOLINESTERASE 18 1.3.1 Acetylcholin, enzym acetylcholinesterase giả thuyết vai trò hệ cholinergic bệnh Alzheimer 18 1.3.2 Một số phương pháp thường dùng nghiên cứu hoạt tính ức chế enzym AChE in vitro 20 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .23 2.1.1 Dược liệu 23 2.1.2 Dung mơi, hóa chất 23 2.1.3 Dụng cụ, trang thiết bị 24 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.2.1 Chiết xuất kiểm nghiệm cao LC 25 2.2.2 Điều chế HTP-LC 32 2.2.3 Phân tích tính chất hóa lý độ ổn định HTP-LC 34 2.2.4 Thử nghiệm tác dụng kháng cholinesterase in vitro 36 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 40 3.1 CHIẾT XUẤT VÀ KIỂM NGHIỆM CAO LC .40 3.1.1 Khảo sát nguyên liệu nấm LC 40 3.1.2 Chiết xuất kiểm nghiệm cao LC 43 3.1.3 Thẩm định quy trình định lượng GA-A cao LC phương pháp HPLC 47 3.2 ĐIỀU CHẾ HTP-LC 51 3.2.1 Khảo sát độ tan GA-A cao LC số tá dược 51 3.2.2 Khảo sát thành phần chất HĐBM công thức 53 3.2.3 Thiết lập công thức quy trình điều chế HTP-LC 53 3.2.4 Định lượng GA-A HTP-LC phương pháp HPLC .56 3.3 PHÂN TÍCH TÍNH CHẤT HĨA LÝ VÀ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA HTP-LC 60 i 3.3.1 Phân tích tính chất hóa lý HTP-LC 60 3.3.2 Độ ổn định 62 3.4 THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG KHÁNG CHOLINESTERASE IN VITRO CỦA HTP-LC .63 CHƯƠNG BÀN LUẬN 67 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 70 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ .72 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 PHỤ LỤC…… PL-1 i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ nguyên ACh Acetylcholine AChE Acetylcholinesterase ATCI Acetylthiocholine iodid BSA Bovine serum albumin BTLC Biology thin layer chromatography Nghĩa tiếng Việt Sắc ký lớp mỏng sinh học D/N Dầu/nước DĐVN Dược điển Việt Nam DMSO Dimethyl sulfoxide DTNB 5,5’-dithio-bis-nitro benzoic GA-A Acid ganoderic A Hoạt động bề mặt HĐBM HLB HPH HPLC Hydrophile lipophile balance High pressure homogenization High performance liquid chromatography Hệ số phân bố dầu-nước Đồng hóa áp suất cao Sắc ký lỏng hiệu cao HTP Hệ tiểu phân HTP-LC Hệ tiểu phân nano chứa cao Linh chi KHV Kính hiển vi LC Linh chi N/D Nước/dầu p Mức ý nghĩa PdI Polydispersity index Chỉ số đa phân tán Plt Plates Số đĩa lý thuyết Từ viết tắt Từ nguyên Nghĩa tiếng Việt RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối Diện tích pic S SD Standard deviation Độ lệch chuẩn SEM Scanning electron microscopy Kính hiển vi điện tử quét Symm Symmetry Hệ số đối xứng Trung bình TB TEM Transmission electron microscopy Kính hiển vi điện tử truyền qua tR Retention time Thời gian lưu DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 1.1 Tác dụng dược lý thành phần điển hình nấm LC Bảng 1.2 Đánh giá mức độ đồng mẫu dựa số PdI 17 Bảng 2.3 Danh mục dung mơi, hóa chất sử dụng 23 Bảng 2.4 Danh mục dụng cụ, trang thiết bị 24 Bảng 2.5 Dự thảo tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao LC 26 Bảng 2.6 Dự thảo tiêu chuẩn kiểm nghiệm HTP-LC 34 Bảng 2.7 Pha dung dịch chuẩn AChE 37 Bảng 2.8 Thành phần mẫu thử nghiệm (cho vào giếng) 38 Bảng 3.9 Kết xác định độ ẩm nguyên liệu nấm LC 42 Bảng 3.10 Kết xác định độ tro nguyên liệu nấm LC 42 Bảng 3.11 Kết xác định chất chiết dược liệu nấm LC 43 Bảng 3.12 Hiệu suất chiết cao LC phân đoạn cloroform từ dược liệu 43 Bảng 3.13 Kết xác định độ ẩm cao LC 44 Bảng 3.14 Kết xác định pH cao LC 44 Bảng 3.15 Kết xác định cắn không tan nước cao LC 45 Bảng 3.16 Kết xác định độ tro cao LC 45 Bảng 3.17 Kết định lượng GA-A cao LC 47 Bảng 3.18 Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống phương pháp định lượng GA-A cao LC 48 Bảng 3.19 Sự tương quan nồng độ GA-A diện tích đỉnh 49 Bảng 3.20 Kết độ lặp lại phương pháp định lượng GA-A cao LC 50 Bảng 3.21 Kết độ phương pháp định lượng GA-A cao LC 51 .1 PHỤ LỤC Phụ lục Trang Phụ lục Kết kiểm nghiệm dung môi tồn dư mẫu cao LC Phụ lục Kết kiểm nghiệm giới hạn nhiễm khuẩn mẫu cao LC .3 Phụ lục Sắc ký đồ thẩm định tính phù hợp hệ thống quy trình định lượng GAA cao LC Phụ lục Sắc ký đồ thẩm định tính phù hợp hệ thống quy trình định lượng GAA HTP-LC .10 Phụ lục Phổ UV acid ganoderic A 13 Phụ lục Kết kiểm nghiệm cao LC theo dự thảo tiêu chuẩn sở 14 Phụ lục Kết kiểm nghiệm HTP-LC theo dự thảo tiêu chuẩn sở 15 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Phụ lục Kết kiểm nghiệm dung môi tồn dư mẫu cao LC Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Phụ lục Kết kiểm nghiệm giới hạn nhiễm khuẩn mẫu cao LC Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Phụ lục Sắc ký đồ thẩm định tính phù hợp hệ thống quy trình định lượng GA-A cao LC Mẫu chuẩn (1) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Mẫu chuẩn (2) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Mẫu chuẩn (3) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Mẫu cao LC (1) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Mẫu cao LC (2) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Mẫu cao LC (3) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 10 Phụ lục Sắc ký đồ thẩm định tính phù hợp hệ thống quy trình định lượng GA-A HTP-LC Mẫu HTP-LC (1) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 11 Mẫu HTP-LC (2) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 12 Mẫu HTP-LC (3) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 13 Phụ lục Phổ UV acid ganoderic A Mẫu chuẩn HTP-LC Hình 2D Hình 3D Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 14 Phụ lục Kết kiểm nghiệm cao LC theo dự thảo tiêu chuẩn sở STT Chỉ tiêu Mức chất lượng Kết Cảm quan Khối đặc quánh, màu nâu đen, mùi thơm đặc trưng, vị đắng Đạt Độ ẩm Không 20% Đạt (7,46 ± 0,06%) pH Từ 3,5-4,5 Đạt (3,79 ± 0,05) Cắn không tan nước Không 80% Đạt (84,382 ± 0,820%) Tro toàn phần Không 1% Đạt (0,344 ± 0,006%) Không 0,5% Đạt (0,111 ± 0,002%) Khơng q 60 µg/g Đạt (Khơng phát hiện) Khơng q 20 µg/mL Đạt Tro không tan acid Tồn dư dung môi cloroform Giới hạn kim loại nặng Giới hạn nhiễm khuẩn 10 Định tính 11 Định lượng Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại khơng q 104 g Tổng số Enterobacteria ≤ 500 g Nấm ≤ 100 g Đạt Mẫu thử phải Escherichia coli, Salmonella, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus g Triterpenoid: vịng ngăn cách màu đỏ, dung dịch phía màu vàng xanh Đúng Sắc ký lớp mỏng: mẫu thử phải có vết trùng với vết GA-A Đạt Hàm lượng GA-A: ≥ 0,16% (0,181 ± 0,001%) (1,809 ± 0,013 mg/g) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 15 Phụ lục Kết kiểm nghiệm HTP-LC theo dự thảo tiêu chuẩn sở STT Chỉ tiêu Mức chất lượng Kết Cảm quan HTP có màu nâu, khơng xuất hiện tượng bền dễ dàng phân tán vào mơi trường nước Đạt Kích thước tiểu phân 50-200 nm đỉnh Kiểu phân bố kích thước Đạt (143,940 ± 2,525 nm) Đạt (1 đỉnh) PdI ≤ 0,4 Đạt (0,338 ± 0,002) Thế zêta (giá trị tuyệt đối) 30-60 mV Đạt (34,767 ± 0,153 mV) Định lượng Hàm lượng GA-A: ≥ 0,3 mg/g Đạt (0,315 ± 0,005 mg/g) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... sĩ Dược học – Năm học 2016-2018 ? ?Điều chế hệ tiểu phân nano chứa cao Linh chi (Ganoderma lucidum) hướng tác dụng kháng cholinesterase? ?? Trần Thị Nguyên Đăng Người hướng dẫn: PGS TS Trần Phi Hoàng... sử dụng phân đoạn cao cloroform LC để bào chế HTP-LC nhằm bảo vệ hoạt chất, từ đó, cải thiện tác dụng kháng cholinesterase chế phẩm 1.2 HỆ TIỂU PHÂN NANO 1.2.1 Khái niệm tiểu phân nano Tiểu phân. .. liquid chromatography Hệ số phân bố dầu-nước Đồng hóa áp suất cao Sắc ký lỏng hiệu cao HTP Hệ tiểu phân HTP-LC Hệ tiểu phân nano chứa cao Linh chi KHV Kính hiển vi LC Linh chi N/D Nước/dầu p Mức