Nghiên cứu khả năng nhân chồi in vitro cây hương thảo (rosmarinus officinalis l)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA SINH MƠI TRƢỜNG  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN CHỒI IN VITRO CÂY HƢƠNG THẢO (ROSMARINUS OFFICINALIS L.) Nguyễn Thị Mỹ Liên Đà Nẵng, năm 2020 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA SINH MƠI TRƢỜNG  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN CHỒI IN VITRO CÂY HƢƠNG THẢO (ROSMARINUS OFFICINALIS L.) Ngành: Cơng nghệ sinh học Khóa: 2016-2020 Sinh viên: Nguyễn Thị Mỹ Liên Ngƣời hƣớng dẫn: TS Võ Châu Tuấn Đà Nẵng, năm 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tôi.Các số liệu, kết nêu nghiên cứu trung thực chưa công bố cơng trình khác Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm vi phạm quy định đạo đức khoa học Tác giả Nguyễn Thị Mỹ Liên i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực khóa luận tốt nghiệp, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô truyền đạt, định hƣỡng giúp tiếp cận với kiến thức khoa học chuyên nghành bổ ích, rèn luyện đƣợc kỹ bổ ích suốt trình thực khoa Sinh – Mơi trƣờng, trƣờng đại học Sƣ phạm – Đại học Đà Nẵng Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Võ Châu Tuấn – ngƣời thầy tận tâm, tận tình hƣớng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình tơi thực đề tài Xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô khoa Sinh - Môi trƣờng giúp đỡ, động viên tơi q trình tơi thực khóa luận tốt nghiệp Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè ln bên cạnh động viên, khích lệ tinh thân vật chất lẫn tinh thần tơi khó khăn để đề tài đạt kết tốt Xin chân thành cảm ơn! Đà Nẵng, tháng 07 năm 2020 Sinh viên thực Nguyễn Thị Mỹ Liên ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vii MỞ ĐẦU .1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài 2.1 Mục tiêu chung 2.2 Mục tiêu cụ thể Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 3.1 Ý nghĩa khoa học .2 3.2 Ý nghĩa thực tiễn .3 CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 1.1 GIỚI THIỆU VỀ NHÂN GIỐNG IN VITRO Ở THỰC VẬT 1.1.1 Cở sở khoa học nhân giống in vitro .4 1.1.2 Các giai đoạn nhân giống in vitro 1.1.3 Ƣu điểm hạn chế nhân giống in vitro 1.1.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến trình nhân giống in vitro 1.2 GIỚI THIỆU VỀ CÂY HƢƠNG THẢO 13 1.2.1 Nguồn gốc 13 1.2.2 Đặc điểm sinh học, sinh thái 13 1.2.3 Các hợp chất có hoạt tính sinh học .14 1.2.4 Công dụng Hƣơng thảo 15 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY HƢƠNG THẢO 17 1.3.1 Những nghiên cứu nƣớc 17 1.3.2 Những nghiên cứu Thế giới 18 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 iii 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU .20 2.2 PHẠM VI NGHIÊN CỨU 20 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.3.1 Phƣơng pháp khử trùng mẫu vật 20 2.3.2 Phƣơng pháp nhân chồi in vitro Hƣơng thảo từ đoạn thân in vitro 21 2.3.3 Phƣơng pháp nhân chồi in vitro Hƣơng thảo từ callus 21 2.3.4 Phƣơng pháp xử lí số liệu .21 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .22 3.1 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ KHỬ TRÙNG MẪU VẬT VÀ TÁI SINH CHỒI IN VITRO 22 3.2 ẢNH HƢỞNG CỦA CHẤT ĐHST ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN CHỒI TỪ ĐOẠN THÂN CÂY HƢƠNG THẢO IN VITRO 24 3.2.1 Ảnh hƣởng BA đến khả nhân chồi in vitro từ đoạn thân 24 3.2.2 Ảnh hƣởng TDZ đến khả nhân chồi in vitro từ đoạn thân 26 3.3 ẢNH HƢỞNG CỦA CHẤT ĐHST ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN CHỒI TỪ CALLUS 28 3.3.1 Ảnh hƣởng BA đến khả nhân chồi từ callus 28 3.3.1 Ảnh hƣởng TDZ đến khả nhân chồi từ callus .30 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : Diclorophenoxyacetic acid BA : – benzyl adenine BAP : 6-benzylaminopurine Cs : cộng ĐHST : Điều hòa sinh trƣởng KIN : Kinetin MS : Murashige Skoog (1962) NAA : α-naphthalen acetic acid TDZ : Thidiazuron v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 3.2 3.3 3.4 Tên bảng Ảnh hƣởng thời gian khử trùng đến hiệu khử trùng hạt Hƣơng thảo Ảnh hƣởng BA đến khả nhân chồi in vitro từ đoạn thân sau tuần nuôi cấy Ảnh hƣởng TDZ đến khả nhân chồi in vitro từ đoạn thân sau tuần nuôi cấy Ảnh hƣởng BA đến khả nhân chồi in vitro từ callus Trang 22 24 26 28 sau -6 tuần nuôi cấy 3.5 Ảnh hƣởng TDZ đến khả nhân chồi in vitro từ callus sau tuần nuôi cấy vi 31 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 2.1 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 Tên hình vẽ Cây Hƣơng thảo tự nhiên Cây Hƣơng thảo in vitro nảy mầm từ hạt môi trƣờng MS sau tuân nuôi cấy Cụm chồi in vitro sinh trƣởng môi trƣờng có BA khác sau tuần ni cấy Cụm chồi in vitro sinh trƣởng môi trƣờng có TDZ khác sau tuần ni cấy Chồi in vitro tái sinh từ callus sau tuần nuôi cấy môi trƣờng BA khác Chồi in vitro tái sinh từ callus sau tuần nuôi cấy môi trƣờng TDZ khác vii Trang 20 23 25 27 29 31 TĨM TẮT Trong khóa luận này, kết nghiên cứu khả tái sinh chồi Hƣơng thảo (Rosmarinus officinalis L.) kĩ thuật nuôi cấy in vitro đƣợc cung cấp Giai đoạn khử trùng hạt giống Hƣơng thảo để tạo thu đƣợc kết quả, hạt giống cho hiệu khử trùng tốt sử dụng cồn 70°trong thời gian 60 giây NaOCl 5% thời gian 10 phút đạt 50% tỷ lệ nảy mầm sau tuần nuôi cấy Sau đƣợc tái sinh từ hạt đem nuôi cấy đoạn thân môi trƣờng BA 0,5 – 2,5 mg/ l để thực khả tái sinh chồi Hƣơng thảo Kết cho thấy, môi trƣờng MS có bổ sung BA với nồng độ 2,0 mg/ l thu đƣợc kết tái sinh chồi cao với 29,4 chồi/ cụm, chiều cao cậy đạt 1,72 cm, tình trạng cụm chồi xanh tốt sau tuần nuôi cấy Tuy nhiên, nuôi cấy đoạn thân mơi trƣờng MS có bổ sung 0,2 – 0,5 mg/ l TDZ, sau tuần thu đƣợc cụm chồi ngắn nhỏ, có xuất thể protocorm; TDZ với nồng độ 1,0 mg/ l hình thành thể protocorm mạnh Tiếp tục sử dụng đoạn thân tái sinh từ hạt nuôi cấy môi trƣờng MS bổ sung 0,05TDZ mg/ l kết hợp với 0,2 mg/ l NAA để nhân callus Ni cấy callus mơi trƣờng MS có bổ sung 0,5 – 2,5 mg/ l BA 0,2 – 1,0 mg/ l TDZ riêng lẻ Kết sau tuần nuôi cấy cho thấy, khả tái sinh chồi Hƣơng thảo từ callus nồng độ 0,5 mg/ l BA cho khả tái sinh chồi cao đạt 26,67% Đối với TDZ nồng độ 1,0 mg/ l cho khả tái sinh chồi cao đạt 6,67% thấp so với BA viii môi trƣờng MS (Murashige– Skoog,1962) bổ sung 15% (v/v) CW (nƣớc dừa) + 2,0 mg/L BA (N6-benzyladenin) sau thời gian 38 ngày nuôi cấy Khả nhân nhanh chồi từ protocorm tốt (15,20 chồi/ protocorm, chiều cao chồi 0,91 cm) môi trƣờng MS bổ sung 15% (v/v) CW + 0,3 mg/L NAA (1-Naphthylacetic acid) + 2,0 mg/L BA sau tuần TDZ đƣợc chứng minh gây tích tụ chất phụ trợ cytokinin nội sinh họ đậu thân thảo Trong nghiên cứu này, TDZ có ảnh hƣởng đáng kể đến hình thành protocorm nồng độ khác Thể đƣợc tác dụng ức chế hình thành chồi thúc đẩy trình hình thành thể protocorm Nhƣ vậy, nuôi đoạn thân mơi trƣờng có bổ sung TDZ, mẫu có xu hƣớng hình thành protocorm tăng nồng độ TDZ; mơi trƣờng có 1,0 mg/l TDZ, khả hình thành protocorm tốt Kết gọi mở đƣờng hữu hiệu nhân nhanh in vitro hƣơng thảo theo hƣớng phát sinh thể protocorm 3.3 ẢNH HƢỞNG CỦA CHẤT ĐHST ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN CHỒI TỪ CALLUS Đoạn thân in vitro từ hạt đƣợc nuôi cấy môi trƣờng MS bổ sung 0,05 mg/l TDZ 0,2 mg/l NAA để tạo callus Nhân callus môi trƣờng để tạo nguyên liệu callus khảo sát khả nhân chồi môi trƣờng có chứa BA TDZ 3.3.1 Ảnh hưởng BA đến khả nhân chồi từ callus Callus đƣợc tạo thành (sau 20 ngày) đƣợc nuôi cấy để tái sinh chồi mơi trƣờng có BA (0,5 - 3,5 mg/l) Kết đƣợc thể bảng 3.5 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng BA đến khả nhân chồi in vitro từ callus sau -6 tuần nuôi cấy BA (mg/ l) Khả nhân chồi từ callus Thời gian bắt đầu tạo chồi (Tuần) Khối lƣợng tƣơi callus (g) Tỉ lệ callus tạo chồi (%) 0,5 1,13e 26,67 1,0 - 1,26d - 1,5 - 1,74c - 2,0 - 2,31b - 2,5 2,60a 13,33 3,0 - 2,60a - 3,5 - 2,09d - Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa với p