Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính và hiệu suất thu hồi enzyme laccase từ canh trường nuôi cấy sợi nấm vân chi (trametes versicolor)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MƠI TRƯỜNG  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH VÀ HIỆU SUẤT THU HỒI ENZYME LACCASE TỪ CANH TRƯỜNG NUÔI CẤY SỢI NẤM VÂN CHI (Trameste versicolor) NGUYỄN THỊ THANH BÌNH Đà Nẵng, năm 2020 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MƠI TRƯỜNG  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH VÀ HIỆU SUẤT THU HỒI ENZYME LACCASE TỪ CANH TRƯỜNG NUÔI CẤY SỢI NẤM VÂN CHI (Trameste versicolor) Ngành : Cơng nghệ sinh học Khóa : 2016-2020 Sinh viên : Nguyễn Thị Thanh Bình Người hướng dẫn : Th.s Nguyễn Thị Bích Hằng Đà Nẵng, năm 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu sử dụng, phân tích đồ án có nguồn gốc rõ ràng, công bố theo quy định Các kết nghiên cứu đồ án tự thực hiện, phân tích cách trung thực, khách quan Các kết chưa công bố nghiên cứu khác Các số liệu trích dẫn có ghi nguồn gốc rõ ràng Sinh viên thực Nguyễn Thị Thanh Bình i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp tơi nhận nhiều quan tâm giúp đỡ từ cá nhân tập thể suốt thời gian thực Đầu tiên xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn quý báu tới ThS Nguyễn Thị Bích Hằng tạo điều kiện ln giúp đỡ tơi thực hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn BCN khoa tồn thể q thầy giáo khoa Sinh – Môi trường trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu, xây dựng thành cơng khóa luận Tôi xin cảm ơn tập thể lớp 16CNSH bạn sinh viên NCKH phịng cơng nghệ sinh học động viên giúp đỡ suốt q trình thực đề tài Cuối tơi xin chân thành cảm ơn tới ba, mẹ gia đình tơi ln lo lắng, chăm sóc tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Đà Nẵng, ii ngày tháng năm MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan laccase 1.1.1 Giới thiệu laccase 1.1.2 Cấu tạo laccase 1.1.3 Cơ chế xúc tác laccase 1.1.4 Nguồn thu nhận laccase 1.1.5 Ứng dụng laccase 1.2 Tổng quan nấm Vân chi 10 1.3 Tình hình nghiên cứu laccase 15 1.3.1 Một số nghiên cứu nước 15 1.3.2 Một số nghiên cứu giới 16 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19 2.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.2 Phạm vi nghiên cứu 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng thành phần môi trường nuôi cấy tới khả sinh enzyme laccase 20 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt độ enzyme laccase 19 2.3.3 Phương pháp thí nghiệm ảnh hưởng phương pháp nuôi cấy đến hoạt độ enzyme laccase 19 2.3.4 Phương pháp thu enzyme laccase thô 20 2.3.5 Phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme thô phương pháp kết tủa 21 2.3.6 Điện di 22 2.3.7 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 23 2.3.8 Nghiên cứu thăm dò khả ứng dụng enzyme laccase bảo quản đậu khuôn 24 2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu 26 iii CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến hoạt độ enzyme laccase từ môi trường nuôi cấy nấm Vân chi 27 3.2 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt độ enzyme laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân chi 28 3.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng phương pháp nuôi cấy đến hoạt độ enzyme laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân chi 30 3.4 Kết ảnh hưởng phương pháp nuôi cấy đến hoạt độ enzyme laccase từ sinh khối sợi nấm Vân chi .Error! Bookmark not defined 3.5 Kết thu nhận chế phẩm enzyme thô phương pháp kết tủa 32 3.5.1 Kết hiệu kết tủa (NH4)2SO4 dịch enzyme 32 3.5.2 Kết kết tủa enzyme laccase dung môi hữu 34 3.6 Xác định khối lượng phân tử enzyme laccase 35 3.7 Thăm dò ứng dụng enzyme laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân chi bảo quản đậu khuôn 36 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 4.1 Kết luận 39 4.2 Kiến nghị 39 iv DANH MỤC BẢNG Tên bảng Số hiệu bảng Số trang Bảng 2.1 Thành phần môi trường nuôi cấy 19 Bảng 2.2 Tỉ lệ dung dịch bảo quản 24 Bảng 2.3 Tiêu chuẩn cảm quan đậu phụ 25 Bảng 2.4 Bảng mô tả bậc đánh giá - phương pháp đánh giá cảm quan 25 Bảng 3.1 Ảnh hưởng hình thức ni cấy đến hoạt độ enzyme laccase 33 từ canh trường nuôi cấy nấm Vân chi Bảng 3.2 So sánh hiệu kết tủa enzyme laccase tác nhân khác 36 Bảng 3.3 Bảng điểm đánh giá cảm quan thăm dị ứng dụng enzyme laccase bảo quản đậu khn v 37 DANH MỤC HÌNH ẢNH Số hiệu hình Tên hình Số trang Hình 1.1 Cấu trúc chiều laccase từ Melanocarpus albomyces Hình 1.2 Trung tâm hoạt động laccase Hình 1.3 Chu trình phát triển nấm Vân chi 12 Hình 1.4 Hình thái nấm Vân chi Hình 3.1 Ảnh hưởng mơi trường ni cấy đến hoạt độ 27 enzyme laccase Hình 3.2 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lắc đến hoạt độ 29 enzyme laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân chi Hình 3.3 Hình ảnh ni cấy nấm Vân chi môi trường lỏng 29 sau(a) ngày; (b) ngày; (c) 11 ngày Hình 3.4 Ảnh hưởng phương pháp nuôi cấy lắc, tĩnh đến hoạt 30 độ enzyme laccase từ canh trường ni cấy nấm Vân chi Hình 3.5 Hình ảnh ni sục khí sau a) ngày; b) ngày; c) ngày 31 ni cấy Hình 3.6 Ảnh hưởng phương pháp nuôi cấy tĩnh đến hoạt độ 31 enzyme laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân chi Hình 3.7 Hình ảnh ni cấy tĩnh sau a) ngày, b) 14 ngày, c) 22 32 ngày Hình 3.8 Hiệu suất tủa enzyme laccase nồng độ muối 34 (NH4)2SO4 bão hịa khác Hình 3.9 Hiệu suất tủa enzyme laccase ethanol/acetone 35 nồng độ khác Hình 3.10 Điện di đồ SDS-PAGE 37 Hình 3.11 Các mẫu đậu khn bảo quản nhiệt độ phòng sau 38 24h vi DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CỤM TỪ VIẾT TẮT PSP Polysaccharide peptide PSK Polysaccharide krestin ABTS 2,2'-azino-bis 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid 2,4,5-T 2,4,5-Trichlorophenoxyacetic acid OD Mật độ quang (Optical Density) TN Thí nghiệm MT Mơi trường PDA Potato dextrose agar KLC Khuẩn lạc cầu CT Công thức ĐC Đối chứng vii TÓM TẮT Laccase (EC 1.10.3.2) enzyme oxi hóa khử đa đồng oxy hóa nhiều loại chất bao gồm phenol, keton, phosphat, ascorbat, amin lignin Nghiên cứu tiến hành nhằm xác định yếu tố ảnh hưởng (thành phần môi trường, thời gian phương pháp nuôi cấy) đến khả sinh laccase dịch thể hệ sợi từ nấm Vân Chi đồng thời đánh giá khả ứng dụng enzyme laccase bảo quản thực phẩm Nấm Vân Chi tiến hành nuôi cấy công thức môi trường khác kết cho thấy môi trường tốt CT3 gồm: dịch khoai tây, glucose, KH2PO4, MgSO4, NH4+, Cu2+ ABTS Thời gian nuôi cấy khảo sát tử – 11 ngày cho hoạt độ cao 2,858 U/ml sau ngày nuôi cấy Nghiên cứu tiến hành để so sánh hiệu phương pháp nuôi cấy dịch thể (lắc, sục khí lên men tĩnh) kết thu phương pháp lắc có hiệu cao Thời gian nuôi cấy tĩnh khảo sát từ 14 – 22 ngày, kết cho thấy thời gian nuôi cấy tĩnh thích hợp 18 ngày Ảnh hưởng tác nhân kết tủa đến hiệu tinh enzyme laccase nghiên cứu Tỷ lệ dung dịch enzyme dung môi hữu (ethanol, acetone) thay đổi từ 1:1 đến 1:5 (v/v), tương tự nồng độ amoni sulfate bão hòa dịch enzyme dao động từ 40 đến 80% Khối lượng phân tử enzyme laccase từ nấm Vân Chi khoảng 100 kDa Khả sử dụng enzyme laccase bảo quản đậu khuôn bước đầu đưa tỉ lệ NaCl 0,9%: enzyme thô (ml) 75:25 phù hợp cho việc bảo quản đậu khuôn Bài nghiên cứu bước đầu nêu ý tưởng sử dụng enzyme để bảo quản đậu khuôn nói riêng thực phẩm nói chung viii (a) (b) (c) Hình 3.7 Hình ảnh ni cấy tĩnh sau a) ngày, b) 14 ngày, c) 22 ngày Kết từ hình 3.6 cho thấy thời gian ni cấy tĩnh ảnh hưởng lớn đến hoạt độ enzyme laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân chi Hoạt độ enzyme laccase đạt giá trị cao 2,847 U/ml sau 18 ngày nuôi cấy tiếp đến 2,808 U/ml sau 16 ngày ni cấy Có thể thấy, khoảng 16 – 18 ngày nuôi cấy thu enzyme có hoạt độ cao Nếu tiếp tục nuôi cấy hoạt độ enzyme giảm cho dù sinh khối tiếp tục phát triển Cụ thể sau 22 ngày ni cấy, hoạt độ enzyme giảm cịn 1,851 U/ml So sánh với hoạt độ enzyme thu từ phương pháp ni lắc hoạt độ enzyme sau 18 ngày nuôi tĩnh tương đương với hoạt độ enzyme sau ngày nuôi lắc Điều chứng minh hiệu cao sử dụng nuôi lắc để thu enzyme laccase rút ngắn thời gian ni cấy so với nuôi tĩnh từ 18 ngày nuôi cấy cịn ngày Nhưng đồng thời, kết luận dùng phương pháp lên men tĩnh để thu enzyme nghiên cứu enzyme laccase từ nấm Vân chi thay cho nuôi lắc ni sục khí Ưu điểm phương pháp ni cấy tĩnh ni cấy nhiều mẫu lúc, tiết kiệm chi phí lượng chi phí thiết bị so với phương pháp lắc sục khí Tuy nhiên nhược điểm phương pháp thời gian nuôi cấy kéo dài Ngược lại, phương pháp lên men động tốn chi phí lượng chi phí cho thiết bị thời gian nghiên cứu giảm nửa so với lên men tĩnh 3.4 Kết thu nhận chế phẩm enzyme thô phương pháp kết tủa 3.4.1 Kết hiệu kết tủa (NH4)2SO4 dịch enzyme 32 Mức độ ion hóa yếu tố quan trọng enzyme, ảnh hưởng đến khả huydrat hóa lực với nước làm thay đổi trạng thái enzyme Trong dung mơi yếu tố có khả thay đổi lực ion hóa enzyme, dựa vào khả tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng muối amonium sulfate (NH4)2SO4 để kết tủa enzyme laccase nhằm thu nhận enzyme laccase Thí nghiệm tiến hành theo bước nêu mục 2.3.3 Kết khảo sát nồng độ muối thích hợp để kết tủa enzyme đánh giá hiệu kết tủa thu thập, xử lý tổng hợp hình 3.8 40 36,39 36,5 35 32,53 29,48 Hiệu suất (%) 30 31,18 25,45 25 20 17,01 15 10 0 40% 50% 60% 70% 80% 85% 90% 100% Nồng độ muối (NH4)2SO4 Hình 3.8 Hiệu suất tủa enzyme laccase nồng độ muối (NH4)2SO4 bão hòa khác Từ kết nghiên cứu hình 3.8 cho thấy phân đoạn từ 40% muối (NH4)2SO4 bão hịa trở xuống khơng xuất kết tủa Trong phân đoạn 50 – 100% muối bão hịa có tủa xuất nồng độ 50% (NH4)2SO4, hoạt độ enzyme hiệu suất tủa enzyme laccase thấp, đạt 17,01% Mẫu kết tủa phân đoạn 70– 80% (NH4)2SO4 đạt hiệu suất cao Và hiệu suất đạt cao 36,5% 80% (NH4)2SO4 bão hòa Khi nồng độ (NH4)2SO4 sử dụng nồng độ cao hiệu kết tủa giảm dần Kết nghiên cứu giải thích thêm muối vào dung dịch enzyme laccase thô, phân tử muối phân ly thành ion, ion liên kết với phân tử nước bao quanh protein enzyme làm cho protein enzyme lớp áo nước, liên kết lại với hình thành kết tủa Tuy nhiên, nồng độ muối cao (>80% muối bão hòa), hiệu suất tủa giảm dần việc sử dụng nồng độ muối (NH4)2SO4 cao làm biến tính khơng thuận nghịch protein enzyme 33 Kết tương đối khớp với kết nghiên cứu Zhijie Qin cs (2017) có hiệu suất kết tủa enzyme laccase từ nấm Vân chi kết tủa phân đoạn 40 – 80% muối amonium sulfate bão hòa (w/v) qua đêm đạt 38% So sánh với nghiên cứu Nguyễn Thị Phương Mai cs (2012), hiệu suất kết tủa enzyme laccase từ nấm mốc Aspergillus Niger D15#26 lcc1 1.8B kết tủa phân đoạn 40 – 80% muối amonium sulfate bão hòa (w/v) qua đêm đạt 39% Kết nghiên cứu cho thấy hoạt độ riêng hiệu suất thu hồi không quan hệ tuyến tính với nồng độ muối (NH4)2SO4 sử dụng Nồng độ muối thích hợp để tủa enzyme laccase từ nấm Vân chi phân đoạn 70 – 80% muối amonium sulfate bão hòa 3.4.2 Kết kết tủa enzyme laccase dung môi hữu Phương pháp kết tủa dung mơi hữu tiến hành dựa độ hịa tan protein, phụ thuộc vào tương tác nhóm tích điện phân tử protein với phân tử nước Các dung môi hữu thường dùng ethanol, acetone, ngồi cịn thường sử dụng isopropanol hỗn hợp loại rượu Ethanol, acetone loại dung môi hữu sử dụng nhiều không nghiên cứu kết tủa enzyme phòng thí nghiệm mà cịn sản xuất cơng nghiệp 90 78,12 80 72,69 73,58 Hiệu suất(%) 70 63,79 57,38 60 59,01 50,49 49,78 50 40 37,71 32,81 30 20 10 1:1 1:2 1:3 Ethanol 1:4 1:5 Acetone Hình 3.9 Hiệu suất tủa enzyme laccase ethanol/acetone nồng độ khác Hiệu kết tủa enzyme laccase đạt giá trị cao sử dụng tỷ lệ dịch enzyme thô/ethanol 1:3 với hiệu suất 78,12% Tiếp đến tỷ lệ 1:4 với hiệu suất 72,69% Ngược lại kết tủa enzyme với tỷ lệ dịch enzyme thơ/ethanol 1:5, hiệu suất tủa enzyme giảm cịn 63,79% Kết thí nghiệm giải thích thêm ethanol vào dung 34 dịch làm giảm số điện mơi dung dịch chứa enzyme, làm giảm lực đẩy tĩnh điện protein mang điện tích dấu nên chúng có khả dính kết lại với Khi tăng tỷ lệ dung dịch enzyme thơ/ethanol lên số điện mơi dung dịch thay đổi nhiều, phân tử dung môi loại lớp phân tử nước bao lấy xung quanh phân tử protein, làm kết tủa nhanh protein Vậy lượng dung mơi ethanol thích hợp để tủa enzyme laccase tỷ lệ dung dịch enzyme thô/ethanol 1:3 (v/v) Acetone tương tự ethanol, tỷ lệ dịch enzyme thơ/acetone tăng hiệu suất kết tủa enzyme tăng đạt giá trị cao 73,58% tỷ lệ dịch enzyme thô/acetone 1:4 Nguyên nhân số phân tử dung môi hỗn hợp tăng, chúng tách triệt để lớp phân tử nước bao lấy xung quanh phân tử protein, làm giảm tính tan protein, tăng khả kết tủa chúng Ở tỷ lệ dung dịch enzyme thô/acetone cao hơn, hiệu suất kết tủa enzyme laccase giảm 59,01% Cũng giống với dung mơi ethanol, điều giải thích enzyme laccase thơ thu bền vững, đồng thời chất enzyme protein nên gặp dung mơi hữu có tính phân cực mạnh acetone, enzyme dễ dàng bị phá hủy bổ sung lượng aceton nhiều vào để kết tủa Vậy lượng dung mơi acetone thích hợp để tủa enzyme laccase tỷ lệ dung dịch enzyme thô/acetone 1:4 (v/v) Bên cạnh việc tìm tỷ lệ sử dụng thích hợp loại dung mơi q trình kết tủa enzyme laccase, hiệu sử dụng loại dung môi cần so sánh nhằm kết tủa enzyme laccase với hiệu suất cao nhất, làm gia tăng khả ứng dụng laccase Bảng 3.2 So sánh hiệu kết tủa enzyme laccase tác nhân khác Tác nhân tủa Hiệu suất (%) Muối (NH4)2SO4 (80% bão hòa) 36,50 ± 0,54 Ethanol (1:3 v/v) 78,12 ± 1,24 Acetone (1:4 v/v) 73,58 ± 1,12 Từ bảng 3.2 kết luận tác nhân tủa thích hợp với enzyme laccase từ canh trường ni cấy nấm Vân chi ethanol với tỷ lệ dung dịch enzyme thô/ethanol 1:3 (v/v) 3.5 Xác định khối lượng phân tử enzyme laccase 35 Dịch enzyme thô sau phương pháp kết tủa tiến hành xác định khối lượng phân tử phương pháp điện di khơng biến tính gel Tris –Glycine Kết điện di thể hình 3.11 Hình 3.11 Điện di đồ SDS-PAGE Kết điện di khơng biến tính cho thấy xuất vùng băng protein kích thước khoảng 100 kDa Kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu Knapp J.S cộng ,(2011) báo cáo khối lượng nấm Vân chi dao động từ khoảng 60-100kDa 3.6 Thăm dò ứng dụng enzyme laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân chi bảo quản đậu khuôn Đậu thành phẩm bày bán cửa hàng dễ bị oxi hóa chất có đậu đặc biệt hợp chất polyphenol dễ bị oxy hóa làm biến màu sản phẩm, chất lượng sản phẩm, đậu dễ bị chua để 12 sau chế biến Các hóa chất bổ sung vào đậu khn nhiều gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người tiêu dùng, nhiều hệ lụy không mong muốn Việc bổ sung dịch enzyme ngoại bào có khả loại bỏ hợp chất polyphenol giúp hạn chế trình biến đổi chất làm thay đổi màu sắc sản phẩm, giữ cho sản phẩm có màu sắc đẹp mắt Thí nghiệm tiến hành theo bước nêu mục 2.3.8 Kết khảo sát Khả ứng dụng enzyme laccase bảo quản đậu khuôn tổng hợp bảng 3.3 36 Bảng 3.3 Ảnh hưởng chế độ bảo quản đến điểm chất lượng cảm quan đậu khuôn Mẫu M1 M2 M3 M4 Điều kiện bq Đối chứng Nhiệt độ phòng (sau 24h) 13,12±0,8d 16,49±0,5a 14,03±0,7b 12,33±0,5e 13,42±0,6c Ngăn mát tủ lạnh (sau 72h) 13,61±0,4e 17,6±0,4a 14,35±0,7d 14,34±0,4c 15,43±0,5b Ghi chú: Những số hàng có chữ theo sau khác có khác biệt với mặt thống kê với độ tin cậy α = 0,05 Dựa vào kết bảng 3.3 TCVN3215-79 ta kết luận M2 (sau 24h), M2, M3( sau 72h) đạt loại tiêu cảm quan Các mẫu cịn lại đạt loại trung bình tiêu cảm quan Qua bảng 3.3 cho thấy M2 bảo quản điều kiện cho hiệu bảo quản cao Nhờ đặc tính chống oxy hóa laccase góp phần giữ cho màu sắc đậu khuôn không bị vàng hợp chất polyphenol, giữ hình thái mùi vị cho sản phẩm Điều phù hợp với nghiên cứu G.K.Guerberoff C.C.Camusso, 2019 enzyme laccase có khả làm suy yếu tính ổn định oxy hóa dầu thực vật Tuy nhiên ta bổ sung nhiều lượng enzyme laccase thô vào dung dịch bảo quản khiến cho sản phẩm nhanh hỏng M3 M4 Điều giải thích dịch enzyme laccase thô thu từ canh trường nuôi cấy hệ sợi nấm Vân chi dinh dưỡng hệ sợi chưa sử dụng hết, môi trường thuận lợi cho phát triển vi sinh vật, khiến sản phẩm nhanh bị hỏng Khi sử dụng tỉ lệ NaCl 0,9%: enzyme thô (ml) mức 75:25 (M2) phần nhờ tính sát khuẩn NaCl 0,9% tiêu diệt số loại vi khuẩn có hại khả oxy hóa vốn có laccase giúp kéo dài thời gian chất lượng sản phẩm Do đặc điểm trội oxy hóa chất kèm theo khử oxy thành nước enzyme laccase, giới có nhiều ứng dụng nhiều lĩnh vực hướng tới việc sử dụng enzyme bảo quản thực phẩm tính oxi hóa chúng Trên sở đặc tính enzyme biến đổi chất lượng thành phẩm bước đầu đưa tỉ lệ bổ sung enzyme phù hợp cho việc bảo quản đậu khuôn 37 Kết nghiên cứu bước đầu nêu ý tưởng sử dụng enzyme để bảo quản đậu khn nói riêng thực phẩm nói chung (M4) (M3) (M2) (M1) (ĐC) Hình 3.10 Các mẫu đậu khn bảo quản nhiệt độ phòng sau 24h 38 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu, rút kết luận sau: - Các môi trường khảo sát có khả sinh tổng hợp laccase mơi trường thích hợp để thu enzyme laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân chi môi trường CT3: 200g khoai tây + 20g glucose + 1g MgSO4.7H2O + 1g KH2PO4 + 0,02g CuSO4 + 0,27g NH4Cl + 0,5ml ABTS 0,01% Sau ngày nuôi cấy môi trường này, hoạt độ enzyme đạt cao 2,803 U/ml - Thời gian thích hợp để ni trồng nấm Vân chi sinh enzyme laccase với công thức môi trường CT3 ngày với hoạt độ đạt 2,858 U/ml - Hiệu sinh enzyme laccase phương pháp nuôi lắc cao phương pháp ni sục khí ni tĩnh - Kết tủa enzyme laccase dung môi ethanol đạt hiệu suất tủa cao (78,12%) sử dụng tỷ lệ dịch enzyme laccase thô/ethanol 1:3 - Khối lượng phân tử enzyme laccase từ nấm Vân Chi khoảng 100 kDa - Bước đầu đưa tỉ lệ NaCl 0,9%: enzyme thô (ml) 75:25 phù hợp cho việc bảo quản đậu khn 4.2 Kiến nghị Vì thời gian điều kiện nghiên cứu, trang thiết bị hạn chế, đề tài cần nghiên cứu sâu thêm với kiến nghị sau: - Nghiên cứu kết hợp enzyme laccase chitosan ứng dụng bảo quản loại thực phẩm giàu polyphenol bòn bon, táo - Nghiên cứu song song thu enzyme laccase sinh khối sợi nấm, hướng tới sản xuất prebiotic từ PSK PSP sợi nấm Vân chi 39 Tài liệu tham khảo Tài liệu tiếng Việt Bùi Thị Kim Tuyền (2010), “Nghiên cứu so sánh phát triển sinh khối hàm lượng β-glucan số chủng nấm hương nuôi cấy môi trường lỏng”, Đại học Nông nghiệp Hà Nội Cổ Đức Trọng (2002) ;Nấm vân chi vị thuốc quý cần ý, Tạp chí thuốc Sức khoẻ, Nhà xuất Khoa học TP Hồ Chí Minh 214, tr 14-15 Dương Minh Lam Trương Thị Chiên, 2013, “Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng nấm Đảm Trametes maxima CPB30 sinh laccase ứng dụng xử lý màu nước ô nhiễm thuốc nhuộm”, Tạp chí sinh học, 35(4), trang 477 - 483 Hà Thị Thụy Vy, Trần Thanh Trúc Nguyễn Văn Mười, 2016 Ảnh hưởng dung môi thờigian kết tủa đến hiệu tinh sơ enzyme protease trích ly từ thịt đầu tơm Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Số chuyên đề: Nông nghiệp (Tập 1): 917 http://namvanchi.com/cac-nghien-cuu-ve-cong-dung-cua-nam-van chi.html Lành Thị Ngọc1, Phạm Thị Ngọc Mai , Nguyễn Quang Tùng , Đào Thị Kim Dung, Đỗ Thị Thanh Trung, Trần Quốc Toàn, 2018 “Nghiên cứu khả thủy phân chè xanh enzyme ứng dụng để chiết tách polyphenol” Lâm Thụ Tiền (2001), “ Trung Quốc dược dụng khuẩn sinh sản dự sản phẩm khai phát, Trung Quốc Nông nghiệp xuất xã Lê Xuân Thám, Trần Hữu Độ Tamikazu Kume (1999), "Bổ sung vào nhóm nấm chống ung thư Việt Nam: Nấm vân chi Trametes versicolor (L.:Fr) Pilát, Tạp chí dược học 2, tr 13-15 Lê Xuân Thám, Nguyễn Giang Nguyễn Thị Diệu Hạnh (2009), "Nghiên cứu tích tụ Selenium nấm vân chi Trametes versicolor phân tích kích hoạ neutron, Tạp chí khoa học cơng nghệ 1(47), tr 73 – 79 Lê Xuân Thám, Nguyễn Giang, Nguyễn Thị Diệu Hạnh, 2009, “Nghiên cứu tích tụ Selenium nấm Vân Chi Trametes versicolor phân tích kích hoạt neutron”, Tạp chí khoa học cơng nghệ, tập 47, số 1, trang 73 - 79 Ngụy Thị Mai Thảo, Trần Văn Khuê Lương Bảo Uyên, 2014, “Ảnh hưởng số ion kim loại lên khả sinh tổng hợp laccase nấm Pleurotus sp.”, Tạp chí sinh học, 36(1se), trang 107 - 111 Nguyễn Thị Chính (2011), "Hồn thiện cơng nghệ sản xuất nấm dược liệu theo hướng công nghiệp để tạo thực phẩm chức hỗ trợ điều trị bệnh viêm gan, tiểu đường, khối u ung thư, nâng cao sức khỏ, Báo cáo tổng kết dự án khoa học công nghệ, quỹ phát triển khoa học cơng nghệ Nguyễn Thị Bích Thùy (2014), "Nghiên cứu đặc điểm sinh học công nghệ nhân giống, ni trồng nấm sị vua (Pleurotus eryngii) nấm vân chi (Trametes versicolor) Việt Nam", Luận án tiến sĩ nông nghiệp, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Nguyễn Thị Phương Mai, Lê Quang Hịa, and Tơ Kim Anh, 2012, “Tinh xác định đặc tính laccase tái tổ hợp từ Aspergillus Niger D15#26 lcc1 1.8B”, Tạp chí khoa học cơng nghệ, 50(3), trang 297 - 304 Nguyễn Thị Phương Mai, Lê Quang Hịa, Tơ Kim Anh, (2010) Phân lập Phomopsis sp N72 sinh tổng hợp laccase Tạp Chí Khoa Học Và Cơng Nghệ Tập 48, số 3, Tr 51-58 Nguyễn Hữu Đống, Đinh Xuân Linh, Nguyễn Thị Sơn, Zan Fderico, Nấm ăn – sở khoa học công nghệ nuôi trồng, Nhà xuất Nông nghiệp, 2002 Nguyễn Khởi Nghĩa (2017) Phân lập tuyển chọn số dịng nấm từ gỗ mục có khả loại màu thuốc nhuộm Đồng sông Cửu Long Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 53b: 79-87 Nguyễn Thị Phương Mai, Lê Quang Hòa, and Tô Kim Anh, 2012, “Tinh xác định đặc tính laccase tái tổ hợp từ Aspergillus Niger D15#26 lcc11.8B”, Tạp chí khoa học cơng nghệ, 50(3), trang 297 - 304 TCVN 3215-79 sản phẩm thực phẩm phân tích cảm quan phương pháp cho điểm Trần Thị Thu Hiền, Lê Thị Hiền, Nguyễn Văn Huynh, Đinh Thị Thu Hằng, Đặng Thị Cẩm Hà (2016) Phân lập, nghiên cứu mơi trường thích hợp sinh tổng hợp laccase chủng nấm đảm thu thập từ vườn Quốc gia Bidoup- núi Bà khả loại màu thuốc nhuộm chủng Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 14(2): 313-325 Trịnh Tam Kiệt, Nguyễn Thị Bích Thùy, 2010,“Nghiên cứu đặc điểm sinh học kỹ thuật trồng nấm Vân Chi”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp trang 77-85 Trịnh Tam Kiệt cs (1982), Thực tập phân loại học thực vật – thực vật bậc thấp, NXB Đại học Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội Trịnh Thu Thủy, Nguyễn Văn Giang, Nguyễn Ngọc Bằng, Phạm Thu Trang (2015) Phân lập tuyển chọn chủng nấm mốc sinh tổng hợp enzyme laccase từ gỗ mục Tạp chí Khoa học Phát triển, tập 13, số 7: 1173-1178 Tài liệu tiếng Anh Adinarayana Kunamneni, Antonio Ballesteros, Francisco J Plou and Miguel Alcalde, 2007, “Fungal laccase - a versatile enzyme for biotechnological applications”, Communicating current research and educational topics and trends in applied microbiology, 1, 233-245 Kunamneni, A., Ballesteros, A., Plou, F J., & Alcalde, M (2007) Fungal laccase— a versatile enzyme for biotechnological applications Alcalde, 2008, Recent Patents on Biotechnology, “Laccase and their applications”, 2(1), pp 10 – 24 Bao Zhen Feng; Peiqian Li (2014) Cloning, characterization and expression of a novel laccase gene Pclac2 from Phytophthora capsici Braz J Microbiol; 45(1): 351–357 Baldrian P (2006), “Fungal laccases – occurrence and prooperties”, FEMS Microbiology reviews, 30(2), pp 215-242 Bourbonnais R, Paice MG, Freiermuth B, Bodie E, Borneman S Reactivities of various mediators and laccases with kraft pulp and lignin model compounds Appl Environ Microbiol 1997;63:4627–4632 Christopher F Thurston, 1994, “The structure and function of fungal laccases”, Microbiology, 140, pp 19 - 26 Couto S.R and Toca Herrera J.L (2006),“Industrial and biotechnological applications of laccases: a review” Biotechnology Advances, vol 24, no 5, pp 500–513 Couto S.R and Toca Herrera J.L (2006), “Industrial and biotechnological applications of laccases: a review” Biotechnology Advances, vol 24, no 5, pp 500–513 Daniela Chmelova and Miroslav Ondrejovic, 2015, “Effect of metal ions on triphenylmethane dye decolorization by laccase from Trametes Versicolor”, Nova Biotechnological et Chimica, 14(2), pp 191 - 199 D M Soden, J O’Callaghan and A D W Dobson (2002) “Molecular cloning of a laccase isozyme gene from Pleurotus sajor-caju and expression in the heterologous Pichia pastoris host” Microbyology, 148, 4003- 4014 Forootanfar H, Faramarzi M.A (2015), “Insights into laccase producing organism, fermentation states, purification strategies, and biotechnological Applications”, Biotechnology Progress, 31(6), pp 1443-1463 Jie Yang, Wenjuan Li, Tzi Bun Ng, Xiangzhen Deng, Juan Lin and Xiuyun Ye (2017), “Laccases: Production, Expression Regulation, and Applications in Pharmaceutical Biodegradation”, frontiers in Microbiology, 1, pp 1-24 Litwińska, K., Bischoff, F., Matthes, F., Bode, R., Rutten, T., & Kunze, G (2019) Characterization of recombinant laccase from Trametes versicolor synthesized by Arxula adeninivorans and its application in the degradation of pharmaceuticals AMB Express, 9(1), 102 Kiiskinen L.L (2005), “Characteration and heterologuos production of novel laccase from Melanocarpus albomyces” 2005, VTT Publications 556 Kidd P.M, 2000, “The Use of Mushroom Glucans and Proteoglycans in Cancer Treatment”, Alternative Medicine Review, 5(1), pp - 27 Kunamneni A, Ballesteros A, F Plou F.J, Alcalde M (2007), “Fungal laccase-a versatile enzyme for biotechnological applications,” Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology, A Mendez-Vilas, Ed., vol 1, pp 233–245 Kurniawati S and Nicell JA, 2008, “Characterization of Trametes versicolor laccase for the transformation of aqueous phenol”, Bioresources Technology, 99(16), pp 7825 – 7834 Liu P., Li G Wen S (2010), "Study for the liquid culture conditions of laccase production in Flammulina velutipes LP03", Food Science, tr 31-36 More, S S., Renuka, P S., Pruthvi, K., Swetha, M., Malini, S., & Veena, S M (2011) Isolation, Purification, and Characterization of Fungal Laccase from Pleurotus sp Enzyme Research, 2011 Muhammad Asgher, Sadia Noreen and Muhammad Bilal, 2017, “Enhancing catalytic functionality of Trametes versicolor IBL-04 laccase by immobilization on chitosan microspheres”, Chenical Engineering Research and design, 119, pp – 11 Myleidi Vera, Gibson S.Nyanhongo, Georg M.Guebitz and Bernabe L Rivas, 2019, “Polymeric microspheres as support to co-immobilized Agaricus bisporus and Trametes versicolor laccases and their application in diazinon degradation”, Arabian Journal of Chemistry 13.2 (2020): 4218-4227 Neha Garg, Nora Bieler, Tenzin Kenzom, Meenu Chhabra, Marion AnsorgeSchumacher, and Saroj Mishra (2012) Cloning, sequence analysis, expression of Cyathus bulleri laccase in Pichia pastoris and characterization of recombinant laccase BMC Biotechnology 12(1):75 Orkun Pinar, Candan Tamerler, Ayten Yazgan Karataş (2017) Heterologous expression and characterization of a high redox potential laccase from Coriolopsis polyzona MUCL 38443 Turkish Journal of Biology, Vol 41 Issue 2, p278-291 18p Ruggaber T.P, Talley J.M (2006), “Enhancing Bioremediation with enzymatic Processes”, American Society of Civil Engeneers, 2(73), pp.10 Santhanam N, Vivanco J.M, Decker SR (2011), “Expression of industrially relevant laccases: prokaryotic style”, Trends in Biotechnology, pp 480-489 Shraddha, Shekher R, Sehgal S, Kamthania M, Kumar A (2011), “Laccase: Microbial sources, production, purification, and potential biotechnological applications”, Enzyme Research, 217861, pp 11 Sivakumar R., Rajendran R., Balakumar C., Tamilvendan M., 2010 Isolation, screening and optimization of production medium for thermostable laccase production from Ganoderma sp” Inter J Engin Sci Tech., 2: 7133-7141 Soonja Kim, Youngeun Leem, Kyunghoon Kim, Hyoung T Choi (2001) “Cloning of an acidic laccase gene (clac2) from Coprinus congregatus and its expression by external pH.” FEMS Microbiology Letters, Volume 195, Issue 2, Pages 151–156 Susana Rodríguez Couto and José Luis Toca Herrera, 2006, “Industrial and biotechnological applications of laccase: A review”, Biotechnology advances, 24(5), pp 500 - 513 Thurston C.F (1994), “The structure and function of fungal laccases”, Microbiology, 140, pp 19-26 Tugba Aydınoglu and Sayıt Sarg, 2013, “Production of laccase from Trametes versicolor by solid-state fermentation using olive leaves as a phenolic substrate”, Bioprocess and biosystems Engineering, 36(2), pp 215 – 223 Tussell R T., Brito1 D P.,, Herrera R R., Velazquez A C., Muñoz G R., Pereira S S., 2011 “New laccase-producing fungi isolates with biotechnological potentialin dyedecolorization” African J Biotech., 10: 10134-10142 Xie, Huifang, Qi Li, Minmin Wang and Linguo Zhao, 2013, “Production of a Recombinant Laccase from Pichia pastoris and Biodegradation of Chlorpyrifos in a Laccase/Vanillin System”, J Microbiol Biotechnol, 23(6), pp 864 – 871 Ugwu E.E Adebayo-Tayo B.C (2011),“Influence of Different Nutrient Sources on Exopolysaccharide Production and Biomass Yield by Submerged Culture of Trametes versicolor and Coprinuss”;, Australian Journal of Biotechnology 15(2), tr 63-69 Yagüe S, Terrón M.C, González T (2000), “Biotreatment of tannin-rich beer-factory wastewater with white-rot basidiomycete Coriolopsis gallica monitored by 39 pyrolysis/gas chromatography/mass spectrometry,” Rapid Communications in Mass Spectrometry, vol 14, no 10, pp 905–910 Yaver DS, Xu F, Golightly EJ, Brown KM, Brown SH, Rey MW, Schneider P, Halkier T, Mondorf K, Dalboge H “Purification, characterization, molecular cloning, and expression of two laccase genes from the white rot basidiomycete Trametes villosa” Appl Environ Microbiol 1996 Mar;62(3):834-41 Zhongyang Ding*, Lin Peng, Youzhi Chen, Liang Zhang, ZhenghuaGu, Guiyang Shi and Kechang Zhang, 2011“Production and characterization of thermostable laccase from the mushroom, Ganoderma lucidum, using submerged fermentation” Annals of microbiology 64.1 (2014): 121-129 ... TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MƠI TRƯỜNG  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH VÀ HIỆU SUẤT THU HỒI ENZYME LACCASE TỪ CANH TRƯỜNG NUÔI CẤY SỢI NẤM VÂN... 3.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến hoạt độ enzyme laccase từ môi trường nuôi cấy nấm Vân chi 27 3.2 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt độ enzyme laccase từ canh trường nuôi cấy. .. QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến hoạt độ enzyme laccase từ môi trường nuôi cấy nấm Vân chi Dinh dưỡng yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến trình sinh trưởng phát triển nấm Vân chi,