Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập từ nước thải nhà máy giấy​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ NƯỚC THẢI NHÀ MÁY GIẤY Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : CN Nguyễn Hoàng Mỹ Sinh viên thực : Bùi Thị Trang MSSV: 107111189 : Lớp: 07DSH4 TP Hồ Chí Minh, 2011 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC Nội dung Trang Mục lục i Danh mục chữ viết tắt .iii Danh mục bảng iv Danh mục hình ảnh v LỜI MỞ ĐẦU vi Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan công nghiệp sản xuất giấy 1.1.1 Giới thiệu 1.1.2 Công nghệ sản xuất bột giấy .4 1.1.3 Công nghệ sản xuất giấy 1.2 Tổng quan nước thải nhà máy giấy .7 1.2.1 Giới thiệu nước thải nhà máy giấy .7 1.2.2 Thành phần tính chất 1.2.3 Ảnh hưởng nước thải nhà máy giấy 10 1.2.4 Phương pháp xử lý nước thải 11 1.3 Tổng quan cellulose 13 1.3.1 Thành phần cấu tạo 13 1.3.2 Tính chất 15 1.3.3 Enzyme cellulase 16 1.3.4 Cơ chế phân hủy 18 1.4 Tổng quan vi sinh vật phân hủy cellulose 21 1.4.1 Giới thiệu chung 21 1.4.2 Vi khuẩn 22 1.4.3 Xạ khuẩn 22 i SVTH: BÙI THỊ TRANG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.4.4Nấm mốc 1.5 Ảnh hưởng điều kiện môi trường đến khả sin cellulase vi khuẩn 1.6 Các nghiên cứu liên quan Việt Nam giới 1.6.1Trên giới 1.6.2Ở Việt Nam Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Thời gian địa điểm 2.2 Vật liệu 2.2.1Đối tượng 2.2.2Cơ chất 2.3 Thiết bị hóa chất 2.3.1Thiết bị 2.3.2Hóa chất 2.4 Các phương pháp nghiên cứu 2.4.1Phương pháp tuyển chọn ch 2.4.2Phương pháp xác định h (CMCase) 2.4.1Khảo sát yếu tố ảnh hư cellulase chủng vi khuẩn Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết tuyển chọn chủng vi khuẩn 3.1.1Kết tuyển chọn mơ 3.1.2Kết xác định hình thái 3.2 Kết khảo sát theo thời gian 3.2.1Kết hoạt tính cellulase 3.2.2Kết xác định mật độ tế 3.3 Khả sinh tổng hợp enzyme cellulase theo pH ii SVTH: BÙI THỊ TRANG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.4 Khả sinh tổng hợp enzyme cellulase theo nồng độ CMC .56 3.4.1 Xác định hoạt tính theo nồng độ CMC 56 3.4.2 Xác định đường kính vịng phân giải theo nồng độ CMC .59 iii SVTH: BÙI THỊ TRANG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BOD : Biochemical oxygen Demand COD : Chemical Oxygen Demand CMCase : Carboxymethyl cellulase CMC : Carboxymethyl cellulose CBH hay C1 : Cellobiohydrolase hay Exoglucanase DNS : Acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic Dal : Dalton ĐC : Đối chứng EG hay Cx : Endoglucanase IU : International Unit, đơn vị quốc tế OD : Optical Density TN : Thí nghiệm UV : Ultraviolet iv SVTH: BÙI THỊ TRANG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các thông số nguồn nước thải nhà máy giấy 10 Bảng 1.2 Thành phần số lượng vi sinh vật số loại đất 25 Bảng 2.1 Thành phần mơi trường ni cấy vi khuẩn 35 Bảng 2.2 Dựng đường chuẩn gluose 40 Bảng 2.3 Xác định hoạt tính enzyme Carboxymethyl cellulase 41 Bảng 3.1 Hình thái đại thể hình thái vi thể 10 chủng vi khuẩn 45 Bảng 3.2 Hoạt tính cellulase 10 chủng theo thời gian 48 Bảng 3.3 Hoạt tính mật độ tế bào chủng vi khuẩn 51 Bảng 3.4 Hoạt tính enzyme cellulase theo pH khác 53 Bảng 3.5 Hoạt tính enzyme cellulase theo nồng độ CMC 56 Bảng 3.6 Đường kính vịng phân hủy cellulose theo nồng độ CMC .59 v SVTH: BÙI THỊ TRANG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cơng nghệ sản xuất bột giấy Hình 1.2 Cơng nghệ sản xuất giấy Hình 1.3 Cơng nghệ xử lý nước thải nhà máy giấy 12 Hình 1.4 Cơng thức hóa học cellulose 14 Hình 1.5 Endoglucanase 16 Hình 1.6 Exoglucanase 17 Hình 1.7 β-glucosidase 17 Hình 1.8 Cơ chế thủy phân cellulose 19 Hình 1.9.Sơ đồ cấu trúc cellulose vi trí cắt enzyme exoglucanase, endoglucanase β-glucosidase 20 Hình 1.10 Cơ chế thủy phân phân tử cellulose phức hệ cellulose enzyme thuộc phức hệ cellulase 21 Hình 1.11 Vi khuẩn Bacillus subtilis 22 Hình 1.12 Xạ khuẩn Streptomyces 23 Hình 1.13 Nấm Trichoderma 26 Hình 2.1 Cơng thức cấu tạo CMC 34 Hình 2.2 Quy trình tuyển chọn chủng vi khuẩn 36 Hình 2.3 Quy trình khảo sát yếu tố mơi trường lên hoạt tính enzyme chủng vi khuẩn 42 Hình 3.1 Hình ảnh vi thể 10 chủng vi khuẩn sau nhuộm Gram 46 Hình 3.2 Xác định hoạt tính enzyme cellulase theo Miller 47 Hình 3.3 Khả sinh tổng hợp enzyme cellulase theo thời gian 49 Hình 3.4 Mật độ tế bào chủng vi khuẩn 52 Hình 3.5 Khả sinh tổng hợp enzyme cellulase theo pH 54 Hình 3.6 Khả sinh tổng hợp enzyme cellulase chất 57 vi SVTH: BÙI THỊ TRANG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.7 Một số hình ảnh đường kính vịng phân hủy chủng vi khuẩn 60 vii SVTH: BÙI THỊ TRANG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI MỞ ĐẦU Cellulose thành phần quan trọng cấu tạo nên lớp thành tế bào thực vật Đó loại polysaccharide có cấu trúc phức tạp Việc phân hủy cellulose tác nhân lý hóa gặp nhiều khó khăn, làm ảnh hưởng đến tốc độ nhiều trình sản xuất công nghiệp Cellulase enzyme đa cấu tử gồm: exoglucanase hay C1, endoglucanase hay Cx β-glucosidase, có khả hoạt động phối hợp để thủy phân cellulose thành glucose Cellulase ứng dụng nông nghiệp để chế biến thức ăn chăn nuôi; công nghiệp thực phẩm để chế biến thực phẩm, q trình trích ly chất từ thực vật, ngày người ta cịn ứng dụng cellulase vào xử lý mơi trường Vấn đề môi sinh ngày trở nên trầm trọng phạm vi toàn cầu Ở Việt Nam, lượng chất thải nhà máy thải ngồi mơi trường ngày lớn, nguy ô nhiễm môi trường nhiều nơi cao Việc sử dụng biện pháp sinh học xử lý nước thải mang lại nhiều giá trị to lớn Tuy nhiên, việc sử dụng vi sinh vật có sẵn tự nhiên để xử lý nước thải, thời gian thường kéo dài gây nên tình trạng nhiễm mơi trường, tốn nhiều diện tích cơng sức Để xử lý triệt để hơn, giảm giá thành thời gian xử lý, việc tạo điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển tốt việc tuyển chọn vi sinh vật có khả sinh trưởng nhanh, hoạt tính phân giải mạnh, chịu nhiệt độ cao để bổ sung vào nước thải hướng nghiên cứu nhiều nhà khoa học quan tâm Công nghiệp sản xuất giấy ngành công nghiệp chiếm vị trí quan trọng xã hội Giấy đáp ứng nhu cầu thiết yếu sống người Tuy nhiên, năm nguồn nước thải ngành công nghiệp thải không qua xử lý ảnh hưởng trực tiếp đến môi trường Trong nguồn nước thải có diện lignin, cellulose… chất hữu khó phân hủy SVTH: BÙI THỊ TRANG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đối với nước thải nhà máy giấy, người ta áp dụng nhiều phương pháp xử lý vật lý, hóa học chưa phân hủy hoàn toàn lượng cellulose diện nguồn nước thải Vì vậy, biện pháp sinh học với việc ứng dụng enzyme cellulase vi khuẩn sinh tổng hợp để xử lý nguồn nước thải vấn đề cấp thiết Xuất phát từ lý tình hình nghiên cứu Việt Nam, tiến hành thực đề tài: “Khảo sát số yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính cellulase chủng vi khuẩn phân lập từ nƣớc thải nhà máy giấy” với mục tiêu: Tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh tổng hợp hoạt tính enzyme celullase cao Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính cellulase chủng vi khuẩn tuyển chọn SVTH: BÙI THỊ TRANG 53 SVTH: BÙI THỊ TRANG U/g U/g U/g Hình 3.5 Khả sinh tổng hợp enzyme cellulase theo pH 54 SVTH: BÙI THỊ TRANG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Từ đồ thị trên, cho thấy 10 chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp enzyme cellulase khoảng pH Tuy nhiên hoạt tính thay đổi khác Hầu hết chủng có hoạt tính trung bình giảm từ 0,0741 (U/g) pH3 giảm xuống 0,0239 (U/g) pH5, sau tăng lên 0,1272 (U/g) pH7 giảm xuống 0,0213 (U/g) pH9 Trong đó, chủng vi khuẩn T2, T3, T4, T7, T8, T9 có hoạt tính cao pH7 chủng vi khuẩn T1, T5, T10 có hoạt tính cao pH3 Riêng chủng T10 hoạt tính thấp pH7 Các chủng vi khuẩn phân lập trực tiếp từ nước thải nhà máy giấy, pH đầu vào nước thải phân lập 6,3 - 7,2 Nghiên cứu Trần Thị Ánh Tuyết, Trương Quốc Huy(2010) với đề tài khảo sát điều kiện nuôi cấy phương pháp tách chiết enzyme cellulase từ vi khuẩn Bacillus Subtilis cho thấy, pH7 chủng vi khuẩn cho hoạt tính enzyme tối ưu Mặt khác, cơng trình xử lý nước thải phương pháp sinh học chế phẩm vi sinh sử dụng cho xử lý nước thải đưa pH trung tính 6,5 – 7,5 trước bổ sung chủng vi sinh vật Do đó, chủng tuyển chọn chúng tơi có hoạt tính cao pH phù hợp ứng dụng xử lý thực tế 55 SVTH: BÙI THỊ TRANG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.4 Khả sinh tổng hợp enzyme cellulase theo nồng độ CMC 3.4.1 Xác định hoạt tính theo nồng độ CMC Các chủng vi khuẩn nuôi cấy môi trường chứa CMC nồng độ khác nhau, pH 7, nhiệt độ 37 C Sau thời gian 24h xác định hoạt tính CMCase: Bảng 3.5 Hoạt tính enzyme cellulase theo nồng độ CMC Chủng T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 56 SVTH: BÙI THỊ TRANG Đ U/g U/g U/g U/g Hình 3.6 Khả sinh tổng hợp enzyme cellulase chất 57 SVTH: BÙI THỊ TRANG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Dựa vào biểu đồ, nhận thấy 10 chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp enzyme cellulase nồng độ CMC khác Ở nồng độ CMC 1% vi khuẩn cho hoạt tính enzyme tối ưu Ở nồng độ CMC 1.5% 2% hầu hết chủng có hoạt tính thấp Trong đó, chủng T10 cho hoạt tính thấp Riêng T5, T1, T10 có hoạt tính cao CMC 0,5%, thấp chủng lại Theo kết khảo sát ảnh hưởng pH, chủng tối ưu pH7 Do đó, thí nghiệm bố trí pH7 nên khơng phải khoảng pH tối ưu cho hoạt động enzyme chủng Vì có khả phát triển nồng độ chất thấp 0,5% Các nghiên cứu Võ Hoài Bắc, Lê Hương Thuỷ, Lê Thị Lan Oanh (Viện Nghiên cứu Hải sản) với mục đích phân lập chủng vi khuẩn từ nước thải nhà máy sản xuất agar; Nghiên cứu Tăng Thị Chính (1999) với mục đích khảo sát điều kiện tối ưu VK phân giải cellulose từ bể ủ rác nghiên cứu Trần Thị Ánh Tuyết, Trương Quốc Huy(2010) với mục đích khảo sát điều kiện nuôi cấy từ chủng vi khuẩn Bacillus Subtilis sử dụng môi trường CMC 1% cho kết hoạt tính cao Do đó, chúng tơi kết luận với nồng độ chất CMC 1% chủng VK sinh enzyme phù hợp 58 SVTH: BÙI THỊ TRANG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.4.2 Xác định đƣờng kính vịng phân giải theo nồng độ CMC Để khẳng định lập luận trên, tiếp tục tiến hành thí nghiệm nồng độ chất để xác định vòng phân giải chủng VK tuyển chọn Kết trình bày bảng 3.6 Bảng 3.6 Đường kính vịng phân hủy cellulose theo nồng độ CMC Chủng T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 59 SVTH: BÙI THỊ TRANG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nồng độ 0,5%CMC Nồng độ 1%CMC Nồng độ 1,5%CMC Nồng độ 2%CMC Hình 3.7 Một số hình ảnh đường kính vịng phân hủy chủng vi khuẩn 60 SVTH: BÙI THỊ TRANG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Dựa kết hoạt tính vịng phân giải chủng vi khuẩn, nhận thấy chất CMC 1% đường kính vịng phân giải vi khuẩn tạo cao Đường kính vòng phân giải chủng T6 T7 27mm 26mm So với kết hoạt tính, chủng có hoạt tính enzyme cao ( 0,2635 U/g 0,2250 U/g) Chủng T1, T5 T10 có đường kính vịng phân giải cao 0,5%, phù hợp với kết xác định hoạt tính Như vậy, nồng độ CMC, khả phân hủy mơi trường thạch có tương quan với phát triển sinh tổng hợp enzyme môi trường lỏng Vì vậy, chúng tơi kết luận nồng độ chất CMC 1% nồng độ tối ưu để vi khuẩn phát triển 61 SVTH: BÙI THỊ TRANG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Chƣơng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Từ 15 chủng vi khuẩn phân lập từ nguồn nước thải nhà máy giấy tuyển chọn phân lập 10 chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp enzyme cellulase cao - Điều kiện tối ưu để vi khuẩn phát triển sinh tổng hợp enzyme cao môi trường A pH7, nồng độ chất CMC 1% thời gian 24h 4.2 Kiến nghị - Tiến hành thí nghiệm định danh 10 chủng vi khuẩn tuyển chọn - Xác định mật độ tế bào khoảng thời gian tương ứng với hoạt tính enzyme - Khảo sát thêm ảnh hưởng nhiệt độ, nguồn chất khác đến hoạt tính enzyme cellulase - Xác định mơ hình ứng dụng chủng vi khuẩn để xử lý nước thải nhà máy giấy 62 SVTH: BÙI THỊ TRANG ... chọn chủng vi sinh vật Tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính enzyme mạnh từ chủng vi khuẩn phân lập từ Đề tài “Nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn có hoạt tính enzyme cellulase từ nước thải nhà máy. .. từ lý tình hình nghiên cứu Vi? ??t Nam, tiến hành thực đề tài: ? ?Khảo sát số yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính cellulase chủng vi khuẩn phân lập từ nƣớc thải nhà máy giấy” với mục tiêu: Tuyển chọn chủng. .. nguồn nước thải nhà máy giấy T BOD5 CO SS Độ m N-N 3- P-PO4 (Nguồn: Nguyễn Đức Ban, xử lý nước thải nhà máy giấy) 1.2.3 Ảnh hưởng nước thải nhà máy giấy Độc tính dịng nước thải từ nhà máy sản