Bài viết cung cấp dẫn liệu về hình thái, hình thái lƣợng và phân tử của quần thể loài tuyến trùng P. zeae ký sinh trên cây cà rốt ở Đông Anh - Hà Nội, so sánh với một số quần thể P. zeae và các loài gần gũi của giống Pratylenchus ở Việt Nam.
TIỂU BAN KHU HỆ ĐỘNG VẬT - THỰC VẬT ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ LỒI TUYẾN TRÙNG PRATYLENCHUS ZEAE GRAHAM, 1951 KÝ SINH CÂY CÀ RỐT Ở ĐÔNG ANH, HÀ NỘI Nguyễn Thị Duyên1,2, Lê Thị Mai Linh1,2, Nguyễn Hữu Tiền1, Trịnh Quang Pháp1,2 Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Tuyến trùng gây tổn thƣơng rễ thuộc giống Pratylenchus nhóm tuyến trùng đa thực phân bố rộng khắp giới (Castillo & Vovlas, 2007) Trong số đó, lồi Pratylenchus zeae gây hại nghiêm trọng số loại trồng nƣớc nhiệt đới cận nhiệt đới (Castillo & Vovlas, 2007) Ở Việt Nam, P zeae phân bố phổ biển tỉnh miền Bắc, miền Trung Tây Nguyên ký sinh nhiều loại trồng khác nhƣ: dứa, chè, cam, chuối, thuốc lá, hồ tiêu, cà phê, mía, thông, lúa, khoai lang, lạc, hành, tỏi, củ cải, cải bắp, đậu, cà chua, xúp lơ, cà rốt, (N N Châu & N V Thanh, 2000) Một số nghiên cứu hình thái lồi P zeae phân lập Việt Nam đƣợc công bố nhƣng chƣa có liệu phân tử lồi (N N Châu & N V Thanh, 2000) Với số lƣợng lớn loài Pratylenchus phát giới (trên 70 loài), phân loại tuyến trùng thuộc giống Pratylenchus gặp nhiều khó khăn biến đổi số đặc điểm hình thái lồi lồi gần gũi, đặc biệt nhóm lồi có vịng đầu, túi chứa tinh khơng có tinh trùng khơng có đực gặp, gồm có: P zeae, P parazeae, P elamini, P japonicus, P mulchandi, P subranjani Castillo & Vovlas (2007) cung cấp đặc điểm hình thái chi tiết liệu phân tử vùng gen nhân ITS D2D3 mở rộng vùng 28S rDNA để phục vụ phân loại loài gần gũi (Castillo & Vovlas, 2007) Trong nghiên cứu này, chúng tơi cung cấp dẫn liệu hình thái, hình thái lƣợng phân tử quần thể loài tuyến trùng P zeae ký sinh cà rốt Đông Anh - Hà Nội, so sánh với số quần thể P zeae loài gần gũi giống Pratylenchus Việt Nam I PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thu mẫu đất mẫu rễ: Tiến hành thu mẫu đất mẫu rễ có biểu vàng lá, còi cọc phát triển Mẫu đất rễ đƣợc thu độ sâu từ 15-20 cm xung quanh cà rốt Tuyến trùng đƣợc tách lọc từ mẫu đất theo phƣơng pháp Baermann cải tiến rễ theo phƣơng pháp xay nghiền đƣợc mô tả Nguyễn Ngọc Châu (2003) Quần thể tuyến trùng Pratylenchus zeae (P.4854) thu vùng trồng cà rốt (Đông Anh, Hà Nội) đƣợc thực nghiên cứu Xử lý làm tiêu cố định: Tuyến trùng sau tách lọc đƣợc giết nhiệt cố định, bảo quản dung dịch TAF (Nguyễn Ngọc Châu 2003) Sau đó, xử lý làm làm tiêu cố định theo phƣơng pháp Nguyễn Ngọc Châu (2003) Phân loại tuyến trùng: Tuyến trùng đƣợc phân loại dựa tài liệu Nguyễn Ngọc Châu & Nguyễn Vũ Thanh (2000) Castillo & Vovlas (2007) Khuếch đại vùng gen D2D3, ITS-rDNA: DNA tổng số đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp Subbotin et al (2006) khuếch đại vùng gen D2D3 cặp mồi D2A D3B (Subbotin et al 2006); vùng gen ITS cặp mồi VRAIN 2F VRAIN 2R (Vrain et al 1992) Chu 96 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ trình PCR đƣợc thực với bƣớc nhiệt: 95oC phút, 35 chu kỳ 96oC/ 35 giây, 50oC/30 giây, 72oC/45 giây kết thúc 72oC/3 phút Sau phản ứng kết thúc điện di sản phẩm PCR gel agarose 1% để kiểm tra, phần lại bảo quản -20oC Các sản phẩm PCR đƣợc tinh QIA quick Gel Extraction Kit (GmbH Qiagen, Hilden, Germay) gửi đọc trình tự cơng ty Macrogen- Hàn Quốc Phân tích số liệu: Sử dụng chƣơng trình BLAST để tìm kiếm trình tự tƣơng đồng đƣợc cơng bố ngân hàng DNA (Genbank) So sánh khác vị trí nucleotit cặp lồi dùng phần mềm ClustalW Bioedit 7.2.0 Phân tích khoảng cách di truyền xây dựng phát sinh chủng loại theo phƣơng pháp Minimum Likelihood (ML) mơ hình TN93+G, phân tích giá trị bootstrap với 1000 mẫu lặp đƣợc thực phần mềm MEGA 6.0 (Tamura et al 2013) II KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Đặc điểm hình thái lồi tuyến trùng Pratylenchus zeae Các đặc điểm hình thái, số đo (bảng 1) quần thể tuyến trùng Pratylenchus zeae (P.4854) cà rốt phân lập Đông Anh - Hà Nội hồn tồn phù hợp với mơ tả gốc nghiên cứu trƣớc Graham (1951), Taylor & Jenkins (1957), Doucet & Cagnolo (1998) Ma trận mã theo Castillo & Vovlas (2007): A2, B2, C3, D1, E1, F5, G3, H3, I2, J1, K1 (A: số vịng đầu; B: có đực hay khơng; C: chiều dài kim hút; D: hình dạng túi chứa tinh; E: vị trí vulva; F: chiều dài tử cung sau; G: hình dạng cái; H: hình dạng mút cái; I: chiều dài thực quản tuyến; J: số lƣợng đƣờng bên vị trí vulva; K: cấu trúc đƣờng bên vị trí vulva) Con cái: Cơ thể thẳng cong phía bụng cố định nhiệt Vùng đầu gồm vịng cutin, cao 2,2-3 µm, rộng 6,5-8,4 µm Kim hút kitin hố mạnh dài 14-15,8 µm, gốc kim hút tròn Phần procorpus rộng thắt lại trƣớc diều Vòng thần kinh bao quanh isthmus Lỗ tiết mở sau vị trí hemizonid Van thực quản - ruột phía trƣớc phía sau lỗ tiết Thực quản tuyến phủ phía bụng dài 29-41 µm Vùng bên có đƣờng bên Tử cung trƣớc kéo dài phía trƣớc, khơng kéo dài đến thực quản, có hàng nỗn bào, trừ hai đến ba noãn bào cuối xếp thành hàng Túi chứa tinh khơng phát triển, hình trịn, nhỏ, khơng chứa tinh trùng Vị trí vulva cao, tỷ lệ khoảng cách từ đầu đến vulva/chiều dài thể 69-74% Tử cung sau ngắn, chiều dài tử cung sau 1-1,5 lần chiều rộng thể vulval Đi hình chóp, mút nhẵn, thƣờng có 21-26 vịng cutin mặt bụng Phần hyaline ngắn (1,3-2,3 µm) hẹp (2,5-3,6 µm) Con đực: Chƣa gặp Cây chủ: Pratylenchus zeae đƣợc mô tả ngô (Zea mays) Florence, South Carolina, USA Ở Việt Nam đƣợc ghi nhận đậu tƣơng, bơng, cà phê, mía, đào, lúa, lạc, cà chua, khoai tây, Pratylenchus zeae đƣợc ghi nhận cà rốt Lâm Đồng, Hải Dƣơng tiếp tục đƣợc ghi nhận Đông Anh (N N Châu N V Thanh, 2000, N T Duyên cs, 2016) Ghi chú: Những đặc điểm quần thể P zeae cà rốt có số c‟ nhỏ quần thể khác ghi nhận trƣớc giới (Castillo & Vovlas, 2007) Những đặc điểm chi tiết đƣợc sử dụng phân loại loài P zeae với loài gần gũi khác nhƣ: hình dạng mút đi, đƣờng bên vị trí vulva, chiều dài thực quản tuyến khác với lồi P parazeae; hình dạng gốc kim hút, kích thƣớc gốc kim hút khác với loài P subranjani P japonicus 97 TIỂU BAN KHU HỆ ĐỘNG VẬT - THỰC VẬT Hình 1: Ảnh chụp kính hiển vi lồi P zeae phân lập Đơng Anh A: Vùng thực quản; B: Phần kim hút; C: Tử cung trƣớc; D: Tử cung sau; E: Đƣờng bên; F: Đi (Thƣớc đo = 10 µm) Bảng Số đo quần thể tuyến trùng Pratylenchus zeae ký sinh cà rốt Đông Anh Hà Nội (P.4854) số nghiên cứu trƣớc (Số đo theo µm) Chỉ số đo N L A B b' C c' V Chiều dài kim hút Chiều cao gốc kim hút Chiều rộng gốc kim hút DGO Chiều rộng đầu Chiều cao đầu Chiều rộng diều Chiều dài diều Chiều dài từ đầu đến diều Chiều dài từ đầu đến vòng thần kinh Chiều dài từ đầu đến van thực quảnruột Chiều dài từ đầu đến vị trí lỗ tiết 98 P 4854 Graham, 1951 20 491,5±26 (450-537) 540 (360-580) 22±1,3 (20,4-25) 27 (25-30) 6,2±0,3 (5,5-6,8) 6,5 (5,4-8) 4,3±0,1 (4-4,5) 18±1,5 (14,8-20,5) 15,2 (17-21) 2±0,2 (1,7-2,5) 71,5±1,3 (68,8-74,2) 71 (68-76) 14,6±0,5 (14-15,8) 15,5 (15-17) 2,3±0,4 (1,5-3) 4,3±0,4 (3,6-5,2) 2,5±0,2 (2-3) 7,2±0,5 (6,5-8,4) 2,6±0,2 (2,2-3) 8,6±0,5 (7,7-9,5) 11±0,7 (9,5-12,2) 49,7±2,4 (44,7-52,7) 61,3±3,6 (54-66,7) - Taylor & Doucet & Jenkins, 1957 Cagnolo, 1998 90 15 520 (410-640) 500 (400-500) 21,1 (17-25,4) 29,2 (25,3-35) 6,3 (5-9,6) 6,5 (5,5-7,4) 4,1 (3,5-5) 17,3 (11,2-24,1) 17,6 (15,3-19,8) 71 (65-75) 72 (70-79) 15-17 15 (14-16) - 79±4 (70,6-85,6) - - - 75,7±3,6 (68-82,6) - - - HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ Chiều dài từ đầu đến hết thực quản tuyến Chiều dài thực quản tuyến Chiều rộng thể Chiều dài tử cung trƣớc Chiều rộng túi chứa tinh Chiều dài túi chứa tinh Chiều dài từ vulval đến túi chứa tinh Chiều rộng thể vulval Chiều dài tử cung sau Chiều rộng thể anus Chiều dài đuôi Chiều dài hyalin Chiều rộng hyalin Số vịng 115,2±5 (105,5122) 36,2±3,5 (29,4-41) 22,4±2 (18-25) 156±19 (117,3-189) 9,8±1,2 (8-12) 10,8±2 (7,7-13,3) 45,8±5 (39,4-56,6) 21,3±1,6 (17,8-23,6) 27±3,6 (20,6-35) 13±1 (11,3-14,6) 27,7±2,7 (22,6-34) 1,8±0,3 (1,3-2) 3±0,3 (2,5-3,6) 23±1,7 (21-26) - - - - - - Đặc điểm phân tử Kết đọc trình tự vùng gen ITS quần thể tuyến trùng P zeae P.4854 thu đƣợc đoạn gen với chiều dài 884 bp (%T = 24,7; %C = 21,7; %A= 27,5; %G= 26,1) Đối chiếu với trình tự tƣơng đồng genbank cho thấy quần thể tuyến trùng P zeae P.4854 có tƣơng đồng loài thuộc giống Pratylenchus từ 90-96%, tƣơng đồng cao loài P zeae (KU198980; JN020933; LC030346) Phân tích vùng gen ITS cho thấy biến đổi nucleotide cá thể loài P zeae từ 3-6% Biến đổi nucleotide loài khác từ 6-28% Phân tích trình tự lồi thuộc giống Pratylenchus thấy biến đổi nucleotide loài loài lớn, cụ thể loài P parazeae (KF765426 KF765425) khác 39 nucleotide, P zeae P parazeae khác 219 nucleotide Trình tự mẫu P zeae P.4854 khác biệt 30 nucleotide so với trình tự LC030346 lồi P zeae 216 nucleotide so với loài P parazeae (KF765425) Trình tự đoạn gen D2/D3 quần thể P zeae P.4854 với chiều dài 682 bp (%T = 21,3 ; %C = 23,8; %A = 20,3; %G = 34,6) tƣơng đồng 99% với trình tự lồi P zeae (JN020929, JN020930, JN020931, JN020932) Với vùng gen D2D3, biến đổi nucleotide loài tƣơng đối thấp: 0-5% nhóm lồi P zeae, 5-9% nhóm lồi P parazeae từ 10-22% với loài khác Các nghiên cứu trƣớc vùng gen D2D3 thích hợp để phân tích phát sinh lồi loài giống Pratylenchus Sự biến đổi di truyền vùng D2D3 loài thuộc giống Pratylenchus đáng kể, trình tự lồi P parazeae (KP903441) lồi P bhattii (JN244270) khác 75 vị trí nucleotide, trình tự lồi P parazeae (KP903441) lồi P zeae (JN020930) khác 70 nucleotide Tuy nhiên, khác mẫu lồi khơng đáng kể, trình tự KP903441 KP903440 lồi P parazeae khác 06 vị trí nucleotide, trình tự loài P zeae (JN020929, JN020930, JN020931, JN020932) khác 52 vị trí Phân tích phát sinh chủng loại vùng gen ITS (hình 2) cho thấy đƣợc chia làm nhánh quần thể lồi P zeae P.4854 thuộc nhánh thứ bao gồm loài P parazea, P zeae, P goodeyi, P bhatii với giá trị bootstrap 100%, trình tự lồi P zeae P.4854 nhánh với tất quần thể loài P zeae tách biệt khỏi loài khác Cây phát sinh chủng loại vùng gen D2/D3 cho kết tƣơng tự với trình tự lồi P zeae P.4854 đƣợc nhóm chung với tất quần thể loài P zeae tách biệt khỏi quần thể lồi khác (hình 3) 99 TIỂU BAN KHU HỆ ĐỘNG VẬT - THỰC VẬT Hình 2: Cây phát sinh chủng loại dựa vùng gen ITS-rDNA xây dựng theo phƣơng pháp Maximum Likelihood (mơ hình HKY+G+I), số gốc giá trị bootstrap (%) Hình 3: Cây phát sinh chủng loại dựa vào vùng gen D2D3 (28S-rDNA) xây dựng theo phƣơng pháp Maximum Likelihood (mơ hình HKY+G+I) số gốc giá trị bootstrap (%) III KẾT LUẬN Chủng tuyến trùng P.4854 ký sinh cà rốt Đơng Anh - Hà Nội có đặc điểm hình thái, hình thái lƣợng phân tử tƣơng đồng với quần thể thuộc loài P zeae Loài P zeae ký sinh cà rốt Đơng Anh-Hà Nội đặc trƣng vùng đầu có vịng cutin, vùng bên có đƣờng bên vị trí vulva chiếm 69-74% chiều dài thể, túi chứa tinh hình trịn, nhỏ, khơng chứa tinh trùng, chiều dài tử cung sau 1-1,5 lần chiều rộng thể vulva, hình chóp, tận mút nhẵn, phần hyaline ngắn Vùng gen ITS quần thể P zeae P.4854 có chiều dài 884 bp, tƣơng đồng cao (96%) với trình tự (KU198980 ; JN020933; LC030346) loài P zeae Vùng gen D2D3 quần thể P zeae P.4854 có chiều dài 682 bp, tƣơng đồng cao (99%) với trình tự (JN020929, JN020930, JN020931, JN020932) loài P zeae 100 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ Lời cảm ơn: Bài báo hỗ trợ kinh phí Đề tài sở mã số IEBR.DT.04/16-17 TÀI LIỆU THAM KHẢO Castillo P., Vovlas V., 2007 Pratylenchus (Nematoda: Pratylenchidae): Diagnosis, Biology, Pathogenicity and Management Brill Leiden-Boston, 528 pp Doucet M E & Cagnolo S., 1998 Variabilidad intra e inter-específica de caracteres morfométricos en poblaciones del orden Tylenchida (Nematoda) provenientes de Argentina Nematologia Mediterranea, 26: 231-236 Graham T W., 1951 Nematode root rot of tobacco and other plants Bulletin 390 South Carolina Agricultural Experiment Station, Clemson Agricultural College, 25 pp Nguyễn Ngọc Châu, 2003 Tuyến trùng thực vật sở phòng trừ Nxb.Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 301 trang Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Vũ Thanh, 2000 Tuyến trùng ký sinh thực vật Việt Nam Động vật chí Việt Nam Nxb.Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 400 trang Nguyễn Thị Duyên, Lê Thị Mai Linh, Nguyễn Hữu Tiền, Trịnh Quang Pháp, 2016 Bƣớc đầu điều tra thành phần loài tuyến trùng ký sinh gây hại cà rốt Hải Dƣơng Tạp chí sinh học, Số 38(1) 6-13 Subbotin S A., Sturhan D., Chizhov V N., Vovlas N., & Baldwin J G., 2006 Phylogenetic analysis of Tylenchida Thorne, 1949 as inferred from D2 and D3 expansion fragments of the 28S rRNA gene sequences Nematology, 8(3), 455–474 Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A & Kumar S., 2013 MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0 Molecular Biology and Evolution, 30: 2725-2729 Taylor D P & Jenkins W R., 1957 Variation within the nematode genus Pratylenchus, with the descriptions of P hexincisus n sp and P subpenetrans n sp Nematologica, 2: 159-174 10 Vrain T C., Wakarchuk D A., Levesque A C., Hamilton R I., 1992 Intraspecific rDNA restriction fragment length polymorphism in the Xiphinema americanum group Fundamental and Applied Nematology, 15(6), 563-573 MORPHOLOGICAL AND MOLECULAR CHARACTERISTICS OF PRATYLENCHUS ZEAE GRAHAM, 1951 ISOLATED FROM CARROTS IN DONG ANH, HANOI Nguyen Thi Duyen, Le Thi Mai Linh, Nguyen Huu Tien, Trinh Quang Phap SUMMARY The morphological, morphometric and molecular characteristics of the population Pratylenchus zeae P.4854 which parasites carrots in Dong Anh (Hanoi) were analysed It resembled other populations of the species Pratylenchus zeae The samples collected from carrots in Dong Anh district is characterised by: labial region with three annuli, lateral fields with four lines, vulva at 68-76% of body length, spermatheca round, small, without sperm, post-vulval uterine sac short, 1-1.5 vulval body diam., tail conoid, tail tip smooth, hyaline short Molecularly, ITS region and D2D3 region of P zeae P.4854 were 884bp and 682 bp in length, respectively They showed highest similarities (96-99%) to the sequences of P zeae (ITS2: KU198980; JN020933; LC030346 and D2D3 region: JN020929, JN020930, JN020931, JN020932) 101 ... trùng P.4854 ký sinh cà rốt Đông Anh - Hà Nội có đặc điểm hình thái, hình thái lƣợng phân tử tƣơng đồng với quần thể thuộc loài P zeae Loài P zeae ký sinh cà rốt Đông Anh -Hà Nội đặc trƣng vùng... NGHIÊN CỨU Đặc điểm hình thái lồi tuyến trùng Pratylenchus zeae Các đặc điểm hình thái, số đo (bảng 1) quần thể tuyến trùng Pratylenchus zeae (P.4854) cà rốt phân lập Đơng Anh - Hà Nội hồn tồn... sau; E: Đƣờng bên; F: Đi (Thƣớc đo = 10 µm) Bảng Số đo quần thể tuyến trùng Pratylenchus zeae ký sinh cà rốt Đông Anh Hà Nội (P.4854) số nghiên cứu trƣớc (Số đo theo µm) Chỉ số đo N L A B b'