Thử nghiệm và so sánh các phương pháp đo hoạt tính khánh vi sinh vật của vi khẩn lên men LACTIC để chọn chủng tiềm năng PROBIOTIC

Thử nghiệm và so sánh các phương pháp đo hoạt tính khánh vi sinh vật của vi khẩn lên men LACTIC để chọn chủng tiềm năng PROBIOTIC Thử nghiệm và so sánh các phương pháp đo hoạt tính khánh vi sinh vật của vi khẩn lên men LACTIC để chọn chủng tiềm năng PROBIOTIC luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH TS Nguyễn Hoài Hương GVHD: Chương 1: Mở Đầu 1.1.Đặt vấn đề Hiện công nghệ sinh học lónh vực phát triển có nhiều tiềm lớn Việt Nam bước tạo điều kiện để phát triển công nghệ sinh học, đặc biệt ứng dụng nông nghiệp công nghiệp Probiotic thành khoa học, thành công nghệ sinh học Nó ứng dụng rộng rãi vào đời sống người ví tính hợp lý hiệu mà thể Hiệu tác dụng probiotic không đơn làm thức ăn ngon mà có nhiều tác dụng, như: tiêu hoá thức ăn làm bớt rối loạn tiêu hoá; đẩy mạnh tổng hợp vitamin B số enzyme tiêu hoá; cải thiện dung nạp lactose; cải thiện chức miễn dịch; ngăn chặn chỗ loét hệ thống tiêu hoá; ngăn chăn chứng viêm; giảm cholesterol; giảm tỷ lệ chết non; làm giảm số lượng vi khuẩn gây hại; tăng trọng nhanh… Trên quan điểm an toàn sinh học, an toàn thiết thực probiotic chiếm thượng phong so với số phương cách khác Vì tính hiệu probiotic (tính trị bệnh) điều hoà tự nhiên không làm tồn dư kháng sinh, tồn dư tác hại sinh vật chủ Mà với khắt khe người điều số Như biết trước nhiều nông dân sử dụng chất kháng sinh chăn nuôi biện pháp tối ưu lợi ích mà mang lại như: SVTH: Đỗ Quê Mi Hương MSSV: 105111016 Trang Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH TS Nguyễn Hoài Hương • GVHD: Tăng suất sinh trưởng sinh sản gia súc, gia cầm • Tăng hiệu sử dụng thức ăn, làm cho vật nuôi thích ứng nhanh chóng với thay đổi bất thường cấu chủng loại nguyên liệu phần ăn • Nâng cao chất lượng sản phẩm (giảm tỷ lệ thịt mỡ, tăng tỷ lệ thịt nạc, làm cho thịt trở nên mềm không nhiễm mầm bệnh) • Phòng bệnh mãn tính ngăn chặn xẩy dịch bệnh vi trùng • Tăng hiệu kinh tế chăn nuôi Tuy nhiên, giới nhanh chóng nhận tác động xấu việc làm mang lại Sử dụng kháng sinh liều thấp chăn nuôi (sử dụng không cách điều trị, phòng bệnh dùng thức ăn chăn nuôi chất kích thích sinh trưởng) dẫn đến hậu nghiêm trọng làm tăng tượng kháng kháng sinh loài vi khuẩn gây bệnh người vật nuôi Có ý kiến cho rằng, việc sử dụng kháng sinh liều thấp chăn nuôi biến vật nuôi thành nơi để số loài vi khuẩn “ học” cách vô hiệu hoá tác dụng loại kháng sinh Hậu kháng kháng sinh vi khuẩn kinh tế lớn Tuy nhiên, thiệt hại kinh tế yếu mà vấn đề đáng lo ngại không vật nuôi mà loài người đứng trước hiểm hoạ xẩy thảm dịch loài vi khuẩn kháng thuốc gây mà kiểm soát SVTH: Đỗ Quê Mi Hương MSSV: 105111016 Trang Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH TS Nguyễn Hoài Hương GVHD: Như nghiên cứu phát triển ứng dụng probiotic vào sống công việc cần quan tâm đầu tư nhiều Có tiếp tục hoàn thiện probiotic đem lại hiệu cao hơn, chất lïng sống ngày cao hơn, an toàn đáp ứng nhu cầøu ngày cao khắt khe Có thể nói tác động thân hữu người vào tự nhiên nên mở chiến lược phát triển bền vững an toàn Khoa học công nghệ phát triển nhằm để đáp ứng lại nhu cầu ngày cao người Trên phương trình tăng tiến này, người đòi hỏi khắt khe chất lượng loại sản phẩm đặc biệt an toàn sức khoẻ thân họ Mà nhu cầu kích thích tố trực tiếp thúc đẩy khoa học phát triển “ Probiotic” phần phát triển Để có chế phẩm probiotic có đầy đủ hoạt tính cần thiết, khâu chọn lọc chủng vi khuẩn để làm probiotic quan trọng Bởi khâu định vai trò tác dụng chế phẩm lên đối tượng cần quan tâm Tuy nhiên, phạm vi nhỏ hẹp nghiên cứu này, thực đề tài bước kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật thời gian thực đề tài 12 tuần không cho phép thực hiệân hoàn chỉnh tất tiêu chí tuyển chọn Probiotic Chính thếø chọn đề tài “THỬ NGHIỆM VÀ SO SÁNH CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐO HOẠT SVTH: Đỗ Quê Mi Hương MSSV: 105111016 Trang Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH TS Nguyễn Hoài Hương GVHD: TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC ĐỂ CHỌN CHỦNG TIỀM NĂNG PROBIOTIC” 1.2.Mục tiêu nghiên cứu Thử nghiệm so sánh phương pháp đo hoạt tính kháng vi sinh vật vi khuẩn lên men lactic Chọn lọc vi khuẩn lên men lactic có hoạt tính probiotic 1.3.Đối tượng nghiên cứu Vì thời gian hạn hẹp, đề tài tập trung đối tượng sau : - Vi khuẩn lên men lactic có nguồn gốc từ thực phẩm lên men ( cà muối, dưa muối, nem, sữa lên men) có nguồn gốc từ chế phẩm dược - Vi sinh vật thị Escherichia coli 1.4 Phương pháp nghiên cứu 1.4.1 Phương pháp luận Trước bắt tay vào thực đề tài này, Tổng hợp biên tập tham khảo nhiều nghiên cứu từ trước tới tài liệu probiotic phương pháp tuyển chọn Nhận thấy có nhiều phương pháp sử dụng để Phân tích nghiên cứu thực việc chọn lọc này, xem xét chọn liên quan phương pháp điển hình cho đề tài Tôi xinýđề xuất sơ đồ tiến hành cứu sau: Trao đổi kiến với giáo Tiếnnghiên hành thử nghiệm viên hướng dẫn phương pháp Phân tích ưu điểm – khuyết điểm phương pháp Chọn phương pháp tối ưu, tiến hành SVTH: Đỗ Quê Mi Hương chọn lọc MSSV: 105111016 probiotic Trang Đưa kết nghiên cứu Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH TS Nguyễn Hoài Hương GVHD: Hình 1.1: Sơ đồ nghiên cứu 1.4.2 Phương pháp xử lý số liệu Sử dụng phần mềm Excel vẽ đồ thị biểu diễn Sử dụng phần mềm Statgraphics xử lý số liệu thô, tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, vè đồ thị tương quan 1.5 Ý nghóa khoa học thực tiễn Tìm hiểu phương pháp đánh giá khả kháng vi sinh vật thị vi khuẩn lên men lactic Tạo tiền đề cho nghiên cứu liên quan sau phòng thí nghiệm Góp phần chọn lọc chủng vi khuẩn lên men lactic có hoạt tính probiotic SVTH: Đỗ Quê Mi Hương MSSV: 105111016 Trang Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH TS Nguyễn Hoài Hương GVHD: Chương 2: Tổng Quan Tài Liệu 2.1.Tổng quan Probiotics 2.1.1 Giới thiệu sơ lược probiotic 2.1.1.1 Giới thiệu chung Việc sử dụng vi khuẩn lactic thức ăn bổ sung xuất từ lâu người biết đến sữa lên men Việt nghiên cứu Metchnikoff làm việc viện Pasteur Paris Ông ta cho vi sinh vật ruột có ảnh hưởng xấu tới sức khỏe vật nuôi ảnh hưởng xấu cải thiện việc sử dụn sữa chua Ông trích dẫn quan sát nông dân Bungari sử dụng số lượng lớn sữa chua có tuổi thọ cao Ông phân lập hệ sinh vật từ sữa chua ông gọi “Bulgarian bacillus” sử dụng chúng thử nghiệm Những sinh vật xác định biết đến Lactobacillus bulgaricus ngày gọi L delbrueckii subsp bulgaricus SVTH: Đỗ Quê Mi Hương MSSV: 105111016 Trang Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH TS Nguyễn Hoài Hương GVHD: số sinh vật sửdụng để lên men sữa sản xuất yoghurt Sau Metchnikoff vào năm 1916, hoạt động nghiên cứu chuyển USA Được biết thời điểm người ta đề xuất việc sử dụng L acidophilus nhiều thử nghiệm thực với sinh vật [34] Thuật ngữ probiotic vốn có nhiều định nghóa khác nhau, sử dụng lần năm 1965 (Lilly & Stillwell ) để mô tả chất tạo protozoan để kích thích tăng trưởng sinh vật khác Đến năm 1974, Parker sử dụng để chất bổ sung thức ăn động vật: sinh vật chất có tác động tích cực lên động vật cách cân vi sinh vật ruột Fuller (1989) đưa định nghóa gần với “ bổ sung vi sinh vật sống qua thức ăn có tác động tích cực lên ký chủ cách cải thiện cân vi sinh vật đường ruột” [33] Bảng 2.1: Một số sản phẩm sữa lên men có chứa đựng vi khuẩn probiotic (T Mattila-Sandholm, M Saarela, Probiotic functional foods) Dạng sản phẩm Tên sản phẩm Công ty Yoghurt LC1 Nestle SVTH: Đỗ Quê Mi Hương MSSV: 105111016 Vi Khuẩn probiotic bổ sung (107-108 LAB/ml) L johnsonii LC-1 Trang Nơi sản xuất France, Belgium, Spain, Switzerlan d, Portugal, Italy, Germany, Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH TS Nguyễn Hoài Hương GVHD: Yoghurt Gefilus Valio L rhamnosus GG Yoghurt Vifit Mona L rhamnosus GG Yoghurt Vifit Yoghurt drink Yo-Plus UK Finland Netherland s, Ireland Yoghurt Yoghurt Ferment ed milk drink Cultures yoghurtstyle product Bio-Pot LA7 Sudmilc h Waterfo rd Foods Onken Bauer Yakult Yakult L casei Shirota strain Gaio MDFoods E faecium Denmark Yoghurt SNO Dairygo ld L acidophilus Ireland Yoghurt Actimel Cholest erol Control Danone L acidophilus Belgium Ferment ed milk drink Actimel Danone L casei Europe Yoplait Waterfo rdFoods L acidophilus Ireland BraMjolk Arla Bifidus, L reuterii, L acidophilus Sweden Fyos Nutricia L casei Netherland s L reuterii, L casei, L acidophilus L acidophilus Switzerlan d Ireland, UK Yoghurt Ferment ed milk drink Ferment ed milk drink Yoghurt Yoghurt Symbala nce Shape Tonilait St Ivel L rhamnosus GG Germany L acidophilus Ireland Biogarde cultures L acidophilus Europe Germany Nertherlan ds, UK, Germany 2.1.1.2 Hiệu sử dụng probiotic SVTH: Đỗ Quê Mi Hương MSSV: 105111016 Trang Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH TS Nguyễn Hoài Hương GVHD: Đã có nhiều chế phẩm probiotic dành cho người hay cho vật nuôi đăng kí bảo hộ sáng chế Hầu hết sản phẩm chứa Lactobacillus spp Streptococcus spp., số chứa Bifidobacteria spp., Saccharomyces boulardii, hay Bacillus subtilis Ảnh hưởng chế phẩm probiotic trực tiếp gián tiếp thông qua điều chỉnh hệ vi sinh vật đường ruột Những chế phẩm có hiệu sử dụng biết tới sau: [2], [3], [5], [25], [32], [33] Có khả kháng ung thư chống yếu  tố đột biến  Kìm hãm vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa  Cải thiện việc sử dụng lactose người không dung nạp lactose  Làm giảm Cholesterol huyết  Kích thích hệ thống miễn dịch  Giảm nhiễm trùng đường niệu  Tăng trọng (5%) gia cầm  Giảm bệnh nhiễm trùng gia cầm  Giảm tiêu chảy dộng vật non  Giảm tác dụng phụ chất kháng sinh Hiệu lâm sàng vài chủng probiotic trình bày Bảng đây: Bảng 2.2: Tác dụng lâm sàng số chủng probiotic [8], [15] Chủng SVTH: Đỗ Quê Mi Hương MSSV: 105111016 Tác dụng lâm Trang sàng Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH TS Nguyễn Hoài Hương GVHD: người Lactibacillus Giảm hoạt tính enzyme phân, rhamnosus GG (ATCC giảm tiêu chảy kháng sinh 53103) trẻ em, điều trị dự phòng rotavirus tiêu chảy cấp trẻ em, điều trị tiêu chảy tái phát Clostridium difficile, kích thích miễn dịch, giảm nhẹ triệu chứng viêm da không điển hình Lactobacillus johnsonii trẻ em Cân hệ vi sinh vật đường (acidophilus) LJ-1 (La1) ruột, tăng cường miễn dịch, hỗ Bifidobacterium trợ điều trị Helicobacter pylori Dự phòng tiêu chảy du lịch, lactis Bb-12 điều trị tiêu chảy virus, kể rotavirus, cân hệ vi sinh vật đường ruột, cải thiện tình trạng táo bón, kích thích hệ miễn dịch, giảm nhẹ triệu chứng viêm da không điển hình Lactobacillus reuteri trẻ em Rút ngắn thời gian bị tiêu chảy (BioGaia Biologics) rotavirus trẻ em, điều trị tiêu chảy cấp trẻ em, an toàn dung nạp tốt bệnh Lactobacillus Shirota casei nhân trưởng thành HIV dương tính Cân hệ vi sinh vật đường ruột, giảm hoạt tính enzyme phân, có tác động tích cực ung thư mặt bàng quang SVTH: Đỗ Quê Mi Hương MSSV: 105111016 Trang 10 Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH TS Nguyễn Hoài Hương GVHD: suốt vòng kháng khuẩn Điều cho thấy tương ứng chất kháng khuẩn với mật độ tế bào vi khuẩn thị Sau thử nghiệm phương pháp với độ dày khác (5mm, 3mm), độ dày 3mm tương ứng với 15 ml môi trường thạch thích hợp Tương tự nồng độ vi khuẩn thị để nhận rõ vòng kháng khuẩn 10 tế bào/ml Hình 4.3 thể rõ kết thu Môi trường dày (5mm) Môi trường thích hợp (3mm) E.coli 105 tế bào/ml E.coli 106 tế bào/ml Hình 4.3 So sánh kết C1 hai đóa môi trường với độ dày nồng độ vi khuẩn thị khác Việc chuẩn hóa cho phương pháp can phải thực chuẩn hóa nồng độ vi khuẩn lên men lactic MRS lỏng Khi cấy chuyển vào môi trường lỏng lượng sinh khối lấy không đồng Theo sau nuôi cấy qua 18-24h, lượng tế bào tăng sinh môi trường khác Khi sử dụng thể tích dịch nuôi cấy chủng để tiến hành thí nghiệm nồng độ tế bào /ml không cố định, mà kết SVTH: Đỗ Quê Mi Hương MSSV: 105111016 Trang 77 Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH TS Nguyễn Hoài Hương GVHD: có độ tin cậy thấp Việc chuẩn hóa thực dựa dựng đường chuẩn nồng độ tế bào vi khuẩn Khi tiến hành đo vòng kháng đóa petri, phương pháp đo thô sơ, dựa mắt thường dùng thước mm để đo Kết có không độ tin cậy cao, chưa có độ nhạy kết quả, cần phải nghiên cứu phương pháp khác có độ nhạy cao T1a (d= 17 mm) T7b (d= 17 mm) C1 (d=18mm) N3 (d= 16 mm) Hình 4.4: Vòng kháng chủng điển hình Hai mươi hai chủng vi khuẩn lactic kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn tổng quát nhờ phương pháp khuếch tán qua giếng thạch với độ dày môi trường nồng SVTH: Đỗ Quê Mi Hương MSSV: 105111016 Trang 78 Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH TS Nguyễn Hoài Hương GVHD: độ E.coli thích hợp là: độ dày 3mm nồng độ 10 tế bào/ml Đường kính vòng kháng khuẩn đo bao gồm đường kính giếng thạch (Hình 4.2 Bảng 4.1) Ta có công thức tính bề rộng vành kháng khuẩn: Bề rộng vành kháng khuẩn = [d vòng kháng – d giếng thạch]/2 (mm) Schillinger Lucke (1989) cho bề rộng vành kháng khuẩn > mm khả kháng vi khuẩn lactic vi sinh vật thị coi mạnh; giá trị nằm khoảng 0,5 – mm tương ứng khả kháng trung bình Còn theo nghiên cứu V Rosenfeldt Nielsen, C N Jacobsen, A E Hayford, P L Molller, K F Michaelsen, A Perrehaard, B Sandstrom, M Tvede, M Jakobsen (1999) bề rộng vành kháng khuẩn xét khoảng 2-5mm cho khả kháng trung bình 5mm cho khả kháng mạnh Gần đây, V Padmanabha Reddy, M.D Christopher, I Sankara Reddy (2006) đo bề rộng vòng kháng khuẩn 3-5mm Lactobacillus acidophilus vi sinh vật thị E.coli Theo bảng 4.1, bề rộng vòng kháng khuẩn đo không khác biệt với tác giả nêu Bề rộng vành kháng khuẩn phụ thuộc vào nồng độ chất kháng khuẩn dịch ly tâm Một số tác giả cô đặc dịch tế bào ly tâm 5, 10 lần để tăng nồng độ chất kháng khuẩn nhằm tăng bề dày vành kháng khuẩn [36] Bảng 4.1 Đường kính vịng kháng khuẩn đo đường phương pháp khuếch tán qua giếng thạch (well diffusion assay) SVTH: Đỗ Quê Mi Hương MSSV: 105111016 Trang 79 Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH TS Nguyễn Hoài Hương Số TT Chủng GVHD: Giá trị Phân Giá trị trung loại hoạt trung bình bình bề tính đường kính rộng kháng vòng vành khuẩn kháng kháng khuẩn (mm) khuẩn T8b 18.0 (mm) 5.0 C1 18.0 5.0 T1a 17.0 4.5 +++ +++ T7b 17.0 4.5 +++ D3 16.0 4.0 ++ N3 16.0 4.0 ++ T1c 15.0 3.5 ++ 10 11 12 13 14 15 16 T3c S6 N4 S2 S4 N1 T2c N5 15.0 15.0 14.0 14.0 14.0 13.0 13.0 10.0 3.5 3.5 3.0 3.0 3.0 2.5 2.5 1.0 S1a 10.0 1.0 ++ ++ ++ ++ ++ + + + + 17 18 19 20 21 22 S1b S3 T1b D2 T4c S5 10.0 10.0 10.0 10.0 8.0 8.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0 + + + + 0 +++ Để tiện theo dõi đánh giá hoạt tính kháng khuẩn chủng vi khuẩn lactic phân lập phòng SVTH: Đỗ Quê Mi Hương MSSV: 105111016 Trang 80 Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH TS Nguyễn Hoài Hương GVHD: thí nghiệm, đề nghị phân loại hoạt tính kháng khuẩn (tạm thời vi khuẩn thị E.coli) sau: - Bề dày vành kháng khuẩn >4.0 mm tương ứng hoạt - tính mạnh (+++) Bề dày vành kháng khuẩn = 3.0mm ÷ 4.0 mm tương - ứng hoạt tính trung bình (++) Bề dày vành kháng khuẩn < 3.0 mm tương ứng - hoạt tính yếu (+) Bề dày vành kháng khuẩn = mm tương ứng hoạt tính (0) Như vậy, số bốn phương pháp khuếch tán môi trường thạch spot on lawn, agar spot test, dics diffusion assay, well diffusion assay, phương pháp cuối sau chuẩn hóa độ dày môi trường nồng độ vi sinh vật áp dụng để so sánh hoạt tính kháng khuẩn chủng vi khuẩn nguồn gốc khác qua đường kính vòng kháng Tuy nhiên, để kết so sánh phương pháp thống kê cần tăng số lần lặp lại Chúng áp dụng phương pháp để so sánh hoạt tính kháng khuẩn tổng thể E.coli 22 chủng vi khuẩn lactic Để xác định chất kháng khuẩn acid lactic, H2O2 hay bacteriocin, cần tiến hành số phương pháp bổ sung trung hòa dịch tế bào ly tâm, bổ sung catalase….Ngoài ra, phương pháp khuếch tán qua môi trường thạch áp dụng để sàng lọc ban đầu quy trình tìm kiếm chủng có hoạt tính probiotic Để so sánh mang tính định lượng cần tìm kiếm phương pháp có độ tin cậy cao SVTH: Đỗ Quê Mi Hương MSSV: 105111016 Trang 81 Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH TS Nguyễn Hoài Hương GVHD: 4.5 Thí nghiệm xác định khả đối kháng phương pháp Turbidimetric assay (đo độ đục) Tế bào vi sinh vật thực thể nên diện môi trường làm cho môi trường trở nên đục Độ đục huyền phù tỉ lệ thuận với mật độ tế bào Do đó, thông qua việc đo độ đục máy quang phổ kể bước sóng định dịch huyền phù tế bào ta định tính mật độ tế bào điều kiện cần khảo sát Khi thực phương pháp đo độ đục, có thay đổi quy trình so với tài liệu tham khảo [16], [31] Thay tiệt trùng dịch ly tâm phương pháp lọc, khử trùng trước eppendorf tube dùng để ly tâm, sau ly tâm trùng Pasteur 80o C 10 phút để tránh biến tính bacteriocin đơn giản hóa thao tác Mọi thao tác cấy truyền bảo đảm điều kiện vô trùng Phương pháp dựa nguyên tắc chung phương pháp phát chất kháng vi sinh vật đo khả ức chế tăng trưởng vi khuẩn thị chất kháng khuẩn sinh từ trình trao đổi chất vi khuẩn lên men lactic Không giống bốn phương pháp thực trên, phương pháp đo độ đục dựa khuếch tán chất kháng khuẩn môi trường lỏng Tỉ lệ phần trăm OD E coli ủ với dịch ly tâm tế bào vi khuẩn LAB so với OD E coli ủ với đối chứng (thay dịch ly tâm LAB môi trường MRS thể tích) cho ta tỉ lệ sống sót E coli sau ủ với chất kháng khuẩn dịch nuôi cấy tế bào LAB Như SVTH: Đỗ Quê Mi Hương MSSV: 105111016 Trang 82 Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH TS Nguyễn Hoài Hương GVHD: biên độ thay đổi giá trị đo tính rộng so với phương pháp well diffusion assay (Hình 4.5 Bảng 4.2) Cũng sở phương pháp có nhiều ưu điểm so với phương pháp trước, việc khảo sát hoạt tính kháng khuẩn tổng quát, bước đầu tìm hiểu chất kháng khuẩn dịch nuôi cấy vi khuẩn LAB ly tâm Thực trình nuôi cấy vi khuẩn lên men lactic MRS lỏng với điều kiện kị khí, dịch nuôi cấy đem phân tích hàm lượng H2O2 sinh Kết cho thấy H2O2 không sinh trình nuôi cấy kị khí, hai chất kháng khuẩn đáng quan tâm lại acid hữu bacteriocin Để loại bỏ tác dụng acid hữu hoạt tính kháng khuẩn, tiến hành trung hòa dịch nuôi cấy LAB đem ly tâm tiếp tiến hành quy trình đo độ đục Kết trình bày bảng 4.2 SVTH: Đỗ Quê Mi Hương MSSV: 105111016 Trang 83 Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH TS Nguyễn Hoài Hương GVHD: Ống nghiệm bên phải: Ống nghiệm bên phải: Dịch nuôi cấy C1 ly tâm Dịch nuôi cấy C1 ly tâm (không trung hòa) ủ với E (sau trung hòa) ủ với E coli coli Ống nghiệm bên trái : đối chứng (thay dịch nuôi cấy C1 môi trường MRS thể tích) Hình 4.5: Kiểm tra hoạt tính phương pháp đo đô đục Bảng 4.2 Tỉ lệ sống sót E coli sau ủ với dịch nuôi cấy LAB ly tâm Số TT SVTH: Đỗ Quê Mi Hương MSSV: 105111016 Chủng Tỉ lệ Tỉ lệ vi sống sót sống sót khuẩn E.coli E.coli lactic (%) ủ (%) ủ với dịch ly với dịch Trang 84 Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH TS Nguyễn Hoài Hương GVHD: tâm ly tâm sau không trung hòa 56.1 T8b trung hòa 4.6 C1 4.1 52.7 T1a 3.2 62.1 T7b 4.5 57.1 D3 15.3 80.1 N3 4.2 63.2 T1c 48.2 74.3 10 11 12 13 14 15 16 T3c S6 N4 S2 S4 N1 T2c N5 20.0 34.3 41.9 12.3 34.0 15.8 63.2 48.1 68.8 63.4 67.9 76.8 54.3 55.8 63.5 65.6 S1a 45.7 58.0 17 18 19 20 21 22 S1b S3 T1b D2 T4c S5 85.1 46.5 92.6 57.0 89.5 53.2 76.0 58.1 80.3 57.6 77.5 73.5 Từ bảng 4.2 ta thấy tỉ lệ sống sót E coli thấp hoạt tính kháng vi sinh vật cao Như để so sánh trực tiếp khả ức chế tăng trưởng E coli sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn LAB, sử dụng đại lượng (100% – tỉ lệ % số sót E coli) biểu diễn đồ thị 4.1 SVTH: Đỗ Quê Mi Hương MSSV: 105111016 Trang 85 Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH TS Nguyễn Hoài Hương GVHD: Đồ thị 4.1: Tỉ lệ ức chế tăng trưởng E coli dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic ly tâm không trung hòa sau trung hòa Đồ thị 4.1 cho thấy: - Tỉ lệ ức chế tăng trưởng vi sinh vật thị dịch nuôi cấy LAB ly tâm không trung hòa thường lớn mẫu tương ứng sau trung hòa (19/22 trường hợp) Điều hợp lý trung hòa nhằm loại bỏ tác dụng acid hữu hoạt tính kháng khuẩn Trường hợp S1b, T1b T4c cho kết ngược lại Tuy nhiên chủng không gây ý đặc biệt tỉ lệ ức chế E coli cao xấp xỉ 20%, thuộc loại thấp so với chủng lại - Nhiều chủng ức chế 80% tăng trưởng E coli không trung hòa (T8b, C1, T1a, N3, S2, N1), sau loại bỏ tác dụng acid hữu tạo SVTH: Đỗ Quê Mi Hương MSSV: 105111016 Trang 86 Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH TS Nguyễn Hoài Hương GVHD: thành khả ức chế lại 40% Nhiều chủng hoạt tính kháng E coli lại acid hữu tạo thành mà chủ yếu yếu tố khác, nhiều khả bacteriocin (T2c, N5, S1a, D2) hoạt tính xấp xỉ 40% So sánh với kết phương pháp khuếch tán giếng thạch (well diffusion assay) nhìn chung ta phân biệt chủng có hoạt tính mạnh yếu hai phương pháp, ví dụ số chủng đánh giá có hoạt tính mạnh well diffusion assay ức chế 90% tăng trưởng E coli (mẫu không trung hòa) Ngược lại nhiều chủng làm giảm độ đục E.coli tương tự bề dày vành kháng khuẩn lại nhỏ (T3c, S2, N1) Có vẻ chủng ức chế tăng trưởng vi sinh vật thị mạnh tác động acid hữu bề dày vành kháng khuẩn lớn Có thể khả khuếch tán bacteriocin môi trường thạch acid hữu Đồ thị 4.2 biểu diễn tương quan tỉ lệ sống sót E coli (A%) theo phương pháp đo độ đục theo bề rộng vành kháng khuẩn (mm) với số liệu xử lý đồ thị vẽ phần mềm Statgraphics SVTH: Đỗ Quê Mi Hương MSSV: 105111016 Trang 87 Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH TS Nguyễn Hoài Hương GVHD: Đồ thị 4.2: Sự tương quan phương pháp đo độ đục (turbidimetric assay method) phương pháp khuếch tán qua giếng thạch (well diffusion assay) Phương trình biểu diễn tương quan là: A(%) = 24.2 + 14.7 D thiết lập với hệ số tương quan (correlation coefficient) 0.8366 R2 = 66.3 % Như vậy, mặt thống kê coi tương quan kết hai phương pháp khuếch tán qua giếng thạch đo độ đục Tóm lại, phương pháp khuếch tán qua giếng thạch cho kết định tính lại tốn nhiều thời gian công phu, phương pháp đo độ đục cho kết mang tính định lượng dễ dàng sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật thành phần chất kháng khuẩn Chúng đề nghị phát triển phương pháp Phòng thí nghiệm công việc tuyển chọn chủng LAB làm probiotics hay sản xuất bacteriocin SVTH: Đỗ Quê Mi Hương MSSV: 105111016 Trang 88 Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH TS Nguyễn Hoài Hương GVHD: Chương 5: Kết Luận & Kiến Nghị 5.1 Kết Luận Để chọn lọc chủng có tiềm probiotics, tuyển chọn khả kháng vi sinh vật đóng vai trò quan trọng hàng rào tuyển chọn cần áp dụng Trong bốn phương pháp thử nghiệm môi trường thạch spot on lawn, agar spot test, dics diffusion assay well diffusion assay phương pháp thứ tư cho kết phòng thí nghiệm Phương pháp dùng để đánh giá hoạt tính tổng hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn lactic sinh trình trao đổi chất Để thực phương pháp tối ưu hóa điều kiện là: Sử dụng môi trường thạch dày 3mm tương ứng với 15ml môi trường Sử dụng E.coli nồng độ 105 tế bào/ml dùng cho tất phương pháp kiểm tra đối kháng Trong phương pháp sử dụng để kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật có phương pháp đo độ đục (turbidometric assay method) cho kết định lượng Áp dụng phương pháp đánh giá ảnh hưởng riêng rẽ chất kháng vi sinh vật thị Bằng phương pháp well diffusion assay xác định năm chủng có vòng kháng khuẩn tốt là: C1, T8b, T1a, T7b, N3 Trong C1 N3 có nguồn gốc SVTH: Đỗ Quê Mi Hương MSSV: 105111016 Trang 89 Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH TS Nguyễn Hoài Hương GVHD: từ thực phẩm cà muối nem Còn T8b, T1a, T7b có nguồn gốc từ dược phẩm, chế phẩm Biolactyl, Probio Ybio Bằng phương pháp đo độ đục xác định năm chủng có khả tạo chất kháng khuẩn, ức chế tăng sinh vi khuẩn thị E.coli cho kết tốt : T1a, C1, N3, T7b, T8b, tương ứng với thí nghiệm kiểm tra vòng kháng khuẩn 5.2 Kiến nghị Kiến nghị phòng thí nghiệm Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ nên triển khai phương pháp turbidometric assay nghiên cứu chọn lọc chủng tiềm probiotic Để thực hoàn chỉnh phương pháp cần phải điều chỉnh, tối ưu hóa số điều kiện sau: • Việc chuẩn hóa thực dựa dựng đường chuẩn nồng độ tế bào vi khuẩn, kiểm soát cố định nồng độ tế bào vi khuẩn lên men lactic sử dụng phương pháp • Kiểm soát cố định nồng độ tế bào E.coli sử dụng phương pháp • Trích ly định lượng bacteriocin xử lý dịch ly tâm proteinase K để xác định hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn có chất protein hay không • Tiếp tục tiến hành kiểm tra hoạt tính Probiotic vi khuẩn lactic với tiêu chí về: khả bám dính cạnh tranh với vi khuẩn thị, khả chịu pH dung hòa với acid, khả chịu nồng độ muối mật cao, kiểm tra khả đối SVTH: Đỗ Quê Mi Hương MSSV: 105111016 Trang 90 Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH TS Nguyễn Hoài Hương GVHD: kháng trực tiếp với vi khuẩn thị điều kiện in vivo SVTH: Đỗ Quê Mi Hương MSSV: 105111016 Trang 91 ... VẬT CỦA VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC ĐỂ CHỌN CHỦNG TIỀM NĂNG PROBIOTIC? ?? 1.2.Mục tiêu nghiên cứu Thử nghiệm so sánh phương pháp đo hoạt tính kháng vi sinh vật vi khuẩn lên men lactic Chọn lọc vi khuẩn... chế vi sinh vật probiotic lên sinh trưởng phát triển vi sinh vật thị Một số ví dụ vi sinh vật thị là: Bảng 2.9: Một số vi sinh vật thị điển hình sử dụng nghiên cứu chọn lọc probiotic Vi sinh vật. .. phương pháp đánh giá khả kháng vi sinh vật thị vi khuẩn lên men lactic Tạo tiền đề cho nghiên cứu liên quan sau phòng thí nghiệm Góp phần chọn lọc chủng vi khuẩn lên men lactic có hoạt tính probiotic