Nghiên cứu xác định môi trường thích hợp nhân PLB và tạo chồi từ PLB giống lan Phalaenopsis amabilis

Nghiên cứu xác định môi trường thích hợp nhân PLB và tạo chồi từ PLB giống lan Phalaenopsis amabilis Nghiên cứu xác định môi trường thích hợp nhân PLB và tạo chồi từ PLB giống lan Phalaenopsis amabilis Nghiên cứu xác định môi trường thích hợp nhân PLB và tạo chồi từ PLB giống lan Phalaenopsis amabilis luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp

Đề án tốt nghiệp GIỚI THIỆU Hoa lan mặt hàng xuất quan trọng, mang lại nguồn lợi kinh tế cao cho nhiều quốc gia, đặc biệt số nước Châu Á Thái Lan nước đứng đầu Thế giới sản xuất xuất hoa lan, với sản phẩm chủ lực lan Dendro (Dendrobium), cho doanh thu năm từ xuất gần 600 triệu USD Hoa lan trồng có giá trị kinh tế cao, với diện tích sản xuất chưa đầy 500ha lan hồ điệp (Phalaenopsis), hàng năm Đài Loan thu 35 triệu USD từ xuất sản phẩm hoa Nước ta bắt đầu ý thương mại hoa lan vào năm 1990 Hiện hoa lan nhiều tỉnh, thành phố xem chiến lược phát triển kinh tế tỉnh Vì tốc độ phát triển hoa lan phát triển nhanh diện tích lẫn chủng loại, từ khu vườn trồng lan nhỏ lẻ trước đây, vòng 10 năm (2000-2009) diện tích trồng lan tăng lên gần 80ha, với hàng trăm chủng loại có giá trị cao như: Hồ điệp, Dendro, Mokara, Vanda, Tuy nhiên việc phát triển sản xuất hoa lan nước gặp nhiều khó khăn đặc biệt giống Các sở sản xuất giống nước không đủ đáp ứng nhu cầu sản xuất, nhà vườn phải nhập giống từ nước nhiều hạn ngạch khác Điều khó khăn cho việc kiểm soát dịch bệnh gây thụ động sản xuất hoa thương phẩm Bởi việc tập trung phát triển sản xuất lan giống in vitro, khắc phục thiếu hụt giống sản xuất cấp thiết nước ta SVTH: Nguyễn Hiền Nhơn Ngành Công nghệ Sinh học K2005 Đề án tốt nghiệp Đề tài nghiên cứu môi trường nhân PLB (protocorm like body) môi trường tạo chồi từ PLB giống lan hồ điệp Phalaenopsis amabilis Yubidan Mục đích xác định môi trường thích hợp sử dụng nhân PLB tạo chồi từ PLB, để làm sở thiết lập hoàn thiện qui trình sản xuất giống hoa lan hồ điệp qui mô rộng Tuy nhiên thời gian có hạn, đề tài nghiên cứu xác định môi trường nuôi cấy giai đoạn nhân PLB giai đoạn tạo chồi Đây hai giai đoạn quan trọng quy trình sản xuất giống hoa lan Nó ảnh hưởng trực tiếp đến suất chất lượng giống mà ảnh hưởng đến chất lượng hoa thương phẩm Việc nhân PLB tạo chồi lan hồ điệp chất lượng cao tiền đề thúc đẩy phát triển sản xuất lan giống nước, góp phần khắc phục tượng thiếu hụt giống sản xuất nay, bước nâng cao trình độ kỹ thuật nhân giống thu nhập cho người sản xuất, hạn chế lây lan nguồn bệnh từ nước qua đường nhập giống SVTH: Nguyễn Hiền Nhơn Ngành Công nghệ Sinh học K2005 Đề án tốt nghiệp CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặt vấn đề Lan hồ điệp (Phalaenopsis spp.) loài lan quý ưa chuộng đóng vai trò quan trọng ngành công nghiệp hoa cắt cành cảnh giới Tuy nhiên, số lượng giống sản xuất chưa đáp ứng nhu cầu ngày tăng thị trường Nguyên nhân lan hồ điệp loài sinh trưởng chậm loài lan khó nhân giống, thường cho hệ số nhân thấp điều kiện vườn ươm Để có số lượng lớn giống chất lượng tốt cung cấp cho thị trường sản xuất gặp nhiều khó khăn Trong năm gần đây, công nghệ lai tạo giống kết hợp gieo hạt ống nghiệm cho tỷ lệ nẩy mầm cao, tạo nên đa dạng màu sắc, cấu trúc, kích thước hoa sau hệ Tuy nhiên nhân giống phương pháp gieo hạt mang tính biến dị cao, tốn nhiều thời gian, có cho hoa mẹ Để khắc phục điều nhà khoa học dùng nhiều phương pháp nuôi SVTH: Nguyễn Hiền Nhơn Ngành Công nghệ Sinh học K2005 Đề án tốt nghiệp cấy mô để tạo đồng loạt ổn định mặt di truyền Phương pháp có ưu điểm tạo nên quần thể đồng tính trạnh, có tăng trưởng chất lượng hoa đồng Hiện phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng lan hồ điệp nhằm tạo giống bệnh quan tâm Tuy nhiên phương pháp thực khó thành công hơn, đỉnh sinh trưởng nhỏ nên tái sinh chết qua lần khử trùng Hồ điệp loại lan đơn thân, thân ngắn cho đỉnh sinh trưởng nên để có nguồn mẫu in vitro cần phải có nhiều mẫu ban đầu làm tăng chi phí trình nuôi cấy Vì vậy, nhà nuôi cấy mô nước giới thường dùng phát hoa làm vật liệu nuôi cấy, phát hoa hồ điệp có chứa mắt ngủ tạo thành chồi Do đó, phương pháp nuôi cấy phát hoa in vitro để tạo chồi xem đặc trưng lan hồ điệp, hệ số nhân giống từ phương pháp thấp Gần đây, phương pháp nhân giống lan hồ điệp thông qua tái sinh protocorm like body (PLB) trực tiếp từ mô trưởng thành quan tâm, phương pháp giúp tạo đồng hệ số nhân giống cao Tuy nhiên, khó khăn lớn phương pháp tỷ lệ PLB tạo từ mô trưởng thành thấp nên nhiều thời gian để tăng sinh PLB Mà thời gian tăng sinh dài dẫn đến nhiều biến dị hình thái không mong muốn giống Như vậy, yêu cầu đặt cần phải tạo số lượng lớn PLB thời gian ngắn nhằm tránh biến dị xảy Trong nội dung đề tài “Nghiên cứu xác định môi trường thích hợp nhân PLB tạo chồi từ PLB giống SVTH: Nguyễn Hiền Nhơn Ngành Công nghệ Sinh học K2005 Đề án tốt nghiệp lan Phalaenopsis amabilis Yubidan phục vụ sản xuất giống” Mục đích xác định môi trường nhân PLB môi trường tạo chồi từ PLB thích hợp cho giống lan hồ điệp Phalaenopsis amabilis Yubidan, làm sở để thiết lập quy trình sản xuất giống lan hồ điệp qui mô rộng 1.2 LAN HỒ ĐIỆP (PHALAENOPSIS) 1.2.1 Nguồn gốc phân bố Lan hồ điệp có tên khoa học Phalaenopsis, loài có hoa lớn, bền, đẹp Tên gọi Phalaenopsis có nguồn gốc từ tiếng Hi Lạp, Grec Phalaina có nghóa "con bướm" Opsis có nghóa "giống như" Hồ điệp lan có hình dáng tựa bươm bướm phất phơ đẹp Hồ điệp phát vào năm 1750, lần Rumphius đặt tên Angraecum Năm 1753 Linne đổi tên thaønh Epidendrum amabile Chi Phalaenopsis (P) C L Blume phát vào năm 1825 Năm 1887, loài hồ điệp lai J Veitch đăng ký với tên Phalaenopsis harriettiae, từ việc kết hợp P amabilis P violacea Sau đó, có nhiều loài lai tạo làm tăng thêm đa dạng huyền bí Phalaenopsis Phalaenopsis gồm có 21 loài phát sinh, ưa nóng phân bố trải dài từ Ấn Độ qua Đông Nam Á, Philipin, từ Bắc tới Nam Úc, chúng sống đá, nơi có khí hậu nóng ẩm, độ cao 2000 m Ở Việt Nam có khoảng 5-6 loài hồ điệp rừng như: - Hồ điệp dẹt: (Phalaenopsis Coenu) Cây sống phụ, rễ lớn, thân, thuôn dài hình bầu dục Phát hoa dài 30cm, thẳng đứng, cánh SVTH: Nguyễn Hiền Nhơn Ngành Công nghệ Sinh học K2005 Đề án tốt nghiệp hoa màu xanh vàng, 6-12 chiếc, nở lâu tàn có hương thơm, cột nh màu vàng Cây mọc miền Trung, có dáng đẹp, gây trồng Đà Lạt Hoa nở vào đầu mùa thu - Hồ điệp ấn: (Phalaenopsis Mannii) Cây mảnh, dạng bầu thuôn, cong, màu xanh bóng Phát hoa dài, thường buông thòng xuống, hoa tập trung đỉnh, cánh màu vàng nghệ với vân màu đỏ Môi nhỏ màu trắng có vạch tím, hai thuỳ bên thuôn Cây mọc Trung Bộ, Đà Lạt Hoa nở vào mùa hè - Hồ điệp trung: (Phalaenopsis Parishii) Cây nhỏ hình trái xoan, màu xanh bóng, rụng vào mùa khô Phát hoa mọc thẳng đứng, mang 3-9 hoa đỉnh, màu vàng nhạt, môi hồng tươi, có hai vạch nâu Cây mọc đẹp, hoa đứng, màu sắc sặc sở nên gây trồng làm cảnh, trang trí phòng Hoa nở vào mùa xuân - Lan tiểu hồ điệp hay hồ điệp nhài: (Phalaenopsis Pulcherrima) Cây nhỏ, sống đất cát rừng chồi, rễ khoẻ mập, hình trái xoan Phát hoa nhỏ dài mang chùm hoa đỉnh, nở dần, có nhiều loại như: màu trắng, màu hồng, tím… Hoa nhỏ, cánh bầu dục, lưỡi có màu đậm hơn, họng màu tím Cây mọc miền Trung, Đồng Nai, Bình Châu…trồng tốt TP, Hồ Chí Minh Ra hoa vào mùa mưa 1.2.2 Phân loại thực vật SVTH: Nguyễn Hiền Nhơn Ngành Công nghệ Sinh học K2005 Đề án tốt nghiệp Giới Plantae Thực vật Ngành Magnoliophyta Ngọc Lan Lớp Liliopsida Phân lớp Hành Liliidae Hành Bộ Orchidales Lan Họ Orchidaceae Lan Chi Phalaenopsis Lan hồ điệp Loài Phalaenopsis amabilis 1.2.3 Sự hình thành nhóm Phalaenopsis Khoảng năm 1945, giới có tới 3500 loài Odontoglossum, 4300 loài Cattleya 5000 loài lan hài lai có khoảng 140 loài Phalaenopsis lai Sau 100 loài Phalaenopsis Doritaenopsis lai tạo đăng ký Các giống lai Phalaenopsis hình thành góp phần tăng thêm tính đa dạng huyền bí giới hoa Các loài lan hồ điệp phân chia thành hai nhóm chính: - Nhóm chuẩn “Moth orchids” có phát hoa dài phân nhánh (trên m) có hoa lớn (đường kính khoảng 12 cm) tròn, màu trắng, hồng sọc Nhóm chủ yếu lai tạo từ P amabilis (hoa trắng) P schilleriana (hoa hồng) - Nhóm hoa nhỏ có phát hoa ngắn, hoa nhỏ (đường kính khoảng cm), không tròn, dạng sáp nhiều màu sắc Nhóm lai từ nhiều loài Phalaenopsis hoa nhỏ P amboinensis, P lueddemanniana, P violacea Ban đầu, nhóm lan hồ điệp hoa nhỏ không ưa chuộng lan hồ điệp chuẩn Đầu thập niên 80, thị SVTH: Nguyễn Hiền Nhơn Ngành Công nghệ Sinh học K2005 Đề án tốt nghiệp hiếu người chơi hoa thay đổi nên nhóm lan hồ điệp hoa nhỏ ưa chuộng hơn, sản xuất rộng rãi lai tạo nhiều giống Các lai có màu sắc sặc sỡ mang hương thơm lai tạo từ P violacea hoa nhỏ mau tàn Đến cuối thập niên 80, người ta trọng đến việc nâng cao chất lượng hoa cách tuyển chọn loài có phẩm chất tốt để lai tạo, thuộc nhóm hoa nhỏ dần cân so với nhóm hồ điệp chuẩn Trong đó, nhóm hồ điệp chuẩn (màu hồng trắng) lai tạo sản xuất với chất lượng tốt đồng thời nhu cầu giống cao Sau đó, giống lai Phalaenopsis màu vàng có kích thước hoa với hoa trắng lớn xuất Hầu hết hoa vàng lai từ 20 năm trước đến chúng đạt chất lượng hoa tốt, lâu tàn Hiện nay, người ta tạo có hoa lớn với đường kính hoa khoảng 10 cm cách lai P deventeriana với lai màu vàng khác Lan hồ điệp hoa vàng tiếp tục tập trung lai tạo sau thời gian dài tạo có chất lượng cao Loài P venosa ý nhờ có hoa màu nâu nhạt hương thơm ngào ngạt Ngoài ra, số giống lai tạo từ P venosa P Mishima Charm P Hausermann’s Gold Cup cho hoa màu vàng ươm Những hoa màu vàng, nhỏ P Orchid World P Michael Crocker lai tạo nhiều hoa lớn lâu tàn Một nhóm Phalaenopsis lai hình thành gọi “Hoàng Hôn” hay “Màu sa mạc” Nhóm tạo thành nhờ lai P venosa P amboinensis với P schilleriana SVTH: Nguyễn Hiền Nhơn Ngành Công nghệ Sinh học K2005 Đề án tốt nghiệp Hoa giống (màu hồng nhạt đến hồng cam cam sẫm) có hình dạng kích thước tương tự hoa P schilleriana Một số giống đặc trưng cho nhóm P Pago Pago (venosa x Lippegiut) Nhóm hồ điệp tạo nhiều phát hoa phổ biến Trung Mỹ gồm loài P equestris P stuartiana Mặc dù kích thước hoa khoảng – cm có nhiều phát hoa, phát hoa mang số lượng lớn hoa hoa nở sớm so với loài hồ điệp khác nên giống ưa chuộng thị trường Hoa có màu từ trắng đến hồng sáng, sọc trắng viền trắng Nhiều giống lai sử dụng ngành công nghiệp hoa cắt cành tạo hoa quanh năm thời gian ngắn với giá thành thấp Mặc dù hoa cắt cành mau tàn hoa trồng chậu chất lượng hoa đạt tiêu chuẩn định Một số giống tạo lai Phalaenopsis với chi khác, đặc biệt Doritis Các giống Doritis có hoa màu sáng số lượng hoa nhiều, lai với Phalaenopsis tạo giống Doritaenopsis có hình dạng hoa tương tự Phalaenopsis Khi lai Phalaenopsis với Vanda alliance tạo số giống Asconopsis Irene Dobkin (P Doris x Ascocentrum miniatum) 1.2.4 Đặc điểm thực vật 1.2.4.1 Cơ quan dinh dưỡng a) Thân Lan hồ điệp thuộc loại lan đơn thân, thân ngắn giả hành, bao bọc hai màng bẹ xếp dọc chiều dài thân tạo đỉnh sinh trưởng hoạt động liên tục, thời kỳ nghỉ rõ ràng Lan SVTH: Nguyễn Hiền Nhơn Ngành Công nghệ Sinh học K2005 Đề án tốt nghiệp sinh trưởng chậm, thân điều kiện thuận lợi lại mọc theo phương thẳng đứng, cành hoa mọc rìa thân nảy từ nách Lá mọc xếp thành hai hàng xen kẽ với Theo sinh trưởng cây, già gốc héo rụng Thân lan hồ điệp tác dụng giữ cho đứng thẳng, có chức tích trữ chất dinh dưỡng nước b) Lá Lá lan hồ điệp to, dầy, đầy đặn, mọc đối xứng không cuống có bẹ ôm lấy thân Hình dạng đơn giản (elip thuôn hình lưỡi mác) với màu xanh đơn mặt xanh mặt rìa có màu tím Một có từ 3-15 lá, có 4-5 tăng trưởng kích thướt Căn vào màu sắc phân biệt màu sắc hoa nó, màu xanh thường hoa màu trắng hoa nhạt màu, màu khác thường cho hoa màu đỏ Trong nách có chồi phụ, chồi phụ to gọi chồi hoa sơ cấp, bên chồi dinh dưỡng sơ cấp Các chồi sơ cấp sinh trưởng đến mức độ định vào giai đoạn nghỉ Thông thường bề mặt khí khổng, có mặt có khí khổng Lan hồ điệp loài thực vật CAM, nên khí khổng mở vào ban đêm để thu nhận CO2 tạo axit Malic dự trữ thể, vào ban ngày, CO2 giải phóng tham gia vào trình quang hợp Do ban ngày bị nước, thóat nước Điều kiện không cung cấp nước đầy đủ thường xuyên có lợi Khi đủ nước khí khổng mở vào ban SVTH: Nguyễn Hiền Nhơn Ngành Công nghệ Sinh học K2005 10 Đề án tốt nghiệp - Xác định số PLB tạo thành chồi: cách đếm số chồi tạo thành cấy chuyền PLB - Xác định số rễ hình thành: cách đếm số rễ tạo thành cấy chuyền - Quan sát đặc điểm hình thái PLB: quan sát màu sắc phát triển PLB - Quan sát khả tiết phenol PLB môi trường nuôi cấy: Quan sát màu môi trường nuôi cấy 2.3.2 Thí nghiệm Khảo sát môi trường tạo chồi từ PLB lan hồ điệp Phalaenopsis amabilis Yubidan Mục đích: Nhằm xác định môi trường nuôi cấy thích hợp dùng tạo chồi từ PLB hồ điệp Phalaenopsis amabilis Yubidan 2.3.2.1 Cách bố trí thí nghiệm Thí nghiệm bố trí với công thức môi trường nhân PLB khác (bảng 2.3) Các môi trường thí nghiệm tạo chồi từ PLB kế thừa có chọn lọc từ kết nghiên cứu nước nước ngoài: K.P Martin (2005); Dương Thị Loan Anh 2005); Cung Hoàng Phi Phượng (2007); Walter Preil Tino Hempfling ( 2002) Bảng 2.3 Các công thức môi trường thí nghiệm nhân PLB STT Kí hiệu C2 C3 Thành phần môi trường MS (1/2) + Kinetin (1.5mg/l) + Agar (8g/l) MS + BA (2mg/l) + NAA (0.5mg/l) + PVP (100mg/l) + ND (10) + Sucrose (30g/l) + agar C4 (8g/l) MS (1/2) + Pepton (1 g/l) + Sucrose (30g/l) + SVTH: Nguyễn Hiền Nhơn Ngành Công nghệ Sinh học K2005 69 Đề án tốt nghiệp TDZ (05mg/l) + Agar (8g/l) MS(1/2) + PVP (0.5g/l) + Pepton (2g/l) + DCKT C5 (30g/l) + ND (15%) + Sucrose (30g/l) + Than (1g/l) + Agar (8g/l) Ghi chuù: - MS1/2 = MS giảm ½ khoáng đa lượng, vi lương vitamin giữ nguyên - 1/2MS = MS giảm ½ (khoáng đa lượng, khoáng vi lượng vitamin) - BA :6-benzyl adenin - NAA :-naphthalene acetic acid - PVP :Polyvinylpyrrolidone - TDZ :Tidiazuron - ND :Nước dừa - DCKT: Dịch chiết khoai tây Thí nghiệm bố trí theo kiểu khối đầy đủ, ngẫu nhiên hoàn toàn, gồm lần lặp lại Các nghiệm thức đặt giàn nuôi cấy với cường độ ánh sáng 1800lux 2.3.2.2 Cách thức thực Tách PLB (PLB tạo từ mảnh in vitro, giống lan hồ điệp Phalaenopsis amabilis Yubidan phòng CNSH - Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam) từ cụm PLB, cân 1g PLB khoẻ mạnh vào bình 250ml chứa 40ml môi trường Thời gian nuôi cấy: tuần Theo dõi ghi nhận kết tuần/lần gồm tiêu theo dõi sau: - Thời gian hình thành chồi môi trường SVTH: Nguyễn Hiền Nhơn Ngành Công nghệ Sinh học K2005 70 Đề án tốt nghiệp - Xác định số chồi hình thành/ bình nuôi cấy: cách đếm số chồi tạo thành từ PLB sau lần cấy chuyền - Xác định tỷ lệ (%) số PLB sống tỷ lệ (%) số PLB chết: cách cân khối lượng số PLB chết số PLB sống sau lần cấy chuyền - Cân khối lượng tươi chồi/ bình sau tuần nuôi cấy: Sử dụng cân phân tích khử trùng cồn 96 độ để cân chồi, cấy chuyền, chồi để giấy hấp vô trùng - Xác định số chồi tạo rễ va số rễ/ bình: cách đếm số rễ chồi cấy chuyền - Quan sát màu sắc phát triển chồi - Xác định chiều cao chồi: cách cấy chuyền tiến hành đo chiều cao chồi sau tuần nuôi cấy - Xác định số hình thành/chồi: đếm số chồi sau tuần nuôi cấy 2.4 Xử lý số liệu Kết thí nghiệm xử lý theo phng pháp phân tích phương sai theo bảng Anova, so sánh xếp hạng kết theo phương pháp Duncan Sử dụng phần mềm thống kê MSTATC SVTH: Nguyễn Hiền Nhơn Ngành Công nghệ Sinh học K2005 71 Đề án tốt nghiệp CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thí nghiệm 1: Thí nghiệm xác định môi trường thích hợp nhân PLB lan hồ điệp Phalaenopsis amabilis Yubidan Các PLB tạo từ mảnh in vitro, giống lan hồ điệp Phalaenopsis amabilis Yubidan phòng CNSH Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam Sau tiến hành nuôi cấy môi trường, PLB bắt đầu tăng sinh Sau tuần nuôi cấy, tiêu đánh giá trọng lượng tươi, màu sắc, phát triển PLB trình bày bảng 3.1 SVTH: Nguyễn Hiền Nhơn Ngành Công nghệ Sinh học K2005 72 Đề án tốt nghiệp Bảng 3.1: Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến tăng sinh PLB lan hồ điệp Phalaenopsis amabilis Yubidan STT Kí hiệu Môi trường B2 Khối lượng PLB (mg) Tuần Tuần Tuần 750,0b 966,7b 2400c Đặc điểm PLB sau tuần nuôi cấy PLB khoẻ, màu vàng nhạt xanh thẫm, B3 866,7b 1017,0 b B4 B5 B6 Cv (%) LSD(0.05) 783,3b 850,0b 2583, lông Đường kính từ 1-1.5mm PLB khoẻ, màu vàng nhạt, 0bc có lông Một số PLB tạo 1933, chồi Đường kính từ 1-1.5mm PLB yếu, màu xanh đậm, có 0d 2733, lông Đường kính 1mm PLB khoẻ, màu vàng nhạt 1267,0 1750,0 a a 0ab 1250,0 1800,0 2933, Đường kính từ 1-1.5mm PLB khoẻ, màu xanh đậm, a a 11.95 0.1407 15.76 0.2378 0a 9.69 0.288 xanh thẫm, có lông có lông Đường kính 2mm Ghi chú: Các chữ giống cột khác biệt ý nghóa mặt thống kê với P = 0.05 Khối lượng PLB mẫu ban đầu 600mg/bình Thảo luận Kết bảng 3.1 cho thấy ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến gia tăng khối lượng PLB rõ rệt Các môi trường nuôi cấy khác tăng trọng PLB khác Đặc biệt môi trường B5 môi trường B6, sau tuần nuôi cấy, PLB nuôi hai môi trường thể gia tăng khối lượng cách rõ rệt Cụ thể khối lượng PLB hai SVTH: Nguyễn Hiền Nhơn Ngành Công nghệ Sinh học K2005 73 Đề án tốt nghiệp môi trường tăng từ 650 - 667mg, tăng gấp lần so với khối PLB lượng ban đầu Cũng thời gian nuôi cấy này, khối lượng PLB môi trường khác tăng từ 150 - 267mg Khối lượng PLB môi trường B5 B6 tiếp tục tăng nhanh ổn định giai đoạn sau tuần tuần nuôi cấy Tại thời điểm tuần sau nuôi PLB môi trường B5 B6 tăng từ 2133 – 2333mg, tăng gấp gần lần so với khối lượng PLB ban đầu Trong môi trường khác khối lượng PLB tăng gấp 2-3 lần so với khối lượng ban đầu Kết quan sát đặc tính PLB (bảng 3.1) cho thấy PLB môi trường B5 B6 phát triển bình thường, không thấy xuất biến dị bất thường PLB Đặc biệt môi trường B6 có kích thước PLB lớn 2mm, PLB khoẻ, màu xanh thẫm Kết biểu 3.1 cho thấy, môi trường nuôi cấy, tăng sinh PLB giai đoạn khác khác Sự gia tăng khối lượng tập trung mạnh giai đoạn tuần sau cấy Khối lượng PLB môi trường B2, B3 B4 tăng gấp đôi so với giai đoạn tuần Riêng môi trường B5 B6 gia tăng khối lượng PLB tương đối đồng ổn định giai đoạn SVTH: Nguyễn Hiền Nhơn Ngành Công nghệ Sinh học K2005 74 Đề án tốt nghiệp Sự tăng sinh PLB không ổn định môi trường nuôi cấy dược giải thích kết thu biểu 3.2 Kết biểu 3.2 cho thấy môi trường B2, B3 B4 tỉ lệ PLB bị chết nhiều sau tuần nuôi cấy Đặc biệt môi trường B2 có tỉ lệ PLB chết tới 46,7% sau tới môi trường B3 18,3% Sau tuần nuôi cấy, PLB lại môi trường bắt đầu thích nghi bắt đầu tăng trưởng tiếp diễn giai đoạn sau Ngược lại, môi trường B5 B6 PLB sau tuần nuôi cấy sống hoàn toàn, tồn phát triển đồng giai đoạn sau Kết thí nghiệm cho thấy vai trò BA NAA quan trọng hình thành tăng trưởng PLB lan hồ điệp Kết trùng với kết So young Park (2001); Dương Tấn Nhựt cộng (2002); Dương Thị Loan Anh (2005) Cung Hoàng Phi Phượng (2007) Tuy nhiên môi trường B2 tỉ lệ PLB chết nhiều sau tuần nuôi cấy hàm lượng BA cao (20mg/l) Kết trái ngược với So young Park (2001) SVTH: Nguyễn Hiền Nhơn Ngành Công nghệ Sinh học K2005 75 Đề án tốt nghiệp thực hai giống lan hồ điệp khác tuổi PLB đưa vào nuôi cấy khác Đối với môi trường B3 tỉ lệ PLB chết nhiều sau tuần nuôi cấy hệ số nhân thấp So với kết Dương Tấn Nhựt cộng (2002) không trùng Dương Tấn Nhựt cộng (2002) thực môi trường lỏng hệ thống Bioreactor Môi trường B3, PLB chết hệ số nhân thấp nhất, điều trái ngược với kết Dương Thị Loan Anh (2005), thực hai giống lan hồ điệp khác tuổi PLB đưa vào nuôi cấy khác Môi trường B5, PLB thích nghi tăng sinh tốt, hệ số nhân cao Kết trùng với Cung Hoàng Phi Phượng (2007), thực môi trường lỏng hệ thống ngập tạm thời Môi trường B6 nồng độ khoáng, BA, NAA thấp PLB thích nghi tăng sinh tốt 3.2 Thí nghiệm 2: Thí nghiệm xác định môi trường thích hợp tạo chồi từ PLB lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis Yubidan Tái tạo chồi từ PLB cung đoạn quan trọng qui trình sản xuất giống in vitro trồng nói chung hoa lan nói riêng Chồi không ảnh hưởng trực tiếp đến sản lượng giống mà ảnh hưởng đến chất lượng giống chất lượng hoa sản phẩm Số lượng chồi tạo từ PLB nhiều hay ít, chất lượng chồi tạo thành đạt tiêu chuẩn hay không phụ thuộc hoàn toàn vào môi trường nuôi cấy Đề tài thực với công thức môi trường tạo chồi (bảng 2.3), thực PLB lan hồ điệp Phalaenopsis amabilis Yubidan, tạo từ SVTH: Nguyễn Hiền Nhơn Ngành Công nghệ Sinh học K2005 76 Đề án tốt nghiệp mảnh in vitro phòng CNSH - Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam Sau tuần nuôi cấy số chồi tạo thành thể bảng 3.2 Bảng 3.2: Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến hình thành chồi từ PLB lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis Yubidan ST Kí Số chồi tạo thành Đặc T hiệu sau tuần nuôi C2 Tuần 10.00 Tuần 17.67 Tuần 27.00 Tuần 47.50 cấy Chồi khoẻ, phát a a a a triển tốt, đều, không C3 C4 C5 6.50b 6.00 0.00 b c 12.67 26.50 40.75 b a a 21.00 39.50 b a a 0.00 0.00 c 0.00 chồi đồng tạo PLB Chồi khoẻ, phát triển tốt, có PLB 10.00 c điểm tạo thành Chồi khoẻ, phát triển tốt, có PLB c tạo thành Không tạo chồi, PLB màu xanh, tăng sinh mạnh Cv (%) 29.37 32.97 27.14 26.07 LSD (0.05) 1.96 4.03 6.12 10.45 Ghi chú: Các chữ giống cột khác biệt ý nghóa mặt thống kê với P= 0.05 Khối lượng PLB mẫu ban đầu 600mg/bình Thảo luận SVTH: Nguyễn Hiền Nhơn Ngành Công nghệ Sinh học K2005 77 Đề án tốt nghiệp Kết bảng 3.2 cho thấy ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến trình tạo chồi từ PLB rõ rệt Các môi trường nuôi cấy khác tạo chồi từ PLB khác Đặc biệt môi trường B2 sau tuần nuôi cấy, PLB nuôi môi trường bắt đầu tạo chồi Sau tuần nuôi cấy môi trường B2 có 10 chồi hình thành, trong thời gian, PLB môi trường khác tăng sinh không tạo chồi tạo chồi Từ giai đoạn tuần, tuần tuần nuôi cấy, môi trường B2, PLB tiếp tục tái tạo chồi, số chồi tạo thành phát triển đồng ổn định qua giai đoạn nuôi cấy Các môi trường khác, sau tuần nuôi cấy, số chồi tạo thành thấp tương đương nhau, khác biệt rõ rệt Tuy nhiên, riêng môi trường C5 sau tuần nuôi cấy, PLB không tạo chồi mà tăng sinh PLB Kết quan sát đặc điểm chồi (bảng 3.2) cho thấy chồi môi trường phát triển bình thường Đối với hai môi trường C3 C4, PLB vừa tăng sinh vừa tạo chồi, môi trường C2 tạo chồi SVTH: Nguyễn Hiền Nhơn Ngành Công nghệ Sinh học K2005 78 Đề án tốt nghiệp Kết biểu 3.3 cho thấy, môi trường nuôi cấy chồi tạo thành ổn định qua giai đoạn nuôi cấy Số chồi tạo thành tập trung chủ yếu giai đoạn tuần sau cấy, đặc biệt môi tường C2 Môi trường việc tạo Trong chồi tạo thành từ PLB môi trường C2 có chất lượng tốt so với môi trường lại Điều giải thích bảng 3.3 Bảng 3.3: Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến số đặc tính sinh học chồi lan hồ điệp Phalaenopsis amabilis Yubidan STT Kí hiệu Môi trường C2 Đặc tính chồi (*) Khối lượng Số Số rễ (g) 74.00 (lá) a SVTH: Nguyễn Hiền Nhơn Ngành Công nghệ Sinh học K2005 79 13.75 (rễ) a 4.5 a Đề án tốt nghiệp STT Kí hiệu C3 Moâi C4 C5 Cv (%) LSD (0.05) Đặc tính chồi 52.00 c 11.25 b 65.75 b 12.00 ab d 0.00 0.00 c 9.61 15.13 7.099 2.156 (*) 6.0 a 1.5 b 0.0 b 49.07 2.268 Ghi chú: Các chữ giống cột khác biệt ý nghóa mặt thống kê với P= 0.05 (*) Xác định 10 chồi Khối lượng PLBs mẫu ban đầu 1g/bình Kết bảng 3.3 cho thấy, khối lượng chồi tạo từ PLB môi trường C2 cao khối lượng chồi tạo từ PLB môi trường lại Cụ thể khối lượng 10 chồi môi trường C2 74g đó, khối lượng 10 chồi môi trường C3 52g môi trường C4 65.75g Ngoài ra, dựa vào đặc điểm chồi tạo thành ghi nhận bảng 3.2 cho thấy Đối với môi trường C2, sau tuần nuôi cấy, PLB sau tạo thành chồi, chồi tiếp tục phát triển mạnh Đối với môi trường C3 C4, PLB tạo chồi chậm đồng thời PLB vừa tạo chồi, vừa tăng sinh Kết thí nghiệm cho thấy, Cytokinin có vai trò quan trọng hình thành phát triển chồi lan hồ điệp Kết qua trùng với kết K.P Martin (2005); Dương Thị Loan Anh 2005); Walter Preil Tino Hempfling ( 2002) Trong môi trường C2 tạo chồi tốt nhất, điều trùng với kết K.P Martin (2005) Nguyên nhân là: môi trường C2 có Kinetin chất thuộc nhóm Cytokinin có khả SVTH: Nguyễn Hiền Nhơn Ngành Công nghệ Sinh học K2005 80 Đề án tốt nghiệp kích thích chồi tạo thaønh (Wickson vaø Thimann, 1958), (Skoog vaø Miller, 1972) Tuy nhiên môi trường C5, PLB không tạo chồi điều trái ngược với kết nghiên cứu Cung Hoàng Phi Phượng (2007), điều thực giống khác tuổi PLB khác Như qua kết thí nghiệm, môi trường C2 thích hợp cho việc tạo chồi từ PLB so với môi trường lại CHƯƠNG SVTH: Nguyễn Hiền Nhơn Ngành Công nghệ Sinh học K2005 81 Đề án tốt nghiệp KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Môi trường nhân PLB thích hợp cho giống lan hồ điệp lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis Yubidan môi trường B5 (MS ½ bổ sung: 4mg/l BA, 1mg/l NAA, 1g/l PVP, 1g/l pepton, 30g/l Sucrose, 15% ND) môi trường B6 (1/2 MS bổ sung: 2mg/l BA, 0,5mg/l NAA, 10g/l sucrose, 20% ND Các môi trøng có khả tái sinh PLB cao, chất lượng PLB tốt Môi trường tạo chồi từ PLB thích hợp cho giống lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis Yubidan môi trường C2 (MS bổ sung: 1.5mg/l Kinetin) Môi trường cho tỉ lệ tạo chồi cao, chất lượng chồi tốt (chồi khỏe, đồng đều) ĐỀ NGHỊ Nghiên cứu giai đoạn tạo giống sản phẩm PLB chồi đề tài để đánh giá chất lượng hoàn thiện quy trình sản xuất giống Nghiên cứu môi trường B5 B6 với giống lan khác để có đánh giá rộng cho kết đề tài SVTH: Nguyễn Hiền Nhơn Ngành Công nghệ Sinh học K2005 82 Đề án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Hiền Nhơn Ngành Công nghệ Sinh học K2005 83 ... tài nghiên cứu môi trường nhân PLB (protocorm like body) môi trường tạo chồi từ PLB giống lan hồ điệp Phalaenopsis amabilis Yubidan Mục đích xác định môi trường thích hợp sử dụng nhân PLB tạo chồi. .. xuất giống? ?? Mục đích xác định môi trường nhân PLB môi trường tạo chồi từ PLB thích hợp cho giống lan hồ điệp Phalaenopsis amabilis Yubidan, làm sở để thiết lập quy trình sản xuất giống lan hồ... nội dung đề tài ? ?Nghiên cứu xác định môi trường thích hợp nhân PLB tạo chồi từ PLB giống SVTH: Nguyễn Hiền Nhơn Ngành Công nghệ Sinh học K2005 Đề án tốt nghiệp lan Phalaenopsis amabilis Yubidan