Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân dạng lỏng

Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân dạng lỏng Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân dạng lỏng Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân dạng lỏng luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp

Đồ án tốt nghiệp PHẦN MỞ ĐẦU Tính cấp thiết cùa đề tài Trong sản xuất nông nghiệp Việt Nam, phân bón đóng vai trị quan trọng việc tăng suất trồng Tuy nhiên tình hình nay, để đáp ứng nhu cầu suất, lượng lớn phân hoá học sử dụng, gây tác động tiêu cực đến môi trường đất, khơng mà cịn ảnh hưởng đến mơi trường nước, vi sinh vật người Lân (phốt pho) yếu tố cần thiết tăng trưởng suất trồng Đóng vai trò quan trọng nhiều hoạt động sinh lý phân chia tế bào, quang hợp phát triển hệ thống rễ tốt (J Microbiol, 2011) Tuy nhiên hợp chất chứa lân đất sử dụng Điển hình đất bazan nâu đỏ Tây Nguyên có hàm lượng lân tổng số đạt 0,02%, lượng lân mà sử dụng 4,12mg/100g đất (Đoàn Triệu Nhạn, 1999) Vì vậy, để nâng cao suất trồng nhà nơng sử dụng loại phân lân hố học để bón cho cây, khoảng 2/3 phân lân hố học bón vào đất bị kết tủa dạng khó tan trồng không hấp thụ nguyên tố sắt, nhơm hợp chất canxi có đất (Gyaneshwar cộng sự, 2002; Turan cộng sự, 2006) Điều khiến cho đất trồng ngày chai cứng, thiếu màu mỡ Mặt khác lượng phân lân lại đất bị rửa trơi thấm vào mạch nước ngầm gây ô nhiễm môi trường nước Để khắc phục tình trạng trên, Việt Nam nói riêng nước giới Ấn Độ, Nhật Bản… tập trung nghiên cứu phân bón theo hướng thân thiện với người môi trường, chi phí thấp, đồng thời cải thiện mơi trường đất chai cứng sử dụng phân hố học trước Một số báo cáo khoa học cho thấy số loài vi khuẩn khác có khả hồ tan hợp chất phốt vô chẳng hạn tricalcium phosphate, dicalcium phosphate, hydroxyapatite Sự xuất vi khuẩn hoà tan phốt tập trung cao vùng rễ, mật độ phụ thuộc vào tính chất đất (J Microbiol, 2011) Đồ án tốt nghiệp Dựa sở đó, phân lân vi sinh tập trung nghiên cứu làm giải pháp thay cho phân lân hoá học Phân lân vi sinh sản phẩm chứa hay nhiều chủng vi sinh vật sống tuyển chọn với mật độ theo tiêu chuẩn hành có khả chuyển hố hợp chất phốt khó tan thành dạng dễ tan mà trồng sử dụng Phân lân vi sinh giải pháp bền vững, an tồn cho hướng tới nơng nghiệp Trong thực tế, doanh nghiệp sản xuất phân bón vi sinh hai dạng rắn lỏng Đối với phân bón vi sinh dạng rắn có hạn chế định thời gian bảo quản ngắn, tác dụng chậm, nhiều hội bị tạp nhiễm, khả sống VSV điều kiện khắc nghiệt kém, chi phí vận chuyển cao…(Viveganandan Jauhri, 2000) Trong bối cảnh đó, phân bón vi sinh dạng lỏng có tầm quan trọng trở nên phổ biến với thời gian sử dụng lâu từ 12 – 24 tháng, dễ tương tác với trồng, không gây ô nhiễm, mật độ VSV hữu ích cao, bảo vệ tốt tế bào khỏi yếu tốt bất lợi từ môi trường… (Sridhar cộng sự, 2004) Xuất phát từ vấn đề trên, đề tài: “Nghiên cứu qui trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân dạng lỏng” tiến hành nhằm tuyển chọn vi sinh vật có khả phân giải lân tốt, từ nghiên cứu thiết lập qui trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân dạng lỏng Nội dung nghiên cứu Tuyển chọn chủng vi sinh vật chủng vi sinh vật phối hợp có khả phân giải lân khó tan tốt nhất, đồng thời có khả sinh tổng hợp chất dinh dưỡng, chất kích thích tăng trưởng trồng để ứng dụng vào sản xuất chế phẩm Xác định môi trường lên men điều kiện ni cấy phù hợp với vi sinh vật Xác định chất ổn định chế phẩm phù hợp với vi sinh vật tạo chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân dạng lỏng Thiết lập qui trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân Đồ án tốt nghiệp Ý nghĩa khoa học Thiết lập qui trình sản xuất chế phẩm phân lân vi sinh dạng lỏng Ý nghĩa thực tiễn Thành cơng đề tài góp phần vào việc sản xuất ứng dụng chế phẩm vi sinh vật phân giải lân khó tan sản xuất nông – lâm nghiệp, vừa phân giải tốt lân khó tan đất vừa có khả sinh tổng hợp chất dinh dưỡng chất kích thích tăng trưởng trồng Cải thiện môi trường đất nông nghiệp xuống cấp Việt Nam Đồng thời đóng góp vào nghiên cứu chế phẩm vi sinh dạng lỏng cịn biết đến Việt Nam Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Các dạng lân đất Lân chất dinh dưỡng thiết yếu cho tăng trưởng trồng, không cung cấp đủ lân, sinh trưởng, phát triển chậm, giảm suất (Sawyer Creswell, 2000) Tuy nhiên, hiệu suất sử dụng lân trồng không 25%, phần lớn lân dễ tan đất bị cố định dạng trồng khó hấp thụ, chiếm tới 95 – 99% tổng lượng lân có đất Thành phần lân dễ tan khó tan đất định tính chất đá mẹ, thành phần giới hàm lượng chất hữu Hoạt động cation kim loại (Ca, Fe, Mg…) hợp chất oxide kim loại đất làm lân dễ tan bị cố định Theo Sharpley (2006), hàm lượng lân trung bình nhiều loại đất thường từ 0,02 – 0,08 % Do q trình tích luỹ sinh học, hàm lượng lân lớp đất mặt cao lớp Quá trình phân giải xác bã động thực vật cung cấp cho đất nguồn lân quan trọng Trong tự nhiên nói chung đất nói riêng, lân tồn hai hình thức: vơ hữu (Sharpley, 2006) 1.1.1 Lân vô Lân vô tồn dạng muối phosphate nguyên tố Ca, Fe, Al, Mg… Ở đất trung tính đất kiềm phosphate caxi chủ yếu, cịn đất chua phosphate sắt nhôm chủ yếu Phosphate canxi dễ huy động để làm thức ăn cho phosphate sắt phosphate nhôm Sự tồn ion phosphate môi trường đất bị chi phối ion phosphate bị chuyển đổi hoá trị (Võ Thị Lài, 2006) Có thể phân loại lân vơ theo tính tan sau: - Lân vơ khó tan (Ca3(PO4)2, AlPO4, FePO4, …): muối phosphate khó tan nước, hấp thụ - Lân vô dễ tan (Na2HPO4, K2HPO4, MgHPO4, …): trồng dễ dàng sử dụng loại muối phosphate Đồ án tốt nghiệp Trong thực tế H2PO4- dạng trồng dễ hấp thu nhất, dạng phosphate lại thường dạng khó hồ tan, muốn trồng sử dụng phải qua trình biến đổi thành dạng dễ tan (Võ Thị Lài, 2006) Trong trình vi sinh vật giữ vai trò quan trọng 1.1.2 Lân hữu Lân hữu đất chủ yếu có mùn, đất giàu mùn giàu lân hữu Tuỳ loại đất lân hữu thường chiếm 20 – 80% lân tổng số (Trần Long Tấu, 2009) Trong lân hữu đất dạng phổ biến fytat, chiếm đến 50% tổng số lân hữu Khi có tham gia vi sinh vật phân giải lân, hợp chất hữu khống hố giải phóng lân vơ hay lân hữu cơ, nguồn cung cấp dinh dưỡng cho trồng Có 70 – 80 tập đồn vi sinh vật tham gia vào trình phân giải lân (Võ Thị Lài, 2006) 1.1.3 Vịng tuần hồn Động vật Cây xanh Ion PO4-3 dung dịch đất Ion PO4-3 bị hấp thụ Q trình khống Hồ tan Q trình cố định Phốt vô Cố định tạm thời Chất hữu tươi tế bào sinh vật Chất hữu mùn hố Hình 1.1 Vịng tuần hồn lân tự nhiên Đồ án tốt nghiệp Lân tự nhiên ln tuần hồn chuyển hố (Hình 1.1), nhờ vi sinh vật lân hữu vơ hố thành dạng muối acid phosphoric Các dạng phần trồng sử dụng biến thành lân hữu cơ, phần bị cố định dạng khó tan Trong trình vi sinh vật giữ vai trị quan trọng Trong tự nhiên, lân tham gia vào trình chuyển đổi vật chất đường hóa học sinh học Sự xuất hiện, tồn chuyển hóa lân tự nhiên diễn theo q trình sau: Khống hóa: Là q trình chuyển hóa lân dạng hữu thành lân dạng vô Cố định sinh học (Immobilization): Là trình tái sử dụng lân vơ nhờ VSV qua chuyển đổi lân vô thành lân hữu protoplasm VSV Cố định hóa học (Fixation): Là q trình chuyển đổi lân dạng tan sang dạng khó tan tác dụng phản ứng hóa học ion PO43- cation kim loại 1.1.4 Vai trò lân trồng Phốt yếu tố quan trọng nông nghiệp nay, nằm nhóm ba ngun tố đa lượng trồng (N, P, K) Tầm quan trọng phốt sản lượng mùa vụ minh hoạ tổng lượng phân lân sử dụng suốt 35 năm gần đây, ổn định khoảng 20 triệu tấn/năm 10 năm gần Phốt có nhiều chức quan trọng thực vật, chức lưu trữ vận chuyển lượng thực vật Adenosine diphosphate (ADP) adenosine triphosphate (ATP) hợp chất phốt lượng cao, điều khiển hầu hết tiến trình thực vật bao gồm quang hợp, hô hấp, tổng hợp acid nucleic protein vận chuyển dinh dưỡng thông qua tế bào thực vật Ngồi cịn đẩy mạnh phát triển rễ, tăng khả hấp thu nước khoáng chất Thúc đẩy trình sinh nhánh, nảy chồi cho hoa tạo sớm (Lê Văn Căn, 1968) 1.2 Tổng quan vi sinh vật phân giải lân VSV phân giải lân - VSV chuyển hóa lân (Phosphate Solubilizing Microorganisms - PSM) hay gọi VSV huy động lân (Phosphate Đồ án tốt nghiệp mobilizing Microorganisms) VSV có khả chuyển hố hợp chất phốt khó tan thành dạng dễ tiêu cho trồng sử dụng Các VSV phân giải hợp chất phốt khó tan biết đến gồm vi khuẩn, nấm mốc nấm men VSV phân giải lân khơng VSV chuyển hố photphate vơ cơ, mà bao gồm VSV có khả khống hóa hợp chất lân hữu tạo nguồn lân dễ tiêu cung cấp cho đất trồng (Vũ Thuý Nga, 2003) VSV phân giải lân chia làm nhóm: nhóm VSV phân giải lân vơ nhóm VSV phân giải lân hữu 1.2.1 VSV phân giải lân hữu Như ta biết, lân hữu nguồn dự trữ lân đất đáng kể cho phát triển thực vật Tuy nhiên, để thực vật sử dụng nguồn lân hữu cần phải vơ hóa (khống hóa) dạng dễ tan Q trình khống hóa hầu hết hợp chất lân hữu thực nhờ hệ enzyme phosphatase vi sinh vật đất Càng gần vùng rễ hoạt động vi sinh vật phân giải lân hữu mạnh mẽ (Tarafdar Junk, 1987) Rõ ràng, tồn hệ vi sinh vật vùng rễ góp phần đáng kể tăng lượng lân khả dụng cho trồng (Garcia cộng sự, 1992; Xu Johnson, 1995) VSV phân giải lân hữu chủ yếu gồm chủng Bacillus (Skrary Cameron, 1998) Pseudomonas (Gügi cộng sự, 1991), ngồi cịn số xạ khuẩn nấm khác Đáng ý B.megaterium var phosphatsum có khả phân giải lân hữu cao Đồng thời B megaterium cịn có khả hình thành bào tử nên sức sống mạnh (Nguyễn Hữu Hiệp, 2009) Qua nghiên cứu hoạt động phân giải lân hữu enzyme phosphatase khác vùng rễ ngô, lúa mạch, lúa mì, Burn (1983) nhận thấy hoạt tính phosphatase mạnh đất chua đến trung tính Tất nghiên cứu khẳng định vi khuẩn đất có vai trị quan trọng việc cung cấp lân khả dụng cho trồng từ nguồn lân vơ hữu sẵn có đất mà trồng không sử dụng 1.2.2 VSV phân giải lân vô Đồ án tốt nghiệp Nhiều vi khuẩn B.megaterium, B.mycoides, B.butyricus, Pseudomonas fluorescens, vi khuẩn nitrat hóa, số vi khuẩn hệ rễ, xạ khuẩn có khả phân giải Ca3(PO4)2 bột apatit Khả phân giải lân vơ có liên quan mật thiết tới sản sinh acid vi sinh vật Quá trình lên men tạo acid carbonic, acid chủ yếu thúc đẩy q trình hịa tan lân vô Ca3(PO4)2 + H2CO3 + H2O  Ca(PO4)2H2O + Ca(HCO3)2 Trong đất vi khuẩn nitrat hóa vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh có tác dụng việc phân giải Ca3(PO4)2 Vì trình sống vi khuẩn tích lũy HNO3 H2SO4 đất 1.2.3 Khả kích thích phát triển trồng VSV phân giải lân Trong tự nhiên tồn số lượng lớn vi khuẩn mà đa phần vi khuẩn liên quan đến rễ cây, có tác dụng kích thích tăng trưởng trồng Nhóm vi khuẩn gọi PGPB (plant growth promoting bacteria) Theo Ahmed Shahab (2011), PGPB sử dụng trực tiếp gián tiếp nhiều chế để cải thiện mức độ tăng trưởng sức khoẻ trồng Những chế hoạt động đồng thời hoạt động giai đoạn khác phát triển thực vật Chúng bao gồm: - Hoà tan lân - Cố định đạm - Kiểm soát tác nhân gây bệnh trồng - Tăng cường hấp thu chất dinh dưỡng cần thiết khác - Sản xuất phytohormone acid indole-3-acetic acid butyric indol Trong số vi khuẩn phân giải lân khó tan (PSB) sử dụng phân bón sinh học thương mại để cải thiện tình trạng nơng nghiệp (Subba-Rao, 1993; Rodríguez Fraga, 1999) Nhóm vi khuẩn phân giải lân coi phân bón sinh học có triển vọng nhiều loại đất giàu lân tổng số lại thiếu hụt trầm trọng lân dễ tan cung cấp cho trồng Tác động có lợi vi khuẩn phân giải lân nhiều tác giả mô tả (Antoun cộng sự, 1998; Chabot cộng sự, 1998; Pal, 1998; Peix cộng sự, Đồ án tốt nghiệp 2001; Sarawgi cộng sự, 1999; Tomar cộng sự, 1996) Hơn nữa, vi khuẩn phân giải lân lại có tiềm để sản xuất phân vi sinh đa chức tương tác kết hợp tốt với vi khuẩn có lợi khác Azospirillum (Gaur Alagawadi, 1992; Belimov cộng sự, 1995) Azotobacter (Kundu Gaur, 1984) Ngoài vai trò cung cấp lân dễ tan cho trồng, vi khuẩn hịa tan lân cịn có khả sinh yếu tố có vai trị nâng cao hiệu suất tăng trưởng cố định đạm, sinh tổng hợp phytohormone, kháng sinh, hay enzyme chitinase, cellulase, pectinnase, giúp trồng phát triển tốt hơn, chống chịu tốt điều kiện bất lợi từ bên 1.2.4 Cơ chế hòa tan lân VSV 1.2.4.1 Cơ chế hịa tan lân vơ Một số lý thuyết giải thích chế hồ tan lân VSV lý thuyết acid hữu lý thuyết acid hóa cách giải phóng H+ (Ahmed Shahab, 2011) Lý thuyết acid hữu Lý thuyết acid hữu chấp nhận nhiều nhà nghiên cứu Trong lý thuyết này, nguồn lân vơ khơng hịa tan mơi trường hịa tan VSV phân giải lân, kèm với sản xuất acid hữu cơ, làm giảm pH làm tăng tạo phức ion dương liên kết với nhóm phosphate (Puente cộng sự, 2004).Việc giảm độ pH dịch nuôi cấy VSV từ giá trị ban đầu môi trường 7.0 đến giá trị cuối 2.0 ghi lại nhiều nghiên cứu (Gaur Gaind 1999; Illmer Schinner, 1992) Việc sản xuất acid hữu dẫn đến tượng acid hóa tế bào VSV mơi trường xung quanh Do đó, việc giải phóng ion P khoáng P-Ca thay H+ Ca2+ Phân tích dịch ni cấy VSV có khả hịa tan lân cho thấy diện số lượng acid hữu malic, glyoxalic, succinic, fumaric, tartaric, alpha keto butyric, oxalic, citric, acid 2-ketogluconic gluconic (Lapeyrie cộng sự, 1991; Cuningham Kuaick, 1992; Illmer cộng sự, 1995; Fasim Đồ án tốt nghiệp cộng sự, 2002; Kim cộng sự, 1997) Trong số đó, acid gluconic tác nhân thường gặp trình hịa tan lân vơ Các vi khuẩn sinh acid gluconic báo cáo Pseudomonas sp (Illmer Schinner, 1992), Erwinia herbicola (Liu cộng sự, 1992), Pseudomonas cepacia (Goldstein cộng sự, 1993) Chủng vi khuẩn Bacillus liqueniformis Bacillus amyloliquefaciens xác định có khả sản xuất hỗn hợp acid lactic, isovaleric, isobutyric, acit acetic có vai trị tham gia vào q trình hịa tan lân vơ khó tan (Rodríguez Fraga, 1999) Goldstein (1995) chứng minh kết oxy hóa glucose sản sinh acid gluconic acid 2-ketogluconic sở trình hịa tan lân vơ khó tan số vi khuẩn Gram âm Bên cạnh acid hữu cơ, acid vô acid nitric acid sulfuric sản xuất vi khuẩn nitrat Thiobacillus q trình oxy hóa hợp chất vơ có chứa nitơ lưu huỳnh Các acid vô phản ứng với canxi phosphat chuyển đổi chúng thành dạng hòa tan (Gaur Gaind, 1999) Hàm lượng loại acid hữu VSV tiết vào dịch nuôi cấy đa dạng Lượng lân VSV hòa tan phụ thuộc vào cường độ loại acid Acid béo đánh giá có hiệu acid phenolic acid citric hịa tan lân Acid fumaric có khả hịa tan lân tốt Tribasic acid dibasic acid có hiệu acid monobasic (Gaur Gaind, 1999) Goldstein (1994) đề xuất q trình oxy hóa trực tiếp periplasmic glucose thành acid gluconic, thường acid 2-ketogluconic, hình thành sở trao đổi chất chất khoáng số vi khuẩn gram âm phân giải lân Mặc dù nhiều nhà nghiên cứu ủng hộ giả thuyết acid hữu cơ, khó khăn việc định lượng lân hòa tan tương ứng với loại acid hữu xuất môi trường chất lỏng Lý thuyết acid hóa Một số nghiên cứu vi sinh vật có khả hịa tan lân mà không sản sinh loại acid hữu q trình sinh trưởng Việc hịa 10 Đồ án tốt nghiệp tốt Kết luận chung Qua kết kiểm tra chất lượng chế phẩm sau thời gian bảo quản, chất ổn định Alginate thể khả bảo vệ tế bào hỗ trợ hoạt tính chế phẩm tốt Vì thế, Alginate chọn để bổ sung vào chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân dạng lỏng 3.5 Thiết lập QTSX chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân dạng lỏng qui mơ phịng thí nghiệm 71 Đồ án tốt nghiệp 3.5.1 Qui trình sản xuất Giống gốc D9 VC1 Môi trường Nutrient Broth, pH7, hấp khử trùng Tăng sinh chủng riêng rẽ Ủ 24h, t0 phịng, lắc 150v/p Kiểm sốt dịch tăng sinh 108cfu/ml Cấy thể tích giống:thể tích mơi trường = 1:10, lên men chủng riêng rẽ Ủ 18h, t0 phòng, lắc 120v/p Bảo quản lạnh dịch lên men (480C) 4-5h Ly tâm 4000v/p 15p, thu sinh khối loại bỏ dịch nuôi cấy Trộn sinh khối chủng D9 VC1 vào mơi trường chế phẩm Thể tích chủng VSV = 1:1 Chế phẩm phân bón VSV phân giải lân dạng lỏng MT lên men g/L: Meat extract Pepton 10 D-Glucose 10 NaCl 2,5 MgSO4.7H2O 1,23 CaCl2 0,61 K2SO4 0,0435 pH = 7, hấp khử trùng Môi trường Pikovskaya + 1% glycerol + 0,5% Alginate + 0,025% Tween 20 pH7, hấp khử trùng Mật độ tế bào VSV hữu ích không thấp 1,0x108 cfu/ml (TCVN 6169 : 1996) Hình 3.17 QTSX chế phẩm phân bón VSV phân giải lân dạng lỏng 72 Đồ án tốt nghiệp 3.5.2 Thuyết minh qui trình 3.5.2.1 Phân lập, tuyển chọn giống gốc Trong qui trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân khó tan dạng lỏng, quan trọng phân lập, tuyển chọn giống gốc Giống gốc phải có khả phân giải lân tốt, đồng thời có khả sinh tổng hợp chất có vai trò thúc đẩy tăng trưởng trồng Nhằm tạo chế phẩm phân lân vi sinh đa chức có tiềm ứng dụng vào sản xuất thực tế Căn vào kết nghiên cứu Nguyễn Thuý Hằng (2013), có chủng VSV có khả phân giải lân Ca3(PO4)2 tốt Từ sưu tập, người thực đề tài tuyển chọn chủng VSV phối hợp tốt D9 VC1 Có khả phân giải canxi photphate Ca3(PO4)2, đồng thời có khả phân giải tốt nhôm photphate AlPO4, sinh tổng hợp IAA cố định đạm Sau chọn chủng VSV để tạo chế phẩm, tiến hành kiểm tra độ khiết giống, làm giữ giống ống thạch nghiêng môi trường Pikovskaya 3.5.2.2 Lên men thu sinh khối Đối với chủng D9 VC1, lên men riêng rẽ chủng để thu sinh khối Tăng sinh ban đầu: Môi trường tăng sinh môi trường Nutrient Broth, điều chỉnh pH7, hấp khử trùng Ni ủ 24 nhiệt độ phịng máy lắc 150 vịng/phút Lên men chính: Sau 24h kiểm sốt dịch tăng sinh VSV OD600nm = 0.8, tương đương 108 cfu/ml mơi trường NB hấp khử trùng Cấy chuyển dịch nuôi cấy NB sang môi trường lên men chính, pH = 7, hấp khử trùng, thể tích giống:thể tích mơi trường = 1:10 Ni ủ 18 nhiệt độ phịng, máy lắc 120 v/p Mơi trƣờng lên men Meat extract Pepton 10 g/L 73 Đồ án tốt nghiệp D-Glucose 10 NaCl 2,5 MgSO4.7H2O 1,23 CaCl2 0,61 K2SO4 0,0435 3.5.2.3 Phối trộn sinh khối vào môi trường chế phẩm Bảo quản lạnh (4 – 80C) dịch lên men – giờ, sau đem ly tâm 4000 v/p 15 phút để thu sinh khối Dùng micropipette hút bỏ dịch nuôi cấy, trả lại nước muối sinh lý 0,85% vô trùng Chủng sinh khối vào môi trường chế phẩm hấp khử trùng, pH = Môi trường chế phẩm môi trường Pikovskaya bổ sung 1% glycerol, 0.5% Alginate, 0.025% Tween 20 Mật độ tế bào VSV hữu ích chế phẩm không thấp 1,0x108 cfu/ml (TCVN 6169 : 1996) Bảo quản chế phẩm nhiệt độ phòng, điều kiện t nh 3.5.2.4 Dự trù kinh phí sản xuất Để chủ động nguồn kinh phí cho việc sản xuất chế phẩm, người thực đề tài tiến hành dự trù khoảng chi phí q trình sản xuất Dựa vào qui trình sản xuất mục 3.5.1, từ 20 ml dịch lên men cấp chủng D9 VC1 ban đầu, tiến hành lên men tạo chế phẩm Sản xuất 12 lít chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân khó tan dạng lỏng Kinh phí dự trù dựa bảng báo giá hố chất Phịng thí nghiệm trường ĐH Cơng nghệ Tp.HCM Kết thể bảng 3.17 Bảng 3.17 Các khoảng chi phí để sản xuất 12 lít chế phẩm Khoảng chi Số lượng Thành tiền (đồng) Môi trường lên men cấp 150 ml 2.000 Môi trường lên men 1,2 lít 13.000 Mơi trường chế phẩm 12 lít 82.000 Điện 20 kW 60.000 74 Đồ án tốt nghiệp Nước 15 lít 8.000 Chi phí phát sinh 20.000 Tổng chi phí 185.000 Chi phí sản xuất lít chế phẩm 15.500 Dựa vào bảng 3.17 cho thấy, sau dự trù khoảng chi phí q trình sản xuất, để sản xuất lít chế phẩm cần tổng chi phí 15.500 đồng Từ đề xuất giá bán lít chế phẩm vi sinh phân giải lân khó tan dạng lỏng đề tài 25.000 đồng Sản phẩm phân vi sinh Dasvila Công ty TNHH Dasco, với khả cố định đạm phân giải lân bán thị trường với giá 50.000 đồng/lít So sánh với sản phẩm chế phẩm đề tài với hoạt tính tương tự, giá thành thấp lần Phân bón hữu sinh học Rapid Hydro Công ty Rapid Growth Nutrients, loại phân bón dạng lỏng cung cấp nguyên tố đa lượng N, P, K cho trồng, bán thị trường với giá 99.000 đồng/lít So với chế phẩm chế phẩm đề tài có nguồn gốc từ vi sinh vật với khả phân giải lân, cố định đạm, sinh IAA với giá 25.000 đồng/lít, thấp Rapid Hydro gần lần giá thành Như chế phẩm đề tài có khả ứng dụng vào thực tiễn cao, cạnh tranh tốt Chế phẩm sinh học Nobala kích thích tăng trưởng phục hồi rễ, đồng thời có khả phân giải chất xơ Giá bán thị trường 55.000 đồng/lít Ngồi chế phẩm Bio-Plant với thành phần VSV cố định đạm, VSV phân giải lân, VSV phân giải Kali số VSV chuyển hoá chất khác, bán với giá 45.000 đồng/lít Như chế phẩm đề tài so giá có ưu chế phẩm 75 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ sưu tập chủng vi sinh vật có khả phân giải lân khó tan tốt với nguồn Ca3(PO4)2 từ Nguyễn Thuý Hằng (2013), thực khảo sát hoạt tính phân giải Ca3(PO4)2, khả sinh IAA, khả cố định đạm sau thời gian bảo quản Tuyển chọn chủng VSV phối hợp tốt để sản xuất chế phẩm D9 VC1 Lên men riêng rẽ chủng D9 VC1 mơi trường lên men để thu sinh khối Ni cấy lắc 120v/p, kết thúc lên men sau 18h Môi trƣờng lên men g/L Meat extract Pepton 10 D-Glucose 10 NaCl 2,5 MgSO4.7H2O 1,23 CaCl2 0,61 K2SO4 0,0435 Chất ổn định chọn bổ sung vào môi trường chế phẩm Sodium alginate Chế phẩm có chi phí sản xuất thấp so với sản phẩm thị trường, đem lại hiệu kinh tế cao 4.2 Kiến nghị Do thời gian thực đề tài giới hạn, cịn nhiều thiếu sót Cần nghiên cứu thêm số vấn đề sau: - Đánh giá khả phân giải AlPO4 khó tan VSV chế phẩm sau thời gian bảo quản - Nghiên cứu mật độ cấy giống - Đánh giá hoạt tính chế phẩm trồng - Thời gian bảo quản chế phẩm dài 76 Đồ án tốt nghiệp - Bổ sung thêm VSV có ích khác vào chế phẩm - Tối ưu thành phần có mơi trường chế phẩm 77 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Lê Văn Căn (1968) Giá trị số nguồn lân địa phương, Nhà xuất Nông Nghiệp Nguyễn Thị Phương Chi, Phạm Thanh Hà (1999) Phối hợp chủng vi khuẩn cố định nitơ vi khuẩn hoà tan photphat để nâng cao hiệu phân vi sinh vật, Báo cáo khoa học Hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc, Hà Nội 1999, Nhà xuất KHKT, trang 428 – 433 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2001) Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo dục Hà Nội Nguyễn Thuý Hằng (2013) Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn phân giải lân khó tan kích thích tăng trưởng trồng, Đồ án tốt nghiệp, Trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Hữu Hiệp (2009) Bài giải vi sinh nông nghiệp, Viện nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học Cần Thơ Võ Thị Lài (2006) Nghiên cứu nuôi cấy khả phân giải lân khó tan vi khuẩn Bacillus megaterrium, Luận văn tốt nghiệp, Trường Đại học Tây Nguyên Bạch Phương Lan (2004) Giáo trình hoạt tính vi sinh vật đất, Trường Đại học Đà Lạt Vũ Thuý Nga, Nguyễn Ngọc Quyên, Trần Tú Thu , Phạm Văn Toản (2003) Nghiên cứu khả sinh tổng hợp IAA phân giải photphat vơ khó tan vi khuẩn Bradyrhizobiu, Những vấn đề khoa học sống, Báo cáo hội nghị CNSH toàn quốc, Nhà xuất KH&KT Hà Nội, trang 349 – 352 Đoàn Triệu Nhạn (1999) Cây cà phê Việt Nam, Nhà xuất Nông nghiệp – Hà Nội Trần Long Tấu (2009) Tài nguyên đất, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội 78 Đồ án tốt nghiệp Trần Linh Thước (2007) Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, Nhà xuất giáo dục Phạm Văn Toản (2002) Báo cáo kết đề tài Nghiên cứu áp dụng công nghệ nhằm mở rộng sản xuất , ứng dụng phân VSV cố định đạm phân giải lân phục vụ phát triển nông nghiệp bền vững, Hội nghị tổng kết chương trình khoa học cơng nghệ cấp nhà nước giai đoạn 1996 – 2000, Hà Nội 12/2002 Bùi Trang Việt (2002) Sinh lý thực vật 1- Dinh dưỡng, Nhà xuất Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh Tài liệu Tiếng Nƣớc Ngồi N Ahmed, S Shahab (2011) Phosphate Solubilization: Their Mechanism Genetics And Application, The Internet Journal of Microbiology, Volume Number 1, DOI: 10.5580/2327 Antoun, H., C.L Beauchamp, N Goussard, R Chabot, and L Roger (1998) Potential of Rhizobium and Bradyrhizobium speciess as plant growth promoting rhizobacteria on non-legumes: Effect on radishes (Raphanus sativua L.) Plant Soil 204:57-67 Belimov, A A., A P., Kojemiakov and C V., Chuvarliyeva (1995) Interaction between barley and mixed cultures of nitrogen fixing and phosphatesolubilizing bacteria Plant Soil 173:29–37 Burns RG (1983) Extracellular enzyme-substrate interactions in soil, In: Slater JH, Whittenbury R, Wimpenny JWT, editors Microbes in their Natural Environment Cambridge: Cambridge Univ Press, pp 49–98 Chabot, R., C J Beauchamp, J W Kloepper and H Antoun (1998) Effect of phosphorous on root colonization and growth promotion of maize by bioluminescent mutants of phosphate solubilizing Rhizobium leguminosarum biovar Phaseoli Soil Biol Biochem 30:1615–1618 79 Đồ án tốt nghiệp Chandra K., Singh T., Srivathsa H (1999) Liquid Biofertilizer, Biofertilizer Ready reckoner Pages, Regional Biofertilizer Dev, Centr, Bhubaneswar, Orissa Cuningham J E and C Kuiak (1992) Production of citric and oxalic acid and solubilization of calcium phosphate by penicillium billai App Environ Microbial 58:1451-1458 Dighton, J and L Boddy (1989) Role of fungi in nitrogen, phosphorus and sulfur cycling in temperate forest ecosystems In Nitrogen, Phosphorus and Sulfur Ultilization by Fungi (L Boddy, R Marchant and D Read Eds) Cambridge University Press, Cambridge Fasim, F., N Ahmed, R Parsons and G M Gadd (2002) Solubilization of zinc salts by bacterium isolated by the air environment of tannery FEMS Microbiol Lett 213:1-6 Garcia C, Fernandez T, Costa F, Cerranti B, Masciandaro G (1992) Kinetics of phosphatase activity in organic wastes Soil Biol Biochem; 25:361–5 A.C Gaur, A.R Alagawadi (1992) Inoculation of Azospirillum brasilense and phosphate-solubilizing bacteria on yield of sorghum [Sorghum bicolor(L.) Moench] in dry land Trop Agric 1992;69:347–50 Gaur, A C and S Gaind (1999) Phosphate solubilizing microorganisms-An overview Agromicrobes Current trends in life sciences, Today and tomorrows publishers, New Delhi India 23:151-164 Glickmann E., Dessaux Y (1995) A critical examination of the specificity of the salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria Appl Environ.Microbiol 61: 793-796 Goldstein AH, Rogers RD, Mead G (1993) Mining by microbe Bio/Technology; 11:1250–4 Goldstein AH (1994), Involvement of the quinoprotein glucose dehydrogenises in the solubilization of exogenous phosphates by gramnegative bacteria, In: A Torriani Gorini 80 Đồ án tốt nghiệp Goldstein, A.H (1995) Recent progress in understanding the molecular genetics and biochemistry of calcium phosphate solubilization by Gram negative bacteria Biol Agric Hort 12, 185–193 Gügi B, Orange N, Hellio F, Burini JF, Guillou C, Leriche F, Guespin-Michel JF (1991) Effect of growth temperature on several exported enzyme activities in the psychrotropic bacterium Pseudomonas fluorescens J Bacteriol; 173:3814–20 Gyaneshwar, P., G.N Kumar, L.J Parekh, and P.S Poole (2002) Role of microorganisms in improving P nutrient of plants Plant Soil 245:83-93 Illmer P, Schinner F (1992) Solubilization of inorganic phosphates by microorganisms isolated from forest soil Soil Biol Biochem; 24:389–95 Illmer P and F Schineer (1995) Solubilization of inorganic calcium phosphate solubilization mechanisms Soil Biol Biochem 27:257–263 Illmer P., A Barbato and F Schinner (1995) Solubilization of hardly soluble AlPO4 with P– solubilizing microorganisms Soil Biol Biochem, 27:260 270 Kapoor ,K.K M M Mishra and K Kukerja (1989) Phosphate solubilization by soil microorganisms Ind J microbial 129:119-127 Kim, K.Y., D Jordan, H B Krishnan (1997) Rahnella aqualitis, bacterium isolated from soybean rhizosphere, can solubilize hydroxyapatite FEMS Microbiol Lett 153: 273–277 Kucey, R M N (1983) Phosphate solubilizing bacteria and fungi in various cultivated and virgin Alberta Soil Can J Soil Sci 63: 671-678 Kundu, B S and A C Gaur (1984) Rice response to inoculation with N2-fixing and P-solubilizing microorganisms Plant Soil 79:227–234 Lapeyrie, F., J Ranger and D Varelles (1991) Phosphate solubilizing activity of ectomycorrhizal fungi in vitro Canadian J of Bot 69:342-346 Leo Daniel Amalraj E, Maiyappan S, John Peter A (2012) In vivo and in vitro studies of Bacillus megateriumvar phosphaticumon nutrient mobilization, 81 Đồ án tốt nghiệp antagonism and plant growth promoting traits Journal of Ecobiotechnology 4: 35-42 Leo Daniel AE, Venkateswarlu B, Suseelendra D, Praveen Kumar G, Mir Hassan Ahmed SK, et al (2013) Effect of Polymeric Additives, Adjuvants, Surfactants on Survival, Stability and Plant Growth Promoting Ability of Liquid Bioinoculants J Plant Physiol Pathol 1:2 Liu TS, Lee LY, Tai CY, Hung CH, Chang YS, Wolfram JH, Rogers R, Goldstein AH (1992) Cloning of an Erwinia herbicola gene necessary for gluconic acid production and enhanced mineral phosphate solubilization in Escherichia coli HB101: Nucleotide sequence and probable involvement in biosynthesis of the coenzyme pyrroloquinoline quinone J Bacteriol;174:5814–9 Lorda and Balatti (1996) Designing Media I and II in Balatti and Freire Legume Inoculant: Selection and Characterrization of Strains, Production, Use and Managenment Editorial Kingraj, Buenos Aries, pp 148-162 Luo, A.C., X Sun and U S Zhang (1993) Species of insoluble Phosphate Solubilizing Bacteria in Rhizosphere and their effect on yield on yield and nutrient uptake of wheat crop Plant and Soil 57: 223-230 Mahdi S, Hassan GI, Samoon SA, Rather HA, Dar SA, et al (2010) Biofertilizers in organic agriculture Journal of Phytology 2: 42-54 J Microbiol (2011) Isolation of Phosphate Solubilizing Microorganism (PSMs) from soil, Joumal of Microbiology and Biotechnology Research, (2): 90 – 95 Pal, S S (1998) Interaction of an acid tolerant strain of phosphate solubilizing bacteria with a few acid tolerant crops Plant Soil 198:169–177 Parks, E J., G J Olson, F E Brinckman and F Baldi (1990) Characterization by high performance liquid chromatography (HPLC) of solubilization of phosphorus in iron ore by a fungus J Ind Microbiol.5:183-190 82 Đồ án tốt nghiệp Peix, A., A.A Rivas-Boyero, P F Mateos, C Rodirguez-Barrueco, E MartinezMolina and E Velazquez (2001) Growth promotion of chickpea and barley by a phosphate solubilizing strain of Mesorhizobium mediterraneum under growth chamber conditions Soil Biol Biochem 33: 103–110 Pikovskaya, R.I (1948) Mobilization of phosphorus in soil connection with the vital activity of some microbial species Microbiol 17: p362-370 Puente, M E., Y Bashan, C.Y Li and V K Lebsky (2004) Microbial populations and activities in the rhizoplane of rock weathering desert plants root colonization and weathering of igneous rocks Plant Biol 6:629-642 Rodríguez H, Goire I, Rodríguez M (1996) Caracterización de cepas de Pseudomonas solubilizadoras de fósforo Rev ICIDCA;30:47–54 Hilda Rodríguez , Reynaldo Fraga (1999) Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant growth promotion Biotechnology Advances 17 (1999), 319–339 Sarawgi, S K., P K Tiwari and R S Tripathi (1999) Uptake and balance sheet of nitrogen and phosphorus in gram (Cicer arietinum) as influenced by phosphorus, biofertilizers and micronutrients under rainfed condition Indian J Agron 44: 768–772 Sawyer, J and J Creswell (2000) Integrated crop management p182-183 In Phosphorus basics Aug 2000, Iowa State University, Ames, Iowa Skrary FA, Cameron DC (1998) Purification and characterization of a Bacillus licheniformis phosphatase specific for D-alpha-glycerphosphate Arch Biochem Biophys;349:27–35 Sharpley, A (2006) Agricultural phosphorus management: Protecting production and water quality Agricultural Phosphate Management: Protecting Production and Water Quality Lesson 34 USDA-Agricultural Research Service, MidWest Plant Service Iowa State University, Ames, Iowa 83 Đồ án tốt nghiệp Somasegaran, P and Hoben, H J (1985) Method in Legume Rhizobium Technology, NiFTAL Project and Mircen, Department of Agronomy and Soil, University of Hawaii, pp 451 Sridhar, V., Brahmaprakash, G P and Hegde, S V (2004) Development od a Liquid inoculant using Osmoprotectans for Phosphate Solubilizing Bacterium (Bacillus megaterium), Kamtaka J Agril Sci, 17(2):251-257 Subba-Rao, N S (1993) Biofertilizers in Agriculture and Forestry, Oxford and IBH Publishing Co Pvt Ltd New Delhi Taha S M., S A Z Mahmoud, A H El-Damaty and A M A El-Hafeg (1969) Activity of phosphate-dissolving bacteria in Egyptian soils Plant Soil 31:149-160 Tarafdar JC, Junk A (1987) Phosphatase activity in the rhizosphere and its relation to the depletion of soil organic phosphorus Biol Fertil Soil 1987;3:199–204 Tomar, R K S., K N Namdeo and J S Ranghu (1996) Efficacy of phosphatesolubilizing bacteria biofertilizers with phosphorus on growth and yield of gram (Cicer arietinum) Indian J Agron 41: 412–415 Turan, M., N Ataoglu, and F Sahin (2006) Evaluation of the capacity of phosphate solubilizing bacteria and fungi on different forms of phosphorus in liquid culture J Sustainable Agri 28:99-108 Viveganadan, G y K.S Jauhri (2000) Growth and survival of phosphatesolubilizing bacteria in calcium alginate, Microbiol, Res, 155: 205-207 J.F Walter, A.S Paau (1993) Microbial Inoculant Production and Formulation, In: Soil Microbial Ecology Applications in Agri-culltural and Enviromantal Management, F.B Meeting Jr.(Ed), Marcel Dekker, New York, USA, pp 579-694 Wang JinLing, Liu XiaoPing, Gao WeiHua, Zhao FengYan, Lv Changshan (2013) Medium optimization for phosphate-solubilizing 84 bacteria Bacillus Đồ án tốt nghiệp megaterium in submerged fementation, Joumal of Agricultural Science and Technology (Beijing), Vol 15, No pp 185-192 Xu JG, Johnson RL (1995) Root growth, microbial activity and phosphatase activity in oil-contaminated, remediated and uncontaminated soils planted to barley and field pea Plant Soil; 173:3–10 85 ... định chất ổn định chế phẩm phù hợp với vi sinh vật tạo chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân dạng lỏng Thiết lập qui trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân Đồ án tốt nghiệp Ý... Xuất phát từ vấn đề trên, đề tài: ? ?Nghiên cứu qui trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân dạng lỏng? ?? tiến hành nhằm tuyển chọn vi sinh vật có khả phân giải lân tốt, từ nghiên cứu. .. cứu thiết lập qui trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân dạng lỏng Nội dung nghiên cứu Tuyển chọn chủng vi sinh vật chủng vi sinh vật phối hợp có khả phân giải lân khó tan tốt nhất,