Nghiên cứu điều kiện công nghệ thích hợp để công nhận cephalosporrin từ Acremonium Chrysogenum Nghiên cứu điều kiện công nghệ thích hợp để công nhận cephalosporrin từ Acremonium Chrysogenum Nghiên cứu điều kiện công nghệ thích hợp để công nhận cephalosporrin từ Acremonium Chrysogenum luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - HỒ TUYÊN NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN CƠNG NGHỆ THÍCH HỢP ĐỂ THU NHẬN CEPHALOSPORIN C TỪ ACREMONIUM CHRYSOGENUM LUẬN ÁN TIẾN SỸ KỸ THUẬT Hà Nội - 2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - Hồ Tuyên NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN CÔNG NGHỆ THÍCH HỢP ĐỂ THU NHẬN CEPHALOSPORIN C TỪ Acremonium chrysogenum Chuyên ngành: Công nghệ sinh học thực phẩm Mã số: 62 54 02 05 LUẬN ÁN TIẾN SỸ KỸ THUẬT NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS Lê Gia Hy GS TS Hồng Đình Hịa Hà Nội - 2010 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu kết thí nghiệm trình luận án trung thực chƣa đƣợc công bố cơng trình khác Một số số liệu đƣợc đăng tạp chí khoa học chun ngành nhƣ trong: “Danh mục cơng trình khoa học cơng bố có liên quan đến luận án”, đƣợc đồng ý cho phép sử dụng số liệu đồng tác giả phần lại kết nhƣ luận án Hà nội, ngày 03 tháng 03 năm 2010 Tác giả iii Lời cảm ơn Tụi xin by t li cm n sâu sắc tới PGS TS Lê Gia Hy, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam GS TS Hồng Đình Hịa, Viện Cơng nghê sinh học thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội hướng cho ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn cán Phịng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học động viên, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình nghiên cứu Tơi xin cảm ơn Viện Sau đại học, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa học luận án Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, cán Viện Công nghệ sinh học thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội tận tình truyền đạt kiến thức giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tôi xin cảm ơn hỗ trợ kinh phí Đề tài: CNHD.ĐT.004/08-11 thuộc Chương trình KH&CN Hóa dược Cuối cùng, tơi xin tỏ lịng biết ơn đến gia đình bè bạn, người ln động viên, góp ý tạo điều kiện cho suốt thời học tập nghiên cứu Hồ Tuyên iv MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa ………………………………………………………………… i Lời cam đoan ………………………………………………………………… ii Lời cảm ơn …………………………………………………………………… iii Mục lục ……………………………………………………………………… iv Những chữ viết tắt sử dụng luận án …………………………………… vii Danh mục bảng …………………………………………………………… viii Danh mục hình, đồ thị …………………………………………………… x MỞ ĐẦU …………………………………………………………………… NHỮNG ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN ÁN ……………………………………… CHƢƠNG TỔNG QUAN ………………………………………………… 1.1 KHÁNG SINH CEPHALOSPORIN C ………………………………… 1.1.1 Đại cƣơng phân loại kháng sinh 1.1.2 Cephalosporin …………….……………………………………… 1.1.3 Cephalosporin C …………………………………………………… 1.1.4 Vai trò ứng dụng Cephalosporin C 1.1.5 Cơ chế tác động kháng sinh ………………………………… 10 1.1.6 Tình hình nghiên cứu sản xuất KS giới Việt Nam 11 1.2 QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP CEPHALOSPORIN C CỦA VI SINH VẬT …………………………………………………………………… 16 1.2.1 Phân lập bảo quản vi sinh vật sinh kháng sinh 16 1.2.2 Vi sinh vật sinh tổng hợp kháng sinh 17 1.2.3 Quá trình sinh tổng hợp cephalosporin C vi sinh vật 20 1.2.4 Động học trình lên men sinh tổng hợp kháng sinh 23 1.2.5 Các phƣơng pháp giai đoạn lên men 25 1.3 NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH CEPHALOSPORIN C CỦA VI SINH VẬT …………………………………………………………………… 26 1.3.1 Các phƣơng pháp cải tạo giống 26 v 1.3.2 Kết nâng cao khả sinh KS số chủng VSV 32 1.3.3 Tối ƣu hóa mơi trƣờng điều kiện lên men 34 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………… 41 2.1 VẬT LIỆU ……………………………………………………………… 41 2.1.1 Chủng giống vi sinh vật …………………………………………… 41 2.1.2 Hoá chất …………………………………………………………… 41 2.1.3 Môi trƣờng dung dịch đệm ………… ………………………… 41 2.1.4 Thiết bị …………………………………………………………… 41 2.2 CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………………………………… 42 2.2.1 Giữ giống ………………………………………………………… 42 2.2.2 Nhân giống ……………………………………………………… 42 2.2.3 Xác định đặc điểm sinh học chủng …………………………… 42 2.2.4 Xác định sinh khối ………………………………………………… 42 2.2.5 Xác định đƣờng khử theo phƣơng pháp DNSA …………………… 42 2.2.6 Xác định lƣợng ôxy hòa tan môi trƣờng …………………… 43 2.2.7 Xác định hoạt tính kháng sinh …………………………………… 44 2.2.8 Điều kiện lên men thành phần môi trƣờng lên men 47 2.2.9 Phƣơng pháp thu nhận phục hồi tế bào trần … ……………… 49 2.2.10 Phƣơng pháp gây đột biến lên tế bào trần ………………………… 49 2.2.11 Tối ƣu hoá theo phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm Box-Wilson 51 2.2.12 Xác định động thái trình lên men ………………………… 53 2.2.13 Tinh định tính CPC ……………………………………… 54 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ………………………………… 59 3.1 NGHIÊN CỨU CHỦNG GIỐNG VÀ MÔI TRƢỜNG LÊN MEN THÍCH HỢP SINH CEPHALOSPORIN C …………………………… 59 3.1.1 Tuyển chọn chủng sinh tổng hợp cao cephalosporin C …………… 59 3.1.2 Ảnh hƣởng môi trƣờng tới khả sinh CPC chủng AC 880 59 3.1.3 Định lƣợng CPC phƣơng pháp quang phổ 68 3.1.4 Chọn dòng khuẩn lạc đột biến tự nhiên cho hoạt tính CPC cao …… 72 vi 3.2 CHỌN LỌC VÀ TẠO ĐỘT BIẾN CHỦNG A Chrysogenum AC 880 … 73 3.2.1 Tạo tế bào trần, đoạn khuẩn ty bào tử tiền nẩy mầm từ chủng AC 880 ………………………………………………………………… 73 3.2.2 Ảnh hƣởng thời gian chiếu UV, thời gian xử lý với chất gây đột biến lên khả phục hồi tế bào chủng AC 880 …………… 3.2.3 Sự biến động HTKS khuẩn lạc sau gây đột biến …… 77 78 3.3 SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM CỦA BIẾN CHỦNG AC 880-33 VỚI CHỦNG GỐC 81 3.3.1 Tính ổn định hoạt tính kháng sinh biến chủng AC 880-33 …… 81 3.3.2 Xác định phổ kháng khuẩn biến chủng so với chủng gốc ……… 85 3.3.3 Nghiên cứu đặc điểm hình thái biến chủng so với chủng gốc 87 3.3.4 Các yếu tố ảnh hƣởng tới khả sinh trƣởng hai chủng …… 90 3.3.5 Các yếu tố ảnh hƣởng tới khả sinh tổng hợp CPC biến chủng chủng gốc ………………………………………………………… 92 3.4 TỐI ƢU ĐIỀU KIỆN, MÔI TRƢỜNG, NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CPC CỦA BIẾN CHỦNG AC 880-33 99 3.4.1 Tối ƣu môi trƣờng lên men sinh CPC biến chủng AC 880-33 … 99 3.4.2 Tối ƣu điều kiện lên men cho biến chủng AC 880-33 108 3.5 THU HỒI DỊCH LÊN MEN VÀ TÁCH CHIẾT CPC ………………… 119 3.5.1 Thu hồi dịch lên men 119 3.5.2 Tách CPC từ môi trƣờng lên men 122 3.5.3 Định tính chế phẩn CPC 127 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ……………………………………………… 133 DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ………………………………………………………………… 135 TÀI LIỆU THAM KHẢO …………………………………………………… 136 PHẦN PHỤ LỤC…………………………………………………………… 147 vii NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT SỬ DỤNG TRONG LUẬN ÁN 1vvp thể tích khí/ thể tích mơi trƣờng/ phút 6-APA Acid 6-aminopenicillanic 7-ACA Acid 7-aminocephalosporanic 7-ADCA Acid 7-aminodeacetoxycephalosporanic Ac Acremonium chrysogenum AC 880 Acremonium chrysogenum AC 880 AC 880-33 Acremonium chrysogenum AC 880-33 CKS/KS Chất kháng sinh / kháng sinh C/N Cacbon / Nitơ CPC Cephalosporin C đvks Đơn vị kháng sinh g/l; mg/ml Gam/lít; miligam/mililít IR Hồng ngoại KTCC Khuẩn ty chất KTKS Khuẩn ty khí sinh HPLC Phổ sắc ký lỏng cao áp HT Hoạt tính HTKS Hoạt tính kháng sinh l/m Lên men MNNG N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine MT Môi trƣờng MTLM Môi trƣờng lên men PB Prussian blue, màu xanh lam Phổ PBP Các protein gắn penicillin SÂ Siêu âm TB Tế bào TLC Sắc ký lớp mỏng VSV Vi sinh vật VVK Vịng vơ khuẩn v/p Vịng/phút UV Tử ngoại viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Phân loại chất kháng sinh dựa cấu tạo hoá học 1.2 Cấu trúc hóa học cephalosporin sản sinh từ loài VSV 1.3 Cấu trúc R1 R2 số cephalosporin bán tổng hợp 1.4 Khả sản suất nhu cầu 7-ACA số nƣớc (tấn) 13 1.5 Vi sinh vật sinh kháng sinh nhóm aminoglycosid 18 1.6 Tóm tắt kiểu phản ứng, chất hình thành danh pháp gen trình sinh tổng hợp kháng sinh nhóm β-lactam 21 1.7 Kết chọn chủng có hoạt tính cao sinh số loại KS 33 2.1 Độ hòa tan CPC-Zn số dung mơi 55 3.1 Hoạt tính kháng sinh chủng có 59 3.2 Kết khảo sát nguồn cacbon thích hợp cho chủng AC 880 sinh tổng hợp CPC 60 3.3 Kết khảo sát nguồn nitơ thích hợp cho chủng AC 880 sinh tổng hợp CPC 62 3.4 Ảnh hƣởng tiền chất lên khả sinh tổng hợp CPC chủng AC 880 65 3.5 Biến động tự nhiên hoạt tính kháng sinh chủng AC 880 72 3.6 Ảnh hƣởng tuổi giống đến số lƣợng tế bào trần chủng AC 880 tạo thành 75 3.7 Sự biến động HTKS tự nhiên chủng gốc AC 880 khuẩn lạc thu đƣợc sau đột biến 79 3.8 Tính ổn định hoạt tính kháng sinh khuẩn lạc chọn lọc lại từ mẫu bảo quản chủng AC 880 biến chủng AC 880-33 82 3.9 Hoạt phổ kháng khuẩn chủng AC 880 biến chủng AC 880-33 86 3.10 Ảnh hƣởng nguồn cacbon tới khả sinh trƣởng chủng AC 880 biến chủng AC 880-33 90 3.11 Ảnh hƣởng hàm lƣợng glucose tới khả sinh trƣởng chủng AC 880 biến chủng AC 880-33 91 3.12 Ảnh hƣởng hàm lƣợng cao nấm men tới khả sinh trƣởng chủng AC 880 biến chủng AC 880-33 92 ix 3.13 Ảnh hƣởng hàm lƣợng pepton tới khả sinh trƣởng chủng AC 880 biến chủng AC 880-33 92 3.14 Ảnh hƣởng pH ban đầu tới khả sinh tổng hợp CPC chủng AC 880 biến chủng AC 880-33 94 3.15 Ảnh hƣởng thời điểm bổ sung tiền chất DL-methionin tới lƣợng CPC sinh tổng hợp chủng AC 880 biến chủng AC 880-33 95 3.16 Ảnh hƣởng khoảng khơng rỗng khí tới lƣợng ôxy hòa tan lƣợng CPC sinh chủng AC 880 biến chủng AC 880-33 96 3.17 Ảnh hƣởng thành phần môi trƣờng cải tiến (môi trƣờng lên men 2) 101 lên khả sinh tổng hợp CPC biến chủng AC 880-33 3.18 Các yếu tố biến đổi thành phần môi trƣờng lên men biến chủng 102 3.19 Kết thí nghiệm theo ma trận phƣơng sai 102 3.20 Kết kiểm tra thích ứng mơ hình 104 3.21 Kết tối ƣu môi trƣờng lên men 105 3.22 Tỷ lệ Cacbon : Nitơ môi trƣờng lên men môi trƣờng tối ƣu 106 3.23 Ảnh hƣởng lƣợng cao ngô (thay cao nấm men) tới sinh tổng 108 hợp CPC biến chủng AC 880-33 117 3.24 Số liệu lên men có bổ sung mơi trƣờng 6.1 Động thái trình lên men sinh tổng hợp CPC chủng AC 880 150 137 toàn quốc, Những vấn đề nghiên cứu Khoa học sống, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 246-250 13 Lương Đức Phẩm (1998), Công nghệ Vi sinh vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 14 Quyết định Thủ tướng Chính phủ việc phê duyệt “Chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ trọng điểm quốc gia phát triển cơng nghiệp hố dược đến năm 2020”, Số: 61/2007/QĐ-TTg, ngày 07/05/2007, http://www.moit.gov.vn 15 Cao Văn Thu (2000), Bài giảng kháng sinh vitamin, Bộ môn Công nghiệp Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội 16 Tổng công ty Dược Việt Nam (2000), Báo cáo nghiên cứu tiền khả thi Dự án đầu tư xây dựng nhà máy kháng sinh, Bộ Y tế 17 Trần Tựu, Nguyễn Thị Ngọc Dao, Lê Gia Hy, Hà Huy Kế, Nghiêm Xuân Dũng, Triệu Tiến Hà, Đào Lan Phương, Phan Quốc Kinh (2003), “Nghiên cứu điều chế cefotaxim Natri - Kháng sinh cephalosporin bán tổng hợp hệ thứ 3”, Báo cáo tóm tắt Hội nghị Hố học tồn quốc lần thứ IV, 20/10/2003, Hà Nội Tiếng Anh 18 Abraham E.P (1983), “History of -lactam antibiotics”, Antibiotics containing the -lactam structure, Vol 1, Springer Verlag KG Berlin, Germany, 1-14 19 Abraham E.P (1990), “Selective reminiscences of -lactam antibiotics: Early research on penicillin and cephalosporins”, Bioessays, 58, 601-606 20 Adrio J.L., Demain A.L (2006), “Genetic improvement of processes yielding microbial products”, FEMS Microbiology Reviews, 30(2), 187-214 21 Adrio J.L., Demain A.L (2008), “Strain improvement for production of pharmaceuticals and other microbial metabolites by fermentation”, Progress in Drug Research, 65, 251-290 22 Almeida R.M.R.G., Cruz A.J.G., Araujio M.L.G.C., Giordano R.C., Hokka C.O (2001), “Modeling and Simulation of Cephalosporin C Production in a 138 Fed-Batch Tower-Type Bioreactor”, Applied Biochemistry and Biotechnology, 91–93, 537-549 23 Andersson I., Terwisscha van Scheltinga A.C., Valegard K (2001), “Review Towards new β-lactam antibiotics”, Cell Mol Life Sci., 58, 1897-1906 24 Arujo L.M.G.C., Giordano R.C., Hokka C.O (1998), “Comparison Between Experimental and Theoretical Values of Effectiveness Factor in Cephalosporin C Production Process with Immobilized Cells”, Applied Biochemistrya and Biotechnology, 70-72, 492-504 25 Barboza M., Hokka C.O., Maugeri F (2002), “Continuous cephalosporin C purification: dynamic modeling and parameter validation”, Bioprocess Biosyst Eng., 25, 193–203 26 Basch J., Franceschini T., Tonzi S., Chiang S.-J.D (2004), “Expression of a cephalosporin C esterase gene in Acremonium chrysogenum for the direct production of deacetylcephalosporin C”, J Ind Microbiol Biotechnol., 31, 531-539 27 Bosshardt R., Flechtig B., Voser W., Peter H., Mueller J., Bickel H (1970), Canadian intellectual property office, Process for the Isolation of Cephalosporin C, CA 853198 28 Brakhage A.A (1998), “Molecular regulation of -Lactam biosynthesis in filamentous fungi”, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62(3), 547–585 29 Brakhage A.A (2004), “Molecular Biotechnology of Fungal beta-Lactam Antibiotics and Related Peptide Synthetases”, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 88, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany 30 Bryskier A (2000), “Cephems: Fifty years of continous research” The journal of antibiotics, 53(10), 1028-1037 31 Chiang S.J (2004), “Strain improvement for fermentation and biocatalysis processes by genetic engineering technology”, J Ind Microbiol Biotechnol., 31, 99–108 139 32 Coque J.J.R et al (1996), “Overexpression of the Nocardia lactamdurans aminoadipyl-cysteinylvaline synthetase in Streptomyces lividans The purified multienzyme uses cystathionine and 6-oxopiperidine 2-carboxylate as substrates for synthesis of the tripeptide”, Euro J Biochem., 242, 264-270 33 Coque J.J.R., Perez-Llarena F.J., Enguita F.J., Fuente J.L., Martin J.F., Liras P (1995), “Characterization of the cmcH genes of Nocardia lactamdurans and Streptomyces calvuligenus encoding a functional 3’-hydroxymethylcephem Ocarbamoyltransferase for cephamycin biosynthesis”, Gene, 162, 21-27 34 Demain A.L., Elander R.P (1999), “The -lactam antibiotics: past, present, and future”, Antonie van Leeuwenhoek, 75, 5-19 35 Demain A.L., Zhang J (1998), “Cephalosporin C production by Cephalosporium acremonium: the methionine story”, Crit Rev Biotechnol., 18(4), 283-294 36 Egorov A.M., Kurochkina V.B., Sklyarenko A.V., Nys P.S (2000), “Enzymatic transformation of betalactam antibiotics trends of development and approaches to practical implementation”, Biocatalysis: fundamentals & applications, 43-46 37 Elander R.P (2003), “Industrial production of -lactam antibiotics”, Appl Microbiol Biotechnol., 61, 385–392 38 Ellaiah P., Adinarayana K., Chand G.M., Subramanyam G.S., Srinivasulu B (2002), “Strain improvement studies for cephalosporin C production by Cephalosporium acremonium”, Pharmazie, 57(7), 489-490 39 El-Shaboury S.R., Saleh G.A., Mohamed F.A., Rageh A.H (2007), “Review Analysis of cephalosporin antibiotics”, J pharm Biomed Anal., 45, 1–19 40 Goo K.-S., Chua C.-S., Sim T.-S (2009), “Directed evolution and rational approaches to improving Streptomyces clavuligerus deacetoxycephalosporin C synthase for cephalosporin production”, J Ind Microbiol Biotechnol., doi: 10.1007/s10295-009-0549-4 140 41 Guilfoile P.G (2007), Antibiotic-Resistant Bacteria, Chelsea House, New York 42 Gutiérrez S., Velasco J., Marcos A.T., Fernández F.J., Fierro F., Barredo J.L., Díez B., Martín J.F (1997), “Expression of the cefG gene is limiting for cephalosporin biosynthesis in Acremonium chrysogenum”, Appl Microbiol Biotechnol., 48, 606-614 43 Gutiérrez S et al (1999), “Gene organization and plasticity of the -lactam genes in different filamentous fungi”, Antonie van Leeuwenhoek, 75, 81-94 44 Hamilton-Miller J.M.T (2000), “Sir Edward Abraham’s contribution to the development of cephalosporins: a reasessment”, International J of Antimicrobiol Agents, 15, 179-184 45 Herold T., Bayer T., Schiigerl K (1988), “Cephalosporin C production in a stirred tank reactor”, Appl Microbiol Biotechnol., 29, 168-173 46 Jekosch K., Kuck U (2000), “Glucose dependent transcriptional expression of the cre1 gene in Acremonium chrysogenum strains showing different levels of cephalosporin C production”, Curr Genet., 37, 388-395 47 Jensen S.E., Demain A.L (1995), “Beta-lactams”, Genetics and biochemistry of antibiotic production, Butterworth-Heinemann, Newton, Mass, 239-268 48 Jermini M.F., Demain A.L (1989), “Solid state fermentation for cephalosporin production by Streptomyces clavuligerus and Cephalosporium acremonium”, Experientia 45(11-12), 1061-1065 49 Kale S.P., Bhatnagar D (2004), “Protoplast Isolation, Regeneration, and Fusion in Filamentous Fungi”, Handbook of Fungal Biotechnology, Second Edition, Marcel Dekker Inc., New York, 12-28 50 Karaffa L., Sandor E., Kozma J., Kubicek C.P., Szentirmai A (1999), “The role of the alternative respiratory pathway in the stimulation of cephalosporin C formation by soybean oil in Acremonium chrysogenum”, Appl Microbiol Biotechnol., 51(5), 633-638 141 51 Karsheva M., Hristov J., Penchev I., Lossev V (1992), “Rheological Behavior of Fermentation Broths in Antibiotic Industry”, Applied Biochemistry and Biotechnology, 68, 197-206 52 Kim B.M., Kim S.W., Yang D.R (2003), “Cybernetic modeling of the cephalosporin C fermentation process by Cephalosporium acremonium”, Biotechnology Letters, 25, 611–616 53 Kim J.C., Kang S.W., Lim J.S., Song Y.S., Kim S.W (2006), “Stimulation of Cephalosporin C Production by Acremonium chrysogennum M35 with Fatty Acids”, J Microbiol Biotechnol., 16(7), 1120-1124 54 Kim J.C., Lim J.S., Kim J.M., Kim C., Kim S.W (2005), “Relationship between morphology and viscosity of the main culture broth of Cephalosporium acremonium M25”, Korea-Australia Rheology J., 17(1), 1520 55 Kim J.C., Song Y.S., Lee D.H., Kang S.W., Kim S.W (2007), “Fatty acids reduce the tensile strength of fungal hyphae during cephalosporin C production in Acremonium chrysogenum”, Biotechnol Lett, 29, 51–55 56 Kim J.H., Lim J.S., Kim S.W (2004), “The Improvement of Cephalosporin C Production by Fed-batch Culture of Cephalosporium acremonium M25 Using Rice Oil”, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 9, 459-464 57 Kim N.R., Lim J.S., Hong S.I., Kim S.W (2005), “Optimization of feed conditions in a 2.5-l fed-batch culture using rice oil to improve cephalosporin C production by Cephalosporium acremonium M25”, World J of Microbiology & Biotechnology, 21, 787–789 58 Kozma J., Karaffa L (1996), “Effect of oxygen on the respiratory system and cephalosporin-C production in Acremonium chrysogenum”, J of Biotechnol., 48, 59-66 59 Kurnsteiner H., Friedlin E (2006), “Process for production of cephalosporin C”, US Patent: 20060105424 Class: 435069100 (USPTO) 142 60 Kurochkina V.B., Satarova D.E., Nys P.S (2000), “Combinatorial enzymology synthesis of novel betalactam libraries”, Biocatalysis: fundamentals & applications, 139-143 61 Lee M.S., Lim J.S., Kim C.H., Oh K.K., Yang D.R., Kim S.W (2001), “Enhancement of cephalosporin C production by cultivation of Cephalosporium acremonium M25 using a mixture of inocula”, Lett Appl Microbiol., 32(6), 402-406 62 Lee M.S., Lim J.S., Kim C.H., Oh K.K., Hong S.I., Kim S.W (2001), “Effects of Nutrients and Culture Conditions on Morphology in the Seed Culture of Cephalosporium acremonium ATCC 20339”, Biotechnol Bioprocess Eng., 6, 156-160 63 Lim J.S., Kim J.H., Kim C., Kim S.W (2002), “Morphological and rheological properties of culture broth of Cephalosporium acremonium M25”, Korea-Australia Rheology J., 14(1), 11-16 64 Mackenzie A.K (2007), “Studies on the Biosynthetic Pathways of Clavulanic Acid and Cephamycin C in Streptomyces clavuligerus”, Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala, 11-73 65 Martín J.F., Casqueiro J., Kosalková K., Marcos A.T., Gutiérrez S (1999), “Penicillin and cephalosporin biosynthesis: Mechanism of carbon catabolite regulation of penicillin production”, Antonie van Leeuwenhoek 75, 21–31 66 Martin J.F., Demain A.L (2002), “Unraveling the methionine-cephalosporin puzzle in Acremonium chrysogenum”, TRENDS in Biotechinology, 20(12), 502-507 67 Martínez L.G., Falcó P.C., Cabeza A.S (2002), “Comparison of several methods used for the determination of cephalosporins Analysis of cephalexin in pharmaceutical samples”, J pharm Biomed Anal., 29, 405-423 68 Mehta R.J., Speth J.L., Nash C.H (1979), “Lysine Stimulation of Cephalosporin C Synthesis in Cephalosporium acremonium”, European J Appl Microbiol Biotechnol., 8, 177-182 143 69 Metwally F.H., Alwarthan A.A., Al-Tamimi S.A (2001), “Flow-injection spectrophotometric determination of certain cephalosporins based on the formation of dyes”, IL Farmaco 56, 601-607 70 Miller G.L (1959), “Use of dinitrosalisylic acid reagent for determination of reducing sugar”, Anal Chem., 31, 426-429 71 Mishra P., Srivastava P., Kundu S (2005), “A comparative evaluation of oxygen mass transfer and broth viscosity using Cephalosporin-C production as a case strategy”, World J of Microbiology & Biotechnology, 21, 525–530 72 Nagy M.A., Emri T., Fekete E., Sándo E., Springael J.Y., Penninckx M.J., Pócsi I (2003), “Glutathione Metabolism of Acremonium chrysogenum in Relation to Cephalosporin C Production: Is γ-Glutamyltransferase in the Center?”, Folia Microbiol., 48(2), 149–155 73 Okoye N.N., Nwokedi G.I.C., Ukwueze N.N., Okoye F.B.C., (2007), “Spectrophotometric determination of some cephalosporin antibiotics using Prussian blue reaction”, Academic J., 2(8), 342-347 74 Prakask M.S (2005), “Strain Improvement for the production of fungal secondary metabolites”, Handbook of Industrial mycology, Marcel Dekker Inc, New York, 22, 539-562 75 Ramakrishna S.V., Prakasham R.S “Microbial fermentations with immobilized cells”, http://www.ias.ac.in/currsci/jul10/articles17.htm 76 Russel A D (2004) “Types of antibiotics and synthetic antimicrobial agents”, Pharmaceutical Microbiology, Blackwell Science, USA, 2, 152-186 77 Sabbagh N.E., Harvey L.M., McNeil B., (2008), “Effects of dissolved carbon dioxide on growth, nutrient consumption, cephalosporin C synthesis and morphology of Acremonium chrysogenum in batch cultures”, Enzyme and Microbial Technology, 42, 315–324 78 Sahoo G.C., Borthakur S., Dutta N.N., Dass N.N (1999), “Reactive extraction of cephalosporin antibiotics in hollow fiber membrane”, Bioprocess Engineering, 20, 117-125 144 79 Sándor E., Karaffa L., Paul G.C., Pócsi I., Thomas C.R., Szentirmai A (2000), “Assessment of the metabolic activity of Acremonium chrysogenum using Acridine Orange”, Biotechnology Letters, 22, 693–697 80 Sándor E., Szentirmai A., Biró S., Karaffa L (1999), “Specific cephalosporin C production of Acremonium chrysogenum is independent of the culture density”, Biotechnology Techniques, 13, 443–445 81 Sándor E., Szentirmai A., Paul G.C., Thomas C.R., Pocsi L., Karaffa L (2001), “Analysis of the relationship between growth, cephalosporin C production, and fragmentation in Acremonium chrysogenum”, Can J Microbiol., 47(9), 801-806 82 Sarookhani, Mohammad Reza, Moazzami, Nasrin (2007), “Isolation of Acremonium species producing cephalosporine C (CPC) from forest soil in Gilan province, Iran”, African J of Biotechnology, 6(22), 2506-2510 83 Schwecke T., Ahanorowitz Y., Palissa H., von Doehren H., Kleinkauf H., Van Liempt H (1992), “Enzymatic characterisation of the multifunctional enzyme -[L--aminoanipyl]-L-cysteinyl-D-valine synthetase from Streptomyces clavuligerus”, Eur J Biochem., 205, 687-694 84 Seidel G., Tollnick C., Beyer M., Schugerl K (2000), “On-line and off-line monitoring of the production of cephalosporin C by Acremonium chrysogenum”, Adv Biochem Eng Biotechnol., 66, 115-132 85 Sidiakina T.M., Ustiuzhanina S.V., Novikova N.D., Gorin S.E., Esipova V.V., Kalakutskii L.V (1990), “Study of the optimal conditions of preservation of cephalosporin C-producing fungus Acremonium chrysogenum”, Antibiot Khimioter, 35(1), 11-14 86 Silva A.S., Cruz A.J.G., Araujo M.L.G.C., Hokka C.O (1998), “The effect of the addition of invert sugar on the production of cephalosporin C in a fedbatch bioreactor”, Braz J Chem Eng., 15(4), 1-8 87 Silva R.G., Cruz A.J.G., Hokka C.O., Giordano R.L.C., Giordano R.C (2001), “A Hybrid Neural Network Algorithm for On-Line State Inference That 145 Accounts for Differences in Inoculum of Cephalosporium acremonium in FedBatch Fermentors”, Applied Biochemistry and Biotechnology, 91–93, 341-352 88 Snell J.F (1996), Biosynthesis of Antibiotics, Vol 1, Acad Pr., N Y., London 89 Tollnick C., Seidel G., Beyer M., Schugerl K (2004), “Investigations of the Production of Cephalosporin C by Acremonium chrysogenum”, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Springer-Verlag 86, 1-45 90 Tozuka Z., Murakawa T (2007), “Beta-lactam Pharmacodynamics”, Antimicrobial Pharmacodynamics in Theory and Clinical Practice, Second Edition, Informa Healthcare Inc., New York , 129-146 91 Ullán R.V., Liu G., Casqueiro J., Gutiérrez S., Banuelos O., Martín J.F (2002), “The cefT gene of Acremonium chrysogenum C10 encodes a putative multidrug efflux pump protein that significantly increases cephalosporin C production”, Mol Genet Genomics, 267, 673–683 92 United States Patent 5403929, 1995 “Process for preparing alkali salts of Cephalosporin C” 93 Velasco J., Gutiérrez S., Casqueiro J., Fierro F., Campoy S., Martín J.F (2001), “Cloning and characterization of the gene cahB encoding a cephalosporin C acetylhydrolase from Acremonium chrysogenum”, Appl Microbiol Biotechnol., 57, 350–356 94 Vialta A., Catani C.F., Bonatelli R.J., Azevedo J.L (1997), “Cephalosporin C production and genetic improvement of the fungus Acremonium chrysogenum based on morphological mutant isolation”, Brazilian J of Gen., 20(2), 165170 95 Vinod K.N., Ruchi V., Abhishek K., Subir K., Purnendu G (2007), “Influence of medium constituents on the biosynthesis of cephalosporin-C”, Electronic J of Biotechnol., ISSN: 0717-3458, 10(2), 230-239 96 http://www.tpub.com/content/altfuels07/4536/45360049.htm 97 http://www.cimsi.org.vn/Sach/dinhduong&attp/chuong6.htm 98 http://www.webtretho.com/home/ index.php/news/view/19432/2009/09/thuockhang-sinh-nhap-khau-tang-manh.htm 146 99 http://www.tinthuongmai.vn/Trangchu/VN/tabid/66/CatID/130/ContentID/ 62550/Default.aspx 100 http://www.vinachem.com.vn/XBPViewContent.asp?DetailXBPID=1508&Ca teXBPDetailID=108&CateXBPID=2&Year=2004 101 http://www.nutrition.org.vn/news/vi/53/54/0/a/nhung-mon-an-che-bien-tudau-nanh-va-benh-xo-vua-dong-mach.aspx 102 http://www.vietmaisau.org/ forum/archive/index.php/t-52824.html 103 http://www2.hcmuaf.edu.vn/data/nhtri/Casein.doc PHẦN PHỤ LỤC 148 Phụ lục 1: Các môi trường nuôi cấy vi sinh vật dung dịch đệm Môi Trường Môi trường nước khoai tây (g/l): Môi trường YPS (g/l): - Nước chiết khoai tây: lít - Cao nấm men: - Glucose: 20 - Tinh bột tan: - Agar: 20 - MgSO4.7H2O: - KH2PO4: - pH: - Agar: - pH Môi trường nhân giống (g/l): - Glucose: 14-16 15 20 Mơi trường lên men (g/l): - Đường kính: 60 - Cao nấm men: - Glucose: - Pepton: 6-7 - Bột đậu tương: 20 - CaCO3: - Cao ngô: 20 - (NH4)2SO4: - DL-methionin: - pH: - CaCO3: - pH: Môi trường lên men (g/l): Môi trường lên men tối ưu (g/l): - Glucose: 27 - Glucose: 12,4 - Đường kính: 36 - Đường kính: 49,6 - Bột đậu tương: 24 - Bột đậu tương: 14,5 - Cao nấm men: 20 - Cao ngô: 18 - DL-methionin: - DL-methionin: - (NH4)2SO4: - (NH4)2SO4: - CaCO3: 10 - CaCO3: 10 - CaSO4: 7,5 - CaSO4: 7,5 - pH: 6,5 - pH: 6,5 149 Môi trường GER (g/l): Môi trường Czapek-Dox (g/l): - Cao thịt: - Saccharose: - Cao nấm men: - NaNO3: - Trypton: - K2HPO4: - Glucose+Saccharose(1:1):1 - MgSO4.7H2O: 0.5 - Tinh bột tan: - KCl: 0.5 24 - CaCO3: - Agar: 20 - pH: 7,2 - FeSO4 30 7H2O: - H2O khử ion: lít - pH: Môi trường MPA (g/l): - Pepton: 10 - Cao thịt: - NaCl: - Agar: 20 - pH: Các dung dịch đệm: Đệm phosphat/citrat pH 7,3: Đệm phosphat 0.1M pH 6,8: - Na2HPO4 0,2M: 17,39 ml - K2HPO4 1M: 49,7 ml - Citric acid 0,1M: 2,61 ml - KH2PO4 1M: 50,3 ml - Nước cất: - Nước cất: 100 ml Đệm Tris-HCl pH 7,2: - Tris-HCl: 0,02 g - Nước cất: 100 ml 0.01 lít 150 Phụ lục 2: Các bảng biểu hình vẽ Bảng 6.1 Động thái trình lên men sinh tổng hợp CPC chủng AC 880 Thời gian, pH cuối Sinh khối, mg/ml Lượng CPC, mg/ml 6,93 - 12 6,87 2,07 24 6,60 4,15 36 6,18 5,95 0,21 48 6,26 6,75 0,26 60 5,89 7,30 0,35 72 5,73 7,85 0,40 84 5,57 8,50 0,42 96 5,56 9,31 0,453 108 5,49 9,37 0,453 120 5,27 9,17 0,49 132 5,50 8,51 0,47 144 5,67 8,07 0,40 156 5,80 7,71 0,35 168 5,85 7,53 0,26 151 Phụ lục 3: Lên men biến chủng AC 880-33 thống Bioflo 110 Hệ thống lên men lít Hệ thống lên men 80 lít Hình 6.1 Hệ thống lên men Bioflo 110 ... pháp phù hợp với điều kiện thực tiễn Việt Nam cần thiết Chính vậy, chúng tơi tiến hành thực đề tài: ? ?Nghiên cứu điều kiện cơng nghệ thích hợp để thu nhận cephalosporin C từ Acremonium chrysogenum? ??... KHOA HÀ NỘI - Hồ Tuyên NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN CƠNG NGHỆ THÍCH HỢP ĐỂ THU NHẬN CEPHALOSPORIN C TỪ Acremonium chrysogenum Chuyên ngành: Công nghệ sinh học thực phẩm Mã số: 62 54 02... men Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho lên men sinh tổng hợp CPC Tối ưu hóa mơi trường lên men sinh tổng hợp CPC, nghiên cứu sử dụng nguồn nguyên liệu có sẵn nước để sản xuất CPC Nghiên cứu lên