Đề tài (y học) nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch và chống oxy hóa của cao quả nhàu trên động vật thực nghiệm

1 Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch chống oxy hóa cao nhàu động vật thực nghiệm ĐẶT VẤN ĐỀ Nhờ có sức đề kháng miễn dịch mà người tồn trước công tác nhân gây bệnh vi sinh vật, hóa chất, vật lý….Sức đề kháng miễn dịch hoạt động hệ thống tế bào có thẩm quyền miễn dịch chất tiết chúng (cytokin) hoạt hóa Sự tồn vẹn hệ thống giúp cho trình đáp ứng miễn dịch thể diễn bình thường Bệnh lý suy giảm miễn dịch hay gọi thiếu hụt miễn dịch nguyên nhân bẩm sinh (nguyờn phát) hay mắc phải (thứ phát), hậu thể khơng có giảm khả đáp ứng miễn dịch (dịch thể tế bào) để chống lại yếu tố lạ (kháng nguyên) gây nên.[2, 4, 11] Suy giảm miễn dịch bệnh lý phổ biến, nước phát triển (nơi bệnh nhiễm trùng tình trạng suy dinh dưỡng cịn nhiều) Ở nước phát triển, tình trạng suy giảm miễn dịch xảy người bị đe dọa loại thuốc, hóa chất, yếu tố vật lý phóng xạ, bệnh béo phì, bệnh ung thư….[2, 7, 8, 11, 29] Trước bệnh lý suy giảm miễn dịch chưa quan tâm mức, đến năm gần đại dịch HIV/AIDS kỷ bùng nổ, bệnh ung thư phát triển ngày tăng…gõy nên tình trạng suy giảm miễn dịch làm khó khăn cho việc điều trị, người ta nghiên cứu cách hệ thống suy giảm miễn dịch Hơn nhờ tiến khoa học, đặc biệt y sinh học phân tử giỳp hiểu rõ chế phân tử bệnh lý suy giảm miễn dịch, để từ có biện pháp điều trị miễn dịch thích hợp hiệu [2, 4, 11, 29] Vì chuyên đề xin trình bày khái quát bệnh lý suy giảm miễn dịch, chế bệnh sinh số bệnh suy giảm miễn dịch mắc phải phổ biến người số phương pháp nghiên cứu gõy suy giảm miễn dịch thực nghiệm, sở để ứng dụng nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch số cõy thuốc Việt Nam mà số cao nhàu Đại cương bệnh lý suy giảm miễn dịch Bệnh lý suy giảm miễn dịch hay gọi thiếu hụt miễn dịch, biểu thể khả giảm đáp ứng miễn dịch tế bào đáp ứng miễn dịch dịch thể để chống lại nguyên nhân (kháng nguyên) gây bệnh [2, 4, 7] MD dịch thể MD tế bào Vi khuẩn ngoại bào VK nội bào, virus, nấm TB lympho B Tế bào trình diện KN Tế bào Th Kháng thể Receptor tế bào T Tiếp nhân trình diện KN Receptor với cytokine Biệt hoá phát triển TBMD: Tc, NK, ĐTB Ly giải (bổ thể) Ly giải TB bị nhiễm Hình 1: Đáp ứng miễn dịch dịch thể tế bào Dựa vào chế sinh bệnh nhà Miễn dịch - Sinh lý bệnh nước phõn làm loại: suy giảm miễn dịch bẩm sinh hay tiờn phỏt (chủ yếu di truyền) suy giảm miễn dịch mắc phải hay thứ phát (thường hậu trình bệnh lý khác) 1.1 Suy giảm miễn dịch bẩm sinh: Suy giảm miễn dịch bẩm sinh bất thường vật chất di truyền Dựa vào nguồn gốc vị trí tổn thương tế bào miễn dịch người ta phân loại suy giảm miễn dịch sau: TB mầm TB lympho mầm TB mầm dòng hạt Tiền TB mầm dòng hạt Tiền lympho bào Các BC hạt Ưa base Ưa acid Hồng cầu Lympho B NK Lympho T Trung tính Tiểu cầu Kháng thể Th, Ts, Tc, TDTH, cytokine Hình Sơ đồ biệt hóa vị trí tổn thương tế bào miễn dịch (1) Suy giảm miễn dịch từ tế bào gốc chung cho dòng tế bào B T nên gọi suy giảm miễn dịch nặng phối hợp (2) Suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng T gồm loại: tổn thương tế bào T cao rối loạn hoạt hóa tế bào T trưởng thành (3) Suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng B gồm loại: tổn thương tế bào B cao rối loạn trình biệt hóa tế bào B để sản xuất kháng thể dịch thể - Suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng tế bào thực bào (liên quan đến trình diện kháng nguyên) sản xuất bổ thể 1.1.1 Suy giảm miễn dịch nặng phối hợp SCID (Severed combined immuno deficiency): Đây nhóm gồm nhiều bệnh phức tạp có bất thường phát triển biệt hóa tế bào lympho vào giai đoạn sớm để thành tiền tế bào B T Đặc trưng bệnh suy giảm nặng nề số lượng tế bào B T Bệnh lần phát Thụy Sĩ Nguyên nhân thứ nhất: di truyền liên kết nhiễm sắc thể giới tính X: bệnh xuất trai nhiều gái (tỷ lệ 3:1) Nguyên nhân thứ 2: di truyền lặn, liên kết với nhiễm sắc thể thường, khoảng 1/50.000 trẻ sinh bị SCID [Trích từ 11] Có nhiều thể SCID di truyền nhiễm sắc thể thường với chế phân tử khác nhau: - Týp 1: thiếu enzym thối hóa purin: adenosin desaminase (ADA) gây tích lũy chất deoxyadenosin chất gây ngộ độc lympho bào gốc làm cho tế bào không phân chia Trên giới có khoảng 100 ca bệnh SCID týp Trên lâm sàng người ta điều trị bệnh cách tiêm định kỳ enzym ADA Tuy nhiên enzym ADA phải gắn giá trơ để bền vững trước đưa vào thể - Týp 2: Khơng có lympho bào (alymphocytosis) Nghiên cứu chuột nhắt thấy chế bệnh sinh rối loạn trình tái tổ hợp gen xảy trình biệt húa cỏc tế bào tiền thân lympho bào để trở thành tế bào B T, dẫn đến rối loạn xếp lại gen q trình chín lympho bào B T để đảm bảo tính đa dạng TCR (T cell Receptor) sIg (Surface Immunoglobulin) Trên người chế bệnh sinh cịn chưa hiểu rõ có ý kiến cho bệnh cú cựng chế - Ngoài cũn cú cỏc thể SCID khác như: giảm biểu lộ phân tử MHC lớp II tế bào có thẩm quyền miễn dịch lympho B, đại thực bào…nờn bệnh gọi hội chứng tế bào lympho trần trụi, hậu thiếu sót trình diện kháng nguyên giảm biểu lộ phõn tử MHC Thể SCID đột biến chuỗi gamma receptor IL-2, lympho T CD3… rối loạn chuyển tín hiệu di truyền bên tế bào nên tế bào lympho T CD3 không hoạt hoá phõn chuyển, làm giảm sản xuất cytokin [11, 19, 21, 29] Điều trị bệnh SCID: - Ghép tủy xương: cách tốt nhất, kết tốt có hịa hợp mơ hịa hợp hệ ABO người cho người nhận Phản ứng thải loại mảnh ghép nguy hiểm, gây tử vong thể nhận mảnh ghép bị suy giảm miễn dịch - Truyền máu nhiều lần, nhiên biện pháp khó trì lâu dài có phản ứng giống thải loại mảnh ghép - Truyền hồng cầu bình thường chứa enzym ADA cho thể bệnh SCID thiếu enzym ADA 1.1.2 Suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng lympho T  Hội chứng Di George Hội chứng chiếm khoảng 20% bệnh lý suy giảm miễn dịch bẩm sinh Nguyên nhân tình trạng bệnh lý phơi: khơng phát triển túi hầu thứ thứ Cỏc tỳi hầu chịu trách nhiệm phát triển hình thành tuyến ức tuyến cận giáp vào tuần thứ thứ Ngoài cỏc tỳi hầu chịu trách nhiệm phát triển cung động mạch chủ, mơi, tai vào tuần thứ 12 Vì vậy, gặp hội chứng Di George thể điển hình, thường gặp thể khơng điển hình Bệnh nhi bị giảm sản tuyến ức, suy giảm tuyến cận giáp (thường bị co giật giảm calci huyết), kèm theo triệu chứng dị tật tim, mặt, tai… rối loạn phát triển tuyến ức biểu chủ yếu rối loạn môi trường biệt hóa tế bào lympho T Hậu số lượng tế bào T bình thường giảm, chức tế bào T giảm giảm biểu lộ TCR/CD3, giảm sản xuất cytokin Dòng tế bào lympho B không bị ảnh hưởng nên đáp ứng miễn dịch dịch thể gần bình thường giảm khơng có hỗ trợ Th Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào bị ảnh hưởng nặng nề có khơng có đáp ứng [33, 37, 42, 45, 49] Điều trị: - Ghép tuyến ức phụi cú cựng kháng ngun hịa hợp mơ Tiêm truyền tế bào mảnh ghép tuyến ức có đường kớng 1mm thẳng bụng phúc mạc Dùng thuốc biện pháp hữu hiệu tránh phản ứng mảnh ghép chống túc chủ - Tiêm tinh chất tuyến ức thymosin để biệt hóa tế bào gốc thành tế bào T - Điều chỉnh calci huyết, điều trị dị tật tim mặt - Điều trị nhiễm nấm, virus, lao mắc phải  Hội chứng Nezelof: vô sản tuyến ức, không kèm theo vô sản tuyến cận giáp Biểu lâm sàng bệnh thường nhẹ hội chứng Di George: khơng có rối loại calci huyết Do khơng có đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào nên trẻ thường bị nhiễm nấm, virus Điều trị có hiệu ghép tuyến ức tiêm tinh chất tuyến ức [2, 11, 29, 51]  Một số suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng lympho T khác: - Hội chứng Hong Good: gặp, có thiểu sản tuyến ức tuyến giáp trạng Biểu lâm sàng chủ yếu suy giảm miễn dịch tế bào: giảm số lượng chức tế bào T tế bào B bình thường - Khuyết tật cấu trúc TCR: phức hợp CD3/TCR bị khuyết tật đột biến chuỗi gamma CD3 dẫn đến ảnh hưởng đến số protein chuyển tin làm rối loạn phosphoryl hóa, vận chuyển calci nội bào… - Giảm sản suất IL2, IL4 INF-gamma: đột biến tế bào receptor chúng 1.1.3 Suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng lympho B Dòng tế bào lympho B chịu trách nhiệm đáp ứng miễn dịch dịch thể, nên có rối loạn trình biệt hố phát triển dịng làm giảm nồng độ giảm chất lượng globulin máu Biểu lâm sàng bệnh nhân bị nhiễm khuẩn tái lại nhiều lần vi khuẩn sinh mủ (các cầu khuẩn Gram +) [2, 4, 18, 22]  Bệnh Bruton: Bệnh Bruton phát năm 1952, gọi thể khơng có gamma globulin máu, di truyền liên kết nhiễm sắc thể giới tính X nhiễm sắc thể thường Bệnh chiếm 70% bệnh nhân suy giảm miễn dịch bẩm sinh Nếu thể bệnh gắn với nhiễm sắc thể X, bệnh thường xảy trẻ em trai, xuất sớm Nếu di truyền nhiễm sắc thể thường bệnh xuất giới, thường giai đoạn muộn Sự biệt hóa tế bào B bị rối loạn giai đoạn sớm tiền tế bào B, bệnh đặc trưng xét nghiệm khơng có lympho bào B máu mô lympho, hạch bạch huyết nhỏ, khơng có amidan, huyết khơng có loại Ig Phân loại: có týp bệnh Bruton - Týp 1: Suy giảm tế bào B kèm suy giảm toàn Ig: IgA, IgM, IgG, IgE Nguyên nhân thiếu gen mã hóa để tổng hợp Ig - Týp 2: Suy giảm tế bào B kèm suy giảm Ig: IgA, IgG, IgE tăng IgM Nguyên nhân rối loạn gen điều hòa việc tổng hợp, vận chuyển Ig Điều trị: Điều trị bệnh Bruton kháng sinh thường khơng có hiệu Hiện người ta dùng kháng sinh kết hợp với truyền Ig thụ động Các chế phẩm Ig thường dùng chủ yếu chứa IgG (99%) Do IgG có thời gian bán thải dài nên có giá trị phịng số bệnh nhiễm trùng Duy trì nồng độ IgG huyết cao 2g/lớt [11] Khụng dùng IgA để điều trị đưa IgA đường tiêm chúng không đến niêm mạc hệ tiêu hóa, hơ hấp nên khơng có giá trị phòng điều trị bệnh Hơn nữa, thân IgA dễ gõy choỏng phản vệ nên thiếu IgA khơng có định dùng IgA cho bệnh nhân Bruton [2, 11, 29]  Bệnh suy giảm tế bào B có liên quan đến chuyển đổi isotyp Các tế bào B biệt hóa từ tế bào gốc gan phơi, sau chuyển vào tủy xương Dịng tế bào B biệt hóa suốt đời Trong vi môi trường tủy xương cỏc nguyờn bào lympho B xếp lại gen mó húa cho chuỗi nặng muy, chuỗi nhẹ kappa, chuỗi lamda Giai đoạn tiền B có IgM nguyên sinh chất, giai đoạn chưa trưởng thành có IgM bề mặt (mIgM), trưởng thành có IgD IgM Trong giai đoạn phát triển biệt hóa tế bào B, MHC lớp II biểu lộ, sau tế bào B rời tủy xương đến hạch bạch huyết Tại hạch bạch huyết, tế bào B kích thích kháng ngun chúng biệt hóa để trở thành tương bào tiết kháng thể dịch thể đặc hiệu tế bào B trí nhớ Sự biến đổi tế bào B chủ yếu IgD, biểu lộ gen mã cho chuỗi …, đồng thời biến dị số gen tạo thay đổi vị trí receptor, làm tăng ỏi tớnh receptor với kháng nguyên Suy giảm IgA Là bệnh tương đối phổ biến, cộng đồng người da trắng với tần xuất khoảng 1/700 người di truyền theo NST 18 Loại suy giảm triệu chứng biểu ngồi dễ bị nhiễm khuẩn đường hô hấp đường ruột hay thấy xuất bệnh tự mẫn Xét nghiệm có nồng độ IgA máu thấp (< 50 g/ml) hay Khoảng nửa bệnh nhân có 10 thể xuất kháng thể chống IgA nờn cú nguy bị sốc truyền máu hay huyết tương Điều trị biện pháp miễn dịch cần dè dặt phải tiêm  - globulin Cơ chế bệnh sinh tình trạng suy giảm IgA chưa rõ có lẽ phức tạp Nguyên nhân tổn thương bên tế bào (tế bào lympho B có sIgA không chuyển tiếp nữa) hay thiếu hỗ trợ bên (thiếu Th đặc hiệu, thiếu cytokin TGF-  , IL-5) Yếu tố địa giữ vai trò quan trọng định Bệnh nhân hay có haplotyp A1, B8, DR3 có thiếu sót gien mã cho C 4, C4a giảm [41, 42, 43, 46, 51] + Suy giảm lớp IgG Một số trường hợp suy giảm IgG thường có kết hợp với suy giảm IgA hay với bệnh điều hoà – gión mạch Bệnh nhân bị suy giảm IgG khơng có triệu chứng đặc hiệu, bệnh nhân bị nhiễm khuẩn sinh mủ, tái phát nhiều lần, dai dẳng, nặng Nguyên nhân thiếu sót lớp IgG3 hay phối hợp IgG2 IgG4 Nồng độ IgG chung bình thường, số trường hợp có tăng IgM Nếu có kết hợp suy giảm IgA có đột biến điểm gien mã cho glycoprotein 39 nằm NST X [17, 29, 51] Suy giảm miễn dịch thông thường (CVID = Common variable ImmunoDeficiency) Bệnh cũn có tên vơ  -globulin huyết muộn (late agamma globulinemia) hay vô  -globulin huyết mắc phải (acquired agamma globulinemia) Bệnh thường xuất muộn tuổi 20 -30 nam lẫn nữ nên tỷ lệ mắc Xét nghiệm máu thấy có giảm loại IgG, IgA IgM Số lượng tế bào lympho B thay đổi không rõ rệt chức chúng có thay đổi có kết hợp với thay đổi tế bào lympho T Điều trị biện pháp miễn dịch tiêm gamma-globulin, liều lượng tuỳ nồng độ Ig máu mức độ biểu lâm sàng [2, 4, 11, 29, 51] 1.1.4 Suy giảm miễn dịch phối hợp 46 Các thuốc thường dùng làm thuốc chuẩn lô súc vật đối chứng dương là: levamisol, cycloporin A, prednisolon, leflunomid - Trên ex vivo: Các súc vật dùng thuốc thử ngày lần ngày liên tục Sau dùng thuốc thử đủ ngày, lấy tổ chức lỏch, tỏch lấy tế bào (Hỗn dịch chứa 5x 106 tế bào/ml) Các mitogen đưa vào giếng nuôi cấy Ủ ấm nuôi cấy tế bào điều kiện chuẩn: nhiệt độ 37 oC, khơng khí có % khí CO 2, thời gian ni cấy 48- 60 Thêm 0,25 àC +3H-thymidin vào giếng nuôi cấy Thu hoạch tế bào dụng cụ lọc thủy tinh chuyên biệt, làm khô định lượng - Đánh giá: số kích thích tăng q trình biệt hóa so sánh cỏc lụ súc vật nghiên cứu: lô chuẩn đối chứng dương, đối chứng õm, lụ chứng sinh học lụ dựng thuốc thử 2.2.4 Nghiên cứu đánh giá tăng sinh tế bào lympho T (T cell proliferation) [25] - Nguyên lý: Các tế bào lympho T tăng biệt hóa kích thích bới kháng nguyên đặc hiệu Dựng cỏc tác nhân khác làm suy giảm số lượng chức tế bào lympho T, sau gián tiếp định lượng tế bào lylpho T phương pháp đánh dấu phóng xạ ( +3Hthymidin) chất tiết đặc hiệu chúng IL-2 phương pháp ELISA - Tiến hành: tế bào lympho máu ngoại vi gồm tế bào B T Dùng kháng CD3 (phân tử CD3 tổ hợp gồm chuỗi peptid có trọng lượng phân tử từ 20-26 kD, phân tử CD3 có mặt tế bào T chín) kháng CD28 để cô lập tế bào T Sau ủ ni cấy tế bào T với kháng nguyên đặc hiệu giếng nuôi cấy tế 47 bào Thêm vào giếng àC +3H-thymidin để gián tiếp định lượng số lượng tế bào lympho T Dùng phương pháp ELISA để định lượng interleukin-2 receptor (IL-2R) - Đánh giá: IL-2 cytokin quan trọng, sản xuất tế bào T h Dưới tác dụng IL-2 tế bào lympho T tăng cường phân chia biệt hóa IL-2R gồm chuỗi peptid (chuỗi α: trọng lượng phân tử 75 kD β: 55 kD) Các tế bào T nghỉ có chuỗi α, khơng cịn chuỗi β Những receptor cú ỏi tớnh cao với IL-2cú khả cảm ứng tăng trưởng biệt hóa tế bào T Receptor cú ỏi tớnh thấp với IL-2 có chuỗi β, chỳng khụng hoạt hóa tế bào T Dựa vào đường cong chuẩn nồng độ xác định giếng nuôi cấy, so sánh với cỏc lụ súc vật dùng thuốc thử lô đối chứng 2.2.5 Nghiên cứu đánh giá quầng dung huyết in vitro (Plaque forming colony test in vitro) [2, 25] - Nguyên lý: xác định tỷ lệ tế bào lympho lách tiết kháng thể kháng hồng cầu cừu (HCC) theo kỹ thuật Cuinningham - Tiến hành: trộn lympho bào lách chuột mẫn cảm với kháng nguyên HCC từ trước với HCC theo tỷ lệ thích hợp kèm theo có mặt bổ thể buồng đếm gắn kín Khi gặp kháng nguyên đặc hiệu, tế bào lympho B biệt hoá thành tương bào tiết kháng thể hồ tan vào mơi trường xung quanh kháng thể kết hợp với kháng nguyên HCC Phức hợp kháng nguyên - kháng thể hoạt hoá bổ thể làm tan HCC xung quanh tế bào B tiết kháng thể, tạo vịng trắng khơng có HCC xung quanh tế bào Đây gọi tế bào tạo quầng dung huyết Đếm tế bào lympho tạo quầng dung huyết tổng số 100 tế bào lympho lách kính hiển vi độ phóng đại 10 x 40 Từ tính tỷ lệ phần trăm tế bào tạo quầng dung huyết lơ thí nghiệm 48 - Đánh giá: Các lympho bào B mẫn cảm với kháng nguyên đặc hiệu phân chia biệt hố nhanh chóng thành tương bào sản xuất kháng thể Vì vậy, súc vật mẫn cảm kháng nguyên hồng cầu cừu, sau ủ tế bào lympho B với hồng cầu cừu, tạo thành phức hợp kháng nguyên kháng thể, với tác dụng bổ thể làm dung giải hồng cầu cừu xung quanh tế bào lympho tạo thành quầng dung huyết Tỷ lệ tế bào tạo quầng dung huyết đánh giá khả tiết kháng thể đặc hiệu lympho B mà đánh giá thụ thể bề mặt tế bào với C3 bổ thể 2.2.6 Phản ứng bì với kháng nguyên OA [2, 25] - Nguyên lý: Thí nghiệm thường tiến hành chuột nhắt trắng, chuột cống trắng Đánh giá miễn dịch qua trung gian tế bào thông qua phản ứng mẫn chậm gan bàn chân chuột với kháng nguyên OA - Tiến hành: trước đo kết phản ứng mẫn chậm với kháng nguyên OA, tiêm 50 100 l kháng nguyên OA (liều phát hiện) vào bên gan bàn chân chuột, bên lại tiêm thể tích tương tự dung dịch BSA Sau 24 tiêm kháng nguyên phát hiện, đo bề dày hai gan bàn chân chuột thước palmer Lấy hiệu số bề dày phản ứng mẫn chậm chuột với kháng nguyên OA BSA số phản ứng với kháng nguyên OA - Đánh giá: phản ứng mẫn chậm với kháng nguyên OA đánh giá đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, tế bào lympho T đóng vai trũ chớnh Tại chỗ tiếp xúc với kháng nguyên có tập trung nhiều tế bào lympho đặc biệt lympho bào T Một số phương pháp nghiên cứu khác như: nghiờn cứu đánh giá kết hợp receptor interferon (binding to interferon receptors), nghiờn cứu sàng lọc chất đối kháng với IL-1 (screening for interleukin-1 49 antagonists), nghiờn cứu ức chế enzym chuyển IL-1β (inhibition of interleukin-1β converting enzym) [25]… 2.2.7 Xác định số lượng nhúm lympho bào T Dùng kỹ thuật miễn dịch hình quang xác định số lượng T CD3, TCD4, TCD8a, TCD8b - Nguyên lý: tế bào lympho T có nhiều loại T h, Tc, Ts, TDTH… loại có chức đặc hiệu đặc trưng dấu ấn miễn dịch riêng (các CD) bề mặt tế bào Ví dụ, CD3: đặc trưng cho tế bào T9 sau hoạt hoá kháng nguyên đặc hiệu, CD4: đặc trưng cho tế bào T hỗ trợ, CD8 đặc trưng cho tế bào T độc (là tế bào có chức quan trọng miễn dịch chống tế bào ung thư virus) - Tiến hành lấy máu tổ chức lympho súc vật bị gõy suy giảm miễn dịch tác nhõn đặc hiệu (hoá chất, tia xạ…) Đánh giá số lượng nhúm lympho bào T kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp máu ngoại vi tổ chức lympho Xác định tỷ lệ phần trăm tế bào TCD3, TCD4, TCD8a, TCD8b tổng số 100 tế bào - Đánh giá: tế bào TCD3 tế bào T chín sau mẫn cảm với kháng nguyên đặc hiệu Phõn tử CD3 tế bào T chín liên kết trực tiếp với TCR Số lượng tế bào T CD3 tăng tương ứng với khả đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào cải thiện Các tế bào TCD4 TCD8 quần thể tế bào gõy độc với virus tế bào ung thư Bản thõn chúng tiêu diệt trực tiếp tế bào ung thư tế bào nhiễm virus (TCD8) gián tiếp thông qua cytokin chúng tiết IL-2, TNF 2.2.8 Định lượng cytokin IL-2, TNF Nguyên lý: tế bào lympho T sau hoạt hoá kháng nguyên tăng sinh, biệt hoá để trở thành tế bào T mẫn cảm có chức 50 loại bỏ kháng nguyên Một công cụ quan trọng tế bào lympho T mẫn cảm chất tiết cytokin chúng Các cytokin có tác dụng trực tiếp loại bỏ kháng nguyên (TNF với tế bào ung thư) chúng có vai trị khuếch đại dịng thác miễn dịch thơng qua việc kích thích tế bào T hỗ trợ IL-2 Bản chất cytokin protein đặc trưng chuỗi acid amin Dùng kỹ thuật ELISA để xác định nồng độ cytokin dịch tiết tế bào lympho T nuôi cấy - Tiến hành: lấy tổ chức lympho súc vật (thường lách, hạch, tuyến ức) nghiền nhỏ ly tõm, rửa dung dịch đặc hiệu, tách lấy tế bào lympho khoảng 105 tế bào, tế bào nuôi cấy khoảng 48giờ với PHA 3g/ml - Đánh giá: IL-2 cytokin quan trọng bậc có tác dụng tăng sinh biệt hố lympho bào T, hoạt hoá tế bào T độc, hoạt hố đại thực bào, có vai trị quan trọng miễn dịch chống ung thư chống virus TNF có nhiều nguồn gốc khác từ đại thực bào, tế bào mast, tế bào lympho… nên đặc hiệu so với IL-2, TNF có phạm vi tác dụng rộng có tác dụng gõy độc tế bào ung thư tế bào nhiễm virus tăng biểu lộ phõn tử MHC lớp I cho tế bào T độc hoạt động 2.3 Các số dùng để đánh giá suy giảm miễn dịch thực nghiệm Các số chung: Trọng lượng quan lympho (lách, tuyến ức, hạch) số lượng bạch cầu máu ngoại vi, tiêu giải phẫu bệnh quan lympho Trọng lượng lách tuyến ức Trọng lượng lách = tuyến ức tương đối Thể trọng súc vật 2.3.2 Các số đánh giá đáp ứng miễn dịch dịch thể: 51 Định lượng  globulin, lớp Ig, kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên mẫn cảm, số lượng tỷ lệ tế bào lympho B tiết kháng thể đặc hiệu, tế bào tạo hoa hồng mẫn cảm, khả tạo cụm tế bào lympho B nuôi cấy với chất kÝch thích phân bào 3 Các số đánh giá đáp ứng miễn dịch tế bào: Phản ứng mẫn chậm da thông qua ghép da dị gen, phản ứng bì với kháng nguyên đặc hiệu, số lượng tế bào lympho T, nhóm lympho T (Th, Ts, Tc, TCD4+, TCD8+ ) máu tổ chức lympho, khả gây độc tế bào lympho Tc, khả tiết lymphokin tế bào lympho T mẫn cảm interleukin, interferon, yếu tố hoại tử khối u Tài liệu tham khảo Tiếng Việt Phan Sĩ An (1995), "Tương tác xạ ion với vật chất tác dụng xạ ion hoá", Tài liệu tập huấn Quốc gia an tồn phóng xạ Y tế, Bé Khoa học Công nghệ môi trường Bộ Y tế phối hợp tổ chức Vũ Triệu An (1997), Miễn dịch học, Trường Đại học Y Hà Nội, Nhà xuất Y học Bộ môn Dược lý (2007), Dược lý học, Trường Đại học Y Hà Nội, Nhà xuất Y học Bộ môn Miễn dịch- Sinh lý bệnh (2007), Sinh lý bệnh miễn dịch,Trường Đại học Y Hà Nội, Nhà xuất Y học Bộ môn Y học hạt nhân (2007), Bài giảng Y học hạt nhân, Trường đại học Y Hà Nội, Nhà xuất Y học Bé Y tế (2006), Dược thư quốc gia Việt Nam, Hội đồng Dược điển Việt Nam Đào Văn Chinh, Nguyễn Quốc Tuấn, Phạm Văn Thức (2002), Miễn dịch học lâm sàng, Nhà xuất Y học Nguyễn Bá Đức (2003), Thực hành xạ trị bệnh ung thư, Nhà xuất Y học Nguyễn Thị Vinh Hà, Phạm Huy Quyến, Phan Thị Phi Phi (1994), “Về mơ hình gây suy giảm miễn dịch thực nghiệm”, Kỷ yếu cơng trình nghiên cứu khoa học, Đại học Y Hà Nội, 5, tr 16-17 10 Nguyễn Thế Khánh, Phạm Tử Dương(2001), Xét nghiệm sử dụng lâm sàng, Nhà xuất Y học 11 Phan Thị Phi Phi (2007), Một số vấn đề y sinh học cập nhật cho bác sĩ, Nhà xuất Y học Tiếng Anh: 12 Akiyama M (1995), "Late effects of radiation on the human immune system: an overview of immune response among the atomic-bomb survivors", Int J Radiat Biol., Japan, 68(5), pp 497 - 508 13 Banks W.A., Farr S.A., Morley J.E (2003), “Entry of blood-borne cytokines in the central neurvous system: effect on cognitive processes”, Neuro immuno modulation, 10(6), pp 319 - 327 14 Bertram G.K (1998), Basic and clinical pharmacology, Karolinska Institutets Bibliotek, pp 917-944 15 Birkeland S A (1980), "Influence of irradiation on the capacity of human T and B lymphocytes to from E and EAC rosettes", Transplantation, 29, pp 23 - 24 16 Bourgeois C; Rocha B; Tanchot C (2002), A role for CD40 expression on CD8+ T cells in the generation of CD8+ T cell memory, Science, 297(5589):2060-3 17 Castigli E; Wilson SA; Garibyan L; Rachid R; Bonilla F; Schneider L; Geha RS (2005), TACI is mutant in common variable immunodeficiency and IgA deficiency, Nat Genet, 37(8):829-34 18 Castigli E; Wilson SA; Scott S; Dedeoglu F; Xu S; Lam KP; Bram RJ; Jabara H; Geha RS (2005), TACI and BAFF-R mediate isotype switching in B cells, J Exp Med, 201(1):35-9 19 Chang C.C., Naiki M., Halpern G.M., Gershewin M.E (1993), "Pharmacological regulation of the immune system", J Investig Allergol Clin Immunol, 3, pp 8-18 20 Cosman D (1998), "Colony stimulating factors invivo and invitro", Immunology today 21 Doan T., Melvold R., Waltenbaugh C (2005), Medical Immunology, Lippincott Willams and Wilkins 22 Ferrari S; Plebani A (2002), Cross-talk between CD40 and CD40L: lessons from primary immune deficiencies, Curr Opin Allergy Clin Immunol, 2(6):489-94 23 Fooksman DR; Gronvall GK; Tang Q; Edidin M (2006), Clustering class I MHC modulates sensitivity of T cell recognition, J Immunol, 176(11):6673-80 24 Gatto D; Martin SW; Bessa J; Pellicioli E; Saudan P; Hinton HJ; Bachmann MF (2007), Regulation of memory antibody levels: the role of persisting antigen versus plasma cell life span, J Immunol, 178(1):67-76 25 Gehard Volgel H (2002), Drug discovery and evaluation, Pharmacological assays, Springer 26 Gong J K., Glomski C A., Bruce A K (1983), "The effects of low dose X-rays on the erythropoietic marrow" Cell Biophys, 5, pp 143 - 162 27 Goodman and gilman’s (2005), The pharmacological basic of therapeutics (11 th edition), pp.1463-1484 28 Gutierrez T., Berber A (2001), “Safety and efficacy of two courses of OM-85 Bronchovaxom in the prevention of respiratory tract infections in children during 12 months”, Chest Journal, Jun, 119(6), pp 1742 - 1748 29 Hans D Ochs, C I Edvard Smith, Jennifer M Puck (2007), Primary Immuno deficiency Diseases: A Molecular and Genetic Approach, Second Edition, Oxford university press 30 Hendry J H (1985), "The cellular basis of long term marrow injury after irradiation" Radiother Oncol Vol 3, pp 331 - 338 31 Huggins J; Pellegrin T; Felgar RE; Wei C; Brown M; Zheng B; Milner EC; Bernstein SH; Sanz I; Zand MS (2007), CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27- naive human B cells, Blood, 109(4):1611-9 32 Knoechel B; Lohr J; Zhu S; Wong L; Hu D; Ausubel L; Abbas AK (2006), Functional and molecular comparison of anergic and regulatory T lymphocytes, J Immunol, 176(11):6473-83 33 Krogsgaard M; Li QJ; Sumen C; Huppa JB; Huse M; Davis MM (2005), Agonist/endogenous peptide-MHC heterodimers drive T cell activation and sensitivity, Nature, 434(7030):238-43 34 Kuppers R (2003), B cells under influence: transformation of B cells by EpsteinBarr virus, Nat Rev Immunol, 3(10):801-12 35 Lieberman J (2003), The ABCs of granule-mediated cytotoxicity: new weapons in the arsenal, Nat Rev Immunol, 3(5):361-70 36 McHeyzer-Williams LJ; McHeyzer-Williams MG (2005), Antigen-specific memory B cell development, Annu Rev Immunol, 23:487-513 37 Mills DM; Cambier JC (2003), B lymphocyte activation during cognate interactions with CD4+ T lymphocytes: molecular dynamics and immunologic consequences, Semin Immunol, 15(6):325-9 38 Niedbala W; Wei XQ; Cai B; Hueber AJ; Leung BP; McInnes IB; Liew FY (2007), IL-35 is a novel cytokine with therapeutic effects against collagen-induced arthritis through the expansion of regulatory T cells and suppression of Th17 cells, Eur J Immunol.37(11):3021-9 39 Novoselova E G, Safonova M V (1995), Immune functions of spleen lymphocytes of rats subjected to chronic irradiation and antioxidant (ubiquinone Q9) diet Int J Radiat Biol., 67 (4), pp 469 - 476 40 Ojeda F Flores M (1999), "Radiation induced loss of anti-Ig binding ability of lymphocytes" J Naturforsch, 34, pp 888 - 889 41 Quesenberry P J (1995), Hematopoietic stem cells, progenitor cells and cytokin Inc New York, pp 211 - 228 42 Quezada SA; Jarvinen LZ; Lind EF; Noelle RJ (2004), CD40/CD154 interactions at the interface of tolerance and immunity, Annu Rev Immunol, 22:307-28 43 Richard J., Brian M., June E (2005), “IL-15 has stimulatory activity for the induction of B cell proliferation and differentation”, The American Association of Immunologists, pp 484 - 488 44 Shen J., Bao S., Reeve V (1999), “Modulation of IL-10, IL-12 and IFN- in the epidermis of hairless mice by UVA and UVB radiation”, Invest Dermatol, 113(6), pp 1059 - 1064 45 Shinkai K; Mohrs M; Locksley RM (2002), Helper T cells regulate type-2 innate immunity in vivo, Nature, 420(6917):825-9 46 Tangye SG; Avery DT; Deenick EK; Hodgkin PD (2003), Intrinsic differences in the proliferation of naive and memory human B cells as a mechanism for enhanced secondary immune responses, J Immunol, 170(2):686-94 47 Thomas R., Cupps, Lynne Edgar, Amthony S (2002), “Suppression of human B lymphocyte function by cyclophosphamid”, Journal of immunology, 125 (6) 48 Toftegaard C.L., Knigge U., Kjaer A (2003), “Effect of Interleukin 1 on the HPA axis in H(1)-receptor knockout mice”, Neuroimmunomodulation, 10(6), pp 344 - 350 49 Vigouroux S; Yvon E; Biagi E; Brenner MK (2004), Antigen-induced regulatory T cells, Blood, 104(1):26-33 50 Wang JC; Livingstone AM (2003), Cutting edge: CD4+ T cell help can be essential for primary CD8+ T cell responses in vivo, J Immunol, 171(12):6339-43 51 William E (1999), “Fundamental immunology, th edition”, Lippincott - Raven Philadelphia, New York 52 William P (2003), “Grannulocyte and granulocyte macrophage colony stimulating factors”, The Lancet, (342), pp 153 - 157 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BÉ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI PHẠM THỊ VÂN ANH CHUYÊN ĐỀ TIẾN SỸ SUY GIẢM MIỄN DỊCH Ở NGƯỜI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU SUY GIẢM MIỄN DỊCH THỰC NGHIỆM THUỘC ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KÍCH THÍCH MIỄN DỊCH VÀ CHỐNG OXY HÓA CỦA CAO QUẢ NHÀU TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM HÀ NỘI - 2009 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BÉ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI CHUYÊN ĐỀ TIẾN SỸ SUY GIẢM MIỄN DỊCH Ở NGƯỜI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU SUY GIẢM MIỄN DỊCH THỰC NGHIỆM THUỘC ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KÍCH THÍCH MIỄN DỊCH VÀ CHỐNG OXY HÓA CỦA CAO QUẢ NHÀU TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM Người thực hiện: PHẠM THỊ VÂN ANH (NCS khóa 24 - Chuyên ngành Dược lý) Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Phan Thị Thu Anh HÀ NỘI - 2009 Các chữ viết tắt CD DTH Elisa GM-CSF ICAM INF Ig IL KTMD LPS MHC NK TGF Th TNF Ts : : : : : : : : : : : : : : : : Cluter of differentiation Delayed hypersensitivity Enzyme linked immunosorbent assay Granulocyte monocyte colony stimulating factor Intercellular adhesion molucule Interferon Immunoglobulin Interleukin Kích thích miễn dịch Lipopolysaccharid Major histocompatibility complex Natural killer Tumor growth factor Helper T cell Tumor necrosis factor Suppessor T cell MỤC LỤC Đại cương bệnh lý suy giảm miễn dịch 1.1 Suy giảm miễn dịch bẩm sinh: 1.1.1 Suy giảm miễn dịch nặng phối hợp SCID 1.1.2 Suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng lympho T 1.1.3 Suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng lympho B 1.1.4 Suy giảm miễn dịch phối hợp 1.1.5 Suy giảm bẩm sinh tế bào thực bào bổ thể 1.1.6 Kết luận suy giảm miễn dịch bẩm sinh: 15 1.2 Suy giảm miễn dịch mắc phải: 15 1.2.1 Suy giảm miễn dịch ung thư 16 1.2.2 Suy giảm miễn dịch nhiễm HIV/AIDS 22 Các phương pháp gây suy giảm miễn dịch thực nghiệm Các tác nhân gây suy giảm miễn dịch thực nghiệm: 2.1 Thuốc hóa chất: 29 2 Tác nhân phóng xạ gây suy giảm miễn dịch 12 28 28 thực nghiệm: 36 Gây ung thư thực nghiệm: 38 2.1.4 Vi sinh vật: 41 2 Một số mơ hình nghiên cứu 41 2.2.1 Nghiên cứu đánh giá giải phóng cytokin: IL-1alpha, IL-1 beta, IL-6, IL-8 TNF-alpha từ bạch cầu người 41 2.2.2 Nghiên cứu chất đối kháng với yếu tố hoại tử khối u 42 2.2.3 Nghiên cứu đánh giá tăng sinh tế bào lympho với mitogen 43 2.2.4 Nghiên cứu đánh giá tăng sinh tế bào lympho T 44 2.2.5 Nghiên cứu đánh giá quầng dung huyết in vitro 45 2.2.6 Phản ứng bì với kháng nguyên OA 46 2.2.7 Xác định số lượng nhóm lympho bào T 47 2.2.8 Định lượng cytokin IL-2, TNF 48 2.3 Các số dùng để đánh giá suy giảm miễn dịch thực nghiệm 48 Các số chung: 48 2.3.2 Các số đánh giá đáp ứng miễn dịch dịch thể: 49 3 Các số đánh giá đáp ứng miễn dịch tế bào: 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO ... sở để ứng dụng nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch số cõy thuốc Việt Nam mà số cao nhàu Đại cương bệnh lý suy giảm miễn dịch Bệnh lý suy giảm miễn dịch hay gọi thiếu hụt miễn dịch, biểu... giảm miễn dịch, ngồi điều trị ngun nhân người ta cũn dựng biện pháp kớch thích miễn dịch thích hợp Tuy nhiờn thuốc kích thích miễn dịch hay tăng cường miễn dịch thường có tác dụng hệ miễn dịch vật. .. nhiều loài súc vật Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch thuốc thiết phải tiến hành trờn cỏc súc vật bị suy giảm miễn dịch súc vật bình thường Ýt đáp ứng với chất kích thích miễn dịch Có nhiều