Báo cáo (y dược) staphylococcus

Staphylococcus aureus Muc lục Lời nói đầu .2 Chương I : Tổng quan về tác nhân gây ngộ độc 1.1 Giới thiệu 1.2 Lịch sử 1.3 Phân loại 1.4 Đặc điểm 1.5Yếu tố độc lực 1.6 Các bệnh S.aureus 1.7 Các loại thực phẩm nhiễm nguồn nhiễm 1.8 Phòng bệnh điều trị 10 Chương II: Các phương pháp xác định 13 2.1 Phương pháp truyền thống 14 2.2 Phương pháp đại .17 Chương III: Kết luận đề nghị 21 3.1 Kết luận 22 3.2 Đề nghị 22 Tài liệu tham khảo 23 -1- Staphylococcus aureus Lời nói đầu Trong cuộc sống hối hả,chúng ta thường phải tất bật với công việc, chúng ta ăn cơm ở nhà được , phải ăn ở quán hay lòng lề đường Những thức ăn ở đó, chế biến không sẽ, chúng ta có thể bị ngộ độc thực phẩm vi khuẩn gây Nhũng vi khuẩn gây ngộ độc thường rất đa dạng , số chúng, loài Staphylococcus aureus loài vi khuẩn gây ngộ độc rất nguy hiểm cho chúng ta Do yếu tố nguy hiểm đó, chúng ta cần phải biết được chi tiết về chủng vi khuẩn này, biết được cách lây lang truyền bệnh, có phương pháp phòng ngừa Do những lý trên, nhóm em xin làm một báo cáo về loài Staphylococcus aureus (hay khuẩn cầu vàng) Bài báo cáo làm khoảng thời gian ngắn, nên có nhiều phần chưa được hợp lý,sơ sót, xin thầy bỏ qua cho -2- Staphylococcus aureus Chương I : Tổng quan về tác nhân gây bệnh -3- Staphylococcus aureus 1.1 Giới thiệu Staphylococci (tụ cầu khuẩn) vi khuẩn gram dương hình cầu, nhìn bằng kính hiển vi có hình chùm chùm nho.Được tìm thấy da tóc của người.Năm 1884, Rosenbach đã mô tả sắc tố khuẩn lạc mẫu của staphylococci là: Staphylococcus aureus( màu vàng) Staphylococcus albus( màu trắng).Loài được phát sau có tên gọi Staphylococcus epidermidis.Mặc dù có 20 loài Staphylococcus được mô tả sách cua Bergey(2001), chỉ có Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis có ý nghĩa tác động đến người Khuẩn S.aureus có thể dc tìm thấy da, khoang miệng dày Staphylococcus aureus được các nhà khoa học xếp vào giới Eubacteria, thuộc ngành Firmicutes, lớp Cocci, bộ Bacillales, họ Staphylococcaceae, giống Staphylococcus 1.2 Lịch sử Staphylococcus aureus( tụ cầu vàng) Robert Koch(1843-1910)phát năm 1884 phân lập từ mũ ung nhọt Năm 1926, Julius von Daranyi người đầu tiên phát mối tương quan giữa diện của hoạt động lên men coagulase làm đông huyết tương của vi khuẩn với khả gây bệnh của nó Tuy nhiên mãi đến năm 1948, phát được chấp nhận rộng rãi 1.3 Phân loại -4- Staphylococcus aureus Trên phương diện gây bệnh, tụ cầu khuẩn được chia thành hai nhóm chính: tụ cầu có coagulase tụ cầu không có coagulase 1.3.1Tụ cầu có coagulase Nhờ men coagulase mà môi trường nuôi cấy có máu, vi khuẩn tạo nên các khuẩn lạc màu vàng Do vi khuẩn gọi tụ cầu vàng Các vi khuẩn quan trọng của nhóm là: +Staphylococcus aureus hay gọi tụ cầu vàng +Staphylococcus intermedius 1.3.2Tụ cầu không có coagulase Do không có men coagulase nên môi trường nuôi cấy có máu, khuẩn lạc có màu trắng ngà Trên lâm sàng thường gọi các vi khuẩn tụ cầu trắng Các vi khuẩn nhóm có thể kể:         Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophyticus Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus capitis Staphylococcus simulans Staphylococcus hominis Staphylococcus warneri Cùng 16 chủng tụ cầu khuẩn khác không diện ở người Tụ cầu khuẩn mọc dễ dàng các môi trường nuôi cấy ở nhiệt độ 37° C Màu đặc trưng của các khuẩn lạc màu trắng sứ màu trắng ngà Khả tan máu của vi khuẩn được nuôi cấy cung cấp gợi ý quan trọng về tính chất của vi khuẩn 1.4 Đặc điểm 1.4.1 Đặc điểm chung Staphylococcus có nguồn từ tiếng Hy lạp staphyle nghĩa chùm nho các cầu khuẩn kị khí tùy ý, Gram dương không tạo nha bào có đường kính khoảng -5- Staphylococcus aureus μm,không di động sắp xếp theo mọi hướng thường tạo thành cụm (tụ) trông giống chùm nho 1.4.2 Đặc điểm sinh hóa Tụ cầu có hệ thống enzyme phong phú, những enzyme được dùng chẩn đoán:Coagulase có khả làm đông huyết tương người động vật đã được chốngđông Đây tiêu chuẩn quan trọng nhất để phân biệt tụ cầu vàng với tụ cầu khác.Coagulase có ở tất các chủng tụ cầu vàng Catalase (+) Catalase có ở tất các tụ cầu mà không có ở liên cầu,chuyển hóa hydrogen peroxit thành nước oxygen Lên men đường mannitol Desoxyribonuclease enzyme phân giải ADN Phosphatase Hầu hết các chủng tụ cầu đều sản xuất được men penicillinase (betalactamase).Men phá hủy vòng beta-lactam, cấu trúc của các kháng sinh penicilline G,Ampicilline Ureidopenicilline, làm cho các kháng sinh mất tác dụng 1.5Yếu tố độc lực 1.5.1 Đặc tính các yếu tố độc lực Trên lâm sàng việc phân biệt các chủng tụ cầu có khả gây bệnh không gây bệnh thường dựa vào diện của men Coagulase Men gắn với prothrombin huyết tương hoạt hóa quá trình sinh fibrin từ tiền chất fibrinogen Enzyme cùng với yếu tố kết cụm (clumping factor), một enzyme vách vi khuẩn, giúp tụ cầu vàng tạo kết tủa fibrin bề mặt của nó Tính chất yếu tố bệnh sinh quan trọng yếu tố cũng đóng vai trò quan trọng chẩn đoán Tụ cầu vàng sản xuất nhiều yếu tố độc lực khác có liên quan đến cấu tạo của vách vi khuẩn -6- Staphylococcus aureus  Vỏ polysaccharide: một số chủng tụ cầu vàng có thể tạo vỏ polysaccharide Vỏ cùng với protein A có chức bảo vệ vi khuẩn chống lại tượng thực bào  Hầu hết các chủng tụ cầu vàng đều có khả tổng hợp một loại protein bề mặt (protein A) có khả gắn với mảnh Fc của các globuline miễn dịch Chính nhờ tượng gắn độc đáo mà số lượng mảnh Fc giảm xuống Vì mảnh Fc của các globuline miễn dịch có vai trò quan trọng tượng opsonin hóa: chúng các receptor cho các đại thực bào Quá trình gắn giúp tụ cầu vàng tránh không bị thực bào bởi đại thực bào  Ngoài phần lớn các chủng tụ cầu đều có khả sản xuất một chất kết dính gian bào Nhờ chất này, vi khuẩn tạo được một lớp màng sinh học bao phủ chính nó vi khuẩn có thể phát triển lớp màng nhầy niêm mạc 1.5.2 Các yếu tố độc lực ngoại bào Ngoài coagulase yếu tố kết cụm, tụ cầu cịn sản x́t mợt số men quan trọng góp phần tạo nên độc lực mạnh mẽ của chủng vi khuẩn  Hyaluronidase: men có khả phá hủy chất của tổ chức, giúp vi khuẩn có thể phát tán tổ chức  Hemolysine leukocidine: phá hủy hồng cầu (tan máu) gây chết các tế bào hạt cũng đại thực bào  Exfoliatine: các men phá hủy lớp thượng bì Men gây tổn thương da tạo các bọng nước Ví dụ điển hình hợi chứng Lyell tụ cầu  Sáuđộc tố ruột (Enterotoxine A, B, C, D, E, F) bền với nhiệt Các độc tố ruột đóng vai trị quan trọng ngợ đợc thực phẩm  Độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc: nguyên nhân gây nên hội chứng sốc nhiễm độc, một hội chứng sốc trầm trọng  Hầu hết các chủng tụ cầu đều sản xuất được men penicillinase (betalactamase) Men phá hủy vòng beta-lactam, cấu trúc của các kháng sinh penicilline G, Ampicilline Ureidopenicilline, làm cho các kháng sinh mất tác dụng -7- Staphylococcus aureus 1.6 Các bệnh S.aureus Tụ cầu có men coagulase gây nên rất nhiều bệnh lý khác Có thể chia các bệnh theo khả xâm nhập hay sinh độc tố của tụ cầu: 1.6.1 Bệnh tụ cầu xâm nhập Các bệnh nhiễm trùng khu trú da niêm mạc: những bệnh nhiễm trùng da các phần phụ thuộc (chủ yếu các chân lông tuyến mồ hôi) tạo thành bệnh cảnh áp xe kinh điển của tụ cầu Các tụ cầu khuẩn có khả tạo fibrin đó tạo được một vách fibrin bao bọc ổ áp xe Các ổ nhiễm trùng có thể chỉ nhỏ đầu đinh ghim (bệnh viêm nang lông) kích thước táo áp xe Các vùng da có lông rậm bao phủ, tụ cầu thường nguyên nhân gây nên các mụn đầu đanh Tổn thương chỗ có thể nhẹ nhàng nó cũng một mối nguy phát tán vi khuẩn đến những quan xa Mủ của các ổ áp xe tụ cầu vàng thường có màu vàng, đặc không hôi Nhiễm trùng các quan sâu: nhiễm trùng các quan bên thể có thể đường nội sinh: từ một ổ nhiễm viêm nhiễm ngoại vi, vi khuẩn theo đường máu bạch huyết đến các quan khác Nhiễm trùng cũng có thể nguyên nhân ngoại sinh: vi khuẩn từ môi trường vào thể thong qua vết rách da sau chấn thương quá trình phẫu thuật Các bệnh lý điển hình nhóm có thể kể: viêm xương tủy xương, nhiễm trùng huyết, viêm tắc tĩnh mạch xoang hang, viêm nội tâm mạc, viêm màng não mủ… 1.6.2 Thể trung gian Viêm da bọng nước (bong da sơ sinh, hội chứng bong da tụ cầu) thường gặp ở trẻ sơ sinh trẻ nhỏ Tác nhân gây bệnh các chủng tụ cầu sản xuất độc tố Exofoliatine Ngay sau triệu chứng sốt đỏ da, bệnh được đặc trưng bằng dấu hiệu bong lớp biểu bì đồng thời hình thành bọng nước diện rộng Bệnh thường diễn tiến lành tính Mặc dù da hình thành nhiều bọng nước lớn ít đưa đến tình trạng rối loạn nước điện giải Lớp da non được hình thành khá nhanh Tương tự với bệnh lý Hội chứng Lyell tụ cầu Chốc truyền nhiễm -8- Staphylococcus aureus Hội chứng sốc nhiễm độc: thường gặp ở phụ nữ trẻ kỳ kinh nguyệt có dùng băng thấm hút mạnh Chính khả thấm hút tốt mà băng có thời gian sử dụng lâu Một số loại thấm có khả gắn với các ion magnesium đó làm giảm lượng ion âm đạo Khoảng 20% phụ nữ có mang tụ cầu ở đường âm đạo Do lượng ion magnesium giảm xuống, vi khuẩn tăng cường sản xuất các ngoại độc tố gây sốc Bệnh cảnh lâm sàng của hội chứng sốc nhiễm độc gồm đột ngột sốt cao, cảm giác mệt mỏi, tiêu chảy toàn nước, nhức đầu, đau cơ, nởi ban ngồi da mợt nhiều dấu hiệu của sốc Hội chứng có tỉ lệ tử vong khá cao Hội chứng Thukydides: thể đặc biệt của hội chứng sốc nhiễm độc Hội chứng có thể gặp ở thiếu niên hai giới, thuờng gặp bội nhiễm tụ cầu sau bị cúm Tỉ lệ tử vong của hội chứng rất cao (trên 50%) Biểu lâm sàng về mặt hô hấp tiêu hóa rất giống với bệnh dịch hạch Thurykodides mô tả ở Athen năm 430 trước công nguyên 1.6.3 Bệnh độc tố Ngộ độc thực phẩm bệnh điển hình nhất đợc tố ṛt bền với nhiệt của tụ cầu Sau ăn các thức ăn nguội kể các thức ăn nhiễm tụ cầu đã được nấu chín Có thể phân thành hai thể: +Viêm dày ruột: nguyên nhân ăn phải các thức ăn nhiễm độc tố tụ cầu Bệnh thường xảy thời gian ngắn với triệu chứng nôn mửa dữ dội, tiêu chảy phân tóe nước, không sốt Bệnh thường lành nhanh chóng không cần điều trị kháng sinh +Viêm ruột non-đại tràng: nguyên nhân thức ăn nhiễm một lượng lớn vi khuẩn tụ cầu (>105 vi khuẩn/g thức ăn) vi khuẩn tăng sinh lịng ṛt (có đến 2-30% số người mang vi khuẩn ruột) Triệu chứng bệnh lý ở đường tiêu hóa đau bụng, nôn mửa, tiêu chảy kéo dài cần phải điều trị kháng sinh 1.7 Các loại thực phẩm nhiễm nguồn nhiễm 1.7.1 Các loại thực phẩm dễ nhiểm -9- Staphylococcus aureus Những loại thức ăn dễ nhiễm Staphylococcus aureus thường thực phẩm giàu protein, có độ âm cao như: thịt chế biến sẵn: cá, sản phẩm gia cầm, sản phẩm từ sữa,các thức ăn ngọt…Ngoài ra, tụ cầu khuẩnS.aureus nhiễm các sản phẩm thức ăn, nước uống quy trình sản x́t khơng đúng tiêu chuẩn vệ sinh Các thực phẩm thường bị ngộ độc thịt, các sản phẩm từ thịt , gia cầm trứng , các sản phẩm từ sữa.Các loại thực phẩm được yêu cầu xử lý giữ ở nhiệt độ cao Staphylococcal tồn không khí , bụi , nước thải , sữa , thực phẩm , bề mặt môi trường , người động vật Con người động vật các nguồn chứa ban đầu.Nó có mặt ở mũi cổ họng tóc da của 50% người khỏe mạnh Tỷ lệ cao những người tiếp xúc với người bệnh môi trường bệnh viện 1.7.2 Nguồn nhiễm Tụ cầu vàng có rải rác tự nhiên đất, nước, không khí, đặc biệt người nguồn chứa chính của tụ cầu vàng, chủ yếu ở vùng mũi họng (30%), nách, âm đạo, mụn nước da, các vùng da trầy xước Tỷ lệ mang vi khuẩn cao ở các nhân viên y tế, bệnh nhân lọc máu, có bệnh tiểu đường type 1, nhiễm HIV, mắc bệnh da mãn tính Sau tuần nằm viện, tỉ lệ lên đến 30%-50% thường nhiễm chủng kháng thuốc Dịch vụ thực phẩm bằng tay, đến các dụng cụ chứa đựng thực phẩm phương tiện lây truyền S.aureus, đặc biệt với những người chế biến trực tiếp chuẩn bị nấu ăn có mụn nhọt tay Khi ho hay xỉ mũi cạnh nơi sản xuất thực phẩm cũng có thể gây ô nhiễm S.aureus cho thực phẩm 1.8 Phòng bệnh điều trị 1.8.1 Phòng bệnh Phòng bệnh nhiễm khuẩn tụ cầu chủ yếu vệ sinh mơi trường, q̀n áo thân thể Vì tụ cầu có rất nhiều ở những nơi này, đặc biệt vệ sinh môi trường bệnh viện để chống nhiễm khuẩn bệnh viện - 10 - Staphylococcus aureus Một số biện pháp hạn chế ô nhiễm Staphylococcus aureus: +Giữ gìn tốt vệ sinh cá nhân, giảm tiếp xúc thực phẩm đã nấu chín không để tiếp xúc trực tiếp với người +Ngăn ngừa ô nhiễm chéo giữa thực phẩm chưa nấu chín thức ăn đã nấu chín +Bảo quản thực phẩm đã nấu chín ( ở nhiệt độ 50c 600c) Tụ cầu khuẩn thường chịu đựng tốt các thay đổi của môi trường khô hạn, ánh nắng, nhiệt độ, thay đổi pH độ mặn Nhân viên y tế những người có tỉ lệ mang vi khuẩn cao Các biện pháp mang mũ khăn trùm đầu, mạng che mặt trang rửa tay thường xuyên biện pháp phòng lây truyền vi khuẩn hữu hiệu nhất bệnh viện đặc biệt các đơn vị hồi sức Những biện pháp cũng được áp dụng cho những người làm việc các bếp ăn tập thể các xưởng chế biến thực phẩm Tỷ lệ người mang vi khuẩn tụ cầu vàng da niêm mạc vào khoảng từ 10 đến 90% Các khu vực cư trú thường gặp của tụ cầu vàng tiền đình mũi, tóc, nách nếp hậu môn Đây nguồn lây chéo các đơn vị hồi sức, đặc biệt ở các bệnh nhân suy giảm miễn dịch đái tháo đường, bệnh nhân AIDS xơ gan Chủng vi khuẩn nguy hiểm các khu vực tụ cầu vàng đề kháng với methicillin 1.8.2 Điều trị Điều trị bao gồm lưu chỗ tụ mủ, cắt loại mô hoại tử, loại bỏ dị vật sử dụng kháng sinh: Chọn lựa kháng sinh: cần làm kháng sinh cho từng bệnh nhân dùng gamma- globuline chống tụ cầu Mặc dù hầu hết các chung S aureus gây bệnh đều kháng penicillin Hiện người ta vẫn sử dụng các penicillin cephalosporine kháng với β-lactamase điều trị nhiễm trùng S.aureus Penicillin vẫn sử dụng vi khuẩn nhạy cảm Nafcilline Oxacilline loại penicillin kháng β-lactamase được chọn lựa điều trị bằng đường tiêm - 11 - Staphylococcus aureus Các trường hợp nhiễm tụ cầu nặng nên chọn sử dụng cephalosporine hệ thứ nhất cephazoline giá rẻ phở tác dụng rộng Nếu bệnh nhân không dung nạp với kháng sinh nhóm β-lactamase nên thay bằng vancomycine clindamycine chích Dicloxaciline vàcephalexine kháng sinh dạng uống được - 12 - Staphylococcus aureus Chương II: Phương pháp xác định - 13 - Staphylococcus aureus 2.1 Phương pháp truyền thống 2.1.1 Nguyên tắc S.aureus được xác định sở các đặc điểm tăng trưởng phản ứng đông huyết tương của các dòng thuần từ các khuẩn lạc đặc trưng môi trường phân lập 2.1.2 Môi trường hóa chất Môi trường canh Mannitol Salt Broth (MSB): môi trường được để phân tích định tính S.aureus hay định lượng bằng phương pháp MPN Môi trường thạch máu: máu được sử dụng máu cừu hay bê non tháng tuổi đã được loại bỏ các sợi máu hay máu đã được bổ sung chất chống đông citrate Môi trường cần được pha chế ít nhất ngày trước sử dụng để kiểm tra khả bị nhiễm Môi trường thạch Baird Parker Agar (BPA): thành phần lòng đỏ trứng tươi potassium tellurite chỉ được bổ sung vào môi trường sau khử trùng làm nguội đến 600c Môi trường thạch Tellurite Glycerine Agar (TGA) Môi trường Brain Heart Infusion (BHI) Huyết tương thỏ: huyết tương thỏ được cố định bằng 0,1% EDTA hay sodium oxalate được phân phối 0,3ml các ống nghiệm nhỏ 2.1.3 Phân tích định tính S.aureus Cấy 2ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 8ml môi trường MSB, trộn đều ủ ở 370 c 24 giờ Dùng que cấy vòng câý ria dịch mẫu từ ống (+) ( môi trường chuyển từ màu đỏ sang màu vàng) lên môi trường phân lập thạch TGA hay thạch Braird Parker, ủ ở 37 c 24 giờ Tìm khuẩn lạc đặc trưng của S.aureus môi trường phân lập có màu đen nhánh, sang, tròn, lồi, đường kính 1-1,5mm có vòng sang chung quanh khuẩn lạc Chọn khuẩn lạc đặc trưng, cấy vào môi trường BHI, ủ ở 370 c 24 giờ Cấy vào ống nghiệm nhỏ chứa khoảng 0,3ml huyết tương ủ ở 37 c 24 giờ để thử phản ứng đông kết Thực song song một ống đối chứng không cấy dịch vi sinh vật - 14 - Staphylococcus aureus Mẫu được kết luận có S.aureus thử nghiệm coagulase (+) (có xuất của khối đông ống đối chứng không có) 2.1.4 Định lượng S.aureus phương pháp đếm khuẩn lạc Phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định tế bào vi sinh vật sống diện mẫu tế bào sống tế bào có khả phân chia tạo thành khuẩn lạc môi trường chọn lọc Cách thực hiện: Đồng nhất mẫu pha loãng Cân chính xác 10g mẫu túi PE vô trùng, thêm 90ml dung dịch pha loãng, đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu khoảng 30 giây Chuẩn bị dãy pha loãng thập phân thích hợp tùy theo mức nhiễm của từng loại mẫu cho cấy một thể tích xác định lên đĩa thạch Baird Parker sẽ xuất khoảng 10-100 khuẩn lạc/ đĩa Phân lập môi trường chọn lọc Cấy 0.1ml mẫu ban dầu đã pha loãng vào đĩa môi trường thạch Baird Parker Dùng que cấy tam giác thủy tinh (thanh gạt thủy tinh) trải đều mẫu bề mặt môi trường khô úp ngược lại, thực lặp lại đĩa môi trương thạch Baird Parker cho độ pha loãng Trên môi trường thạch máu sau 24 giờ ủ S.aureus cho khuẩn lạc bóng, đục, lồi có màu xám hay vàng nhạt, đường kính khoảng 1-2mm hầu hết S.aureus có vùng tan máu, nhiên mợt số dịng khơng tạo vùng tan máu Khẳng định Dùng que cấy vòng cấy khuẩn lạc đặc trưng khuẩn lạc không đặc trưng từ môi trường Baird Parker lên môi trường thạch TSA, ủ ở 370c +_ 10c 24 giờ Cấy sinh khối vi khuẩn từ môi trường TSA vào các ống nghiệm chứa huyết tương đã rã đông, ủ ở 370c +_ 10c Theo dõi kết phản ứng đông huyết tương sau các khoảng thời gian 2,4,6,8 24 giờ Tính tỷ lệ khẳng định dựa số khuẩn lạc đặc trưng không được trưng Thực tương tự với các khuẩn lạc đặc trưng môi trường thạch máu Kết thử nghiệm (+) có khối đơng huyết tương hình thành ( mọi mức độ ngưng kết đều được xem (+)) Kết (-) khơng có hình thành khối đông, hỗn dịch vẫn đồng nhất ống không cấy Cách tính kết - 15 - Staphylococcus aureus Mật độ S.aureus mẫu được tính sau: 10.(Nt.Ht.+ Na Ha ) Mật độ (CFU/g hay CFU/ml) = _ F1 + F2 F: độ pha loãng Na: tổng số khuẩn lạc không đặc trưng Nt: tổng số khuẩn lạc đặc trưng Ht: tỉ số giữa số khuẩn lạc đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với số khuẩn lạc đặc trưng Ha: tỉ số giữa số khuẩn lạc không đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với số khuẩn lạc không đặc trưng 2.1.5 Định lượng S.aureus phương pháp MPN Phương pháp MPN ( phương pháp số có xác suất cao nhất) được gọi phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ Đây phương pháp dùng để đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất diện một đơn vị thể tích mẫu Đây phương pháp định lượng dựa kết định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác Phương pháp được dùng để định lượng S.aureus mẫu có mật độ S.aureus thấp mật độ vi sinh vật canh tranh cao, khó có thể xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Dung dịch mẫu được pha loãng thập phân với ba độ thập phân liên tiếp Tùy theo yêu cầu về độ chính xác của kết phân tích, có thể sử dụng phương pháp MPN với hệ thống ống nghiệm (3 độ pha loãng với lần lặp lại ở độ pha loãng) hay hệ thống 15 ống nghiệm (3 độ pha loãng với lần lặp lại ở độ pha loãng) Môi trường được sử dụng canh MSB hay Tryptose Soy Broth chứα 10% muối NaCl Cấy 1ml dịch mẫu có độ pha loãng khác vào ống 10ml môi trường, ủ ở 370c 48 giờ Kết quả: Chọn các ống (+), có vi sinh vật phát triển làm đục môi trường để tiến hành phân lập khuẩn lạc đơn môi trường thạch Baird Parker, Chọn các khuẩn lạc đặc trưng môi trường Baird Parker để thực thử nghiệm khẳng định S.aureus - 16 - Staphylococcus aureus tương tự trường hợp phương pháp đếm khuẩn lạc các đĩa cho kết khẳng định S.aureus (+) được đối chiếu với các ống nghiệm hệ thống các dãy ống nghiệm ban đầu ghi lại số ống nghiệm (+) ứng với độ pha loãng Tra bảng MPN để suy mật độ S.aureus mẫu ( MPN/g hay MPN/ml) 2.2 Phương pháp hiện đại 2.2.1 Phương pháp Probe( phương pháp lai phân tử) Phương pháp sử dụng mẫu dò để phát vi sinh vật thực phẩm được dựa phát một đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật sở của việc sử dụng mẫu dị quá trình lai phân tử Quá trình bao gồm tách rời mạch đôi của chuỗi xoắn kép DNA nhiệt độ vượt quá nhiệt độ nóng chảy của phân tử DNA tái bắt cặp giữa các đoạn DNA có trình tự nucleotit bở sung nhiệt đợ trở lại bình thường lai phân tử có thể xảy giữa DNA RNA Các thử nghiệm lai DNA sử dụng S.aureus- mẫu dò ADN cụ thể một hệ thống phát đo màu cho các phát của S.aureus thực phẩm Phương pháp một kiểm tra định lượng để xác định diện của S.aureus ở ô nhiễm mức độ lớn tế bào gam mẫu thực phẩm gốc Thao tác thực hiện: Làm phong phú các mẫu thực phẩm Cho 0,5ml mẫu, cho vào 12×0,75mm ống nghiệm riêng Cho 0,1ml thuốc thử vào ống lắc giây, sau đó ủ bồn nước 370c 30 phút Cho 0,1ml thuốc thử vào ống nghiệm lắc giây Thay nước ủ bồn nước 370 c 45 phút Thêm 0,5ml mẫu dò S aureus đã xử lý vào ống Đặt dipsticks vào mẫu nâng lên hạ xuống dipsticks lần để trộn ủ ở 65 c giờ Rửα dipsticks lần lần phút, lần đầu 650 c, sau đó ở nhiệt đợ phịng Chuyển dipsticks vòng ồng chứα 0,75ml enzyme liên kết ủ ở nhiệt đợ phịng 20 phút Rửa dipsticks lần phút ở nhiệt đợ phịng - 17 - Staphylococcus aureus Chuyển dipsticks đến ống chứa 0,75ml chất nền tạo màu ủ ở nhiệt đợ phịng 20 phút Bỏ các dipsticks thêm 0,25ml thuốc dừng Đọc kết bằng cách sử dụng Gene Trak quang kế 2.2.2 Phương pháp PCR Định nghĩa: PCR kỹ thuật khuếch đại acid nucleic giúp người nghiên cứu có đủ vật liệu di truyền để so sánh hay làm nguyên liệu cho các kỹ thuật khác Áp dụng kỹ thuật làm tùy tḥc vào cách sử dụng các yếu tố lien quan ( primer) các kỹ thuật bổ sung khác ( dùng enzyme, dùng kỹ thuật dấu) Ưu điểm: Độ nhạy cao, nhanh Có thể xác định một sinh vật mà mẫu của chúng tách riêng được Phương pháp PCR xác định gen TSST-1 củα S aureus (từ Libya) Nguồn xác định bao gồm vết thương, cổ họng, nhiễm trùng rốn các nguồn mẫu thực phẩm thịt, kem, bánh ngọt… Chủng được trồng môi trường thạch máu ở 370 c sau đó ủ qua đêm, giống được kiểm tra bởi nhuộm Gram sử dụng thử nghiệm catalase coagulase Sau thử nghiệm môi trường thạch máu tiến hành tách chiết DNA sau sử dụng lysozyme vortexing phút Trình tự mồi được sử dụng: 5’ –ATGGCAGCATCAGCTTGATA-3’ Và 5’-TTTCCAATAACCACCCGTTT-3’ Khuếch đại được thực theo các bước sau: Giống các bước thực PCR bình thường chỉ khác:1 chu kỳ lúc 940 c phút 30 chu kỳ phút ở 940 c sau 30 chu kỳ, các ống PCR được ủ ở 720 C phút trước làm mát đến 40 c Sản phẩm khuếch đại được thực bằng điện di thông qua một siêu 2%-tinh khiết agarose gel 1x đệm TBE (10x TBE 108 g Tris, 55,5 g acid boric, 9,3 g EDTA, pH 8,3, điều chỉnh để 1000 ml với nước) bromua ethidium nhuộm 2.2.3 Phương pháp Multiplex PCR - 18 - Staphylococcus aureus Định nghĩa Multiplex PCR ( m-PCR) phương pháp xác định nhanh nhiều đoạn sản phẩm cùng một lần phản ứng Nhiều cặp primers được cùng sử dụng tất các primers sẽ cùng đồng thời tương tác cùng một hỗn hợp môi trường chất chung Ưu nhược điểm Ưu điểm: giảm thời gian Nhược điểm: hỗn hợp phản ứng đa dạng, phải tạo điều kiện ( nhiệt độ, chất) cho nhiều phản ứng khác cùng có thể hoạt động Phương pháp Multiplex PCR Khoa Y học củα đại học Y Dược TP.HCM đã nghiên cứu chế tạo bộ thử nghiệm dùng phương pháp Multiplex PCR để phát Staphylococcus aureus đề kháng methicillin *Vật liệu phương pháp Vật liệu: Chủng vi khuẩn S.aureus ATCC 25923(MSSA), S aureus ATCC 43300 (MRSA) ,Steptococcus ogygenes một số chủng MRSA (1035,1037,1041,1105), MSSA(1014, 1015, 1020), MS SCN (1104), MR SCN (1016) đã được các tác giả nghiên cứu trước nhận định bằng kỹ thuật truyên thống Các mồi dùng nghiên cứu : - 19 - Staphylococcus aureus Phương pháp: Chuẩn bị DNA vi khuẩn Đun cách thủy ở nhiệt độ sôi huyền phù vi khuẩn (5 khóm/500 ml TE 1x) 10 phút Ly tâm 1400 vòng phút Bỏ cặn, thu phần dịch nổi pha loãng 10 lần bằng TE 1X Multiplex PCR dùng 2microlit DNA chiết nhanh trực tiếp huyền phù vi khuẩn mô tả ở trên, thêm 48 microlit hỗn hợp PCR 1×(160mM (NH4)2SO4,67mM Tris- HCl (pH 8,8)), 0,2 mM cho thứ bốn loại dNTP, 1,5mM đến 2,5mM MgCl2, 5pM đến 20Pm củα mồi fem Α, 25pM mồi mec Α 1,25U củα taq DNA polymerase Chu kỳ luân nhiệt 950 c 10phút, các bước (940 c 30 giây, 500 c đến 650 c 30 giây,720 c phút) lặp lại 35 lần, 72 0c 10 phút sau xác định điều kiện tối ưu của Multiplex PCR, một phản ứng được tạo thành với mồi fem Α để nhận định ccc chủng S.aureus, với đoạn mồi mec Α để nhận định đề kháng với mồi cho chủng vi khuẩn sau khuếch đại bằng PCR, lấy 5microlit phân tích điện di gel argarose 2% để ước tính kích thước của sản phẩm bằng cách so sánh với thang chuẩn 100bp Gel được nhuộm với ethidium bromide quan sát tia UV Kết chạy điện di: - 20 - Staphylococcus aureus Chương III: Kết luận đề nghị - 21 - Staphylococcus aureus 3.1 Kết luận Qua các phân tích đây, chúng ta có thể thấy được S.aureus loài vi sinh vật gây bệnh có ảnh hưởng nghiêm trọng chúng ta, chúng ta không ăn uống hợp vệ sinh Thật vậy, các vụ ngộ độc S.aureus thường nấu nướng không hợp vệ sinh, nấu nướng không kỹ , nhiệt độ không thích hợp 3.2 Đề nghị Chúng ta cần phải giữ vệ sinh ăn uống, nấu nướng hợp vệ sinh, đun sôi thật kỹ nấu ăn để tránh nhiễm phải vi khuẩn S.aureus, gây ngộ độc thức ăn, gây ảnh hưởng tới sức khỏe của thân - 22 - Staphylococcus aureus Tài liệu tham khảo http://vi.wikipedia.org/wiki/T%E1%BB%A5_c%E1%BA%A7u_khu%E1%BA%A9n 2.Bài giảng thực hành phân tích đánh giá chất lượng thực phẩm của Ks Phạm Minh Nhựt Ths.Bùi Đức Chí Thiện 3.http://www.fda.gov/Food/FoodSafety/FoodborneIllness/FoodborneIllnessFoodborne PathogensNaturalToxins/BadBugBook/ucm070015.htm http://kwd.ru/staphylococcus.htm - 23 - ... kể:         Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophyticus Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus capitis Staphylococcus simulans Staphylococcus hominis Staphylococcus warneri... của staphylococci là: Staphylococcus aureus( màu vàng) Staphylococcus albus( màu trắng).Loài được phát sau có tên gọi Staphylococcus epidermidis.Mặc dù có 20 loài Staphylococcus được... cua Bergey(2001), chỉ có Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis có ý nghĩa tác đợng đến người Khuẩn S.aureus có thể dc tìm thấy da, khoang miệng dày Staphylococcus aureus được