KY THUAT SX DUOC PHAM

PhÇn lín c¸c chñng vi sinh vËt sinh tæng hîp kh¸ng sinh nhãm aminoglycosid trong qu¸ tr×nh sinh tæng hîp cã kh¶ n¨ng t¹o ra ®ång thêi nhiÒu chÊt cã cÊu tróc rÊt gÇn nhau nh − chñng S[r]

Bé y tÕ

Kü thuËt

sản xuất dợc phẩm Tập II

Kỹ thuật sản xuất thuốc phơng pháp sinh tổng hợp

Sách đào tạo d−ợc sỹ đại học

M số: Đ20.Z.09

Chủ biên: PGS.TS Từ Minh Koóng

Chỉ đạo biên soạn

Vụ Khoa học & Đo tạo, Bộ Y tế

Chủ biên:

PGS.TS Từ Minh Koóng

Các tác giả biên soạn:

PGS.TS Từ Minh Koóng Đàm Thanh Xuân

Hiu ớnh:

Đàm Thanh Xuân

Lêi giíi thiƯu

Thực số điều Luật Giáo dục, Bộ Giáo dục vμ Đμo tạo vμ Bộ Y tế ban hμnh ch−ơng trình khung đμo tạo đối t−ợng lμ D−ợc sỹ Đại học Bộ Y tế tổ chức biên soạn tμi liệu dạy – học môn sở, chuyên môn vμ chuyên ngμnh theo ch−ơng trình nhằm b−ớc xây dựng sách chuẩn chuyên môn để đảm bảo chất l−ợng đμo tạo nhân lực y tế

Sách “Kỹ thuật sản xuất d−ợc phẩm, tập 2” đ−ợc biên soạn dựa ch−ơng trình giáo dục Tr−ờng Đại học D−ợc Hμ Nội sở ch−ơng trình khung đ−ợc phê duyệt Sách đ−ợc nhμ giáo giμu kinh nghiệm vμ tâm huyết với công tác đμo tạo biên soạn theo ph−ơng châm: Kiến thức bản, hệ thống; nội dung xác, khoa học; cập nhật tiến khoa học, kỹ thuật đại vμ thực tiễn Việt Nam

Sách “Kỹ thuật sản xuất d−ợc phẩm, tập 2” đ−ợc Hội đồng chuyên môn thẩm định sách vμ tμi liệu dạy – học chuyên ngμnh D−ợc sỹ Đại học Bộ Y tế thẩm định vμo năm 2006 Bộ Y tế ban hμnh lμm tμi liệu dạy – học đạt chuẩn chuyên môn ngμnh y tế giai đoạn 2006-2010 Trong trình sử dụng, sách phải đ−ợc chỉnh lý, bổ sung vμ cập nhật

Bộ Y tế xin chân thμnh cảm ơn cán giảng dạy Bộ môn Công nghiệp D−ợc Tr−ờng Đại học D−ợc Hμ Nội giμnh nhiều công sức hoμn thμnh sách nμy, cảm ơn GS Lê Quang Toμn vμ PGS TS Hoμng Minh Châu đọc, phản biện để sách đ−ợc hoμn chỉnh, kịp thời phục vụ cho công tác đμo tạo nhân lực y tế

Vì lần đầu xuất bản, chúng tơi mong nhận đ−ợc ý kiến đóng góp đồng nghiệp, bạn sinh viên vμ độc giả để lần xuất sau đ−ợc hoμn thiện

Lời nói đầu

Cuốn giáo trình "Kỹ thuật sản xuất d−ợc phẩm" đ−ợc biên soạn để giảng cho sinh viên Đại học D−ợc vμo học kỳ đ−ợc xuất lần thứ năm 2001, gồm tập Theo ch−ơng trình cũ, thời l−ợng giảng dạy mơn học nμy lμ so với kiến thức chung D−ợc sỹ Đại học Đặc biệt tình hình nay, sau có nghị Bộ Chính trị (NQ-46/BCT-2005) phát triển Công nghiệp D−ợc đất n−ớc tình hình mới, phải −u tiên phát triển cơng nghiệp sản xuất ngun liệu lμm thuốc, trọng Cơng nghiệp Hóa d−ợc vμ Cơng nghệ Sinh học Ban ch−ơng trình nhμ tr−ờng định tăng thêm đơn vị học trình cho học phần "Sản xuất thuốc Công nghệ sinh học"

Bộ môn biên soạn lại để xuất giáo trình gồm tập Cả ba tập có tên chung giáo trình: “Kỹ thuật sản xuất d−ợc phẩm”

Giáo trình đ−ợc biên soạn theo hai nội dung: Kỹ thuật sản xuất nguyên liệu lμm thuốc Kỹ thuật sản xuất dạng thuốc thμnh phẩm Trong đó:

Néi dung thø nhÊt gåm tËp lμ:

* TËp 1 Kü thuËt s¶n xuất thuốc phơng pháp tổng hợp hóa dợc v chiÕt xt d−ỵc liƯu

* TËp 2 Kü tht sản xuất thuốc phơng pháp sinh tổng hợp Nội dung thø hai gåm tËp lμ:

* TËp 3 Kỹ thuật sản xuất dạng thuốc

So với lần xuất tr−ớc, tác giả biên soạn cố gắng chắt lọc kiến thức chủ yếu để cung cấp cho ng−ời học hiểu đ−ợc ngμnh khoa học vừa hấp dẫn vừa quan trọng nμy Tuy nhiên, với nội dung phong phú, đa dạng vμ thời l−ợng hạn chế nên sâu đ−ợc Vì giáo trình khơng tránh khỏi thiếu sót Các tác giả mong nhận đ−ợc góp ý đọc giả để chỉnh sửa cho lần xuất sau đ−ợc hoμn chỉnh Xin chân thμnh cảm ơn

Môc lôc

phần I tổng quan Công nghệ sinh học Chơng Giới thiệu công nghệ sinh học

1.1 Công nghệ sinh học l gì?

1.2 Công nghệ sinh học - theo đuổi ®a ngμnh

1.3 C«ng nghƯ sinh häc - hạt nhân trung tâm ba thnh phần 1.4 An ton s¶n phÈm

1.5 Nhận thức cộng đồng công nghệ sinh học 1.6 Công nghệ sinh học vμ n−ớc phát triển Ch−ơng Nguyên liệu cho cơng nghệ sinh học

2.1 ChiÕn l−ỵc sinh khối

2.2 Nguyên liệu thô thiên nhiên 2.3 Tính sẵn có sản phẩm phụ 2.4 Nguyên liệu hoá học v hoá dầu

2.5 Nguyên liệu thô v tơng lai công nghệ sinh học Chơng Kü tht lªn men

3.1 Giíi thiƯu tỉng quát

3.2 Các giai đoạn phát triển vi sinh vật 3.3 Thiết bị lên men vi sinh vật

3.4 Cung cÊp kh«ng khÝ v« trïng cho nh máy lên men vi sinh vật 3.5 Khử trùng môi trờng công nghệ lên men

3.6 Lọc v thiết bị lọc công nghiệp sản xuất kháng sinh 3.7 Trình tự trình lên men

3.8 Thiết kế môi trờng cho trình lên men 3.9 Lên men chất rắn

3.10 Kỹ thuật nuôi cấy tế bμo động vật vμ thực vật 3.11 Quá trình tinh chế để thu sản phẩm

4.1 Đại cơng

4.2 Các øng dơng cđa enzym

4.3 Kü tht di trun công nghệ enzym 4.4 Kỹ thuật sản xuất enzym

4.5 Ph−ơng pháp bất động enzym (immobilised enzym) Ch−ơng Sản xuất Protein đơn bμo

5.1 Sự cần thiết sản xuất protein đơn bμo 5.2 Sản xuất sinh khối nấm men

5.3 Sản xuất tảo đơn bμo 5.4 Sản xuất nấm sợi

5.5 S¶n xuất nấm ăn 64

Chng Sn xut cỏc sản phẩm trao đổi chất bậc dùng Y học 6.1 Sản xuất aminoacid 66

6.2 S¶n xuÊt acid glutamic 67 6.3 S¶n xuÊt Dextran 70

6.4 Sinh tổng hợp Vitamin B12 73 6.4.1 Đại cơng 73

6.4.2 CÊu tróc ho¸ häc vμ tÝnh chÊt 74 6.4.3 Lên men sinh tổng hợp 75

6.4.4 Quy trình sản xuất 76 6.4.5 Quy trình chiết xuất 78

phần II Công nghệ sản xuất kháng sinh Chơng Đại cơng kháng sinh 7.1 Định nghĩa kháng sinh 83 7.2 Đơn vị kháng sinh 83 7.3 Phân loại kháng sinh 83

7.4 Các phơng pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh 84

7.5 Ph−ơng pháp gây đột biến vi sinh vật để nâng cao hiệu suất 87 7.6 Nghiên cứu điều kiện ni cấy chủng vi sinh vật sinh

kh¸ng sinh phân lập đợc 89

7.8 Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn vμ độc tính 89 7.9 Nghiên cứu d−ợc lý vμ điều trị kháng sinh 90 7.10 Tiêu chuẩn kháng sinh 90

7.11 Ph−ơng pháp định l−ợng kháng sinh 91 7.12 ứng dụng kháng sinh ngoμi lĩnh vực y học 94 Ch−ơng Sản xuất kháng sinh nhóm β-lactam 8.1 Đại c−ơng β -lactam 100

8.2 Sinh tổng hợp kháng sinh Penicillin 100

8.3 Sản xuất 6-APA v Penicillin bán tổng hợp 110 8.4 Sản xuất Cephalosporin 116

8.5 Sản xuất 7ACA; 7ADCA v kháng sinh bán tổng hợp nhóm cephalosporin 120

8.6 Sinh tỉng hỵp acid clavulanic 122

Chơng sản xuất kháng sinh nhóm Tetracyclin 9.1 Đại cơng 128

9.2 Công thức cấu tạo v tính chất 128

9.3 Sinh tổng hợp Tetracyclin tự nhiên 130 9.4 Sinh tổng hợp Clotetracyclin 134

9.5 Sinh tỉng hỵp Tetracyclin 136 9.6 Sinh tỉng hỵp Oxytetracyclin 139 9.7 Các Tetracyclin bán tổng hợp 142

Chơng 10 sản xuất kháng sinh nhóm aminoglycosid 10.1 Đại cơng chung aminoglycosid 146 10.2 Sinh tổng hợp Streptomycin 150

10.3 Sinh tỉng hỵp Gentamicin 157

Chơng 11 sản xuất kháng sinh nhóm macrolid 11.1 Tổng quan vỊ c¸c Macrolid 162

11 Sinh tỉng hợp Erythromycin 165 chơng 12 sản xuất kháng sinh chống ung th 12.1 Đại cơng 168

12.3 C¸c kh¸ng sinh chèng ung th− nguån gèc sinh học 170 12.4 Sinh tổng hợp Daunorubicin 172

chơng 13 sản xuất kháng sinh có nguồn gốc từ vi khn 13.1 Sinh tỉng hỵp Polymyxin 175

phần I tổng quan Công nghệ sinh học

Ch−¬ng

giíi thiƯu vỊ công nghệ sinh học

Mục tiêu

Sau học xong chơng ny, sinh viên phải trình by đợc:

1. Tờn cỏc lnh vc khoa hc có liên quan đến Cơng nghệ sinh học vμ

phạm vi ứng dụng Công nghệ sinh học ngμnh

2 TÇm quan träng cđa Công nghệ sinh học xu phát triển chung cña khoa häc thÕ kû 21

1 Công nghệ sinh học l gì?

Ngy khơng cịn nghi ngờ thμnh tựu công nghệ sinh học đem lại cho loμi ng−ời Chẳng mμ hai thập kỉ cuối kỉ XX, khoảng 20 giải Nobel đ−ợc trao cho khám phá lĩnh vực nghiên cứu nμy Để hiểu cơng nghệ sinh học lμ ta nêu vμi định nghĩa cơng nghệ sinh học

− “ViƯc øng dơng sinh vật, hệ thống v trình chế biến vo sản xuất v công nghiệp dịch vụ

“Việc kết hợp sử dụng hoá sinh, vi sinh vμ khoa học công nghệ để tạo khả ứng dụng vi sinh vật, mô tế bμo vμ phận chúng”

− “Công nghệ sử dụng t−ợng sinh học để chép vμ sản xuất vật phẩm hữu ích”

− “Việc ứng dụng ngμnh khoa học vμ kỹ thuật vμo trình biến đổi nguyên liệu tác nhân sinh học để sản xuất hμng hoá vμ cung cấp dịch vụ”

− “Công nghệ sinh học thực lμ tên đ−ợc đặt cho tập hợp trình vμ kỹ thuật.”

Công nghệ sinh học l việc giải m· vμ sư dơng c¸c kiÕn thøc vỊ sinh häc”

Có thể coi định nghĩa cơng nghệ sinh học sau Liên đoμn công nghệ sinh học châu Âu (EFB) lμ hoμn chỉnh cả:

"C«ng nghệ sinh học l kết hợp ngnh khoa häc tù nhiªn vμ

khoa học cơng nghệ để đạt tới ứng dụng vi sinh vật, tế bμo, một số thμnh phần tế bμo nhằm tạo sản phẩm vμ phục vụ (services) có lợi cho ng−ời”

Sở dĩ nói đến số thμnh phần tế bμo ngμy cơng nghệ enzym (enzyme technology) với enzym bất động hố (immobilized enzymes) khơng cần tới tế bμo tạo đ−ợc sản phẩm qui mơ lớn Sở dĩ nói đến phục vụ việc xử lý chống nhiễm môi tr−ờng công nghệ sinh học không tạo sản phẩm nh−ng có vai trị quan trng

Công nghệ sinh học phát triển nhanh chóng sở số kỹ thuật hon ton mẻ thờng gọi l kỹ thuật chìa khoá (Key-Technology) §ã lμ kü tht di trun (genetic engineering); kü tht dung hỵp tÕ bμo (cell fusion); kü tht sư dơng ph¶n øng sinh thĨ (bioreaction technology) bao gåm kü thuËt lªn men (fermentation technology), kü thuËt enzym (enzyme technology) v bình phản ứng sinh vật (bioreactor); kỹ thuật nuôi cÊy tÕ bμo (cell culture technique); kü thuËt nu«i cÊy m« (tissue culture technique); kü tht chun ph«i (embryo tranplantation) vμ kü tht chun nh©n tÕ bμo (nucleus tranplantation)

2 Công nghệ sinh học - theo đuổi ®a ngμnh

Công nghệ sinh học lμ −u tiên trình theo đuổi đa ngμnh Trong thập kỉ gần đây, nét đặc tr−ng phát triển khoa học vμ công nghệ lμ ph−ơng pháp dùng chiến l−ợc đa ngμnh để đạt đ−ợc giải pháp cho vấn đề khác Điều nμy dẫn đến đời lĩnh vực nghiên cứu đa ngμnh vμ cuối tạo ngμnh với khái niệm vμ ph−ơng pháp đặc tr−ng Kĩ thuật hố học vμ hố sinh lμ hai ví dụ dễ nhận thấy ngμnh khoa học cho hiểu sâu sắc q trình hố học vμ sở hoá sinh hệ thống sinh học

Công nghệ sinh học xuất thông qua tác động qua lại lẫn phần khác sinh học vμ kỹ thuật

Một nhμ công nghệ sinh học sử dụng kỹ thuật: hố học, vi sinh học, hố sinh vμ tin học (Hình 1.1) Mục đích lμ sáng tạo, phát triển vμ tối −u hố q trình, chất xúc tác hố sinh giữ vai trị tảng vμ khơng thay đ−ợc Nhμ cơng nghệ sinh học phải biết hợp tác chặt chẽ với chuyên gia lĩnh vực liên quan nh− y học, dinh d−ỡng học, hố học, d−ợc học, bảo vệ mơi tr−ờng vμ xử lý chất thải Việc ứng dụng công nghệ sinh học ngμy cμng cho thấy tính chất phụ thuộc lẫn khoa học liên ngμnh, muốn đạt đ−ợc thμnh cơng nghiên cứu ngμnh mình, cần

hiểu đợc ngôn ngữ kỹ thuật ngnh khác, hiểu đợc tiềm nh hạn chÕ cđa c¸c ngμnh kh¸c

Cơng nghệ sinh học có yêu cầu cao kỹ chuyên môn, nghiệp vụ Biết đầu t− vμo việc phát triển ngμnh cơng nghệ nμy đ−ợc h−ởng lợi ích lâu dμi Cơng nghệ sinh học có số lĩnh vực hoạt động nh− sau:

− Điều trị học: d−ợc phẩm dùng để điều trị bệnh cho ng−ời bao gồm kháng sinh, vaccin, liệu pháp gen

− Chẩn đốn: kít dùng để xét nghiệm chẩn đốn lâm sμng, thực phẩm, môi tr−ờng, nông nghiệp

− Nông nghiệp, lâm nghiệp, lμm v−ờn: giống mới, động vật, thuốc trừ sâu

− Thực phẩm: bao gồm sản xuất thực phẩm, đồ uống, phụ gia, phõn bún

Môi trờng: xử lý chất thải, chất có chất sinh học, sản xuất l−ỵng

− Các hố chất trung gian: hố chất cần thiết cho công nghệ sinh học nh−: enzym, ADN, ARN, hoá chất đặc biệt

− Thiết bị: phần cứng, phần mềm tin học, bình phản ứng sinh học v thiết bị khác có tính hỗ trợ cho công nghệ sinh học

Nhiều q trình cơng nghệ sinh học có nguồn gốc từ q trình lên men cổ truyền nh− lên men r−ợu, bia, men bánh mì, sữa chua, mát, dấm Chỉ công nghệ lên men sản xuất Penicillin qui mơ lớn ngμnh cơng nghệ lên men thực có b−ớc nhảy vọt Từ đến chứng kiến phát triển phi th−ờng công nghệ nμy Biết bao sản phẩm công nghệ lên men cung cấp lμm phong phú thêm sống vμ cứu chữa đ−ợc mạng sống khỏi tử thần Nhìn t−ơng lai, nhμ khoa học cho kỷ XXI lμ kỷ nguyên công nghệ sinh học nh− hoá học vμ vật lý lμ đặc tr−ng kỷ XX

Về mặt lý thuyết, cơng nghệ sinh học chuyển gen từ sinh vật sang sinh vật khác, vi sinh vật khác, thực vật hay động vật khác (xem Ch−ơng 3), thực tế có nhiều yếu tố chi phối nh− gen nμo phải tạo dịng vơ tính vμ cách chọn gen nh− nμo yếu tố hạn chế việc ứng dụng kỹ thuật di truyền lμ thiếu kiến thức khoa học cấu trúc gen chức Đối với thực vật phải l−u ý khoảng 150 gen thực vật tổng số 10.000 biết đ−ợc đặc điểm mức ADN

Công nghệ sinh học phát triển với tốc độ gần với tốc độ phát triển vi điện tử vμo năm 70 Tuy nhiên, nhμ nghiên cứu công nghệ sinh học h−ớng nghiên cứu vμo mục đích th−ơng mại nhằm mục đích vừa phục vụ, vừa thu lợi nhuận Công nghệ sinh học có ảnh h−ởng to lớn đến tất ứng dụng công nghiệp khoa học sống Cμng ngμy ng−ời ta cμng nhận thấy nguồn nhiên liệu lỏng có nguồn gốc hố thạch trái đất hết, nguồn l−ợng khác đ−ợc nghiên cứu để thay thế, công nghệ sinh học giúp nhμ nghiên cứu tìm nguồn l−ợng vừa rẻ tiền vừa an toμn Những quốc gia có điều kiện khí hậu phù hợp với điều kiện sản xuất sinh khối có −u lớn lao mặt kinh tế quốc gia có điều kiện phù hợp Những n−ớc nhiệt đới phải nắm đ−ợc tiềm to lớn để đẩy mạnh phát triển công nghệ sinh học

Công nghệ sinh học d−ờng nh− xuất sớm lĩnh vực bảo vệ sức khoẻ vμ y học, tiếp sau lμ công nghệ thực phẩm Năm 1982, công nghệ gen tạo đ−ợc insulin để chữa bệnh đái tháo đ−ờng Gen để sản xuất insulin từ tuyến tuỵ ng−ời đ−ợc tách đem ghép vμo ADN E coli, nuôi cấy vi khuẩn E coli thu lấy insulin kỹ thuật thích hợp hố sinh Trong việc chẩn đoán lâm sμng có hμng trăm kít chuẩn khác vừa xác vừa cho kết nhanh chóng Đặc biệt để phát mầm gây bệnh có máu giúp cho việc truyền máu an toμn Công nghệ sinh học giúp cho việc cải thiện chất l−ợng thực phẩm, tăng dinh d−ỡng, tạo thực phẩm chức giúp cho ng−ời sống lâu vμ chất l−ợng sống tốt

Nhiều công ty công nghệ sinh học đời doanh nhân lμ nhμ khoa học từ môi tr−ờng hμn lâm, họ muốn xây dựng vμ phát triển ngμnh khoa học có hμm l−ợng chất xám cao, ngμnh cơng nghệ mang tính “bác học”

Những cơng ty cơng nghệ sinh học có đặc điểm mμ th−ờng không gặp công ty khác Có thể tóm tắt nh− sau:

− Cơng nghệ điều chỉnh vμ gồm nhiều ngμnh, việc phát triển sản phẩm có liên quan đến nhμ sinh học phân tử, nhμ nghiên cứu lâm sμng

− Môi tr−ờng th−ơng mại đ−ợc đặc tr−ng thay đổi nhanh chóng vμ rủi ro đáng kể, đổi cơng nghệ sinh học nhanh chóng lμm thay đổi khác

− Cần phải quản lý: quan chức năng, nhận thức cộng đồng, vấn đề sức khoẻ vμ an toμn, đánh giá rủi ro

Sự phát triển thơng mại công nghệ sinh học phụ thuộc nhiều vo đầu t, thờng l nhu cầu đầu t lớn, trớc thu ®−ỵc lỵi nhn

3 Cơng nghệ sinh học - hạt nhân trung tâm ba thμnh phần Nhiều trình cơng nghệ sinh học đ−ợc coi lμ có hạt nhân trung tâm ba thμnh phần Trong thμnh phần thứ liên quan đến chất xúc tác sinh học lμm nhiệm vụ đặc biệt trình Thμnh phần thứ hai giúp cho thμnh phần thứ thực đ−ợc q trình kỹ thuật tốt nhất, cịn thμnh phần thứ ba th−ờng gọi lμ q trình xi dòng (downstream processing) liên quan đến việc tách vμ tinh chế sản phẩm chính, sản phẩm trình lên men

Trong đa số chất xúc tác đ−ợc sử dụng đến nay, hiệu bền vững vμ thuận tiện trình sinh học lμ vi sinh vật nguyên vẹn Vì phần lớn q trình cơng nghệ sinh học liên quan đến q trình vi sinh Điều nμy khơng loại trừ việc sử dụng sinh vật bậc cao, đặc biệt tế bμo động vật vμ thực vật ngμy cμng có vai trị quan trọng cơng nghệ sinh học đại

Trong thiên nhiên, vi sinh vật đ−ợc coi nh− nhân tố việc cố định l−ợng quang hợp, nh− hệ thống dẫn đến thay đổi hoá học hầu hết loại phân tử hữu tự nhiên vμ tổng hợp Vi sinh vật chứa nguồn gen vô phong phú vμ khả tổng hợp nh− phân huỷ hầu nh− vô tận Mặt khác, vi sinh vật có tốc độ sinh tr−ởng nhanh mμ khơng động vật nμo có đ−ợc

bằng kỹ thuật di truyền thông th−ờng, hay kỹ thuật di truyền thu đ−ợc giống có −u điểm mμ ta mong muốn (Ch−ơng 3)

Những vi sinh vật đ−ợc chọn lọc cần phải nghiên cứu biện pháp nuôi giữ để cho khơng bị hoạt tính để dùng sản xuất lâu dμi Một số tr−ờng hợp chất xúc tác đ−ợc dùng dạng tách vμ tinh chế nh− enzym Việc tách vμ tinh chế enzym cho mục đích xúc tác sinh học trình bμy Ch−ơng

4 An toμn s¶n phÈm

Trong công nghệ sinh học, qui định Nhμ n−ớc định đầu t− cho nghiên cứu vμ cho phép đ−a sản phẩm nghiên cứu vμo sử dụng Các quan chức đóng vai trị “ng−ời gác cổng” cho phép nghiên cứu hay sản xuất sản phẩm vμ sử dụng chúng Các qui định lμ rμo cản đáng kể cho phát triển công nghệ sinh học Trên thực tế rμo cản nμy có nguồn gốc từ chi phí cho việc thử sản phẩm có đáp ứng tiêu chuẩn qui định hay không? Sự chậm trễ vμ hay thay đổi việc thơng qua qui định vμ chí phản đối thẳng thừng sản phẩm lý an toμn Việc sử dụng công nghệ tái tổ hợp ADN tạo mối lo ngại độ an toμn sản phẩm Thái độ cộng đồng công nghệ sinh học phần lớn liên quan đến vấn đề nguy hiểm t−ởng t−ợng hay cảm tính kỹ thuật thao tác gen

5 Nhận thức cộng đồng công nghệ sinh học

Trong công nghệ sinh học thể tiềm to lớn việc bảo vệ sức khoẻ vμ phát triển sản xuất, việc chế biến vμ đảm bảo chất l−ợng thực phẩm kỹ thuật gen, sản xuất phân bón, thuốc trừ sâu sinh học, vaccin, loại động vật vμ giống khác nhau, liên quan q trình cơng nghệ sinh học nμy v−ợt ngoμi lợi ích mặt kỹ thuật Việc thực kỹ thuật nμy phụ thuộc nhiều vμo chấp nhận ng−ời tiêu dùng Trong báo cáo phát triển ngμnh công nghệ sinh học ủy ban t− vấn khoa học vμ công nghệ Mỹ viết: "Nhận thức cộng đồng cơng nghệ sinh học có ảnh h−ởng to lớn đến tốc độ vμ ph−ơng h−ớng phát triển cơng nghệ sinh học, vμ có lo ngại ngμy cμng tăng sản phẩm biến đổi gen Liên quan đến việc thao tác gen lμ câu hỏi khác độ an toμn, đạo đức vμ việc bảo vệ"

lại kỹ thuật gen với giọng điệu cảm động vμ thiếu sở lμm cho trị gia vμ cộng đồng nhầm lẫn Những lợi ích to lớn cơng nghệ sinh học đem lại tự nói lên vμ đ−ợc bμn đến ch−ơng sau

6 Công nghệ sinh học v nớc ph¸t triĨn

Một nơng nghiệp thắng lợi lμ câu trả lời cho việc rút ngắn khoảng cách n−ớc giμu vμ n−ớc nghèo n−ớc phát triển khoa học nông nghiệp phát triển mạnh, sản xuất l−ợng lớn sản phẩm chất l−ợng cao Công nghệ sinh học nông nghiệp cμng cải tiến chất l−ợng, chủng loại vμ sản l−ợng nông nghiệp Liệu loμi đ−ợc cải biến kỹ thuật gen có tìm đ−ợc đ−ờng đến với n−ớc phát triển đảm bảo suất cao hơn, sức đề kháng bệnh tốt vμ dễ đ−ợc thị tr−ờng chấp nhận hơn? Ch−a có rõ rμng, xảy n−ớc giμu ngμy cμng đ−ợc cung cấp thừa thãi thực phẩm Liệu có đủ l−ơng thực cho ng−ời nh−ng tiếp tục phân bố không không? Sự phát triển công nghệ sinh học cần đầu t− tiền vμ lực l−ợng lao động lμnh nghề cao Cả hai yếu tố n−ớc phát triển thiếu

Tr−ớc số quốc gia phát triển hợp tác có hiệu với cơng ty công nghệ sinh học ph−ơng Tây Song ngμy cμng thấy đầu t− nμy bị giảm dần Ví dụ từ năm 1986 - 1991, tỷ lệ thoả thuận đ−ợc công ty sinh học Mỹ thực với n−ớc phát triển giảm từ 30% 3%! Các n−ớc phát triển cần nhìn rõ tiềm cơng nghệ sinh học mμ có ph−ơng h−ớng phát triển cho phù hợp với trình độ vμ tiềm đất n−ớc mình, phải biết tắt đón đầu, nhanh chóng hội nhập vμ cố gắng có phát minh riêng

Cuối cần nói hầu hết ngμnh khoa học trải qua thời kỳ vμng son mμ cách tiếp cận mở đ−ờng cho phát triển vμ nhanh chóng Cơng nghệ sinh học bắt đầu, nhớ lấy lời nhắn nhủ “hoặc bắt đầu không bao giờ” T−ơng lai sáng lạn chờ ta phía tr−ớc

Chơng

Nguyên liệu cho công nghệ sinh học

Mục tiêu

Sau học xong chơng ny sinh viên phải trình by đợc: 1. Tên nguồn nguyên liệu chủ yếu cđa CNSH

2 ¦u thÕ cđa CNSH so với ngnh khác việc tận dụng sản phÈm phơ.

1 ChiÕn l−ỵc sinh khèi

Ước tính sản l−ợng hμng năm sinh khối thực vật tạo quang hợp khoảng 120 tỉ chất khô mặt đất vμ khoảng tỉ từ đại d−ơng Trong số sinh khối sản mặt đất có khoảng 50% d−ới dạng lignocellulose Tỉ lệ lớn sinh khối mặt đất (44%) lμ từ rừng (bảng 2.1)

Bảng 2.1. Phân chia sản l−ợng sinh khối sản xuất trái đất

Sinh khối sản xuất trái đất Năng suất thực (% tổng số )

Rừng vùng có cối Đồng cỏ

Đất canh tác

Hoang mạc bán hoang mạc Nớc

Đại dơng

44,3% 9,7% 5,9% 1,5% 3,2% 35,4%

của công nghệ sinh học vùng phát triển nơi có tăng tr−ởng thực vật trội hơn, có khả dẫn đến thay đổi cán cân kinh tế

Cần nhận thấy nguồn nguyên liệu l−ợng không tái chế đ−ợc mμ xã hội đại phụ thuộc nh− dầu mỏ, than đá có nguồn gốc từ sinh khối cổ đại Những quốc gia có cơng nghiệp đại ngμy cμng phụ thuộc vμo dự trữ nguồn l−ợng nμy nh− nguồn nguyên liệu cho hμng loạt cỏc ngnh sn xut

Bảng 2.2. Sản lợng hàng năm số sản phẩm nông, lâm nghiệp giới (Nguồn: từ tổ chức phát triển hợp tác kinh tế, 1992)

Ngành Sản phẩm Sản lợng (tấn)

Trị giá (tỷ $)

Ngò cèc 1,8 tû 250

MÝa 120 triệu -

Đờng

Củ cải 1,8 triệu -

Cá 85 triệu

Tinh bột thô 1,0 tỷ 17

Lơng thực thức ăn gia súc

Tinh bột tinh chế 20 triệu -

TiÒm gỗ 13 tỷ -

Gỗ thu hoạch 1,6 tỷ -

Gỗ nhiên liệu - 100

Gỗ c−a 200 triÖu 60

VËt liÖu

GiÊy - 110

Dầu glycerin 70 -

Dầu đậu tơng 17

Dầu cọ 10

Dầu hớng dơng

Dầu hạt cải

Tinh bét -

Ho¸ chÊt

Cao su tự nhiên 4

Các loại hoa 10

Kh¸c

Gần kỷ qua, giới cơng nghiệp hố phải nhờ đến nguyên liệu hoá thạch mμ phải hμng trăm triệu năm để hình thμnh d−ới lịng đại d−ơng hay sâu lòng đất Hơn việc sử dụng lại không công bằng: Hiện n−ớc Mỹ với 6% dân số vμ Tây Âu với 8% dân số giới sử dụng 31% vμ 20% t−ơng ứng toμn sản l−ợng dầu vμ khí giới

Trong dự trữ than kéo dμi hμng trăm năm nguồn dầu vμ khí với mức tiêu thụ nh− cạn kiệt vμo lúc nμo kỷ XXI nμy Câu trả lời vấn đề nμy lμ phải dùng sinh khối từ quang hợp để cung cấp l−ợng vμ nguyên liệu cho công nghiệp Những năm gần cho thấy hμng năm l−ợng đ−ợc sinh từ quang hợp gấp 10 lần so với l−ợng ng−ời sử dụng Việc khai thác sinh khối qui mô lớn dùng cho nhiên liệu vμ nguyên liệu bị hạn chế giá thμnh cịn đắt giá ngun liệu hố thạch

Sử dụng sinh khối trực tiếp nh− lμ nguồn nguyên liệu vùng cơng nghiệp hố nh− Mỹ la tinh, ấn Độ, châu Phi n−ớc phát triển, sinh khối từ nông nghiệp vμ lâm nghiệp đ−ợc dùng chủ yếu công nghiệp vμ thực phẩm (bảng 2.2) Hiện sinh khối đ−ợc sử dụng để sản xuất sản phẩm công nghiệp vμ th−ơng mại quan trọng (bảng 2.3) vμ chất dùng công nghệ sinh học đ−ợc nêu bật vμ nói rõ chng sau

Bảng 2.3. Những sản phẩm quan trọng tõ sinh khèi

Nhiªn liƯu

- Methan (biogas) đặc biệt n−ớc phát triển - Sản phẩm nhiệt phân (khí, than)

- Ethanol (th«ng qua lên men rỉ đờng cellulose) - Dầu (từ hydro hoá)

- Đốt trực tiếp chất thải sinh khèi

Nguyªn liƯu

- Ethanol (ngn nguyªn liƯu có tiềm cho công nghiệp) - Khí tổng hợp (từ trình khí hoá)

- Phân bón

- Phân trộn (compot) - Bùn

Thức ăn gia sóc

- Bổ sung trực tiếp vào thức ăn gia súc - Đạm đơn bào

2 Nguyªn liệu thô thiên nhiên

Bảng 2.4. Các loại sản phẩm phụ làm chất CNSH

Ngành Các sản phẩm phụ dùng làm chất

Nông nghiệp

Rơm

BÃ mía, củ cải đờng Lõi ngô

Vỏ cà phê, côca, dừa Vỏ, trái

ChÊt th¶i cđa chÌ

Bánh ép từ hạt để lấy dầu Chất thải từ bơng

C¸m

Thịt cà chua, cà phê, chuối, dứa, chanh, ô liu Chất thải gia súc

Lâm nghiệp

Chất thải dung dịch thuỷ phân gỗ Dung dịch n−ớc sulfat hoá Vỏ cây, mùn c−a, cnh cõy Giy v cellulose

Sợi phíp

Công nghiệp

Mật đờng

Chất thải nhà máy ch−ng cÊt r−ỵu

Chất lỏng giống nh− n−ớc sau sa chua ụng li

Nớc thải công nghiệp từ CN thực phẩm (ô liu, dầu cọ, cà chua, chà là, chanh, sắn)

Nc thi (t ngnh sa, đóng hộp, bánh kẹo, n−ớng bánh mỳ, đồ uống khơng cn, mch nha, nc ngõm ngụ)

Chất thải ngành thủ s¶n

Sản phẩm phụ ngành chế biến thịt Rác thị

N−íc cèng

ChÊt th¶i lò sát sinh

Nhng nguyờn liu thụ cú chứa đ−ờng nh− củ cải đ−ờng, mía sẵn vμ thích hợp để dùng lμm ngun liệu cho cơng nghệ sinh học Do việc sử dụng đ−ờng truyền thống đ−ợc thay đ−ờng có hiệu t−ơng đ−ơng dẫn đến thừa đ−ờng hμng hoá vμ khuyến khích phát triển cách sử dụng Nhiều ngμnh kinh tế nhiệt đới phá sản nh− thị tr−ờng đ−ờng bị Đ−ờng mía đ−ợc sử dụng Brazil lμm ngun liệu cho ch−ơng trình khí gas, số quốc gia khác nghiên cứu để áp dụng tiềm to lớn nμy

Nguồn nguyên liệu vô tận từ thiên nhiên lμ cellulose trở thμnh ngun liệu cho cơng nghệ sinh học Bởi khơng có xanh sống trái đất khơng cịn Tuy nhiên hμng loạt khó khăn mặt cơng nghệ cần phải khắc phục tr−ớc có đ−ợc lợi ích kinh tế từ hợp chất phong phú nμy Cellulose nguyên chất phân huỷ hoá học enzym thμnh đ−ờng, sau lên men để tạo thμnh sản phẩm khác nh− ethanol, aceton, protein đơn bμo metan vμ sản phẩm khác Ng−ời ta tính tốn hμng năm có khoảng 3.3 x 1014 kg CO

2 đ−ợc cố định bề mặt trái đất vμ khoảng

6% sè nμy, tøc 22 ngμn triÖu tÊn mét năm thnh cellulose Trên giới cối hng năm sản xuất 24 cellulose đầu ngời Thêi gian sÏ cho chóng ta thÊy r»ng lignocellulose lμ nguồn carbon hữu ích cho phát triển công nghệ sinh học

3 Tính sẵn có sản phÈm phơ

Nhiều q trình cơng nghệ sinh học sử dụng sản phẩm nông nghiệp nh− đ−ờng, tinh bột, dầu thực vật lμm nguyên liệu nhiều chất thải từ nông nghiệp ch−a đ−ợc dùng, chắn đ−ợc nghiên cứu để sử dụng t−ơng lai không xa Chất thải nông nghiệp vμ lâm nghiệp đa dạng chủng loại nh−: rơm ngũ cốc, vỏ vμ lõi ngô, chất thải từ đậu t−ơng, vỏ dừa, vỏ hạt cμ phê, rỉ đ−ờng mía Chất thải lâm nghiệp gồm: vỏ gỗ, mùn c−a vỏ cây, (bảng 2.4) lμ phần nhỏ chất thải đ−ợc dùng qui mô cơng nghiệp, phần cịn lại ch−a đ−ợc sử dụng

Mục đích chủ yếu cơng nghệ sinh học lμ cải tiến cách quản lý vμ sử dụng số l−ợng lớn chất thải hữu nông nghiệp, công nghiệp vμ đô thị toμn cầu Xử lý chất thải lμm giảm thiểu nguồn ô nhiễm, đặc biệt lμ ô nhiễm n−ớc vμ biến số chất thải thμnh sản phẩm có ích

Xử lý n−ớc thải nhiễm công nghệ sinh học, ph−ơng pháp siêu lọc Ng−ời ta sử dụng mμng xốp cho n−ớc qua nh−ng không cho chất rắn chất có phân tử lớn qua Tuy nhiên ph−ơng pháp nμy giá thμnh đắt, đ−ợc dùng số lĩnh vực nh− sản xuất n−ớc phục vụ cho ng−ời sống biển thiếu n−ớc ngọt, chất rắn không độc khỏi n−ớc

tồn với khoảng thời gian kéo di phơng pháp sử dụng phù hợp đợc xem xét (bảng 2.5)

Bảng 2.5 Chiến lợc CNSH sử dụng chất thải hữu phù hợp

Nâng cấp chất l−ợng chất thải thực phẩm để biến chúng thành sản phẩm thích hợp phục vụ việc s dng ca ngi

Đa chất thải thực phẩm trực tiếp qua xử lý vào làm thức ăn cho lợn, gia cầm, cá vật nuôi khác

Sản xuất biogas (methan) sản phẩm lên men khác chi phí cho việc xử lý chất thải làm thức ăn gia súc tốn

Những mục đích chọn lọc khác nh− dùng trực tiếp làm nhiên liệu, vật liệu xây dựng

Hai chất thải có nhiều đ−ợc ứng dụng để lên men lμ rỉ đ−ờng vμ n−ớc thải công nghệ sản xuất sữa chua Rỉ đ−ờng lμ sản phẩm phụ cơng nghệ đ−ờng có chứa khoảng 50% đ−ờng khử Rỉ đ−ờng đ−ợc sử dụng rộng rãi lμm nguyên liệu lên men sản xuất kháng sinh, acid amin, acid hữu cơ, nấm men th−ơng mại để sản xuất bánh mì vμ dùng trực tiếp để nuôi gia súc N−ớc thải công nghệ sữa chua, phomát đ−ợc sử dụng cho cụng ngh lờn men

Những chất thải nh rơm rạ, bà mía sẵn v ngy cng đợc sử dụng nhiều trình phân huỷ lignocellulose ngy cng đợc cải tiến (bảng 2.6)

Bng 2.6. Các xử lý cần thiết để chất s dng lờn men

Nguyên liệu Cơ chất Xử lý

Các nguyên liệu chứa đờng

Mía, củ cải đờng, rỉ đờng, nớc ép hoa quả, nớc sữa

Cần pha loÃng khử trùng

Các nguyên liệu chứa tinh bột

Ngũ cốc, rau quả, chất thải lỏng từ trình chế biến

Cần xử lý thuỷ phân acid enzym, tách thành phần tinh bột trớc

Các nguyên liệu chứa lignocellulose

Lõi ngô, trấu, rơm rạ, bà mía, chất thải gỗ, dung dịch sulfat, chất thải giấy

Cn lm nguyờn liệu sau thuỷ phân hố học enzym, đòi hỏi nhiều l−ợng đắt tiền

4 Nguyên liệu hoá học v hoá dầu

Bên cạnh việc phát triển sản xuất protein đơn bμo (single cell protein, viết tắt lμ SCP) vμ sản phẩm hữu khác, số nguyên liệu hoá dầu, hoá học trở thμnh nguyên liệu quan trọng cho công nghệ lên men Những nguyên liệu nμy có nhiều −u điểm nh− sẵn có với khối l−ợng lớn vμ có chất l−ợng địa điểm khác giới Do khí tự nhiên hay methan vμ dầu khí đ−ợc coi nh− nguyên liệu thô chúng dễ chế biến Mối quan tâm mặt th−ơng mại lμ n-parafin, methanol, ethanol Các chất nμy đ−ợc sử dụng vμo mục đích khác công nghệ sinh học, đặc biệt để sản xuất SCP đ−ợc nói kỹ phần sau Trong t−ơng lai q trình cơng nghệ sinh học ngμy cμng tận dụng đ−ợc nguyên liệu tái chế thiên nhiên, chất thải giá trị gây ô nhiễm môi tr−ờng Bảng 2.7 tóm tắt mặt kỹ thuật cần l−u ý tiếp cận với chất thải muốn sử dụng lm nguyờn liu

Bảng 2.7. Những cân nhắc kü tht cho viƯc sư dơng chÊt th¶i

Néi dung Đặc điểm

Sự sẵn có mặt sinh học

ã Thấp (cellulose)

ã Trung bình (tinh bột, lactose)

ã Cao (rỉ đờng, đờng hoa quả)

Nng

ã Chất rắn (phần lại sau xay rác)

ã Cụ c (mt mớa)

ã LoÃng (lactose, đờng hoa quả)

ã Rất loÃng (dung dịch xử lý trình)

Chất lợng

ã Sạch (mật mía, lactose)

ã Trung bình (rơm)

ã Bẩn (rác, chất thải gia súc)

Vị trí

ã Tp trung (nơi đặt thiết bị lớn)

• TËp trung chuyên môn hoá (dầu cọ, ô liu, chà là, cao su, hoa quả)

ã Phân tán (rơm, rừng)

Mùa ã Kéo dài (dầu cọ, lactose)

ã Rt ngắn (chất thải ngành đóng hộp rau quả)

Cách sử dụng tơng đơng

ã Một số cách (rơm)

ã Không có (rác)

ã Cách tiêu cực (nớc thải) Tiềm công nghệ

ca a phng

ã Cao (Mỹ)

ã Trung bình (Brazil)

5 Nguyên liệu thô vμ t−ơng lai công nghệ sinh học Chúng ta biết phát triển t−ơng lai trình cơng nghệ sinh học qui mơ lớn khơng thể tách rời việc cung cấp nguyên liệu thô vμ giá trị chúng Tiêu chuẩn quan trọng định việc chọn ngun liệu thơ cho q trình cơng nghệ sinh học bao gồm sẵn có, giá cả, thμnh phần vμ hình thức, tình trạng oxy hố nguồn carbon Nguyên liệu đ−ợc sử dụng rộng rãi lμ ngơ, đ−ờng thơ, rỉ đ−ờng, methanol

Tóm lại, ngũ cốc lμ ngun liệu thơ ngắn hạn vμ trung hạn cho q trình cơng nghệ sinh học vμ có giá trị th−ơng mại, lμ tinh bột Tuy nhiên việc nμy khơng ảnh h−ởng đến cung cấp l−ơng thực cho ng−ời vμ vật nuôi Sự khủng hoảng thừa ngũ cốc xảy nơi mμ công nghệ sinh học đ−ợc ứng dụng rộng rãi Đây lμ ví dụ chứng minh hiệu cho đầu t− phát triển ngμnh khoa học đầy triển vọng nμy

Mặc dù ng−ời ta ý nhiều đến việc sử dụng chất thải cơng nghệ sinh học, nh−ng cịn nhiều khó khăn to lớn cần v−ợt qua Ví dụ: chất thải nơng nghiệp có theo mùa vμ theo vùng địa lý, đơi chất thải nμy cịn chứa độc tố Sự tồn chất thải nμy gây nhiễm mơi tr−ờng, phải tìm biện pháp để xử lý Về lâu dμi công nghệ sinh học phải tìm cách sử dụng cellulose vμ lignocellulose lμm nhiên liệu hay nguyên liệu, có khó khăn mặt kỹ thuật

Gỗ lμ nguồn cung cấp nhiên liệu, vật liệu cho xây dựng, nguyên liệu cho công nghiệp giấy Việc cung cấp cho nhu cầu giảm nhanh chóng Nguyên nhân lμ việc phá rừng trμn lan nhiều quốc gia Phá rừng dẫn đến sa mạc hố vμ xói mịn đất Công nghệ sinh học tạo trồng để phủ xanh đồi trọc nh− keo trμm Những phát triển nhanh nh− keo trμm cịn hấp thụ nhiều khí CO2 nên cịn có tác dụng khắc phục

hiệu ứng nhμ kính Cơng nghệ sinh học tạo trồng biến đổi gen có khả kháng sâu bệnh, suất cao chất l−ợng v−ợt trội so với giống cũ, t−ơng lai nông nghiệp sạch, hiệu vμ tiên tiến lμm cho nhiều ng−ời muốn trở thnh nụng dõn hn

Tự lợng giá

Chơng

Kỹ thuật lên men

Mơc tiªu

Sau häc xong chơng ny sinh viên phải trình by đợc:

1. Trình by đợc tên phơng pháp lên men, trình công nghệ lên men

2. Kể tên đợc thiết bị công nghệ lên men

3 Nêu đ−ợc tầm quan trọng kỹ thuật nuôi cấy tế bμo động vật vμ

thùc vËt.

1 Giíi thiƯu tỉng qu¸t

Từ xa x−a loμi ng−ời biết nấu r−ợu để uống, biết lμm t−ơng, muối d−a, biết ủ chua thực phẩm để giữ đ−ợc lâu dμi Các q trình đ−ợc gọi lμ lên men (bảng 3.1)

B¶ng 3.1 Các sản phẩm lên men phân theo lĩnh vực công nghiệp

Lĩnh vực công nghiệp Hoạt chất

Hữu

(Số lợng lớn) Ethanol, aceton, butanol Hoá

học

Hữu (Số lợng )

Acid hữu (citric, itaconic), enzym Các chất dùng cho mỹ phẩm Các polymer (các polysaccharid) Dợc phẩm

C¸c chÊt kh¸ng sinh, vitamin

Các kit chẩn đốn (enzym, kháng thể đơn dòng) Các enzym ức chế, steroid, vaccin Năng l−ợng Ethanol (gasohol), methan (biogas)

Thực phẩm

Các sản phẩm từ sữa (phomát, sữa chua, )

Đồ uống (các loại rợu, trà, cà phê), men làm nở bánh mì, chất phụ gia cho thực phẩm (chất chống oxy hoá, chất màu, chất b¶o qu¶n)

Các thực phẩm đặc biệt (đậu t−ơng lên men, loại n−ớc xốt để trộn), acid amin, vitamin

Các sản phẩm từ tinh bột

N«ng nghiƯp

Protein đơn bào, vaccin cho động vật

ủ thức ăn cho gia súc, ủ phân bón Vi sinh vật trừ sâu hại, côn trùng Rhizobium vi khuẩn cố định nitơ

Lên men mô tế bào để nhân giống trồng…

Chỉ công nghệ lên men chìm sản xuất penicillin đời (1947) cơng nghệ lên men thực phát triển vμ trở thμnh ngμnh khoa học thực – ngμnh công nghệ lên men

Các trình lên men truyền thống chủ yếu sản xuất thực phẩm vμ đồ uống, nguyên giá trị th−ơng mại Song q trình đ−ợc sản xuất qui mô công nghiệp với thiết bị đại vμ tự động hoá, nên giá thμnh sản phẩm hạ nhiều Có thể gọi trình lên men tên sau:

− C¸c chÊt chun ho¸ bËc mét nh−: acid acetic, acid lactic, glycerol, alcol butylic, amino acid, vitamin vμ polysaccharid;

− Các chất chuyển hoá bậc hai, lμ chất đóng vai trị chuyển hố vμ tạo sản phẩm Nó phụ thuộc nhiều vμo thμnh phần mơi tr−ờng lên men chúng Ví dụ nh− hình thμnh chất kháng sinh (penicillin, streptomycin), kích tố sinh tr−ởng (giberellin),… − Các enzym sử dụng công nghiệp gồm enzym ngoại bμo

(amylase, pectinase, protease), c¸c enzym néi bμo (invertase, asparaginase, endonuclease )

Các trình lên men để sản xuất sản phẩm nêu lμ đòi hỏi thiết yếu xã hội đại Bên cạnh sản phẩm đó, kỹ thuật sinh học tạo sản phẩm quan trọng từ tế bμo thực vật vμ động vật Lên men tế bμo thực vật nhằm mục đích tạo sản phẩm chuyển hố bậc hai (các tinh dầu, chất gia vị, d−ợc liệu) Lên men tế bμo động vật để chế tạo vaccin Kỹ thuật lên men tạo protein có hoạt tính nh− interferon, interleukin…

Một số sản phẩm công nghệ sinh học tạo ra, ph−ơng pháp hố học khơng thể sản xuất đ−ợc (bảng 3.2) Có sản phẩm vi sinh vật sinh tổng hợp cần thực nhiệt độ bình th−ờng Song thực ph−ơng pháp hoá học địi hỏi phải có áp suất đến hμng trăm kg/cm2

Bảng 3.2.Ưu nhợc điểm phơng pháp sinh tổng hợp

(so với phơng pháp hoá học)

u điểm

ã Các phân tử phức tạp nh protein, kháng sinh tổng hợp hoá học

ã Bin i sinh hc cho suất cao

• Sinh tổng hợp thc hin nhit thp

ã pH gần trung tÝnh

• Xúc tác phản ứng có nhiều đặc điểm

• Sản phẩm thu đ−ợc khơng cú ng phõn

Nhợc điểm

ã Sinh tổng hợp dễ bị nhiễm trùng

ã Các sản phẩm mong muốn thờng lẫn phức hợp, cần phải tách riêng

ã Cần xử lý thể tích môi tr−êng lín

• Q trình lên men cần thời gian lâu so với biến đổi hoá học

2 Các giai đoạn phát triển vi sinh vật

Quá trình sinh trởng vi sinh vật diễn theo giai đoạn khác đợc gọi lμ c¸c pha ph¸t triĨn, bao gåm pha tiỊm ph¸t, pha logarit, pha cân v pha suy vong (hình 3.1)

Hình 3.1 Đặc điểm phát triển vi sinh vËt lªn men chu kú

1 Pha tiềm phát Pha nhân lên chậm 3-4 Pha logarit Pha c©n b»ng Pha suy vong

Nghiên cứu trình sinh tr−ởng vμ phát triển vi sinh vật bình lên men để điều khiển trình cho vi sinh vật phát triển tốt vμ tạo đ−ợc tối đa sản phẩm mμ ta mong muốn Để theo dõi phát triển vi sinh vật bình lên men th−ờng tiến hμnh phân tích số tiêu nh− trọng l−ợng sinh khối đơn vị thể tích, hμm l−ợng protein ADN tế bμo, số l−ợng tế bμo/đơn vị thể tích Sự tăng sinh khối đơn vị thể tích bao hμm tăng số l−ợng tế bμo vμ tăng kích th−ớc tế bμo

Thời gian trung bình để tăng gấp đôi tế bμo vi sinh vật nh− sau: − Vi khuẩn : 0,25 -

− Nấm men : 1-2 − Nấm mốc : - 6,5 − Tế bμo thực vật : 20 - 70 − Tế bμo động vật : 15 - 48

Để đạt đ−ợc tốc độ sinh tr−ởng vi sinh vật theo mong muốn vμ tạo sản phẩm với hiệu suất tối đa cần phải nghiên cứu thêm điều kiện khác nh− thμnh phần môi tr−ờng chất kích thích sinh tr−ởng, tiền chất (precusor) để h−ớng dẫn vi sinh vật tạo sản phẩm mong muốn Ví dụ, thêm acid phenylacetic vμo mơi tr−ờng lên men sinh tổng hợp penicillin ta thu đ−ợc benzylpenicillin (penicillin G), cịn ta thêm vμo mơi tr−ờng chất acid phenoxyacetic ta lại thu đ−ợc phenoxymethylpenicillin (penicillin V), rõ rμng lμ điều khiển đ−ợc q trình lên men theo ý muốn Trên thực tế viện nghiên cứu, nhμ máy sản xuất chế phẩm sinh học có phịng nghiên cứu cơng nghệ lờn men

Trong công nghệ lên men, ngời ta phân kiểu lên men (nuôi cấy) sau: lên men chu kỳ (batch fermentation), lên men bán liªn tơc (semi – continuous fermentation) vμ lªn men liªn tôc (continuous fermentation)

Trong lên men chu kỳ, vi sinh vật đ−ợc ni cố định bình lên men với thể tích mơi tr−ờng xác định Vi sinh vật phát triển theo giai đoạn (hình 3.1) vμ tạo sản phẩm Kết thúc trình, ng−ời ta tiến hμnh công đoạn cần thiết để thu lấy sản phẩm Ph−ơng pháp lên men chu kỳ đ−ợc ứng dụng để sản xuất nhiều hoạt chất quan trọng nh− acid amin, chất kháng sinh

Lên men chu kỳ có cải tiến đ−ợc áp dụng nhằm nâng cao hiệu sử dụng bình lên men Ví dụ ni nấm men để thu sinh khối tế bμo, nhằm thu đ−ợc suất cao đơn vị thể tích ni cấy, q trình ni th−ờng bổ sung thêm dinh d−ỡng (hydrat carbon) vμ yếu tố cần thiết khác nhằm lμm cho mật độ tế bμo bình tăng lên

sinh khối cần thiết ng−ời ta lấy bớt thể tích mơi tr−ờng bao gồm sinh khối, đồng thời bổ sung thêm thể tích mơi tr−ờng l−ợng mơi tr−ờng lấy Bằng cách lμm nh− cần truyền giống lần thu hoạch sản phẩm nhiều lần

Hình 3.2. Sơ đồ đơn giản mơ tả ngun tắc lên men liên tục

Lên men liên tục lμ q trình ni vi sinh vật thiết bị đ−ợc cấu tạo đặc biệt để cho vật ni phát triển đến giai đoạn nμo thích hợp cho việc lấy thể tích mơi tr−ờng lên men tế bμo vμ sản phẩm trao đổi chất chúng, lại bổ sung thể tích mơi tr−ờng dinh d−ỡng vμo bình ni cấy, lúc ta có đ−ợc trạng thái cân động Vi sinh vật bình ni ln ln pha logarit (hỡnh 3.2)

Đặc điểm phơng pháp lên men vi sinh vật Bảng 3.3. Đặc điểm phơng pháp lên men

Phng phỏp lên men Các đặc điểm thao tác

Môi trờng xốp Đơn giản, rẻ, chọn lọc

Nuôi bề mặt Các khuẩn lạc từ tế bào đơn; kiểm tra trình bị giới hạn

Lên men chìm đồng thể phân phối tế bào chu kỳ

Các kiểu bình lên men khác nhau; lọc tia, đĩa quay, ống quay bình phản ứng tạo bọt tự động phản ứng, kiểu bình phản ứng khác nhau: liên tục bình phản ứng có khuấy, bình elip, vịng có máy khuấy, khuấy khí nén, kiểm tra số vật lý chất lỏng, nh−ng chủ yếu kiểm tra số hố học sinh học

Chu kỳ có bổ sung Ph−ơng phápđơn giản kiểm tra điều chỉnh hiu qu Liờn tc ng nht mt

giai đoạn

Ph−ơng pháp lên men liên tục đ−ợc ứng dụng để sản xuất protein đơn bμo (nấm men) sản xuất acid acetic, ethanol vμ xử lý n−ớc thải số nhμ máy Tuy nhiên nhiều nguyên nhân nên ph−ơng pháp lên men chu kỳ hay c ng dng hn

Ưu điểm kỹ tht lªn men chu kú vμ chu kú cã bỉ sung môi trờng

ã Cung cp sn phm theo yêu cầu với số l−ợng nhỏ thời gian nμo, đơi có u cầu

• Vịng đời sản phẩm ngắn

• Sản xuất với nồng độ cao dịch lên men yêu cầu q trình thao tác phải tối −u

• Một vi sản phẩm chuyển hoá đợc tạo pha cân chu kỳ phát triển

• Tính khơng ổn định vμi chủng sản xuất cần l−u ý th−ờng xuyên phải chọn lọc

• Q trình lên men liên tục địi hỏi kỹ thuật phức tạp 3 Thiết bị lên men vi sinh vật (fermentor)

1 Th©n nåi

2 Bộ phận trao đổi nhiệt ống đựng nhiệt kế ống dẫn khí vào Giằng trục khuấy Trục khuấy Cánh khuấy Bệ đỡ nồi Nối trục

10 Bộ phận truyền động 11 Động

Trong công nghệ lên men vi sinh vật thiết bị lên men lμ vấn đề vô quan trọng Vi sinh vật sống vμ phát triển điều kiện vô trùng tuyệt đối, phải cung cấp đủ oxy hoμ tan môi tr−ờng cho vi sinh vật hơ hấp Thiết bị khuấy trộn có cấu tạo đặc biệt vừa phải hoμ tan oxy vμo mơi tr−ờng, vừa phải khuấy trộn hỗn hợp tế bμo sống đặc quánh không tan n−ớc, lại lμm việc liên tục thời gian dμi (th−ờng từ 4-7 ngμy) Thiết bị lên men cần có phận trao đổi nhiệt hữu hiệu, đa số vi sinh vật sống vμ phát triển nhiệt độ từ 260C-300C

Hình 3.4. Các dạng thiết bị lên men vi sinh vËt

Kể từ penicillin đ−ợc sản xuất ph−ơng pháp lên men chìm (1947), thiết bị lên men đ−ợc cải tiến vμ hoμn thiện nhiều Về nguyên lý chung lμ thiết bị có hình trụ chế tạo thép khơng rỉ (stainless steel) có dung tích khác từ 5-10 lít dùng phịng thí nghiệm, 50-500 lít qui mơ pilot, 50.000-150.000 lít dùng lên men tạo kháng sinh, 300.000 - 500.000 lít dùng lên men sản xuất acid amin (hình 3.3)

Các thiết bị lên men đ−ợc chế tạo theo kiểu dáng khơng khác tr−ớc Song đ−ợc gắn điện cực để đo pH, nhiệt độ, oxy hoμ tan, điện cực dò bọt vμ cảm biến (sensor) đ−ợc khuếch đại vμ gắn với máy phân tích tự động thμnh phần môi tr−ờng, lại tự động điều chỉnh mở van điện từ bổ sung chất cần thiết cho phát triển vi sinh vật Nhờ q trình tự động hố vμ máy tính cμi đặt sẵn ch−ơng trình điều khiển nên cơng nghệ lên men trở thμnh ngμnh công nghệ vừa đại vừa có sức hấp dẫn lμm việc lĩnh vực nμy

4 Vấn đề cung cấp khơng khí vơ trùng cho nhμ máy lên men vi sinh vật

Hình 3.5 Sơ đồ hệ thống thiết bị lọc khơng khí vơ trùng Lọc sơ bộ; Máy nén khí; 3, Thiết bị làm nguội khí; Bình chứa khí; Thiết bị lọc khí lần thứ nhất;

7 ThiÕt bÞ sấy khí; Thiết bị lọc khí lần hai

vμ vi sinh vật có kích th−ớc (0,5-2,0 μm) Chi phí điện cho cơng nghệ lọc khí vơ khuẩn lớn Thμnh cơng hay thất bại cơng nghệ lên men lμ vấn đề vơ khuẩn khơng khí

1.Bé phËn Ðp vËt liƯu läc 2.L−íi trªn

3.VËt liƯu läc 4.Than ho¹t

5.Ngăn để chứa vật liệu lọc 6.L−ới đỡ vật liệu lọc 7.Thân thiết bị lọc 8.Vỏ

Hình 3.6 Thiết bị lọc khí vô trùng

5 Khử trùng môi trờng công nghệ lên men

Trong cơng nghệ lên men chìm để thu sản phẩm, thiết bị lên men có dung tích từ 30 lít đến 10.000 lít th−ờng mơi tr−ờng đ−ợc pha chế trực tiếp thiết bị lên men Sau dùng nóng đun đến nhiệt độ khử trùng qua phận truyền nhiệt giữ nhiệt độ vμ thời gian khử trùng thích hợp Khử trùng xong, mơi tr−ờng đ−ợc lμm nguội đến nhiệt độ thích hợp (25-30OC) Khi lên men vi sinh vật

thiết bị lớn (50.000-300.000 lít) đun nóng trực tiếp để khử trùng địi hỏi cơng suất thiết bị cung cấp lớn, không thời gian đun đến nhiệt độ khử trùng dμi lμm ảnh h−ởng đến chất l−ợng thμnh phần dinh d−ỡng có mơi tr−ờng, từ ảnh h−ởng đến phát triển vi sinh vật lên men để thu sản phẩm Vì cơng

9

2

3

8

7

Hình 3.7. Sơ đồ cấu tạo thiết bị khử trùng liên tục

nghệ lên men chìm ng−ời ta chế tạo thiết bị khử trùng liên tục (cột khử trùng) để khắc phục nh−ợc điểm Cột khử trùng liên tục cịn có −u điểm lμ: cho phép pha chế riêng thμnh phần môi tr−ờng vμ khử trùng chế độ riêng nên môi tr−ờng dinh d−ỡng không bị phá huỷ (hình 3.7)

6 Läc vμ thiÕt bÞ läc công nghiệp sản xuất kháng sinh

Trong cơng nghiệp vi sinh vật nói chung vμ cơng nghiệp kháng sinh nói riêng, th−ờng phải lọc thể tích lớn mơi tr−ờng lên men chứa vi sinh vật (xạ khuẩn, nấm mốc, vi khuẩn) Chúng lμ cá thể kích th−ớc vừa nhỏ lại nằm mơi tr−ờng có độ nhớt cao sản phẩm trao đổi chất vi sinh vật với thμnh phần môi tr−ờng dinh d−ỡng ch−a sử dụng hết, dầu phá bọt nồng độ chất kháng sinh mơi tr−ờng thấp, nhiều chất lại khơng bền vững Vì để chiết xuất vμ tinh chế đ−ợc hoạt chất, công đoạn quan trọng bậc lμ phải lọc để phân riêng sinh khối vμ dịch lọc khoảng thời gian ngắn cho phép Để lọc đ−ợc nhanh cần phải thêm chất trợ lọc, chất có khả lμm đơng vón protein Tuy nhiên thiết bị lọc quan trọng Có thể dùng lọc ép khung để lọc dịch lên men Song nh−ợc điểm thiết bị lọc ép lμ lμm việc không liên tục Khi sinh khối chất đầy khoang lại phải tháo bã vμ lắp lại thiết bị tiến hμnh lọc tiếp đ−ợc Vì nhμ máy sản xuất kháng sinh th−ờng sử dụng thiết bị lọc trống quay (hình 3.8) Ưu điểm thiết bị nμy lμ lμm việc liên tục, tự động hố việc loại bã Máy ngừng lμm việc nμo suất lọc giảm, máy có diện tích bề mặt lọc lớn nên suất lọc cao

Hình 3.8. Sơ đồ cắt ngang máy lọc chân khơng hình trống Thùng rỗng

2 BĨ chøa hun phï V¶i läc

4 Dao cạo bà Cánh khuấy Các ngăn ống nối

7 Trình tự trình lên men

chun b cho lờn men qui mô công nghiệp, tr−ớc tiên giống đ−ợc chọn lọc hộp petri, lấy khuẩn lạc nuôi thạch nghiêng nuôi cho phát triển nhiệt độ thích hợp, tiếp sau chuyền vμo bình tam giác (erlanmayer) nuôi máy lắc vi sinh vật tiếp tục phát triển Các b−ớc tiếp sau giống đ−ợc ni bình lên men có khuấy trộn từ thể tích nhỏ đến thể tích lớn (2 cấp) Giống ni bình nhân giống cấp hai đ−ợc kiểm tra cẩn thận tất tiêu chuẩn cần thiết, đạt yêu cầu chuyền vμo thiết bị lên men ni tiếp để thu sản phẩm (hình 3.9)

Hình 3.9 Sơ đồ trình chuẩn bị giống để lên men a ống giống; b Giống nuôi thạch nghiêng; c Giống nuôi máy lắc; d Bình nhân giống cấp 1; e Bình nhân giống cấp 2; f Bình lên men tạo sản phẩm

8 Thiết kế môi trờng cho trình lên men

Bảng 3.5. Nguồn hydrat carbon nitơ dùng cho công nghiệp lên men

Nguồn hydrat

carbon Dạng dùng

Nguồn nitơ (% nitơ/ trọng lợng)

Glucose Monohydrat tinh khiết, tinh bột thuỷ

phân Lúa mạch (1,5-2,0)

Lactose Lactose tinh khiết, bột sữa Mật rỉ củ cải ®−êng (1,5-2,0)

Tinh bét Lóa m¹ch, bét l¹c, n mạch, bột gạo, bột đậu tơng

Cao ngô (4,5) Bột lạc (8,0)

Bột yến mạch (1,5-2,0) Bột đậu tơng (8,0) Saccharose Mật rỉ củ cải đờng, đờng thô, mật,

đờng kính tinh khiết Bột sữa (4,5)

Trong vμi tr−ờng hợp cần nhân tố phát triển tiền chất để điều khiển vi sinh vật tạo chất mμ ta yêu cầu Ví dụ lên men sinh tổng hợp vitamin B12 nhờ vi khuẩn Propioni bacterium shermanii cần bổ sung vμo môi tr−ờng chất 5, dimetylbenzimidasol để tạo phân tử vitamin B12 thật, vμ hiệu suất cao Các nhân tố phát triển hay tiền chất cần với số l−ợng nhỏ mg/lít, thiếu q trình sinh tổng hợp thất bại

Môi tr−ờng nuôi vi sinh vật cần đ−ợc khử trùng để loại tất vi sinh vật tạp nhiễm lẫn nguyên liệu Công đoạn khử trùng môi tr−ờng quan trọng Vì cịn lại cá thể vi sinh vật lạ ch−a bị tiêu diệt, chúng tiếp tục phát triển với vi sinh vật nuôi cấy lμm hỏng trình lên men Th−ờng gọi lμ nhiễm trùng Trong năm 50 kỷ XX, cơng nghệ lên men cho phép nhiễm trùng 10% kỹ thuật lên men bắt đầu phát triển Vấn đề khử trùng môi tr−ờng vμ lọc không khí để đạt đ−ợc tuyệt đối vơ trùng lμ điều khó khăn Từ năm 70 kỷ XX, công nghệ lên men không cho phép đ−ợc nhiễm trùng Quá trình lên men bị nhiễm trùng phải đổ lμm thiệt hại to lớn kinh tế Q trình lên men có thμnh cơng hay khơng phụ thuộc vμo chất l−ợng mơi tr−ờng dinh d−ỡng vμ kỹ thuật khử trùng môi tr−ờng

9 Lên men chất rắn

chất rắn lμ cơng nghệ gia đình, cơng nghệ lên men truyền thống Chính cơng nghệ nμy bổ sung đ−ợc nhiều sản phẩm quí hiếm, đặc biệt lμ thực phẩm lên men cần số l−ợng giμu dinh d−ỡng cơng nghệ lên men chìm khơng thể thực đ−ợc (bảng 3.6)

B¶ng 3.6. Một vài ví dụ lên men chất rắn

VÝ dơ C¬ chÊt Vi sinh vËt sư dơng

Trồng nấm (Âu châu ph−ơng ụng)

Rơm, phân Agaricus bisporus, Lentinula edodes, Volvariella

volvaceae

Da cải bắp Cải bắp Vi khuẩn lactic

Tơng Đậu tơng gạo Rhizopus oligosporus

Chao Đậu tơng Rhizopus oligosporus

Phomát Bột sữa Penicillium roquefortii

Acid hữu Rỉ đờng Aspergillus niger

Các enzym Cám gạo, mì Aspergillus niger

Phân trộn Hỗn hợp chất

hữu Nấm mốc, vi khuẩn, xạ khuẩn

Xử lý nớc thải Các thành phần

của nớc thải Vi khuẩn, nấm mốc protozoa

Cỏc n−ớc ph−ơng tây th−ờng áp dụng ph−ơng pháp lên men nμy để trồng nấm, sản xuất phomát Một −u điểm kỹ thuật lên men chất rắn lμ lên men lúc hai, ba vi sinh vật chất mμ không gọi lμ nhiễm trùng Một vi sinh vật tạo sản phẩm lên men chính, vi sinh vật thứ hai tạo h−ơng vị lμm cho sản phẩm lên men thêm hấp dẫn vμ giá trị Nấu r−ợu bánh men thuốc bắc lμ ví dụ điển hình

Ng−ời ta chế tạo thiết bị để lên men chất rắn, nhiên cấu tạo đơn giản nhiều so với thiết bị lên men chìm (hình 3.3)

10 Kỹ thuật nuôi cấy tế bμo động vật vμ thực vật

vμ chấp nhận đ−ợc nh− tiến hμnh đối t−ợng lμ có giá trị kinh tế cao nh− d−ơng địa hoμng (digitalis), nhμi (jasmine), l−u lan h−ơng (spearmint)

Nuôi cấy tế bμo thực vật ph−ơng pháp ni cấy chìm có khuấy trộn vμ sục khơng khí vô trùng nguyên tắc giống nh− lên men vi sinh vật Tuy nhiên mức độ cung cấp không khí vμ tốc độ khuấy thấp nhiều so với lên men vi sinh vật Tuy có sản phẩm nuôi cấy tế bμo thực vật thị tr−ờng nh−ng ng−ời ta hy vọng lμ có sản phẩm hμng hố cạnh tranh thị tr−ờng t−ơng lai Nuôi cấy mô tế bμo thực vật đ−ợc áp dụng để nhân giống vô tính, bệnh cung cấp giống trồng Ni cấy tế bμo vμ mô động vật vμi chục năm trở lại phát triển rộng rãi áp dụng kỹ thuật di truyền Hμng loạt tế bμo vμ mô đ−ợc nuôi cấy nhân tạo nh−: tế bμo tuỷ x−ơng, sụn, gan, phổi, vú, da, ruột, thận, thần kinh, tuyến yên vμ nhiều loại tế bμo ung th− khác Sử dụng ph−ơng pháp nuôi cấy tế bμo qui mô công nghiệp để sản xuất chế phẩm sinh học có giá trị cao dùng y học nh− vaccin (bại liệt, sởi, quai bị, dại ), interferon, hormon, insulin, plasminogen vμ kháng thể Vấn đề khó khăn kỹ thuật ni cấy tế bμo lμ: tế bμo nuôi nhạy cảm với vi sinh vật nhiễm mơi tr−ờng Do nuôi cấy tế bμo phải thực điều kiện vô trùng tuyệt đối Khi tách lấy tế bμo từ quan động vật biết gọi lμ tế bμo gốc chuẩn bị cho nuôi cấy tiếp sau, giai đoạn nμy tế bμo th−ờng không đồng nhất, sau phải tìm đ−ợc tế bμo đại diện cho tế bμo kiểu cha mẹ biểu đặc điểm mô học Sau vμi lần ni cấy mơi tr−ờng chọn lọc, dịng tế bμo chọn đ−ợc khơng chết mμ chuyển thμnh dịng tế bμo liên tục So sánh với dòng tế bμo ni ban đầu thấy rõ chúng có thay đổi hình thái tế bμo chất, tế bμo phát triển nhanh hơn, tăng thêm số đặc điểm nhiễm sắc thể Tế bμo động vật phát triển nuôi cấy dạng nhũ dịch mμ cịn mọc đ−ợc bề mặt mơi tr−ờng đặc Các tế bμo nh− kiểu Hela (các tế bμo biến đổi từ tế bμo u ác ng−ời) phát triển mơi tr−ờng ni cấy huyền dịch, tế bμo gốc tế bμo diploid bình th−ờng mọc bề mặt môi tr−ờng đặc Nuôi cấy bề mặt tế bμo động vật bị ảnh h−ởng diện tích bề mặt mμ tế bμo tiếp xúc, phải tạo thiết bị nuôi cho bề mặt tiếp xúc tế bμo đạt đ−ợc tối đa Có nhiều kiểu bình ni đ−ợc thiết kế theo hình dáng khác nh− dạng ống, chai bẹt cốt mặt thống rộng để tế bμo dễ dμng hơ hấp

Ni cấy dạng huyền dịch tiến hμnh bình lên men nh− ni vi sinh vật Gần cịn kết hợp ni cấy dạng huyền dịch có bề mặt tiếp xúc rộng cách ni tế bμo hạt mang tế bμo dạng đặc biệt giống nh− Sephadex - DEAE Các hạt nμy có diện tích bề mặt cm2/mg Các

11 Quá trình tinh chế để thu sản phẩm Sau kết thúc công đoạn nuôi cấyvi sinh vật tế bμo động vật, phải tìm cách chiết xuất lấy hoạt chất vμ tinh chế sản phẩm đạt đ−ợc tiêu chuẩn cần thiết theo qui định dùng điều trị Q trình nμy gọi lμ q trình xi dịng (downstream processing), tuỳ theo sản phẩm chứa mơi tr−ờng lên men mμ chọn ph−ơng pháp xử lý thích hợp

Cơng đoạn tinh chế sản phẩm địi hỏi nhiều nhân cơng, nhân cơng nμy phải có kiến thức vμ kỹ cao chuyên môn Th−ờng sử dụng cán hố sinh, hố học, ví dụ nhμ máy Eli Lilly sản xuất insulin có 200 cán 90% số ng−ời nμy lμm việc công đoạn tinh chế sản phẩm

Cơng đoạn chiết xuất để thu sản phẩm cịn quan trọng cơng đoạn lên men sản phẩm thuộc nhóm nμy th−ờng khơng bền vững, hμm l−ợng chứa môi tr−ờng lên men tế bμo th−ờng thấp (0,1-3,0%) Do chiết để lấy đ−ợc lμ vơ khó khăn Cơng đoạn tinh chế sản phẩm định tới giá thμnh sản phẩm Ví dụ cơng nghệ lên men sản xuất penicillin, năm 60 kỷ XX chiết xuất lấy đ−ợc 60% hiệu suất môi tr−ờng Hiện cải tiến kỹ thuật chiết đ−ợc 90% hiệu suất mơi tr−ờng

C¸c phơng pháp sử dụng bao gồm: lọc, ly tâm, chiết dung môi, bốc chân không, hấp phụ, điện di, thÈm tÝch, läc mμng chän läc

C«ng đoạn chiết xuất v tinh chế sản phẩm bao gồm nhiều bớc (hình 3.10)

Tự lợng giá

1 Kể tên phận v yêu cầu thiết kế thiết bị lên men vi sinh vật Trình by phơng pháp lọc không khí vô trùng v tầm quan

trọng lọc khí vô trùng cho nh máy lên men

3 Tại phải khử trùng môi trờng công nghệ lên men?

4 Nêu cấu tạo thiết bị lọc công nghiệp sản xuất kháng sinh Nêu trình tự trình lên men

Chơng

Kỹ thuật sản xuất enzym

Mục tiêu

Sau học xong chơng ny sinh viên phải trình by đợc:

1. K thuật sản xuất enzym nói chung vμ enzym dùng y học để điều trị bệnh

2 Nguyên tắc vμ ứng dụng ph−ơng pháp bất động enzym.

1 Đại cơng

Enzym l nhng phân tử protein phức tạp tồn tế bμo sống, chúng đóng vai trị xúc tác sinh học lμm biến đổi hoá học chất Do phát triển hoá sinh phân tử ng−ời ta hiểu biết rõ vai trò enzym tế bμo sống Cho dù enzym đ−ợc hình thμnh tế bμo sống, nh−ng tách rời enzym khỏi tế bμo thực đ−ợc chức xúc tác sinh học in vitro Nhờ tính chất kì diệu lμm tăng khả sử dụng enzym q trình cơng nghiệp Hμng năm cơng nghiệp enzym giới sản xuất hμng ngμn tập trung vμo số enzym sau: proteinase, amyloglucosidase, amylase, glucose isomerase, rennet, pectinase…

Hoạt tính enzym lμ đặc điểm xúc tác tự nhiên Mỗi enzym thực xúc tác cho phản ứng, tế bμo sống có hμng loạt enzym khác để thực chuỗi phản ứng liên tục nh− enzym mạch hô hấp tế bμo Các phản ứng xúc tác enzym đ−ợc thực nhiệt độ bình th−ờng, phản ứng thực hoá học đòi hỏi nhiệt độ vμ áp suất cao Khả phân giải enzym thật kỳ diệu, ví dụ gram vi khuẩn lactic biến đổi lactose thμnh acid lactic vòng giờ! Enzym tách khỏi tế bμo d−ới dạng tinh khiết thực phản ứng xúc tác biến đổi chất nhiều lần với kỹ thuật đặc biệt kéo dμi thời gian sử dụng enzym đến tháng! Chức xúc tác enzym phụ thuộc vμo cấu hình khơng gian chúng, cần lμm thay đổi cấu hình khơng gian pH hay nhiệt độ lμ enzym bị bất hoạt Một vμi enzym có gắn thêm coenzym, coenzym nμy lμ ion kim loại, nucleotid, vitamin

khơng địi hỏi thiết bị chống ăn mịn nh− cơng nghệ hố học Kỹ thuật enzym bao gồm lên men vi sinh vật, chiết xuất, tinh chế sử dụng enzym dạng hoμ tan dạng enzym bất động Enzym đ−ợc sử dụng nhiều lĩnh vực khác đời sống hμng ngμy, lĩnh vực nghiên cứu khoa học, dùng y học vμ bảo vệ mơi tr−ờng

2 C¸c øng dơng cña enzym

Hμng ngμn năm tr−ớc loμi ng−ời biết ủ chua để giữ thực phẩm đ−ợc lâu hơn, biết lμm bánh mì, phomát, lμm t−ơng, nấu r−ợu vμ lμm vang từ nho (bảng 4.1) Hai tr−ờng ca tiếng cổ Hy lạp lμ Iliad vμ Odysei (khoảng 700 năm tr−ớc cơng ngun) nói tới cách lμm phomát, chế r−ợu nho nh−ng chẳng biết đ−ợc thủ phạm q trình lμ enzym vi sinh vật

ở n−ớc ph−ơng Tây, công nghiệp enzym đ−ợc hiểu biết xung quanh vấn đề nấm men vμ malt, nghề truyền thống họ xem nh− có cơng nghiệp lμm bánh mỳ lμ phát triển Do nhiều n−ớc phát triển hố sinh tập trung vμo lên men sản xuất men cho công nghiệp lμm bánh mỳ vμ biến đổi tinh bột thμnh đ−ờng Trái lại n−ớc ph−ơng Đông ý nhiều đến chế biến thực phẩm lên men Họ sử dụng nấm ăn lμm nguồn enzym Năm 1896 n−ớc ph−ơng Tây có giới thiệu bán enzym từ vi sinh vật lμ takadiastase từ Aspergillus oryzae, lμ enzym thuỷ phân Ph−ơng pháp sản xuất enzym nμy đ−ợc bắt đầu hμng ngμn năm tr−ớc Châu Otto Rohm nhμ hoá học tiếng ng−ời Đức tách đ−ợc protease từ phân chó, sau tiến hμnh chiết enzym nμy từ tạng động vật

Năm 1905, ng−ời ta tách đ−ợc pancrease từ gan bò vμ lợn Vμo năm 1950 kỹ thuật enzym phát triển nhanh chóng Do cơng nghệ lên men chìm sản xuất penicillin địi hỏi hiểu biết để lên men qui mô lớn vi sinh vật sản xuất enzym, ng−ời ta đặc biệt trọng đến enzym từ vi sinh vật lý sau:

Sự hiểu biết đặc điểm enzym đẫn đến việc sử dụng rộng rãi enzym vμo lĩnh vực khác đời sống

một số enzym khác đ−ợc sản xuất công nghiệp, nh−ng lại lμ enzym nội bμo Ví dụ glucose oxydase dùng bảo quản thực phẩm, asparaginase dùng điều trị ung th− máu, penicillinamidase (penicillinacylase) dùng để sản xuất 6-APA từ penicillin lμm nguyên liệu bán tổng hợp kháng sinh nhóm beta lactam

Bảng 4.1 Các enzym vi sinh vật ứng dơng cđa chóng

Enzym Vi sinh vËt øng dụng Công nghiệp

Amylase (phân giải tinh bét)

• NÊm mèc

• Vi khuÈn

• NÊm mèc

• Vi khuÈn

• NÊm mèc

• Vi khuÈn

• Vi khuÈn

ã Bánh mì

ã Bao bột

ã Sản xuất glucose

ã Hồ hoá vải

ã Trợ giúp tiêu hoá

ã Rũ hồ vải

ã Tẩy vết bẩn

ã Bánh mì

ã Giấy

• Thùc phÈm

• Tinh bét

• Dợc phẩm

ã Dệt

ã Giặt

Protease (phân giải protein)

ã Nấm mốc

ã Vi khuÈn

• Vi khuÈn

• Vi khuÈn

• Vi khuÈn

• Vi khuÈn

• Bánh mì

ã Tẩy vết bẩn

ã Làm mềm thịt

ã Làm vết thơng

ã Xử lý sợi

ã gia ỡnh

ã Bánh mì

ã Giặt khô

ã Thịt

ã Y học

ã Dệt

ã Giặt Invertase (thủ

ph©n saccharose) NÊm men KĐo xèp cã nhân Kẹo xốp

Glucose oxydase Nấm mốc ã Loại bỏ glucose

ã Kít giấy thử tiểu đờng

ã Thực phẩm

ã Dợc phẩm

Glucose isomerase Vi khuẩn Siro fructose từ ngô Đồ uống nhẹ

Pectinase Nấm mốc Lọc làm Vang, nớc

Rennin Nấm mốc Đông tụ sữa Phomát

Cellulase Vi khuẩn Tẩy rửa Giặt

Nghiờn cu cỏc enzym nội bμo lμ vấn đề hấp dẫn nhằm tìm enzym đặc hiệu dùng chẩn đốn vμ điều trị Việc phát tính chất tẩy rửa enzym lμm cho công nghệ nμy phát triển nhanh chóng năm gần đây, lμm giảm bớt lao động đơn giản, giảm ô nhiễm môi tr−ờng Các n−ớc Tây âu th−ờng giặt quần áo n−ớc nóng (65-700C) để quần áo đ−ợc sạch, Mỹ vμ Canada th−ờng giặt 550C

Do kỹ thuật sản xuất enzym ngμy cμng đ−ợc cải tiến nên giá thμnh liên tục giảm năm qua Theo thống kê Phịng Th−ơng mại vμ Cơng nghiệp Hoa Kỳ doanh thu enzym toμn giới khoảng 750 - 850 triệu USD 80% doanh số nμy thuộc vμo enzym sau đây: biến đổi tinh bột 40%, tẩy rửa 30%, chế biến sữa 10%

B¶ng 4.2. Sản xuất enzym công nghiệp số nớc phơng Tây

Một số nớc phơng tây Sản lợng enzym (tÊn) Tû lÖ %

USA 6.360 12

Nhật 4.240

Đan Mạch 24.910 47

Pháp 1.590

Đức 3.180

Hà Lan 10.070 19

Anh 1.060

Thuỵ Sĩ 1.060

C¸c n−íc kh¸c 530

Tỉng sè 53.000 100

Trong năm gần đây, kỹ thuật tái tổ hợp ADN ngμy cμng có nhiều ứng dụng, vi sinh vật đ−ợc biến đổi gen có suất tạo enzym cao hơn, với kỹ thuật lên men vμ thu hồi sản phẩm ngμy cμng hoμn thiện nên giá thμnh enzym liên tục giảm Những enzym dùng y học lμm kít chẩn đốn hay điều trị sổ bệnh hiểm nghèo số l−ợng dùng nhỏ (mg microgram) nh−ng giá đắt (100.000 đôla/kg) Đặc biệt, kỹ thuật bất động enzym đời lμm cho trình sản xuất tự động hoá nên hiệu sử dụng enzym cao Kỹ thuật bất động enzym coi nh− vi chíp điện tử máy tính, lμm cho công nghệ enzym trở thμnh ngμnh khoa học hấp dẫn vμ hiệu Chỉ cần kg penicillinamidase bất động mạng polyacriamid sản xuất đ−ợc 1000 kg 6-APA

Sự tăng tr−ởng thị tr−ờng enzym giới theo hai xu h−ớng sau: sản xuất enzym dùng công nghiệp với số l−ợng lớn vμ enzym có độ tinh khiết cao với số l−ợng nhỏ dùng phân tích, chẩn đốn vμ điều trị Hai quốc gia nhỏ bé Châu âu lμ Hμ Lan vμ Đan Mạch đ−ợc coi lμ “c−ờng quốc" sản xuất enzym dùng công nghiệp (bảng 4.2)

3 Kü thuËt di truyÒn c«ng nghƯ enzym

Kỹ thuật tái tổ hợp ADN cho phép chuyển gen điều khiển sinh tổng hợp enzym có ích nμo từ thể nμy sang thể khác Cơ thể nhận gen ngoại lai gọi lμ vật chủ Mục đích trình chuyển gen nμy lμ để tạo vi sinh vật có khả sinh tổng hợp enzym có ích mμ việc nuôi vi sinh vật nμy điều kiện đơn giản hơn, trình chiết xuất vμ tinh chế enzym dễ dμng Nh− hiệu kinh tế Nguyên tắc chuyển gen để tạo enzym đ−ợc minh hoạ sơ đồ hình 4.1

Bằng kỹ thuật chuyển gen nêu trên, hãng Novo Nordisk thực chuyển đoạn ADN gen từ nấm mốc Humicola languinosa sang cho Aspergillus oryzae tạo đ−ợc enzym lipolase sản xuất thích hợp qui mơ cơng nghiệp dùng nghiên cứu enzym Công nghiệp tẩy rửa đạt hiệu kinh tế cao Lipolase bền vững nhiệt độ vμ pH khác Sự biến đổi enzym nhằm cải thiện đặc điểm xúc tác chúng thực vμi thập kỷ vừa qua Tr−ớc đây, cơng việc xảy cách ngẫu nhiên, cịn thay đổi thiết kế mơ hình vμ thực cách chủ động vμ có hiệu Bảng 4.4 cho ta thấy mục tiêu để nghiên cứu enzym

Sự phát triển VSV với enzym đợc sử dụng

Tinh chÕ mARN tỉn g hỵp

mARN Tinh chế

enzym

Phân tích phần chuỗi amino acid

Tổng hợp mẫu oligonu cleotid

Xỏc định cADN sợi đơn cách lai với mẫu oligo

Tái tổ hợ p AND vào E.coli(c.ADN)

Chuyển vào vật chủ SX công nghiệp (Aspergillus oryzae)

Sản xt c«ng nghiƯp enzym

Bảng 4.4. Những vấn đề cần nghiên cứu để biến đổi enzym

ã Nâng cao hoạt tính enzym

ã Tăng độ ổn định

• Cho phép enzym hoạt động mơi tr−ờng thay đổi

• Thay đổi pH nhiệt độ tối −u

• Thay đổi hẳn đặc tính enzym nh− chúng xúc tác cho biến đổi chất hoàn toàn khác

• Thay đổi phản ứng xúc tác

ã Nâng cao hiệu trình

K thuật protein đ−ợc gọi lμ “phẫu thuật phân tử” đ−ợc sử dụng để thực biến đổi phân tử enzym Kỹ thuật protein enzym có liên quan đến mơ hình khơng gian ba chiều enzym tinh khiết tiến hμnh nhiễu xạ phân tử tia X Sự thay đổi cấu trúc enzym lμ kết lμm tăng tính ổn định enzym Ví dụ, pH vμ nhiệt độ, yêu cầu biến đổi phân tử enzym đ−ợc thực thay đổi mã di truyền vi sinh vật tạo enzym Có hai đ−ờng để nghiên cứu thực mục tiêu Thứ lμ đột biến gen để vi sinh vật tạo enzym có cấu trúc mμ thμnh phần vμ trình tự amino acid thay đổi Ph−ơng pháp thứ hai có liên quan đến chiết xuất enzym tự nhiên vμ lμm biến đổi cấu trúc phân tử enzym hố học - đơi cịn gọi lμ đột biến “hố học” Một ví dụ để minh hoạ cho điều lμ: lμm biến đổi cấu trúc enzym phospholipase A2 bền vững môi tr−ờng acid vμ enzym nμy đ−ợc ứng dụng rộng rãi công nghiệp chế biến sữa Rõ rμng lμ kỹ thuật gen vμ vμ kỹ thuật protein đóng vai trị quan trọng việc nghiên cứu enzym dùng công nghiệp Kỹ thuật gen góp phần lμm giảm giá thμnh sản phẩm, tạo enzym từ vi sinh vật, ch−ơng trình nghiên cứu phát triển nhanh

4 Kü thuËt s¶n xuÊt enzym

Mặc dù có nhiều enzym đ−ợc sử dụng có nguồn gốc từ thực vật vμ động vật, song nguồn enzym khơng thể thoả mãn nhu cầu sống, phải tìm nguồn enzym phong phú từ vi sinh vật Ngay q trình đ−ờng hố tinh bột tr−ớc sử dụng malt (thóc mầm), ngμy đ−ợc thay amylase từ vi sinh vật hiệu

Sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzym có lợi sau:

− Hoạt tính cao đơn vị sản phẩm tính theo trọng l−ợng khô − Không phụ thuộc vμo thời tiết, thời vụ trình thực

− Các enzym vi sinh vật có đặc điểm lμ hoạt độ mạnh phạm vi rộng pH vμ nhiệt độ, đồng thời có tính chọn lọc cao (asparaginase)

− Di truyền công nghiệp cho phép lựa chọn vμ tạo vi sinh vật cho hiệu suất enzym cao, dễ dμng lên men vμ chiết xuất, tinh chế Các enzym đặc biệt khó sản xuất th−ờng đ−ợc chuyển gen vμo vật chủ nh− Aspergillus oryzae biết rõ đặc điểm phát triển chúng nên không cần phải nghiên cứu tốn

Để chọn vi sinh vật sản xuất enzym cần ý tiêu chuẩn sau đây: vi sinh vật địi hỏi điều kiện lên men đơn giản, enzym ngoại bμo, qui trình thu sản phẩm vμ tinh chế không phức tạp, enzym ổn định khoảng nhiệt độ vμ pH rộng Tuỳ theo mục đích sử dụng mμ chọn enzym cho phù hợp Ví dụ, enzym dùng y học cần hoạt tính enzym cao pH trung tính Các enzym dùng cơng nghiệp tẩy rửa cần có hoạt tính cao pH kiềm Nguyên liệu cho công nghiệp lên men sản xuất enzym phải đơn giản, rẻ tiền Th−ờng dùng bột loại ngũ cốc rỉ đ−ờng, cao ngô Sản xuất enzym cơng nghiệp dùng ph−ơng pháp lên men xốp hay lên men chìm nh− mơ tả Ch−ơng Kỹ thuật lên men

Ph−ơng pháp lên men xốp sản xuất enzym th−ờng áp dụng nuôi nấm mốc đ−ợc ứng dụng từ lâu số n−ớc nh− Nhật Bản, n−ớc vùng Viễn Đông để sản xuất amylase, protease, pectinase vμ cellulase

Lên men chìm sản xuất enzym đợc tiến hnh thiết bị giống nh lên men sản xuất kháng sinh (h×nh 4.2)

Hình 4.2. Sơ đồ minh hoạ giai đoạn sản xuất enzym dạng dung dịch

Môi tr−ờng lên men bao gồm chất cung cấp l−ợng nh− hydrat carbon, nguồn nitơ, môi tr−ờng đ−ợc khử trùng thiết bị lên men, sau truyền giống vμ tiến hμnh lên men từ 30 - 150 tuỳ theo chủng vi sinh vật Công nghiệp sản xuất th−ờng sử dụng thiết bị từ 10 - 50 m3

Enzym th−¬ng phẩm đợc sản xuất dới hai dạng: dạng bột khô v dạng lỏng, l dạng thô dạng tinh khiÕt (h×nh 4.3)

Hình 4.3 Sơ đồ chiết xuất tinh chế enzym

Cho đến có số l−ợng nhỏ vi sinh vật đ−ợc sử dụng để sản xuất enzym Vì h−ớng nghiên cứu tìm kiếm enzym từ vi sinh vật lμ vấn đề thời vμ hấp đẫn

5 Ph−ơng pháp bất động enzym (immobilised enzym)

Việc sử dụng enzym để phân giải chất cần l−u ý đến tính chất sau enzym để khỏi lãng phí: enzym dạng hoμ tan tự trộn vμo với chất để tiến hμnh phản ứng enzym sử dụng đ−ợc lần Vì phản ứng kết thúc ta khơng thể lấy lại enzym để sử dụng lần sau Do kỹ thuật bất động enzym đời, ngun lý mơ tả tóm tắt nh− sau: enzym tinh chế dạng tinh khiết đ−ợc gắn gói polymer khơng hoμ tan n−ớc, hấp phụ chất trơ vô hữu Các hạt enzym nμy đ−ợc nhồi vμo cột hình trụ có kích th−ớc thích hợp, sau cho dung dịch chất chảy qua, enzym thực phản ứng phân cắt chất thμnh sản phẩm t−ơng ứng Thu lấy sản phẩm để thực b−ớc tinh chế tiếp sau Có thể bất động hoá enzym tế bμo vi sinh vật chứa enzym t−ơng ứng (hình 4.4)

Khi enzym tế bμo bất động hố phản ứng phân giải chất đ−ợc thực liên tục với hiệu suất cao, trì đ−ợc điều kiện phản ứng khơng thay đổi q trình giữ đ−ợc hμng ngμn giờ, có q trình phản ứng kéo dμi đ−ợc 100 ngμy phải thay đổi enzym Do enzym đ−ợc sử dụng nhiều lần, giá thμnh sản xuất đơn vị sản phẩm giảm nhiều

Enzym đ−ợc bất động cách nμo? Trên thực tế sử dụng ph−ơng pháp vật lý vμ hoá học để bất động enzym

Bằng phơng pháp vật lý enzym đợc hấp phụ lên khuôn không ho tan, đợc gói vo gel, capsul thnh hạt vi nang, dán vo phía sau mng bán thấm (hình 4.4)

a Các kiểu bất động enzym b Bất động enzym với glutaraldehyd

Bằng ph−ơng pháp hoá học, phân tử enzym đ−ợc nối lại với tạo thμnh sợi ngang dọc phản ứng nhóm amin enzym với tác nhân polymer hoá hoá chất nh− glutaraldehyd Có nhiều phản ứng hố học sử dụng để bất động enzym cách nμy nhóm chức khơng yếu chúng đ−ợc gắn với chất mang vô nh− gốm, thuỷ tinh, sắt, titan với polymer thiên nhiên nh− sepharose vμ cellulose, với polymer tổng hợp nh− nilon, polyacriamid, polymer vinyl khác vμ polymer nμy giữ đ−ợc nhóm hố chức hoạt động trở lại Trong nhiều thủ thuật thực để gói enzym với chất mang ph−ơng pháp nμy nhận thấy nhóm hoạt động hố học bị phân tán lộn xộn Vì nghiên cứu gần ý đến kỹ thuật bất động enzym cho enzym gắn với chất mang khơng bị giảm hoạt tính Giới hạn kỹ thuật bất động enzym đ−ợc trình bμy bảng 4.5

Bảng 4.5. Những hạn chế kỹ thuật bất động enzym

Ph−¬ng pháp Ưu điểm Nhợc điểm

Sự gắn kết đơng lợng

Khụng b nh hng ca pH, ion môi tr−ờng nồng độ chất

L−ới hoạt động biến đổi giá thành t

Polymer hoá đơng lợng

Enzym hot ng mạnh, chậm hoạt tính

Hoạt tính bị không hiệu chất có phân tử l−ợng lớn; khơng có khả tái sinh

HÊp phô

Đơn giản, enzym không bị biến đổi, thu hồi chất mang, giá thành thấp

Bị thay đổi mơi tr−ờng ion hố mạnh, enzym bị đẩy dùng cho protease

BÉy b»ng ho¸ häc

Enzym khơng bị biến đổi hoá học

Cơ chất khuếch tán vào sản phẩm ngồi, chuẩn bị khó khăn, enzym bị hoạt tính, khơng hiệu chất có phân tử lớn

Kỹ thuật “bẫy” enzym vμo gel lμ thμnh công tiến hμnh polymer hố tạo hạt phản ứng đơng tụ Polyacriamid, collagen, silicagel lμ chất tỏ thích hợp cho kỹ thuật nμy Tuy nhiên q trình tạo gel khó khăn vμ hiệu hoạt tính enzym thấp

Trên thực tế th−ờng có khuynh h−ớng bất động tế bμo lμ bất động enzym bỏ qua đ−ợc công đoạn chiết xuất vμ tinh chế enzym thời gian, tốn

a Bình phản ứng có khuấy trộn

b Các bình phản ứng liên tục dạng kín

Bng 4.6 Những −u điểm chất xúc tác sinh học bất động

• Cho phÐp sư dơng enzym nhiều lần

ã Có thể tiến hành trình liên tục

ã Sản phẩm enzym tự

ã Cho phép kiểm tra chặt chẽ trình xúc tác

ã Ci thin c n nh ca enzym

ã Cho phép phát triển hệ thống phản ứng nhiều enzym

ã Cung cấp tiềm to lớn cho công nghiệp y học

Do kết ứng dụng thμnh công ph−ơng pháp bất động enzym vμ tế bμo tạo nang, hạt, cột vμ mμng chứa enzym, nhiều kiểu bình phản ứng sinh học đ−ợc chế tạo để đáp ứng cho nghiên cứu phịng thí nghiệm nh− sản xuất công nghiệp

Trên thực tế đặc điểm xúc tác cúa enzym cô lập, bất động enzym hay tế bμo đ−ợc thực bình phản ứng sinh học Hệ thống bình phản ứng sinh học có nhiều kiểu dáng khác nhau, phụ thuộc vμo kiểu phản ứng vμ độ ổn định enzym (hình 4.2)

Hình 4.5. Các kiểu bình phản ứng sinh học chứa enzym tế bào bất động

Hμng ngμn siro fructose đ−ợc sản xuất ph−ơng pháp bất động enzym (hình 4.6)

Hình 4.6. Sơ đồ sản xuất fructose từ tinh bột

Một đối t−ợng khác quan trọng lμ sử dụng ph−ơng pháp bất động enzym aminoacylase để sản xuất acid amin Các cột chứa aminoacylase đ−ợc sử dụng Nhật Bản để sản xuất hμng ngμn kilogram L - methionin, L - phenylalanin, L - tryptophan vμ L - valin

Enzym liên kết dạng polymer đ−ợc sử dụng rộng rãi phân tích hố học vμ hố lâm sμng Các cột enzym bất động đ−ợc sử dụng nhiều lần coi nh− xúc tác đặc biệt để phát chất Các điện cực enzym đ−ợc chế tạo giống nh− detector kiểu cảm biến sinh học (biosensor) dùng thử nghiệm đo dòng điện dùng cho chất nh− urê, amino acid,

glucose, alcol vμ acid lactic Trong thiết kế chế tạo cho điện cực có tác dụng nh− cảm biến điện hố đóng mạch enzym thấm qua mμng bán thấm để phản ứng với chất (hình 4.7)

Hình 4.7. Sơ đồ đơn giản biosensor gắn với điện cực điện hoá enzym bất động màng bán thấm

Các enzym gắn vμo mμng tạo oxy, ion hydro, amoni, carbonic vμ phân tử nhỏ khác tuỳ thuộc vμo phản ứng enzym Mặc dù thμnh phần sinh học cảm biến sinh học lμ enzym hệ thống nhiều enzym, lμ kháng thể, tế bμo vi sinh vật mẩu mô Kỹ thuật enzym thực nghiệm lμ trình lý thú, nh− trình chế biến thực phẩm, d−ợc phẩm, cơng nghiệp hố học, xử lý n−ớc thải có ý nghĩa to lớn lần l−ợt đ−ợc xem xét ch−ơng Trong t−ơng lai thμnh tựu nghiên cứu lĩnh vực enzym giải vấn đề thiết yếu sống nh−: để bảo vệ môi tr−ờng, vấn đề l−ợng, thực phẩm vμ nhu cầu cao cấp khác loμi ng−ời

Tự lợng giá

1 K tờn cỏc vi sinh vật đ−ợc sử dụng công nghiệp để sản xuất enzym Nêu −u vi sinh vật sn xut enzym

2 Kể tên phơng pháp lên men đợc dùng chủ yếu sản xuất enzym

3 Kể tên các ph−ơng pháp bất động enzym, tên vμ đặc điểm chất th−ờng đ−ợc sử dụng bất động enzym?

Ch−¬ng

Sản xuất Protein đơn bμo

Mục tiêu

Sau học xong chơng ny sinh viên phải trình by đợc:

1 Tm quan trọng sản xuất protein đơn bμo, −u nh−ợc điểm protein đơn bμo

2 Tên chủng vi sinh vật th−ờng sử dụng để sản xuất protein đơn bμo vμ đặc điểm trình lên men chủng

1 Sự cần thiết sản xuất protein đơn bμo

Vấn đề bao trùm giới lμ vấn đề dân tộc vμ dân số Vấn đề dân tộc hay sắc tộc thuộc phạm trù trị xã hội Vấn đề dân số lμ vấn đề phát triển riêng quốc gia Hiện dân số giới khoảng tỉ ng−ời Mức tăng bình quân hμng năm khoảng 95 triệu Dự tính đến năm 2050 dân số giới lμ 10 tỉ Với trình độ phát triển nơng nghiệp nh− khơng thể cung cấp đủ l−ơng thực thực phẩm cho nhân loại, đặc biệt lμ nguồn protein khơng thể thoả mãn địi hỏi nhu cầu Tổ chức L−ơng thực vμ nông nghiệp giới (FAO) cảnh báo thiếu hụt protein quốc gia phát triển vμ quốc gia phát triển 25% dân số giới đói vμ thiếu dinh d−ỡng Đại đa số số nμy lμ n−ớc phát triển Dân số n−ớc phát triển tiêu thụ protein mức 12 g protein động vật/ng−ời/ngμy Việc trồng giống có hμm l−ợng protein cao nh− đậu t−ơng, lạc khó khăn cịn phải phụ thuộc nhiều vμo thời tiết m−a nắng không thuận hoμ, sâu bệnh phá hoại Để đảm bảo nguồn protein cần thiết cho loμi ng−ời khơng thể có đ−ờng nμo khác lμ đ−ờng sản xuất protein từ vi sinh vật

Từ cổ x−a hai văn hố ph−ơng Đơng vμ ph−ơng Tây biết chế biến thực phẩm vi sinh vật Trong phần ăn có chứa vi sinh vật cho ng−ời vμ vật nuôi Sữa chua, d−a chua, chao, t−ơng, mắm chua chứa vi sinh vật Tuy nhiên q trình sản xuất cơng nghiệp vi sinh vật cho mục đích dinh d−ỡng xảy Đức vμo thời kỳ Đại chiến giới lần thứ nhất, lúc đ−ợc gọi lμ nấm men “Torula” Sau chiến tranh mối quan tâm Đức giảm đi, song lại đ−ợc phục hồi vμo năm 30, vμ Đại chiến giới lần thứ hai khoảng 15.000 nấm men đ−ợc sản xuất năm nhằm phục vụ nhu cầu protein cho binh lính vμ th−ờng dân Chủ yếu để nấu súp vμ lμm xúc xích Sau chiến thứ hai Mỹ vμ Anh quan tâm đến sản xuất sinh khối nấm men để phục vụ nhu cầu chăn nuôi công nghiệp Từ năm 50, công nghiệp sản xuất nấm men đ−ợc thúc đẩy mạnh mẽ

Bảng 5.1. Thành phần hoá học tế bào số loại nấm đ−ợc sử dụng làm protein đơn bào (SCP)

Thành phần Pacilomyces vaioti Fusarium graminearum

Candida utilis

Trọng lợng khô (%) 96,0 94,2 91,0

Protein th« (% N x 6,25) 55,0 54,1 48

ChÊt bÐo (%) 1,0 1,0 1,35

Tro (%) 5,0 6,1 11,0

Lysin (g/16g N) 6,5 3,5 7,2

Methionin (g/16 g N) 1,9 1,23 1,0

Cystin vµ Cystein (g/16 g N) 1,0 0,75 1,0

Hội nghị lần thứ SCP Viện kỹ thuật Massachusett năm 1967 có nhiều dự án thực nghiệm sản xuất SCP Riêng Hãng British Petroleum (BP) trình bμy báo cáo sản xuất công nghiệp SCP Đến hội nghị lần thứ hai vμo năm 1973 nhiều hãng thuộc nhiều n−ớc khác sản xuất qui mô công nghiệp vμ chứng minh đ−ợc khả kỹ thuật họ Cũng năm 1973 sản xuất SCP từ hydrocarbon đ−ợc đẩy mạnh

Nguyên nhân nμo thúc đẩy nhiều n−ớc phải sản xuất SCP?

So với sản xuất nguồn protein truyền thống, sản xuất SCP cã nh÷ng −u thÕ sau:

− Tốc độ sản xuất tăng nhanh

− Hμm l−ỵng protein cao (30-80% tính theo trọng lợng khô)

Có thể dïng c¸c nguån carbon kh¸c (mμ mét sè chÊt đợc coi l chất thải)

Nhiều chủng vi sinh vật cho suất cao, hm lợng protein cao v chất lợng tốt

Diện tích sản xuất nhỏ, sản lợng cao Không phụ thuộc vo mùa vô, thêi tiÕt

Một nh−ợc điểm quan trọng SCP lμ chúng chứa hμm l−ợng acid nucleic cao, đặc biệt lμ vi khuẩn vμ nấm men Nếu loại nμy đ−ợc sử dụng cho ng−ời lμ vấn đề cần quan tâm, ng−ời thiếu enzym uricase xúc tác cho oxy hoá acid uric thμnh allantoin dễ hoμ tan Nếu ăn nhiều dẫn chất chứa purin lμm tăng hμm l−ợng acid uric máu, acid nμy tạo thμnh sỏi đọng lại khớp x−ơng vμ bể thận, dễ sinh sỏi thận Hμng ngμy ng−ời lớn nên ăn 20 g nấm men (tính theo trọng l−ợng khơ) Đã có ph−ơng pháp nêu nhằm lμm giảm hμm l−ợng acid nucleic SCP Tuy nhiên ph−ơng pháp xử lý dẫn đến việc lμm giảm giá trị sinh học protein đơn bμo Các ph−ơng pháp lμ:

− Thủ phân kiềm Chiết hoá chất

Hoạt hoá ARNase (bằng xử lý nhiệt)

V hiu suất sinh tổng hợp protein vi sinh vật cao nhiều lần so với động vật chăn nuôi trang trại (bảng 5.2) Th−ờng so sánh suất tạo protein bò nặng 250 kg với 250 g vi sinh vật Trong bò tổng hợp đ−ợc 200 g protein ngμy vi sinh vật tính lý thuyết (trong điều kiện phát triển lý t−ởng) chúng tạo đ−ợc 25 thời gian Tuy nhiên bị có khả đặc biệt lμ biến đổi cỏ thμnh sữa giμu protein

Bảng 5.2. Thời gian cần thiết để tăng gấp đôi sinh ca mt s loi

Tên loài Thời gian

Vi khn vµ nÊm men 20-120

Nấm tảo 2-

Cỏ vài thực vật 1-2 tuần

Gà 2-6 tuần

Bồ câu 4-6 tuần

Trâu, bò (còn nhá) 1-2 th¸ng

Protein từ SCP chứa đầy đủ chất dinh d−ỡng quan trọng nh− acid amin, vitamin nguyên tố vô cần thiết cho thể (bảng 5.3)

Cũng điều khiển trình lên men vi sinh vật để tạo sinh khối có chứa chất cần thiết có giá trị sử dụng cao Ví dụ nh− ni Saccharomyces uvarum mơi tr−ờng có chứa selenid tạo sinh khối có chứa hợp chất selen hữu dùng lμm thuốc antioxydant vμ điều trị ung th−, ni tảo Spirullina chứa β caroten…

B¶ng 5.3. Thành phần acid amin protein tế bào Saccharomyces

Acid amin mmol/100 g protein

nÊm men Acid amin

mmol/100 g protein nÊm men

Alanin 114,70 Leucin 74,08

Arginin 40,18 Lysin 1,54

Asparagin 25,43 Methionin 12,66

Acid aspartic 74,38 Phenylalanin 33,44

Cystein 1,65 Prolin 41,13

Acid glutamic 75,45 Serin 46,33

Glutamin 26,33 Threonin 47,85

Glycin 72,56 Tryptophan 7,10

Histidin 16,55 Tyrosin 25,49

Isoleucin 48,17 Valin 66,18

Nuôi vi sinh vật để sản xuất SCP có nhiều −u điểm nh− sau:

− Vi sinh vật phát triển với tốc độ nhanh điều kiện tối −u, vμi loμi tăng gấp đơi sinh khối sau 0,5 -

− Vi sinh vật dễ dμng bị biến đổi gen thực vật vμ động vật, tạo loμi biến đổi gen nhằm tăng tốc độ phát triển, chịu đ−ợc điều kiện sống khắc nghiệt vμ điều kiện lên men dễ dμng

− Vi sinh vËt chøa hμm lợng protein cao v giá trị dinh dỡng cao Vi sinh vật tạo lợng sinh khèi lín mét thiÕt bÞ

lên men dung tích nhỏ vμ thực q trình liên tục điều khiển tự động Diện tích để sản xuất nhỏ, khơng phụ thuộc vμo thời vụ, thời tiết

2 S¶n xuÊt sinh khèi nÊm men

Trong công nghiệp sản xuất sinh khối nấm men th−ờng hay dùng Saccharomyces cerevisiae lμ loμi đ−ợc sử dụng vμo nhiều lĩnh vực công nghiệp thực phẩm (lên men r−ợu, bia, lμm nở bột mì, lμm thức ăn gia súc ) Tuỳ theo điều kiện lên men hiếu khí hay kỵ khí mμ ta có sản phẩm khác Khi lên men kỵ khí để tạo alcol ethylic, nấm men biến đổi đ−ờng theo phản ứng sau:

C12H22O11 + H2O C2H5OH + CO2 + H2O

Trong điều kiện lên men hiếu khí, nấm men sử dụng đ−ờng để phát triển tăng tích luỹ sinh khối lμ Tuy nhiên tạo thμnh l−ợng nhỏ alcol ethylic Ph−ơng trình biểu diễn biến đổi đ−ờng lên men hiếu khí nh− sau:

C12H22O11 + H2O Sinh khèi + CO2 + H2O 2.1 S¶n xuÊt sinh khèi nÊm men tõ rØ ®−êng

Trong công nghệ sản xuất đ−ờng từ củ cải đ−ờng từ mía, sau kết tinh đ−ờng, phần cịn lại không kết tinh đ−ợc gọi lμ rỉ đ−ờng Rỉ đ−ờng dùng lμm nguyên liệu cho nhiều trình lên men có giá thμnh rẻ Trong rỉ đ−ờng ngoμi thμnh phần lμ saccharose cịn chứa số chất vơ cơ, hữu vμ vitamin có giá trị Sản l−ợng trung bình rỉ đ−ờng chứa 50% saccharose, dao động từ 3,5% đến 4,5% tính theo nguyên liệu dùng chế đ−ờng Hμm l−ợng saccharose chứa rỉ đ−ờng phụ thuộc nhiều vμo hμm l−ợng muối vô Muối K vμ Na lμm cản trở trình kết tinh đ−ờng, ng−ợc lại muối Mg lại lμm tăng khả kết tinh đ−ờng Thμnh phần rỉ đ−ờng mía vμ củ cải lμ khác (bảng 5.4)

Bảng 5.4. Thành phần rỉ đờng củ cải rỉ đờng mía chứa 75% chất khô

Thành phần Đơn vị tính Rỉ đờng củ cải Rỉ đờng mía

Đờng tổng số (%) 48-52 48-56

Chất hữu (%) 12-17 9-12

Protein (Nx 6,25) (%) 6-10 2-4

K (%) 2,0-7,0 1,5-5,0

Ca (%) 0,1- 0,5 0,4- 0,8

Mg (%) 0,09 0,06

P (%) 0,02-0,07 0,6-2,0

Biotin (mg/kg) 0,02-0,15 1,0-3,0

Acid pantothenic (mg/kg) 50-110 15-55

Inositol (mg/kg) 5.000-8000 2.500-6.000

Sự khác biệt rỉ đ−ờng mía vμ rỉ đ−ờng củ cải lμ hμm l−ợng biotin Rỉ đ−ờng mía chứa khoảng 2,5 mcg biotin/g, gấp khoảng 20 lần rỉ đ−ờng củ cải Rỉ đ−ờng củ cải có hμm l−ợng acid pantothenic gấp 2-4 lần rỉ đ−ờng mía Vì sử dụng rỉ đ−ờng mía để sản xuất men bánh mì cần phải bổ sung acid nμy

Rỉ đ−ờng cần đ−ợc xử lý tr−ớc pha chế môi tr−ờng để ni cấy Th−ờng đ−ợc acid hố acid sulfuric tới pH vμ nâng nhiệt độ lên 120 - 1250C phút để kết tủa số chất lơ lửng Đồng thời bổ sung thêm

nh÷ng thμnh phần cần thiết cho men phát triển Rỉ đờng lμ m«i tr−êng tèt cho mét sè vi sinh vËt lạ phát triển lm hỏng trình nuôi men, nên môi trờng pha chế xong cần đợc khử trùng

Để sản xuất men bánh mì th−ờng sử dụng S cerevisiae Cũng có nhiều nghiên cứu tìm cách sử dụng loμi Torula, Candida vμOspora để sản xuất men bánh mì nh−ng ch−a thμnh cơng sản xuất cơng nghiệp

ở Anh có loại ”nấm men bơng” lên men nổi, có xu h−ớng tạo thμnh bơng mạnh vμ chúng dễ dμng tách khỏi mơi tr−ờng mμ không cần đến ly tâm, thuận tiện cho sản xuất Chúng đ−ợc sử dụng lμm men bánh mì

S cerevisiae lμ loại vi sinh vật sống vμ phát triển điều kiện có oxy vμ khơng có oxy Khi sinh tr−ởng điều kiện hiếu khí chúng cần biotin, cịn nhu cầu inositol vμ acid pantothenic thay đổi theo chủng Ngoμi nhu cầu trên, nấm men cần thμnh phần khác nh− acid béo không no vμ ergosterol, số chủng cần acid nicotinic Trong điều kiện kỵ khí bắt buộc thiếu thμnh phần nμy, nấm men phát triển vμi hệ sau dừng lại hoμn toμn

Quan hệ nấm men với oxy lμ mối quan hệ phức tạp, điều nμy đ−ợc kiểm chứng qua nghiên cứu hiệu ứng trao đổi ôxy nấm men Ngoμi hiệu ứng Pasteur, cịn có hiệu ứng Pasteur ng−ợc, hiệu ứng glucose hay kiềm chế dị hoá Tốc độ sinh tr−ởng nấm men phụ thuộc nhiều vμo nồng độ oxy mơi tr−ờng (hình 5.1)

Nồng độ oxy chứa môi tr−ờng có ảnh h−ởng gián tiếp lên enzym điều khiển q trình biến đổi glucose Có thể kiềm chế dị hố cách ni nấm men nồng độ glucose thấp nh− hệ thống lên men liên tục Có thể tính tốn nồng độ glucose cần thiết để men phát triển bình th−ờng, sau bổ sung đ−ờng theo chu kỳ, khống chế để men phát triển với tốc độ tối đa Nếu đ−ờng nạp vμo thừa nấm men chuyển h−ớng trao đổi chất từ t hơ hấp sang lên men, lúc phát thấy ethanol khí thải Qui trình sản xuất men bánh mỳ minh họa sơ đồ (hình 5.2)

Hình 5.2 Sơ đồ qui trình sản xuất men bánh mì

1 Men gièng, Nuôi máy lắc, Nhân giống,

4 Nhân giống, Nuôi để thu sản phẩm, Lọc để thu men

• Men gièng

Năng suất vμ chất l−ợng men thu hoạch phụ thuộc nhiều vμo việc chuẩn bị men giống Men thμnh phẩm sau thu hoạch lẫn vi sinh vật lạ, nên sử dụng lμm men giống đ−ợc Một vμi nhμ máy sử dụng men thμnh phẩm lμm men giống, song hiệu khơng cao Vì phải bắt đầu ống giống khiết, sau nhân giống điều kiện vơ trựng

ã Nhân giống

Ging c nuụi điều kiện vô trùng, th−ờng chuẩn bị giống theo ba cấp Môi tr−ờng nuôi men giống cấp vμ cấp ngoμi đ−ờng lμ thμnh phần chính, cần có thêm nitơ dạng hữu để men phát triển nhanh Đến bình nhân giống cấp vμ bình lên men để thu hoạch men cần nguồn nitơ vơ

Trong trình nhân giống phải theo dõi phát triển men, đồng thời cung cấp khơng khí với l−u l−ợng cần thiết Khi truyền giống từ cấp độ lên men nμy sang cấp độ lên men khác tỉ lệ giống truyền th−ờng lμ 10% vμ giống phát triển pha logarit

• Lên men để thu hoạch sinh khối nấm men

Thiết bị nuôi men dùng sản xuất cã dung tÝch tõ 50-300 m3 M«i

tr−ờng ni chiếm 70% dung tích thiết bị ni Nhiệt độ nuôi men th−ờng giữ 30oC - 32oC Cấp khí liên tục với l−u l−ợng 1VVM (1 thể tích khụng khớ/1

thể môi trờng/phút)

ã Thu sinh khèi nÊm men

Tiêu chuẩn chủ yếu dùng để xem xét men bánh mì th−ơng phẩm kết thúc ni men lμ có sản l−ợng cao, tế bμo men phải đảm bảo tính chất nấm men, có hoạt tính lên men cao vμ chất l−ợng bảo quản tốt hay không Tiêu chuẩn nμy dễ dμng đ−ợc đánh giá xác nhờ vμo việc phân tích hμm l−ợng mARN vμ loại ARN khác hμm l−ợng protein tổng số Trong công nghiệp để thu hoạch men th−ờng sử dụng ph−ơng pháp ly tâm vắt để loại bỏ mơi tr−ờng sau rửa n−ớc 2-3 lần để loại bỏ toμn môi tr−ờng cịn dính bám vμo tế bμo men nhằm khơng cho tế bμo men cịn lên men tiếp Tế bμo men thu đ−ợc dạng men ép có độ ẩm khoảng 80% đ−ợc bao gói thμnh đơn vị nhỏ từ 1-5 kg giấy nhôm vμ bảo quản nhiệt độ 4-8˚C Cũng sấy khơ men điều kiện áp suất vμ nhiệt độ thấp đến độ ẩm 4-6% vμ giữ đ−ợc hoạt tớnh lờn men cao

ã Vi sinh vật tạp nhiễm trình sản xuất sinh khối nấm men

Trong sản xuất men thực điều kiện vô trùng tuyệt đối nh− sản xuất chất kháng sinh khơng có vi sinh vật tạp nhiễm Trong điều kiện địi hỏi phải đầu t− lớn, đặc biệt lμ mμng lọc khơng khí vơ trùng Lúc giá thμnh sản xuất men cao chi phí lớn Trên thực tế sản xuất men bánh mì, th−ờng sử dụng qui trình đơn giản, thiết bị khơng cần đắt tiền, hệ thống lọc khơng khí khơng cần đại Thủ thuật để đảm bảo q trình ni men thμnh cơng lμ xử lý mơi tr−ờng rỉ đ−ờng acid sulfuric đến pH = 2,5 - 3,0 Đun sôi môi tr−ờng để khử trùng ban đầu, sau điều chỉnh pH = 3,5 - 4,0 Trong khoảng - đầu nuôi men điều kiện kỵ khí hiếu khí nhẹ Nấm men lên men r−ợu vμ tạo l−ợng cồn định có khả ức chế phát triển số vi sinh vật nhiễm vμo môi tr−ờng điều kiện pH mơi tr−ờng thấp Sau tiếp tục ni men điều kiện hiếu khí mạnh men phát triển tối đa

Nếu q trình ni men có lẫn loμi men khác nh−Torula, Candida , chúng th−ờng phát triển nhanh vμ lấn át S cerevisiae Các loμi nấm men kể th−ờng khó ép vμ lμm giảm đáng kể lực lên men men ép

Hμng loạt vi sinh vật khác xâm nhập sau vμo men ép lμm hỏng men Đáng sợ lμ Oidiumlactis th−ờng gây cho men có mùi ủng khó chịu Các nấm khác nh− Penicillium tạo nên đám mμu lục men ép, Aspergillus tạo nên đám mμu vμng nhạt tới mμu xám, Mucor vμ Fusarium tạo vết vμng vμ đỏ men ép Dematium pullutans tạo nên vết mμu nâu bẩn, vi khuẩn acetic tạo nên vùng ố bề mặt, Serratia marcescens lại tạo nên vết đỏ men ép

2.2 øng dơng cđa men Ðp

Men bánh mì đ−ợc sử dụng cơng nghiệp sản xuất bánh mì, bánh bao vμ loại bánh lμm từ bột nhμo dùng gia đình Để sản xuất bánh mì trắng cần tỉ lệ nấm men khoảng 2%, với loại bánh nhỏ cần từ 3-5%, bánh sữa 4-5% (so với trọng l−ợng bột mì) Th−ờng nhμo bột mì với men giống trộn vμ ủ men nhiệt độ thích hợp Nấm men lên men saccharose, glucose vμ fructose có sẵn bột, sau lên men maltose glucose đ−ợc tạo thμnh nhờ amylase có bột nhμo Thơng th−ờng bột nhμo khơng chứa đủ l−ợng amylase cần thiết nên th−ờng ng−ời ta cần bổ sung α-amylase bền với nhiệt vμo men bánh mì CO2 đ−ợc tạo trình lên men lμm khối bột nở phồng lên Quá trình lên men tạo khoảng 0,5%-1% r−ợu vμ có mùi thơm đặc biệt Khi n−ớng bánh, nhiệt độ lò đạt tới 50-60˚C nấm men bị chết

Men ép đ−ợc sử dụng để sản xuất cao nấm men hay bột nấm men dùng lμm môi tr−ờng lên men vi sinh vật phịng thí nghiệm Cách chế tạo cao nấm men hay bột nấm men đơn giản Men ép đem hoμ n−ớc tỉ lệ 1/4 để nhiệt độ 35-37˚C, protein nội bμo thuỷ phân protein nấm men (autolyse) để tạo acid amin vμ giải phóng vitamin có tế bμo men mơi tr−ờng n−ớc Để q trình thuỷ phân đ−ợc triệt để thuỷ phân tiếp acid papain Điều chỉnh pH trung tính lọc trong, d−ới áp suất giảm đến dạng cao mềm hay sấy phun để tạo bột nấm men Bột hay cao nấm men chứa hμm l−ợng cao vitamin nhóm B vμ acid amin khơng thay Có thể bμo chế dạng viên nén, viên nang, viên bao đ−ờng dạng thuốc n−ớc dùng lμm thuốc bồi bổ thể quí

Cũng ph−ơng pháp nuôi S cerevisiae điều kiện đặc biệt, chúng tạo hμm l−ợng cao vitamin D ergosterin lμ thuốc quí 3 Sn xut to n bo

Để sản xuÊt SCP th−êng dïng ba chi lμ Chlorella, Scenedesmus vμ

hoặc dị d−ỡng Ph−ơng pháp nuôi tảo nhờ quang hợp đ−ợc ứng dụng nhiều giá thμnh rẻ Nhân tố định cho trình nμy lμ ánh sáng mặt trời Vì th−ờng sử dụng ao hồ ruộng để nuôi tảo d−ới ánh sáng mặt trời Tuy nhiên tiến hμnh nuôi qui mơ lớn khó giữ đ−ợc điều kiện vô trùng Trong tr−ờng hợp nμy nguy nhiễm tạp lμ nghiêm trọng Hơn mật độ tế bμo nuôi theo ph−ơng pháp nμy th−ờng thấp (khoảng 1-2 g/lít SCP tính theo trọng l−ợng khơ) Riêng tảo sợi Spirulina phát triển mạnh hơn, hμm l−ợng protein cao vμ đặc biệt lμ chứa betacaroten, vitamin B12 lμ thuốc quí Dân c− Mehico vμ vùng bờ Bắc hồ Tchad

thuộc châu Phi th−ờng sử dụng loμi tảo nμy lμm nguồn dinh d−ỡng protein Nhật Bản sử dụng Chlorella nh− nguồn protein vμ vitamin để bổ sung vμo vμi thực phẩm nh− sữa chua, kem vμ bánh mì Gần cịn chứng minh đ−ợc tác dụng chống phóng xạ chất có tảo Spirulina

4 Sản xuất nấm sợi

Nấm sợi lμ nguồn protein đơn bμo phong phú Tốc độ sinh tr−ởng nấm sợi thấp vi khuẩn vμ nấm men, nhiên có chủng nấm sợi có tốc độ sinh tr−ởng nhanh nh− nấm men, đặc biệt chủng nμy nuôi chất đặc vμ ph−ơng pháp bề mặt Hμm l−ợng protein thô nấm sợi đạt 50-55%, sinh tr−ởng nhanh hμm l−ợng acid nucleic cao (ARN tới 15%) Cần l−u ý đến thμnh phần kitin chứa thμnh tế bμo nấm Công nghiệp sản xuất penicillin tạo l−ợng lớn sinh khối nấm Penicillium chrysogenum L−ợng sinh khối nμy coi nh− chất phế thải cơng nghệ penicillin sấy khơ vμ sử dụng vμo nhiều mục đích khác nh− lμm thức ăn giμu protein cho chăn nuôi, thuỷ phân để tạo acid amin lμm môi tr−ờng giầu dinh d−ỡng để nuôi vi khuẩn (Bacillus subtilis) sinh tổng hợp protease amylase kinh tế Có loμi nấm sợi phát triển nhanh môi tr−ờng bột sắn sắn lát nghèo protein (~1,0-1,5%) có bổ sung thêm khống vi l−ợng ni 40-48 giờ, nấm phát triển, đem sấy khô vμ nghiền thμnh bột lμm thức ăn cho gia súc Bột nμy có hμm l−ợng protein tổng số lên tới 10%

B¶ng 5.5 Hàm lợng protein thô, N -amin N phi protein ë mét sè loµi nÊm

Loµi nÊm Nguån C Protein th«

N α-amin

N phi protein (kĨ c¶ kitin)

Aspergillus oryzae tinh bét 50,2 28,7 42,6

A oryzae rØ ®−êng 42,3 26,1 38,2

A niger rØ ®−êng 47,9 25,5 46,6

P chrysogenum đờng sữa 56,3 41,5 26,0

P chrysogenum rØ ®−êng 48,2 26,8 44,3

Neurospora sitophila tinh bét 65,7 35,6 45,6

N sitophyla rØ ®−êng 50.6 33,7 33,5

Fusarium graminearum tinh bét 54,0 42,1 22,0

F.moniliorme rØ ®−êng 51,5 35,6 30,9

Alternaria tenuis tinh bét 51,5 28,3 49,4

A tenuis rØ ®−êng 49,5 22,3 55,0

Agaricus bispora - 32,8 19,4 41,0

Paecilomyces elegans, Aspergillus oryzae, Myrothecium verrucaria vμ Trichodermareesei lμ loμi nấm thích hợp tạo thμnh sinh khối n−ớc thải công nghiệp sản xuất cμ phê vμ r−ợu rum Nếu lên men điều kiện vô trùng pH ban đầu 4,2 sau 6-8 ngμy lên men sản l−ợng sinh khối đạt 20-30 g/lít dịch ni, vμ hμm l−ợng protein đạt 20-34% Sau nuôi nấm hμm l−ợng chất hữu n−ớc thải giảm đi, từ 13-15% giảm 2-3% Các kết t−ơng tự thấy lên men Verticillium sp n−ớc thải sản xuất cμ phê; Aspergillus fumigatus bã mía, n−ớc thải công nghiệp thực phẩm, bột giấy từ gỗ; Penicillium digitatum n−ớc thải sản xuất tinh bột khoai tây

Trong tr−ờng hợp dùng nấm sợi ăn trực tiếp, cần l−u ý đến hμm l−ợng kitin cao thμnh tế bμo nấm vμ độc tố nấm có thμnh phẩm Cần tiến hμnh kiểm tra tr−ớc sử dụng Về chất l−ợng protein nấm sợi, nhiều phân tích cho thấy hμm l−ợng acid amin chứa l−u huỳnh nh− cystein vμ methionin nấm sợi thấp protein động vật 5 Sản xuất nấm ăn

phân giải đ−ợc dùng lμm phân bón hữu cơ, chế biến thμnh thức ăn cho cá số động vật có giá trị kinh tế

Các bã thải hữu nhờ công nghệ trồng nấm mang lại hiệu sau:

• Chất thải đ−ợc loại bỏ đ−ợc xử lí thμnh sản phẩm an toμn trả lại cho môi tr−ờng xung quanh vμ hoμ nhập vμo môi tr−ờng sinh thái nhờ q trình chuyển hố tự nhiên

• Chất thải rắn hay chất thải lỏng dùng lμm chất cho cơng nghệ trồng nấm

• Lignhin khơng tiêu hố đ−ợc thμnh phần thμnh tế bμo bị lignhin hoá cao nh− cellulose vμ hemicellulose bị phân huỷ nhờ enzym nấm lμm biến đổi hoμn toμn

• Các nguồn carbon từ chất thải hầu nh không sử dụng đợc nhờ trồng nấm ta thu đợc sinh khối giu protein có giá trị dinh dỡng cao (nấm rơm, nấm mỡ, nấm sò, nấm hơng, mộc nhĩ ), nÊm d−ỵc liƯu (linh chi )

* Qui trình trồng nấm ăn tổng quát nguyên tắc nh− sau: Giống nấm đ−ợc chuẩn bị vμ nhân giống phịng thí nghiệm nhằm tạo số l−ợng lớn bμo tử Sau đem rắc bμo tử nấm lên chất trồng nấm đ−ợc chuẩn bị sẵn, chất ủ thμnh luống nhỏ (trồng nấm rơm), hay bó lại thμnh bịch hình trụ vμ xếp thứ tự giá, nuôi nhμ kính, hay ni hở ngoμi trời, nhμ có mái che Điều quan trọng lμ giữ đ−ợc nhiệt độ vμ độ ẩm thích hợp để bμo tử nấm nẩy mầm, sau tạo thể Trong q trình chăm sóc cho thể phát triển th−ờng t−ới phun thêm dung dịch có chứa dinh d−ỡng (N,P,K, ) Nếu chăm sóc kỹ thuật thu hoạch thể đ−ợc nhiều lần vμ suất cao Trồng nấm lμ nghề phụ nhiều gia đình nơng dân Việt Nam góp phần xố đói giảm nghèo, lμm môi tr−ờng sống

Nấm ăn đ−ợc trồng nhiều n−ớc giới điều kiện khí hậu khác Các chất thải nông vμ công nghiệp lμ chất thích hợp nghề trồng nấm Nấm mỡ đ−ợc trồng nhiều châu á, châu úc vμ bắc Mĩ Đμi Loan lμ nơi sản xuất nấm ăn đứng thứ ba giới Trung Quốc lμ n−ớc sản xuất nấm rơm nhiều nhất, nấm nμy đ−ợc trồng nhiều Philipin, Vit nam v Indonecia

Tự lợng giá

1 Phân tích −u nh−ợc điểm protein đơn bμo

2 Các chủng nμo th−ờng đ−ợc dùng sản xuất sinh khối nấm men? Nêu ứng dụng nấm men vμ sinh khối nấm men đời sống vμ ngμnh D−ợc

Ch−¬ng

Sản xuất sản phẩm trao đổi chất bậc dùng Y học

Mục tiêu

Sau học xong chơng ny, sinh viên phải trình by đợc:

1. Nêu đợc khái niệm v tên chủng loại sản phẩm bËc mét cña vi sinh vËt

2 Trình by đợc quy trình sản xuất số sản phÈm thĨ.

Vi sinh vật sống vμ phát triển điều kiện tự nhiên hay điều kiện đ−ợc ni phịng thí nghiệm Chúng muốn tồn cần phải đồng hố chất dinh d−ỡng có chứa mơi tr−ờng xung quanh Q trình hấp thu vμ biến đổi chất dinh d−ỡng môi tr−ờng xung quanh để tạo l−ợng cần thiết cho phát triển chúng gọi lμ q trình đồng hố Vi sinh vật sử dụng l−ợng trình đồng hoá để tổng hợp nên thμnh phần cấu trúc tế bμo, để sinh tr−ởng, phát triển vμ trì nịi giống Trong q trình đó, số vi sinh vật có khả sinh tổng hợp thừa số l−ợng chất mμ tế bμo không dùng hết thải môi tr−ờng ngoμi nh− acid amin, vitamin, enzym Các chất đ−ợc gọi lμ chất trao đổi bậc Lợi dụng đặc điểm tự nhiên vi sinh vật, nhμ khoa học tìm đ−ợc ph−ơng pháp chọn giống vμ tác động lμm biến đổi số đặc điểm di truyền chúng vμ nghiên cứu đặc điểm sinh lý hố sinh chúng nhằm ni cấy vi sinh vật để “siêu tổng hợp” hoạt chất mμ ta mong muốn

1 Sản xuất acid amin

quan trọng cần phải nghiên cứu sản xuất ph−ơng pháp công nghiệp Sản xuất ph−ơng pháp tổng hợp hoá học th−ờng tạo acid amin dạng DL, việc tách riêng để lấy đồng phân dãy L vừa khó, giá thμnh lại đắt Sinh tổng hợp acid amin thuận tiện tạo dạng acid amin dãy L Trên giới hμng năm sản xuất 500 ngμn acid amin, doanh thu khoảng 4,5 tỉ USD Hai acid amin sản xuất với số l−ợng lớn lμ acid glutamic vμ lysin Trong giáo trình nμy giới thiệu ph−ơng pháp sinh tổng hợp acid glutamic

2 S¶n xuÊt acid glutamic 2.1 Đại cơng

Acid glutamic đ−ợc sản xuất với số l−ợng lớn tất acid amin acid nμy đ−ợc dùng phần sản xuất d−ợc phẩm, số l−ợng lớn đ−ợc dùng thực phẩm lμm chất điều vị đ−ợc sản xuất d−ới dạng mononatri glutamat Acid glutamic sản xuất ph−ơng pháp thuỷ phân protein bột lúa mì (gluten) Hiện nhμ máy sản xuất acid glutamic giới tiến hμnh ph−ơng pháp lên men vi sinh vật vừa có suất cao giá thμnh lại thấp nhiều so với ph−ơng pháp sản xuất hoá học

Sản xuất acid glutamic ph−ơng pháp lên men vi sinh vật có hai cách Lên men trực tiếp vi sinh vật có khả siêu tổng hợp acid glutamic sau chiết xuất vμ tinh chế thu lấy sản phẩm Một số vi sinh vật khác lại có khả sinh tổng hợp với số l−ợng lớn acid α-cetoglutarat Vì ni cấy vi sinh vật nμy để chúng tạo acid α-cetoglutarat Sau biến đổi enzym hố học acid nμy thμnh acid glutamic theo hình 6.1

2.2 Lên men sinh tổng hợp acid glutamic

2.2.1 Chđng gièng

Có nhiều chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp acid glutamic Tuy nhiên chủng sau đ−ợc nhiều nhμ máy sử dụng để sản xuất cho hiệu suất cao (80-120 g/lít): Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, B divaricatum Đây lμ vi khuẩn Gram (+) hiếu khí Nhiệt độ ni cấy thích hợp 34-37OC vμ thời gian lên men lμ 40 - 48

2.2.2 Nhu cÇu dinh d−ìng

Mơi tr−ờng dinh d−ỡng dùng để lên men sinh tổng hợp acid glutamic đơn giản Tuỳ theo đặc điểm chủng sản xuất yêu cầu cần nghiên cứu để có mơi tr−ờng tối −u cho suất sinh tổng hợp cao Nguồn carbon th−ờng lμ glucose, sacharose Thực tế sản xuất th−ờng sử dụng glucose từ dịch thuỷ phân tinh bột kết hợp với sacharose rỉ đ−ờng (mía củ cải đ−ờng) Đây lμ nguyên liệu rẻ tiền Nguồn nitơ th−ờng dùng lμ urê với tỉ lệ 1,5 - 2,0%, dùng (NH4)2SO4, NH4Cl với nồng độ 0,5% Quá trình lên men tạo acid glutamic lμm cho pH môi tr−ờng giảm xuống Vì th−ờng bổ sung urê để giữ cho pH mơi tr−ờng đạt trung tính, đảm bảo khơng ảnh h−ởng đến phát triển vi khuẩn lμm giảm hiệu suất sinh tổng hợp, đồng thời urê lại có tác dụng bổ sung thêm nguồn nitơ lμm chất dinh d−ỡng cho vi khuẩn

2.2.3 Quy trình lên men v chiết xuất

Sn xuất acid glutamic th−ờng áp dụng ph−ơng pháp lên men chu kì (theo mẻ) thiết bị lên men có dung tích từ 100.000 - 300.000 lít điều kiện hiếu khí vμ vơ trùng tuyệt đối

§Ĩ chiÕt xt vμ tinh chÕ acid glutamic cã nhiỊu ph−¬ng pháp Tuy nhiên có hai phơng pháp đợc áp dụng công nghiệp

ã Phng phỏp im ng điện

Sau kết thúc trình lên men, dịch lên men đ−ợc cô chân không nhiệt độ 50-60OC đến nồng độ định Sau tẩy mμu than hoạt, lọc

loại than, điều chỉnh pH acid clohydric đến điểm đẳng điện lμ 3,2 Acid glutamic kết tinh Lọc hay ly tâm lấy tinh thể Ph−ơng pháp thu hồi sản phẩm nμy đơn giản, nhiên hiệu suất thu hồi thấp th−ờng đạt 50 - 60%

• Ph−ơng pháp trao đổi ion

Trong công nghiệp để chiết xuất acid glutamic th−ờng áp dụng ph−ơng pháp chiết trao đổi ion theo hình 6.2

2.3 Sản xuất mì chính

Trong thc t, acid glutamic đ−ợc dùng chủ yếu để chế tạo mì dùng thực phẩm lμm chất điều vị Để sản xuất mì cần hoμ tan acid glutamic đến nồng độ định, sau tạo muối mononatri glutamat Na2CO3 NaOH pH 6,8-7,0, khử sắt, tẩy mμu Dung dịch glutamat Natri đem cô d−ới áp suất giảm đến nồng độ khoảng 30 - 30,5 độ Bé Thêm vμi tinh thể mì lμm mầm kết tinh Tiếp tục cô đến đậm độ 31 - 31,8 Bé, tinh thể mì kết tinh dạng hình trụ đặn Điều kiện để kết tinh mì cần tuân thủ lμ: áp suất chân không: 600 mmHg; nồng độ glutamat: 31,5 - 31,8 Bé Nhiệt độ cô đặc: 60 - 65OC

Sản phẩm có hμm l−ợng mononatri glutamat đạt 98 - 98,5% Hiệu suất chuyển đổi thμnh glutamat đạt 85 - 90% Ly tâm lấy tinh thể N−ớc ót khơng kết tinh đ−ợc bổ sung thêm natri clorid để tạo dạng bột có chứa 20 - 25% mononatri glutamat dùng lμm bột gia v

3 Sản xuất dextran 3.1 Đại cơng

Dextran l polysaccharid có trọng lợng phân tư rÊt kh¸c nhau, th−êng lμ dextran 1, 40, 60, 70 hay 110 kDa t−¬ng øng víi 1.000, 40.000, 60.000, 70.000 v 110.000 Dextran l polymer đợc trùng hợp nhóm vi khuẩn Lactic nhờ liên kết 1,6 glucosid

Dextran đợc sử dụng y học

nh− chất dùng thay huyết t−ơng bị choáng máu, chấn th−ơng, bỏng, nhiễm độc, viêm tuỵ, viêm mμng bụng Dextran “gia công” hay sephadex đ−ợc coi nh− sμng phân tử dùng kỹ thuật lọc gel để tinh chế protein có trọng l−ợng phân tử khác th−ờng dùng để tinh chế enzym peptid lμm thuốc Dextran đ−ợc sử dụng lμm chất keo bảo vệ, chất độn có tính trơ dùng d−ợc học

3.2 Phơng pháp sản xuất

Có nhiều chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp dextran nh Streptobacterium dextranicum, Streptococcus mutans Tuy nhiên công nghiệp thờng sư dơng chđng Leuconostoc mesenteroides ATCC10830, chđng nμy t¹o tới 95% polymer dextran có liên kết -1,6 glucosid (phần lại l liên kết -1,3) v trọng lợng phân tư lμ 4-5 x 107 dalton

Mơi tr−ờng để sinh tổng hợp dextran đơn giản gồm có saccharose 6%, cao ngô cao nấm men 2%, KH2PO4 0,1% vμ vi l−ợng, pH 5,0-6,0 Quá

O OH

OH OH C H2

O CH2 O OH

OH OH

trình lên men đợc tiến hnh 25OC, lúc ban đầu thông khÝ nhÑ vμ khuÊy

trộn liên tục Khi dextran đ−ợc hình thμnh dung dịch trở nên đặc sánh vμ có độ nhớt cao phải tăng tốc độ khuấy vμ cung cấp đủ khơng khí vơ trùng Kết thúc lên men sau 72-96 Sản phẩm lμ khối keo dextran đ−ợc hình thμnh, fructose tự do, acid lactic

3.3 Tinh chÕ vμ chÕ t¹o dextran d−ỵc dơng

Kết thúc q trình lên men dùng methanol để kết tủa dextran (1/3) Lọc thu dextran để tinh chế tiếp Dịch thải đ−ợc cất để thu hồi methanol

Dextran có trọng l−ợng phân tử lớn đ−ợc thuỷ phân acid hydrocloric nhiệt độ 95-100OC Khống chế trọng l−ợng phân tử ph−ơng pháp đo độ

4 Sinh tæng hợp vitamin B12 (Cyanocobalamin) 4.1 Đại cơng

Các vitamin đ−ợc sản xuất quy mô công nghiệp nhờ vi sinh vật lμ vitamin B12 (Cyanocobalamin), vitamin B2 (Riboflavin)

Từ kỷ XIX (1849) đến đầu kỷ XX, nguyên nhân bệnh thiếu máu ác tính khơng giải thích đ−ợc Mãi đến năm 1926, G R Minot vμ W P Murphy phát đ−ợc tác dụng điều trị bệnh thiếu máu ác tính cao gan h−ớng nghiên cứu đ−ợc mở Năm 1927, Castle nhận xét dịch tiêu hố có chất đ−ợc gọi lμ "nhân tố nội", kết hợp với chất gọi lμ "nhân tố ngoại" có protein gia súc giúp cho thể hấp thu đ−ợc "tác nhân chống thiếu máu ác tính" Đến năm 1948, Ricker vμ cộng Mỹ vμ Smith-Parkers Anh chiết vμ kết tinh đ−ợc tinh thể hình kim mμu đỏ đậm từ cao gan động vật vμ gọi lμ vitamin B12 Parker chứng minh đ−ợc lμ "nhân tố ngoại" vμ lμ tác nhân chữa thiếu máu ác tính Từ gan lấy đ−ợc 20 – 25 mg vitamin B12

Cấu trúc hoá học vitamin B12 D C Hodgkin (giải th−ởng Nobel 1964) xác định Trong động vật vμ thực phẩm B12 tồn dạng coenzym liên kết với acid amin

Vitamin B12 lμ yếu tố sinh tr−ởng, điều trị bệnh thiếu máu ác tính Nhu cầu cho ng−ời bình th−ờng mcg/ngμy Thiếu vitamin B12 ảnh h−ởng đến chức tạo hồng cầu gây suy nh−ợc toμn thân Cơng dụng vitamin B12 lμ chữa bệnh thiếu máu ác tính vμ chứng thiếu máu khác Vitamin B12 phối hợp với vitamin B1, B6 dùng điều trị viêm dây thần kinh gây đau khớp, liệt chân, tay hiệu Calci - B12 giúp trẻ chống còi x−ơng, chậm lớn

Vitamin B12 tham gia vμo nhiều phản ứng trao đổi chất thể, kích thích q trình tổng hợp protein (th−ờng gọi lμ nhân tố protein động vật) gia súc, gia cầm ăn thức ăn có chứa B12 tăng trọng nhanh (10 - 15%)

Tăng tỷ lệ đẻ trứng gμ vμ tăng tỷ lệ trứng nở thμnh gμ

Vitamin B12 thuộc loại hợp chất hoạt động sinh lý vμ đ−ợc tổng hợp tự nhiên hoμn toμn vi sinh vật Sinh vitamin B12 mạnh lμ vi

khuÈn propionic vμ vi khuÈn metan, vitamin B12 n»m tế bo vi khuẩn ny Ngoi mét sè x¹ khn cịng sinh vitamin B12 nh−: Str griseus, Str aureofaciens, Str rimosus…

Thực vật không tạo đ−ợc vitamin B12 ng−ời, vitamin B12 vi sinh vật tạo ruột giμ không đ−ợc hấp thu vμo máu Phân ng−ời, gia súc có vitamin B12 động vật: thịt bị, gan, thận, tim (10 mcg/100 g); hải sản: cua,

cá, trứng cá; sản phẩm phomát, kem, sữa… có chứa l−ợng nhỏ vitamin B12

4.2 CÊu tróc ho¸ häc vμ tÝnh chÊt

Công thức cấu tạo cyanocobalamin (C63H88CoN14O14 P; 1355) theo BP 2003

TT Tªn gäi Tªn cobalamin R

1 Vitamin B12 Cyanocobalamin CN

2 Vitamin B12a Hydroxocobalamin OH

3 Vitamin B12b Aquacobalamin H2O

4 Vitamin B12c Nitrosocobalamin NO

5 Coenzym B12 5'-deoxy-adenosylcobalamin

6 Methyl vitamin B12 Methylcobalamin CH3

Phân tử vitamin B12 có dạng coenzym liên kết với acid amin, bao gồm phần chính: phần Corin (còn gọi l nhân tố B) v phần nucleotid gồm base chứa nitơ l 5, dimetylbenzimidazol, đờng ribose v phân tử H3PO4 Nhân

Corin phức hợp với nguyên tử cobalt; cobalt g¾n víi gèc R vμ gäi chung lμ cobalamin Tuú theo gèc R mμ ta cã c¸c vitamin B12 cã t¸c dơng sinh häc

Tất cobalamin chuyển đ−ợc thμnh cyanocobalamin cho tác dụng với nhóm -CN Cyanocobalamin vμ hydroxocobalamin lμ dạng hay dùng y học

550 nm Đỉnh 361 nm dùng để định l−ợng vitamin B12 quang phổ

Vitamin B12 bÞ ánh sáng phân huỷ 4.3 Lên men sinh tổng hợp

Để sản xuất vitamin B12 có đờng sau: 4.3.1 Chiết từ bùn cống hoạt hoá

Một số vi sinh vật đặc biệt thuộc nhóm vi khuẩn sinh metan sống kỵ khí bùn cống, ruộng, ao có khả sản sinh vitamin B12 với hμm l−ợng 0,5 - mcg/1g bùn khơ Nếu ủ bùn điều kiện kỵ khí hμm l−ợng vitamin B12 tăng lên Có thể chiết lấy vitamin B12 thô từ bùn bổ sung vμo thức ăn chăn nuôi gμ lợn Hiện không sử dụng ph−ơng pháp nμy để sản xuất mμ để kiểm tra độ ô nhiễm môi tr−ờng

4.3.2 ChiÕt từ nớc thải công nghiệp kháng sinh

Một số xạ khuẩn nh− Streptomyces griseus sinh tổng hợp streptomycin, Str aureofaciens tạo tetracyclin, Str rimosus tạo oxytetracyclin , ngoμi kháng sinh sinh tổng hợp l−ợng vitamin B12 từ 0,5 ữ 1cg/ml môi tr−ờng Vì sau chiết kháng sinh lμ sản phẩm ng−ời ta cịn chiết lấy vitamin B12 từ n−ớc thải bỏ Từ 100 lít n−ớc thải thu đ−ợc 40 mg

vitamin B12

4.3.3 Lên men sinh tổng hợp

Chủng giống: sản xuất dùng vi khuẩn Propionibacterium shermanii cho hiƯu st cao nhÊt

Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn sinh vitamin B12: vi khuẩn Propionibacterium shermanii thuộc Gram (+), lμ trực khuẩn nhỏ, xếp thμnh đôi chuỗi ngắn khơng di động, sống kỵ khí hay hiếu khí khơng bắt buộc Trong điều kiện kỵ khí có hình cầu đ−ờng kính 0,5 - 0,6 μm, điều kiện hiếu khí lại có hình que Phát triển mạnh mẽ điều kiện kỵ khí

Điều kiện nuôi cấy: sinh tr−ởng phạm vi pH 4,5 - 7,5 nh−ng thích hợp lμ pH = 6,8 - 7,0 Nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp vitamin B12 lμ 28 - 30OC Giới hạn tối đa cho sinh tổng hợp lμ 32OC

Nguån carbon: lên men đợc nhiều loại đờng nhng thích hợp l glucose

Nguồn nitơ: acid amin, muối amoi Methionin có tác dụng lm tăng hiệu suất sinh tỉng hỵp B12 tõ 10 - 12%

Các ion kim loại: bổ sung l−ợng nhỏ muối cobalt (clorid nitrat) tăng đáng kể hiệu suất sinh tổng hợp B12, kim loại sắt, đồng, kẽm,

C¸c vitamin: cã t¸c dơng kích thích sinh trởng v lm tăng hiệu suất sinh tỉng hỵp vitamin B12 gåm (thiamin, biotin, acid nicotinic, acid folic) 4.4 Quy trình sản xuất

Môi trờng thạch giữ giống có thnh phần gồm (%): Glucose 3,0

Cao ng« 0,5 KH2PO4 0,1

CoCl2 6H2O 0,01 Agar-agar 1,0 pH 6,8 ÷ 7,2

Khư trïng 110C/20 phút, cấy vi khuẩn v nuôi điều kiện kỵ khí bắt buộc 30C 72

Môi trờng nhân giống (%):

Glucose 3,0

Cao ngô 1,5

CoCl2 6H2O 0,015 pH 6,8 ữ 7,2

Khử trùng 115C/30' Nuôi giống điều kiện kỵ khí 30C/48 Cấy giống với tỷ lệ 10% l thích hợp

Môi trờng lên men t¹o vitamin B12 (%):

Glucose 8,0

Cao ng« 2,5

CoCl2 6H2O 0,015

5,6 DMB 0,015

pH 6,8 ÷ 7,2

Khư trïng 115°C/30 Lªn men - ngμy

Vi khuẩn Propionibacterium shermanii sống kỵ khí tuỳ thích nh−ng khơng thể phát triển đ−ợc điều kiện hiếu khí mạnh Hμm l−ợng vitamin B12 tạo thμnh nhiều điều kiện kỵ khí, 50h đầu hiếu khí lμm giảm sinh khối vμ hiệu suất sinh tổng hợp Trong lên men công nghiệp thiết phải kỵ khí - ngμy đầu, từ ngμy thứ t− thổi khí nhẹ cách cấp khí khoảng 15 phút

trình lên men vi khuẩn phát triển tạo acid propionic lμm pH môi tr−ờng giảm xuống Một dấu hiệu q trình lên men tốt lμ pH mơi tr−ờng ni cấy giảm rõ rệt ngμy đầu Vì luôn phải kiểm tra pH môi tr−ờng vμ điều chỉnh amoniac để giữ pH 7,0

Môi trờng nhân giống v môi trờng lên men giống nhau, nhiên

môi tr−ờng lên men l−ợng glucose cần nhiều vμ cần bổ sung tiền chất 5,6 DMB (dimethylbenzylmidazol) với nồng độ - 10 mg/l Do vi khuẩn có khả tạo thμnh hμng loạt chất t−ơng tự vitamin B12 nên cần bổ sung 5,6 DBM

lμ base nucleotid cđa vitamin B12, nã cã nhiƯm vơ chun toμn nhân tố B thnh vitamin B12 thật v hiệu suất sinh tổng hợp cao Thời gian bổ sung 5,6 DMB cã thÓ bÊt kú nh−ng nÕu cho muộn nhân tố B cha kịp chuyển hết thnh vitamin B12 lm giảm hiệu suất sinh tổng hợp

Thời gian lên men kéo dμi - ngμy Ba ngμy đầu ni kỵ khí bổ sung 5,6 DMB vμo thứ 72 Nếu cho muộn nhân tố B không chuyển hết thμnh vitamin B12 đ−ợc Trên qui mơ 100 m3 hiệu suất có th t

80 ữ 100mg/1 lít môi trờng 4.5 Quy tr×nh chiÕt xuÊt

Vitamin B12 lμ sản phẩm nội bμo nên tồn sinh khối vi khuẩn Sau kết thúc lên men, dịch lên men đ−ợc đem lọc ly tâm thu lấy sinh khối, loại dịch Tiến hμnh chiết xuất dung môi hữu nhựa trao đổi ion

Hoμ sinh khối vμo n−ớc tạo hỗn dịch vμ chỉnh pH 4,5 HCl 10% vμ thêm chất ổn định Đun nóng hỗn dịch lên 80oC 30 phút để giải

phãng vitamin B12 vμo dung dÞch Läc lấy dịch lọc, bỏ bà tận thu lm thức ăn chăn nuôi Chiết vitamin B12 từ dung dịch nớc sang pha hữu hỗn

hp dung mụi phenol: n-butanol (1:1) với tỷ lệ V pha hữu cơ: V pha n−ớc lμ 1:10 Dịch chiết hữu nμy đ−ợc pha loãng tricrezol vμ carbon tetraclorid (CCl4) – sau chiết vitamin B12 trở lại pha n−ớc nhiều lần n−ớc

Chỉnh pH pha dung dịch n−ớc 8,0 - 8,5 vμ tiến hμnh cyanid hoá Sử dụng KCN để chuyển dạng vitamin B12 coenzym thμnh Cyanocobalamin Chỉnh pH trung tính, chân không ≤ 60°C đến nồng độ vitamin B12 đạt khoảng 10.000 mcg/ml

SK

6,0 7,5 pH

Quá trình tinh chế Vitamin B12 đợc tiến hnh cột oxyd nhôm

(Brochman alumium oxide) hoạt hoá 3000C/1 Hấp phụ dung dịch

vitamin B12 lên cột dung dịch aceton - n−ớc 75% Chuyển dịch vitamin B12 cột aceton - n−ớc (80%) Sau phản hấp phụ aceton - n−ớc (50%) thu lấy phân đoạn đậm đặc Pha loãng dịch đậm đặc aceton, khuấy nhẹ vμ để kết tinh 12 4°C Lọc thu tinh thể hình kim mμu đỏ đậm, rửa aceton nguyên chất vμ sấy khô nhiệt độ thấp (≤ 50OC) Trong cơng

nghiƯp s¶n xt vitamin B12 ngời ta dùng phơng pháp chiết

nhùa hÊp phơ XAD2 (h×nh 6.5)

Läc

Dịch lọc

Chiết lần

Chiết lần

Cyanid hãa

Tinh chÕ

KÕt tinh

Sản phẩm

Dịch lọc

Sinh khối Hoà n−íc cÊt

ChØnh pH 4,5 = HCl §un 800C/30

Phenol: n-butanol = 1:1

N−íc cÊt

KCN pH 8,5

Cét oxyd nh«m (3000C/1 giê)

aceton/n−íc

Aceton 40C

sÊy kh« 500C

Dịch lên men

Lọc, ly tâm

Hình 6.5b Các công đoạn chiết xuất vµ tinh chÕ vitamin B12 b»ng nhùa hÊp phơ

Lọc, ly tâm

Phá vỡ tế bào

Lọc

Hấp phụ

Phản hấp phụ

Cô chân không

Cyanid hóa

Sắc ký

Phản hấp phụ

Kết tinh

Sản phẩm

Dịch lọc

Sinh khèi Hoµ n−íc cÊt

ChØnh pH 4,5 = HCl §un 800C/30

Nhùa XAD2

KCN pH 8,5

Cét oxyd nh«m (3000C/1 giê)

aceton/n−íc

Aceton 40C

sÊy kh« 500C

Läc, ly t©m

Dd aceton 20%

Vitamin B12 tinh thể phải có hμm l−ợng ≥ 95% Định l−ợng vitamin B12 quang phổ tử ngoại b−ớc sóng 361 nm Cũng định l−ợng vitamin B12 ph−ơng pháp vi sinh vật - chủng kiểm định lμE coli M113-3

Tù l−ỵng giá

1 Trình by quy trình lên men sinh tổng hợp acid glutamic v phơng pháp chế tạo mì

2 Trình by quy trình lên men sinh tổng hợp, phơng pháp tinh chế v chế tạo dextran dợc dụng

3 Kể tên phơng pháp sản xuất vitamin B12

phần II Công nghệ sản xuất kháng sinh

Chơng 7

Đại cơng kháng sinh

Mục tiêu

Sau học xong chơng ny sinh viên phải trình by đợc:

1 Các bớc cần tiến hnh tìm chất kháng sinh dïng y häc

2 Các ph−ơng pháp gây đột biến vi sinh vật để nâng cao hiệu suất Các ứng dụng kháng sinh ngoμi lĩnh vực y học

Hiện nhμ khoa học thông báo phát minh 8.000 chất kháng sinh, có khoảng 100 chất đ−ợc nghiên cứu kỹ vμ đ−a vμo sử dụng y học vμ số lĩnh vực khác Các chất lại lμ độc tính cao, lμ tác dụng vμo thể Do việc tìm kháng sinh lμ khó Nếu khơng có ph−ơng pháp đặc biệt dễ nhầm lẫn với kháng sinh đ−ợc phát lμm tiêu tốn công sức vμ tiền vơ ích Ví dụ: theo tính tốn nhμ khoa học Mỹ, muốn phát minh kháng sinh có hoạt phổ rộng cần 55 nhμ khoa học lμm việc liên tục 2,5 năm để phân tích 100 ngμn mẫu đất vμ tiêu tốn khoảng triệu đôla Để phát minh kháng sinh điều trị lao cần 11 năm nghiên cứu vμ tiêu tốn vμi triệu đơla

Vậy ngun nhân nμo kích thích nhμ nghiên cứu, hãng sản xuất d−ợc phẩm lớn lao vμo đ−ờng nghiên cứu tìm kháng sinh mới? Có lẽ nguyên nhân sau đây:

1 Nhiều chất kháng sinh lμ hố trị liệu khơng có thay đ−ợc để điều trị bệnh nhiễm trùng hiểm nghèo, bệnh ung th− Một số kháng sinh mang lại hiệu cao cho trồng vμ vật nuôi Ngμy cμng có nhiều vi sinh vật gây bệnh kháng lại thuc khỏng sinh

nên phải nghiên cứu tìm c¸c chÊt kh¸ng sinh míi thay thÕ c¸c chÊt kh¸ng sinh cũ tác dụng

Vì nghiên cứu để phát minh chất kháng sinh lμ vấn đề thời hấp dẫn nhμ kinh tế vμ nhμ nghiên cứu thuộc nhiều lĩnh vực khác nh−: vi sinh vật học, hoá sinh học, di truyền học, hoá học, d−ợc lý học vμ nhμ kỹ thuật Nghiên cứu kháng sinh lμ ví dụ điển hình kết hợp nhiều nhμ khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau, có biết phối hợp chặt chẽ em li thng li v hiu qu

1 Định nghÜa kh¸ng sinh

Có nhiều định nghĩa khác chất kháng sinh, song nêu lên định nghĩa đ−ợc coi lμ hoμn chỉnh nhất: "Kháng sinh lμ sản phẩm đặc biệt nhận đ−ợc từ vi sinh vật hay nguồn tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm tiêu diệt cách chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, protozoa ) hay tế bμo ung th−" nồng độ thấp

Cần phân biệt số chất vi sinh vật tạo nh−ng không đ−ợc gọi lμ kháng sinh nh−: r−ợu ethylic, acid hữu chúng tác dụng lên vi sinh vật khác khơng mang tính chọn lọc vμ nồng độ cao

2 Đơn vị kháng sinh

biểu thị độ lớn giá trị hoạt tính chất kháng sinh - ml (đv/ml) dung dịch hay mg chế phẩm (đv/mg) th−ờng dùng đơn vị (đv) kháng sinh Đó lμ l−ợng kháng sinh tối thiểu hoμ tan thể tích mơi tr−ờng xác định có tác dụng ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật kiểm định

Ví dụ: Đơn vị hoạt tính penicillin G lμ l−ợng penicillin G hoμ tan vμo 50 ml canh thang có tác dụng ức chế phát triển Staphylococcus aureus 209 P Đơn vị hoạt tính Streptomycin lμ l−ợng Streptomycin hoμ vμo ml canh thang có tác dụng ức chế phát triển E coli Vì kháng sinh có đơn vị hoạt tính sinh học riêng nên phải ghi rõ để tiện sử dụng Ví dụ: penicillin G đơn vị 0,6 mcg, nghĩa lμ 1mg chứa 1.667 đơn vị; streptomycin đơn vị = mcg (1 mg = 1.000 đv); 1mg Neomycin chứa 300 đơn vị (1 đv = 3,3 mcg); đơn vị bacitracin chứa 20 mcg

3 Phân loại kháng sinh

Danh sỏch cỏc chất kháng sinh đ−ợc phát minh ngμy cμng dμi thêm Việc phân loại kháng sinh lμ cần thiết giúp cho nhμ khoa học tốn thời gian nghiên cứu kháng sinh cấu trúc hố học, chế tác dụng, độc tính

bμo, lên tổng hợp protein, tổng hợp ADN, ARN ) Cách phân loại nμy thích hợp cho nhμ D−ợc lý học Các nhμ Hoá học đề nghị phân loại kháng sinh theo cấu trúc hoá học Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hố học lμ khoa học giúp cho ng−ời nghiên cứu nhanh chóng định h−ớng đ−ợc đặc điểm chất kháng sinh phát biết đ−ợc cấu trúc hố học nó, tránh lãng phí thời gian để nghiên cứu đặc điểm khác Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hoá học th−ờng chia nhóm chất sau đây:

+ C¸c chÊt kh¸ng sinh cã cÊu tróc β-lactam (penicillin, cephalosporin) + Các kháng sinh chứa nhân thơm (chloramphenicol)

+ Các kh¸ng sinh cã cÊu tróc aminoglycosid (streptomycin, gentamicin) + C¸c kháng sinh có cấu trúc vòng (các tetracyclin)

+ C¸c kh¸ng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin) + C¸c kh¸ng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin) + C¸c kh¸ng sinh polyen (nystatin, amphotericin B)

+ C¸c kh¸ng sinh chèng ung th− nhãm antracyclin (daunorubicin) + C¸c kh¸ng sinh chèng ung th− nhãm actinomycin (dactinomycin D) + …

4 Các ph−ơng pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh Để phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh ng−ời ta phải lấy mẫu từ nguồn chất khác nhau: đất ruộng, đất quanh rễ cây, đất chuồng gia cầm, gia súc, bùn, n−ớc sông hồ Từ mẫu đem phân lập khiết vi sinh vật sinh kháng sinh mμ ta mong muốn ph−ơng pháp đặc tr−ng vμ cỏc mụi trng chn lc

Để phân lập xạ khuẩn thờng dùng môi trờng có thnh phần sau:

M«i tr−êng M«i tr−êng (NH4)2SO4

K2HPO4

NaCl MgSO4

Tinh bột Agar – agar N−ớc máy vừa đủ

1 g g g g 10 g 20 g 1.000 ml KNO3 K2HPO4

NaCl MgCO3

Tinh bét FeSO4

CaCO3 Agar - agar N−ớc máy vừa đủ

Để phân lập nấm mốc thờng sử dụng môi trờng có thnh phần: NaNO3

KH2PO4 MgSO4 Saccharose Agar – agar N−ớc máy vừa đủ

6 g g 0,05 g 20 g 20 g 1.000 ml pH tr−íc tiƯt trïng 6,0 ÷ 6,2

Ví dụ: Đa số vi khuẩn phát triển tốt mơi tr−ờng có thμnh phần giμu dinh d−ỡng (pepton, canh thang - thạch) pH 7,0 vμ nhiệt độ 30 ữ 37°C Trong điều kiện nấm mốc vμ xạ khuẩn phát triển chậm

Có thể khái quát hoá thμnh nguyên tắc để thực dễ dμng nh− sau:

1 Mỗi chất kháng sinh đ−ợc tạo vμi loμi vi sinh vật xác định Ví dụ: tetracyclin Str aureofaciens, Str viridifaciens tạo ra; penicillin P chrysogenum hoặc P notatum tạo ra

2 Mỗi loμi vi sinh vật xác định sinh tổng hợp vμi chất kháng sinh theo đặc điểm di truyền chúng Ví dụ: Str fradiae tạo neomycin A, neomycin B, neomycin C Str rimosus tạo oxytetracyclin … Biết đ−ợc nguyên tắc việc tìm kháng sinh đ−ợc mơ tả dễ dμng Ví dụ: muốn có kháng sinh streptomycin cần phân lập xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces vμ loμi lμ griseus Muốn có kháng sinh fumagillin ta cần phân lập nấm mốc thuộc chi Aspergillus vμ loμi fumigatus Muốn có kháng sinh gramyxidin cần phân lập vi khuẩn có bμo tử chi Bacillus loμi brevis

Rõ rμng để phân lập vi sinh vật cho chất kháng sinh biết công việc không phức tạp lắm, song để phân lập vi sinh vật sinh chất kháng sinh địi hỏi cơng việc phức tạp nhiều, lμ kháng sinh chống virus vμ ung th−

4.1 Ph−ơng pháp cấy dịch chiết đất lên bề mặt thạch

4.2 Ph−ơng pháp cấy đất trực tiếp lên bề mặt thạch chứa sẵn vi sinh vật kiểm định

Trên hộp petri có mơi tr−ờng dinh d−ỡng vμ chứa vi sinh vật kiểm định, đem gieo cấy trực tiếp "hạt" đất lên bề mặt thạch, để tủ ấm 24 - 48 mang quan sát Nếu xung quanh hạt đất có vịng vơ khuẩn, ta biết đ−ợc vi sinh vật hạt đất có sinh chất kháng sinh chống lại vi sinh vật kiểm định Từ cục đất ta tiến hμnh phân lập vμ đ−ợc vi sinh vật sinh kháng sinh để nghiên cứu tiếp Ph−ơng pháp nμy cho biết đ−ợc lμ vi sinh vật đối kháng phân lập đ−ợc có khả ức chế đ−ợc vi sinh vật gây bệnh thuộc loại

4.3 Ph−ơng pháp lμm giμu đất

Đất tr−ớc đem phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh đ−ợc đ−a vμo chậu thuỷ tinh, giữ độ ẩm xác định - ta lại cho thêm vi sinh vật kiểm định vμo, trộn Nuôi tủ ấm sau thời gian đem phân lập theo ph−ơng pháp nêu mục 4.1 Bằng ph−ơng pháp nμy ng−ời ta dễ dμng thu đ−ợc vi sinh vật đối kháng với vi sinh vật kiểm định ban đầu vi sinh vật đối kháng có đất

4.4 Ph−ơng pháp thêm kháng sinh vμo môi tr−ờng phân lập Xạ khuẩn phát triển chậm vi khuẩn vμ nấm mốc Vì để dễ dμng phân lập xạ khuẩn, ng−ời ta cho thêm kháng sinh chống nấm vμ kháng khuẩn với nồng độ từ - 25 mcg/ml vμo môi tr−ờng phân lập Các kháng sinh th−ờng dùng lμ: tetracyclin, neomycin, nystatin, streptomycin, penicillin, chloramphenicol Bằng cách nμy ng−ời ta dễ dμng phân lập đ−ợc xạ khuẩn sinh chất kháng sinh

4.5 Ph©n lËp vi sinh vËt sinh kh¸ng sinh chèng ung th−

dùng vi sinh vật đột biến có độ nhạy Khi chọn lọc ban đầu đ−ợc chất kháng sinh chống ung th− rồi, cần phải thử tiếp dòng tế bμo ung th− in vitro vμ in vivo để khẳng định xác xem chất kháng sinh tìm thấy có tác dụng tế bμo ung th− hay khơng? Công việc nμy thực t−ơng đối dễ dμng có nhiều dịng tế bμo ung th− đ−ợc ni cấy chủng phịng thí nghiệm

5 Ph−ơng pháp gây đột biến vi sinh vật để nâng cao hiệu suất

Vi sinh vật sinh tổng hợp kháng sinh phân lập đ−ợc từ chất thiên nhiên th−ờng có hoạt tính thấp Ví dụ: chủng Penicillium phân lập từ đất đạt từ 30 - 50đv/ml dịch ni cấy Vì để thu đ−ợc chủng có hoạt tính cao đ−a vμo sản xuất đòi hỏi phải cải tạo chọn giống ph−ơng pháp khác vμ nghiên cứu điều kiện ni cấy thích hợp

5.1 Chän chđng cã hoạt tính cao phép chọn lọc tự nhiên

Các vi sinh vật có biến dị tự nhiên theo tần số khác ống giống khiết, có cá thể hoạt tính kháng sinh mạnh gấp 10 - 20 lần cá thể khác Cần phải chọn lấy cá thể có hoạt tính cao ống giống để nghiên cứu tiếp

Tiến hμnh cấy giống hộp petri cho hộp có 10 - 20 khuẩn lạc tách riêng biệt, sau tiến hμnh kiểm tra hoạt tính kháng sinh chúng cách sau:

− Đổ lớp thạch có chứa vi khuẩn kiểm định lên bề mặt hộp petri nuôi vi sinh vật sinh kháng sinh Đặt hộp petri vμo tủ ấm, 24 sau đọc kết Vịng ức chế cμng lớn hoạt tính kháng sinh khuẩn lạc tạo cμng mạnh

− Có thể khoan cục thạch có chứa khuẩn lạc vi sinh vật sinh kháng sinh đặt lên hộp petri khác chứa sẵn vi sinh vật kiểm định, sau nuôi tủ ấm 24 vμ đọc kết Từ khuẩn lạc có hoạt tính kháng sinh mạnh cấy thạch nghiêng để nghiên cứu tiếp tục Waskman N.S vμ cộng (1946) sử dụng streptomycin cho vμo môi tr−ờng nuôi cấy Str griseus lμ xạ khuẩn sinh streptomycin với nồng độ 100 mcg/ml Kết cho thấy cá thể nμo có khả tạo streptomycin với nồng độ lớn 100 mcg/ml sống sót vμ phát triển Đây lμ ph−ơng pháp để chọn chủng cho hoạt tính cao

5.2 Đột biến nhân tạo

Các tác nhân gây đột biến mạnh nh− tia UV, X hay hoá chất: iperit, ethylenimin, dimethylsulfat Cho tác dụng với liều l−ợng vμ thời gian thích hợp giết chết vi sinh vật Những cá thể nμo cịn sống sót có đột biến gen, lμm thay đổi tính trạng dẫn đến lμ khả tạo kháng sinh (đột biến âm tính) lμm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên nhiều lần (đột biến d−ơng tính)

Bảng 7.1. Kết chọn giống chủng vi sinh vật sinh kháng sinh

Hiệu suất tạo kháng sinh (đv/ml) Vi sinh vật sinh

kháng sinh

Tác nhân

gõy t bin Chủng ban đầu Chủng sau gây đột biến

Penicillin R, UV, I, EI 220 5200

Streptomycin R, UV 250 4200

Clotetracyclin R, UV 600 2200

Erythromycin UV, EI 500 1000

Chó thÝch: R - R¬nghen UV - Cùc tÝm

I - Iperit EI - Etylenimin

Để tạo chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến hμnh đột biến bậc thang, kết hợp với ph−ơng pháp di truyền phân tử nh− tái tổ hợp định h−ớng gen Kĩ thuật tách dòng gen, kĩ thuật tạo vμ dung hợp tế bμo trần đem lại nhiều kết nâng cao đ−ợc hiệu suất sinh tổng hợp chủng giống mμ rút ngắn đ−ợc thời gian tạo giống Sơ đồ chọn giống bậc thang P chrysogenum NRRL 1951 cho thấy phức tạp cơng việc vμ lịng kiên trì mệt mỏi nhμ nghiên cứu để đạt đ−ợc hiệu cho chủng giống dùng cơng nghiệp sản xuất penicillin (hình 7.1)

6 Nghiªn cứu điều kiện nuôi cấy chủng vi sinh vật sinh kháng sinh phân lập đợc

Sau gây đột biến vμ chọn lọc đ−ợc chủng cho suất cao cần phải nghiên cứu tiếp điều kiện ni cấy thích hợp nh−: thμnh phần mơi tr−ờng, nhu cầu oxy hoμ tan, pH, nhiệt độ, tiền chất tăng hiệu suất lên - lần Ví dụ: để lên men sản xuất penicillin V ng−ời ta cho thêm tiền chất (precursor) lμ acid phenoxyacetic, để tạo penicillin G cho thêm acid phenylacetic

7 Nghiªn cøu chiÕt xuÊt vμ tinh chÕ kh¸ng sinh

Kháng sinh lμ sản phẩm trao đổi chất thứ cấp Tuỳ theo đặc tính loμi mμ sản phẩm thứ cấp đ−ợc tiết vμo mơi tr−ờng ni cấy (penicillin, streptomycin ) hay giữ lại tế bμo (gramicidin, tetracyclin ) Để thu lấy hoạt chất có độ tinh khiết cao cần tìm ph−ơng pháp chiết thích hợp Nếu chiết dung mơi hữu dung mơi cần thoả mãn yêu cầu sau:

− Dung môi dễ kiếm, rẻ tiền, khơng độc, khó cháy

− Cã tÝnh chän läc cao: hoμ tan tèt ho¹t chÊt Ýt hoμ tan t¹p chÊt − DƠ cÊt thu håi

Có kháng sinh lại chiết ph−ơng pháp kết tủa (các tetracyclin, fumagillin ), nhựa trao đổi ion (kháng sinh nhóm aminoglycosid, polymyxin ), phải nghiên cứu chọn đ−ợc chất phụ gia cho trình kết tủa (các amoni bậc 4) cationit có dung l−ợng trao đổi lớn, dễ phản hấp phụ để không phá huỷ hoạt chất Kỹ thuật chiết xuất vμ tinh chế kháng sinh thích hợp lμm cho sản phẩm đạt chất l−ợng cao, bảo quản đ−ợc lâu đồng thời lμm tăng tỷ lệ thu hồi vμ hạ giá thμnh sản phẩm Ví dụ: năm 60 - 70 tỷ lệ chiết xuất penicillin từ môi tr−ờng lên men đạt 60 - 70% Hiện tỷ lệ đạt 90 - 92%

8 Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn vμ độc tính

Sau chiết xuất vμ tinh chế đ−ợc kháng sinh tinh khiết, phải kiểm tra hoạt lực (phổ tác dụng) vi sinh vật kiểm định: vi khuẩn Gram (+), Gram (-), nấm xác định đ−ợc MIC (nồng độ tối thiểu có tác dụng ức chế) Ngoμi cịn phải kiểm tra độ vơ trùng kháng sinh xem có lẫn vi sinh vật lạ, đặc biệt bμo tử vi sinh vật gây bệnh Để lμm đ−ợc việc phải khử hoạt tính kháng sinh, sau cấy mơi tr−ờng đặc biệt: canh thang, thạch máu , khử hoạt tính penicillin penicillinase hay clohydrat hydroxylamin; streptomycin khử hydroxylamin hay cystein Nhiều kháng sinh khơng có chất khử đặc tr−ng độ vơ trùng xác định đ−ợc vi sinh vật không bị tác dụng kháng sinh

Độc tính kháng sinh đ−ợc kiểm tra động vật thí nghiệm Ng−ời ta th−ờng dùng chuột, tiêm tĩnh mạch, phúc mạc hay d−ới da, uống liều l−ợng kháng sinh cần nghiên cứu Theo dõi chúng cẩn thận sau 12 - 15 ngμy thí nghiệm có kết luận độc tính kháng sinh em th

9 Nghiên cứu dợc lý v điều trị kháng sinh

(LD100) LD50 đ−ợc coi lμ liều gây chết tối thiểu Chia động vật thí nghiệm

thμnh nhãm:

− Nhóm 1: dùng kháng sinh điều trị sau gây nhiễm động vật vi khuẩn gây bệnh

− Nhóm 2: dùng kháng sinh điều trị sau gây nhiễm động vật Trong tr−ờng hợp đ−ợc phép dùng kháng sinh với liều tối đa để cứu sống động vật thí nghiệm

− Nhóm 3: lμ nhóm đối chứng

Dựa vμo số l−ợng động vật sống sót mμ kết luận tác dụng điều trị kháng sinh L−ợng kháng sinh tối thiểu cứu đ−ợc động vật thoát chết lμ liều điều trị tối thiểu Mỗi kháng sinh dùng điều trị có độc tính định Nếu liều điều trị thấp độ độc cho phép kháng sinh đ−ợc sử dụng điều trị Trong tất tr−ờng hợp liều điều trị gần với liều độc khơng cho phép sử dụng kháng sinh y học

10 Tiêu chuẩn kháng sinh

Kháng sinh lμ hoá trị liệu, nhiều kháng sinh đ−ợc phát (> 8.000 chất) nh−ng có khoảng 150 chất đ−ợc ứng dụng y học Trong số có khoảng 30 chất đ−ợc ứng dụng rộng rãi Những kháng sinh cịn lại khơng đ−ợc sử dụng phần chúng độc hại với thể bị giảm tác dụng tiếp xúc với dịch thể Những yêu cầu y học kháng sinh lμ:

− Kháng sinh phải không độc độc thể

− Hoạt tính kháng khuẩn phải nhanh vμ mạnh vi sinh vật gây bệnh

− DƠ hoμ tan n−íc v bền vững bảo quản lâu di

Hoạt tính kháng khuẩn khơng bị giảm tiếp xúc với dịch thể Trên thực tế, ngoμi penicillin khơng có kháng sinh nμo thoả mãn yêu cầu Vì ng−ời thầy thuốc điều trị phải hiểu biết đầy đủ chế tác dụng vμ phản ứng phụ kháng sinh để kê đơn xác, nên phối hợp kháng sinh với kháng sinh với chế phẩm khác để tăng c−ờng tác dụng điều trị, giảm phản ứng phụ vμ độc tính

11 Các ph−ơng pháp định l−ợng kháng sinh

11.1 Ph−¬ng ph¸p vi sinh vËt

Định l−ợng kháng sinh vi sinh vật dựa nguyên tắc kháng sinh tác dụng kìm hãm phát triển vi sinh vật kiểm định; so sánh tác dụng với kháng sinh chuẩn biết tính tốn đ−ợc hμm l−ợng kháng sinh cần phân tích Tuy nhiên ph−ơng pháp vi sinh vật có số nh−ợc điểm, phụ thuộc vμo nhiều yếu tố bên ngoμi nên độ xác cho phộp 5%

11.1.1 Phơng pháp pha loÃng liªn tơc

Dùng để định l−ợng kháng sinh dịch nuôi cấy hay dịch chiết Nguyên tắc: pha lỗng kháng sinh mơi tr−ờng canh thang (trong suốt) ống nghiệm tiệt trùng thμnh nồng độ khác nhau:

: 10 ; : 20 ; : 40 ; : 80 ; : 160… hay : 100 ; : 200 ; : 300 ; : 400 : 800… hay : ; : ; : ; : 16 ; : 32 Tại nồng độ kháng sinh ống nghiệm đó, cho vμo l−ợng xác định vi sinh vật kiểm định Đặt ống nghiệm vμo tủ ấm 37°C/20 - 24 đem đọc kết Nếu ống nμo suốt tức lμ nồng độ pha lỗng kháng sinh giết chết vi sinh vật kiểm định

Ví dụ: định l−ợng Streptomycin môi tr−ờng nuôi cấy Str griseus Dung dịch streptomycin chuẩn 10mcg/ml

TiÕn hμnh theo b¶ng sau:

Sè èng nghiƯm Kh¸ng sinh

1 10 11 12

§é pha lo·ng 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:28 1:256 1:512 1:1024 1:2048 1:4096 Streptomycin

chuÈn 10 μg/ml

- - - - - + + + + + + +

Streptomycin thö - - - + + +

Chó thÝch: dÊu (-) vi khuÈn bÞ giÕt chÕt

dÊu (+) vi khn ph¸t triĨn

ở ống nghiệm số (độ pha loãng 1:32) kháng sinh chuẩn vi khuẩn kiểm định không phát triển đ−ợc

o

X Dc Dt

X = ×

đó:

Dc: độ pha lỗng kháng sinh chuẩn Dt: độ pha loãng kháng sinh thử X: nồng độ kháng sinh cần định l−ợng Xo: nồng độ ban đầu kháng sinh chuẩn

trong thÝ nghiƯm trªn ta cã:

ml mcg X 10 320 /

32

1024× =

=

Để kết đ−ợc xác định l−ợng kháng sinh ph−ơng pháp pha loãng cần ý điểm sau:

(1) Dùng môi tr−ờng để pha lỗng có thμnh phần ổn định (2) Thao tác phải tuyệt đối vô trùng

(3) L−ợng vi khuẩn kiểm định cho vμo ống nghiệm phải (4) Thời gian ủ vi sinh vật kiểm định phát triển phải định Có thể pha lỗng kháng sinh cần thử vμo mơi tr−ờng thạch - canh thang sau đổ hộp petri đợi thạch đông ta cấy vi sinh vật kiểm định vμo, để tủ ấm cho vi sinh vật phát triển sau 20 - 24 mang đọc kết Ưu điểm ph−ơng pháp nμy lμ hộp Petri ta thử nhiều vi sinh vt kim nh

11.1.2 Phơng pháp khuếch tán thạch

Nguyờn tc: khỏng sinh khuch tỏn vμo mơi tr−ờng thạch có chứa vi sinh vật kiểm định tạo vòng ức chế phát triển vi sinh vật kiểm định Đo độ lớn vòng ức chế kháng sinh chuẩn vμ kháng sinh thử tính tốn hay tra bảng tính sẵn nồng độ cho kết cần phân tích

a b

Hình 7.2 Các ph−ơng pháp định l−ợng kháng sinh a Định l−ợng kháng sinh dùng ph−ơng

ph¸p khoanh giÊy läc

b Định l−ợng kháng sinh dùng ph−ơng pháp đục lỗ thch

11.2 Phơng pháp hoá học v hoá lý

Trong thực tế số kháng sinh đ−ợc định l−ợng ph−ơng pháp hoá học vμ hoá lý Ưu điểm ph−ơng pháp nμy lμ thực nhanh, cho kết Để định l−ợng penicillin ph−ơng pháp hoá học tiến hμnh nh− sau: phá huỷ penicillin kiềm, trung hoμ oxy hoá sản phẩm phân huỷ iod Định l−ợng iod thừa Natri thiosulfat tính đ−ợc iod tiêu thụ cho phản ứng oxy hố vμ từ tính hμm l−ợng penicillin

Nguyên tắc phơng pháp hoá lý dựa phản ứng tạo mu kháng sinh sản phẩm phân huỷ chúng đo quang phổ tử ngoại máy so mu tính kết

Ví dụ: để định l−ợng kháng sinh nhóm tetracyclin cho tạo phức với FeCl3; đo phổ tử ngoại xác định biến đỉnh hấp thụ cực đại kháng sinh sau phân huỷ kiềm

Ph−ơng pháp so mμu định l−ợng erythomycin dựa phản ứng tạo mμu kháng sinh với acid sulfuric (27N) Định l−ợng kháng sinh ph−ơng pháp nμo lμ xác vμ thuận tiện đ−ợc qui định rõ d−ợc điển n−ớc Chỉ kháng sinh đ−ợc kiểm nghiệm theo qui định d−ợc điển có giá trị pháp lý

12 øng dơng kh¸ng sinh ngoμi lÜnh vùc y häc

12.1 Kh¸ng sinh dïng chăn nuôi

Gia sỳc, gia cm cng bị vi sinh vật gây bệnh công gây chết hμng loạt Bác sĩ thú y sử dụng kháng sinh lμm vũ khí hữu hiệu để điều trị bệnh cho động vật Kháng sinh griseoviridin dùng điều trị bệnh viêm phổi cấp, viêm vú trâu, bò, metimyxin chloramphenicol dùng điều trị bệnh Brucella gây ra; fumagillin điều trị bệnh ỉa chảy Protozoa gây ong lμm chết đμn ong

Kh¸ng sinh đợc sử dụng nh chất kích thích tăng trọng đn gia súc, gia cầm Giảm chi phí thức ăn; kích thích tăng sản lợng trứng g, vịt

Mỹ, nớc Tây Âu v Nhật dùng bacitraxin, flavomycin, avoparxin, monenzin lm chất kích thích tăng trọng Một số nớc khác dùng kháng sinh nhóm tetracyclin C¸c chÕ phÈm Biovit (biomycin vμ vitamin B12), Terravit (teramycin + Vitamin B12) l chất kích thích tăng trọng lợn, gμ, vÞt Th−êng bỉ sung Biovit hay Terravit cã hμm lợng 15 - 20 g kháng sinh v - 12 mg vitamin B12 vo thức ăn cho lợn, g vừa phòng đợc bệnh ỉa chảy,

va kích thích tăng trọng đến 20 - 25% so với lơ chứng Về chế kích thích tăng trọng vật ni kháng sinh nồng độ thấp có nhiều cơng trình nghiên cứu nh−ng ch−a rõ Ng−ời ta giải thích hai ngun nhân sau õy:

12.1.1 Tác dụng kháng sinh lên hệ vi khuÈn chÝ ë ruét

Kháng sinh lμm tăng số l−ợng vi sinh vật có ích ruột, tăng c−ờng tổng hợp vitamin, tăng c−ờng tái hấp thu thức ăn Lμm giảm vi sinh vật có hại th−ờng tiết chất độc, sử dụng vitamin, kháng sinh lμm giảm pH ruột, giảm sức căng bề mặt tế bμo vμ lμm tăng c−ờng sinh tr−ởng Tất nguyên nhân giúp cho động vật tăng c−ờng trao đổi chất vμ lớn nhanh

12.1.2 Tác dụng gián tiếp kháng sinh lên thể động vật

Kháng sinh lμm thay đổi hệ vi sinh vật ruột dẫn tới tác dụng sau: − Tăng c−ờng tốc độ hấp thu chất dinh d−ỡng, kích thích sử dụng

chất chuyển hố đồng thời lμm giảm tiêu hao l−ợng để phân giải thức ăn

− Tăng c−ờng trình điều tiết hormon, đặc biệt lμ hormon sinh tr−ởng giúp thể lớn nhanh

12.2 Kh¸ng sinh dïng trång trät

C¸c nÊm, vi khuẩn, virus gây nhiều loại bệnh cho trồng lμm mïa mμng thÊt thu lín

Mầm bệnh nhiễm từ hạt giống, từ phế thải lại mùa mμng, từ phân chuồng, từ đất bụi khơng khí Việc chọn kháng sinh để tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh cho trồng không ý đến tác dụng kháng sinh mμ phải quan tâm đến hiệu kinh tế

Nghiên cứu q trình phát triển nơng nghiệp giới dễ nhận thấy t−ợng có tính qui luật: sản xuất ngμy cμng sâu vμo thâm canh mức độ phát triển vμ tác hại sâu bệnh cμng nghiêm trọng Theo số liệu Tổ chức FAO, hμng năm tổng số thiệt hại mùa mμng sâu bệnh vμ cỏ chiếm tới 34%, thiệt hại bệnh chiếm 11,6%

Trong số bệnh đ−ợc mô tả, bệnh nấm chiếm 83% Thuốc hoá học dùng bảo vệ thực vật đ−a lại hiệu phòng trị rõ rệt, song tồn số nh−ợc điểm: lμ tính độc khơng chọn lọc, đặc tính khó phân huỷ đất, tích luỹ chất độc mơi tr−ờng khơng lμm thay đổi đáng kể mối quan hệ phong phú loμi sinh vật hệ sinh thái, ảnh h−ởng tiêu cực đến suất mμ nhiễm độc môi tr−ờng sống ng−ời, nhiều tr−ờng hợp dẫn đến tử vong Những thμnh tựu to lớn trị liệu bệnh nhiễm trùng ng−ời thuốc kháng sinh vμo năm 50 kỷ XX gợi mở xu h−ớng sử dụng kháng sinh lĩnh vực bảo vệ thực vật

Kháng sinh dùng để đấu tranh với bệnh thực vật phải thoả mãn u cầu sau:

− Có hoạt tính kháng sinh mạnh mầm gây bệnh − Dễ thấm vμo tế bμo

− Liều điều trị khơng có hại đến

− Kháng sinh phải bền vững thời gian dù bề mặt hay thấm sâu vμo

Thông dụng lμ xử lý hạt kháng sinh tr−ớc đem gieo trồng, xử lý đất trồng kháng sinh vi sinh vật đối kháng đất

Hiện có khoảng 30 chất kháng sinh đ−ợc sử dụng để đấu tranh với bệnh trồng nhiễm khuẩn vμ nấm gây Trong điều kiện thiên nhiên kháng sinh bị phân huỷ nhanh, phải tìm kiếm chất kháng sinh có độ bền vững cao, tiêu diệt mầm bệnh nhanh, không nên dùng chất kháng sinh ứng dụng y học để điều trị bệnh trồng

Những kháng sinh thờng dùng trồng trọt l:

Griseofulvin: dùng chống lại bệnh Botrytis gây (bệnh rỉ sắt lúa mỳ)

Trichotexin: tác dụng với nhiều loại nấm gây bệnh nh Botrylis cenerea, Helmintosporium gây bệnh cho

− Blastixidin S (kháng sinh chiết từ Str griseochromogenes) Có thể tiêu diệt nhiều vi sinh vật gây bệnh cho nồng độ 50 - 100 mcg/ml Nhật dùng đấu tranh với bệnh vμng lụi gây Piricularia oryzae

− Kasugamyxin Str kasugaensis tạo (Umezawa, 1965) nồng độ mcg/ml đủ để tiêu diệt Piricularia oryzae (hoạt tính mạnh blastixindin 50 - 100 lần) Hiện dùng kasugamyxin thay cho blastixidin để chống bệnh vμng lụi khơng độc ngi

Polyoxin: đợc tạo Str cacaoi cã ho¹t tÝnh chèng nÊm m¹nh: Alternaria, Cocholiobalus, Pircularia (Misato, 1975)

− Validamyxin: Str hygroscopicus var limoneus lμ kháng sinh đ−ợc sản xuất Nhật Bản, Trung Quốc dùng để diệt nấm Rhizoctonia solani gây bệnh khô vằn hại lúa hữu hiệu Thời gian bán phân huỷ validamyxin đất lμ

− Herbicidin A vμ B: lμ kh¸ng sinh diƯt cá Str saganonensis tạo (Mamoru, Tatsuo 1976) Herbicidin kìm hÃm phát triển Xanthomonas oryzae gây bệnh cho lúa

12.3 Kháng sinh dùng công nghiệp thực phẩm

Bảo quản thực phẩm t−ơi vμ thực phẩm đóng hộp lμ vấn đề quan trọng đ−ợc nhiều nhμ khoa học quan tâm Thực phẩm đóng hộp để giữ đ−ợc lâu th−ờng dùng ph−ơng pháp khử trùng nhiệt, để lạnh Tuy nhiên khử trùng nhiệt lμm thay đổi giá trị thực phẩm, đặc biệt lμ h−ơng vị, số vitamin bị phân huỷ Nguyên nhân lμm hỏng thực phẩm lμ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc) Sau phân huỷ thực phẩm vi khuẩn tiết độc tố, ăn phải thực phẩm bị ng c nguy him

Để tiêu diệt vi sinh vật có thực phẩm thờng dùng tác nhân vật lý v hoá học

Tác nhân vật lý: khư trïng b»ng nhiƯt, tia X, UV

− Tác nhân hoá học: acid benzoic, nipazin, SO2 Một vμi kháng sinh lμ chất bảo quản lý t−ởng thực phẩm t−ơi vμ đóng hộp Chỉ cần nồng độ kháng sinh thấp giữ cho thực phẩm bảo quản đ−ợc lâu dμi

xuống lμm cho chất l−ợng sản phẩm tốt vitamin khơng bị phá huỷ, h−ơng vị bị biến đổi Đặc biệt bμo tử vi khuẩn −u nhiệt nh−Clostridium chết nhanh khử trùng nhiệt độ thấp có kháng sinh dùng bảo quản

Kháng sinh nisin khơng dùng y học Nó đ−ợc coi nh− "hố chất" lý t−ởng để bảo quản thực phẩm đóng hộp nh−: cμ chua, đậu xanh, bắp cải vμ loại rau khác vμ đặc biệt lμ phomát Trong bảo quản thực phẩm th−ờng sử dụng ph−ơng pháp lên men lactic (muối d−a, cμ, lμm mắm, lμm nem chua…) Nguyên tắc ph−ơng pháp nμy lμ acid lactic vi khuẩn lactic tạo môi tr−ờng đạt đến nồng độ định lμm cho pH giảm xuống - 3,5 Các thực phẩm nμy bảo quản đ−ợc lâu vμ giữ đ−ợc dinh d−ỡng

Sử dụng kháng sinh chăn nuôi, trồng trọt vμ công nghiệp thực phẩm cần phải l−u ý đến khả xuất vi sinh vật kháng kháng sinh nguy hại cho việc điều trị bệnh nhiễm trùng ng−ời Thực phẩm đặc biệt lμ sản phẩm thịt, cá, tôm sữa Nếu xuất tiêu chuẩn kiểm nghiệm cần xác định lμ có chứa kháng sinh hay khơng? Nếu có vết kháng sinh phía nhập trả lại

Tù l−ỵng gi¸

1 Kể tên số đại diện kháng sinh tự nhiên đ−ợc sinh tổng hợp từ nấm mốc, từ xạ khuẩn, từ vi khuẩn

2 Chứng minh ý nghĩa tích cực cơng tác đột biến chọn giống để sản xuất kháng sinh

Chơng

sản xuất Các kháng sinh nhóm -lactam

Mục tiêu

Sau học xong chơng ny, sinh viên phải trình by đợc:

1. Tên chủng vi sinh vật đợc dùng sản xuất kháng sinh nhóm beta-lactam

2. Quy trình lên men v chiết xuÊt penicillin G vμ V

3. Các ph−ơng pháp sản xuất nguyên liệu để điều chế beta-lactam bỏn tng hp

4 Quy trình lên men v chiết xuất acid clavulanic.

1 Đại cơng -lactam

Bảng 8.1 Các nhân kháng sinh -lactam

Tờn nhúm Cấu trúc hoá học chung Kháng sinh đại diện

Nhân Penam

N O

S

Các penicillin tự nhiên bán tổng hợp

N O

O

C¸c penicillin kh¸ng β-lactamase (acid clavulanic)

Nh©n Clavam

N S

O

O O

Các penicillin kháng -lactamase (sulbactam, tazobactam)

Nhân Cephem

N O

S

Các cephalosporin cephamycin

Nhân

Carbapenem N

O

Các carbapenem bán tổng hợp từ thienamycin (imipenem, meropenem) Nhân

Monobactam hay

β-lactam

N O

Kh¸ng sinh nhãm β-lactam bao gåm c¸c chÊt cã chøa vòng -lactam (vòng amid cạnh) v có cấu trúc nhân nh bảng 8.1

Theo cÊu tróc ho¸ häc c¸c kh¸ng sinh nhãm β-lactam cã thể chia thnh nhóm sau:

Các Penicillin − C¸c Cephalosporin − C¸c Carbapenem − C¸c Monobactam

Đặc tính chung kháng sinh -lactam l tác dụng lên thnh tế bo vi khuẩn cách ức chÕ sù tỉng hỵp peptidoglycan cđa thμnh tÕ bμo vi khn nhãm kh¸ng sinh quan träng nhÊt cđa hä -lactam l penicillin v cephalosporin Trong khuôn khổ giáo trình ny giới thiệu quy trình sinh tổng hợp v nguyên tắc bán tổng hợp số kháng sinh tiêu biểu họ -lactam

2 Sinh tổng hợp Penicillin 2.1 Đại cơng

Các penicillin lμ đại diện tiêu biểu cho kháng sinh có nguồn gốc từ nấm mốc Ngoμi vμi kháng sinh khác nh− griseofulvin, trichotexin, fumagillin… đ−ợc sinh từ chủng nấm mốc khác

Các penicillin có cấu trúc hố học chung gồm vòng β-lactam nối với vòng thiazolidin Penicillin G lμ chất kháng sinh tiêu biểu đ−ợc Alexander Flemming tìm vμo năm 1928 nghiên cứu tụ cầu khuẩn Ơng nhận thấy hộp petri ni cấy tụ cầu có nhiễm nấm mốc Penicillium notatum vμ tạo thμnh vịng vơ khuẩn Fleming gọi chất ức chế tạo vịng vơ khuẩn nμy lμ penicillin Đến năm 1941, nhμ bác học Anh Howara Walter Florey vμ Ernst Boris Chain tinh chế đ−ợc penicillin d−ới dạng tinh khiết vμ nghiên cứu ph−ơng pháp lên men Năm 1943, penicillin đ−ợc sản xuất quy mô công nghiệp Mỹ để phục vụ điều trị bệnh nhiễm trùng cho th−ơng binh chiến tranh giới thứ hai Penicillin lμ kháng sinh đ−ợc sản xuất lên men chìm quy mơ cơng nghiệp (1947) Việc phát minh penicillin tạo b−ớc ngoặt quan trọng lĩnh vực y học giới vμ đ−ợc đánh giá lμ phát minh quan trọng bậc kỷ XX Do đóng góp to lớn Flemming, Florey vμ Chain đ−ợc tặng giải Noben y học (hình 8.1)

Alexander Flemming (1881 – 1955)

Ernst Boris Chain (1906 – 1979)

Howara Walter Florey (1898 1968)

Hình 8.1. Các nhà bác học nhận giải Nobel y học năm 1945 công trình penicillin

Penicillin đ−ợc coi lμ kháng sinh có nhiều −u điểm kháng sinh sử dụng: hiệu điều trị cao, độc vμ giá rẻ Tuy nhiên penicillin có số nh−ợc điểm:

Kém bền vững gặp ẩm;

Gây dị ứng, sốc phản vệ bắt buộc phải thử test dị ứng trớc tiêm;

tác dụng lên vi khuẩn Gram (-);

Nhanh chóng bị kháng thuốc loại vi khuẩn cã thĨ tiÕt penicillinase vμβ - lactamase ph¸ hủ chÊt kh¸ng sinh

Tuy có số nh−ợc điểm định nh−ng penicillin lμ kháng sinh đ−ợc sản xuất với số l−ợng lớn tất kháng sinh có (sản l−ợng toμn giới 45.000 tấn/năm - Hμ Lan chiếm 15.000 tấn/năm, Trung Quốc 10.000 tấn/năm, sau lμấn Độ, Mỹ, Anh, Đức, Pháp…) L−ợng penicillin lớn nμy chủ yếu đ−ợc dùng lμm nguyên liệu để bán tổng hợp tạo kháng sinh thuộc nhóm β-lactam, cịn y học vμ thú y dùng l−ợng nhỏ

1.2 Cấu trúc hoá học, phân loại v tính chất

Các penicillin đợc cấu tạo vòng: -lactam v thiazolidin v khác gốc R mạch ngang Tuy nhiên có ý nghĩa lớn điều trị nh thơng mại l penicillin G vμ V (b¶ng 8.2)

N S

COOH O

Bảng 8.2. Phân nhóm penicillin

TT Tên nhóm Tên kháng sinh Nguån gèc

1 C¸c penicillin tù nhiên Penicillin G, V, N, K, F Sinh tổng hợp

2 Các penicillin bán tổng hợp Bán tổng hợp

- C¸c aminopenicillin

Ampicillin Amoxycillin

Bacampicillin

- Các chất kháng lại penicillinase

Cloxacillin Dicloxacillin Flucloxacillin

Oxacillin

Nafcillin Methicillin - C¸c penicillin phỉ réng

(Carboxypenicillin)

Carbenicillin Ticarcillin

Temocillin

- C¸c penicillin phỉ réng (Ureidopenicillin)

Mezlocillin Azlocillin Piperacillin

- C¸c chÊt kh¸ng β-lactamase

Clavulanic acid Sulbactam

Tazobactam

Sinh tổng hợp Tổng hợp hoá học

2.3 Quy trình sinh tổng hợp

TT Gốc R Tªn gäi gèc Tªn penicillin

1 CH3(CH2)5 - CH2 - Heptylpenicillin Penicillin K (IV)

2 CH3 - CH2CH = CH - CH2 2-pentenylpenicillin Penicillin F (I)

3 CH3 - (CH2)3 - CH2 - Amylpenicillin Dihydropenicillin F

4 C6H5 - CH2 - Benzylpenicillin Penicillin G

5 C6H5 - O - CH2 - Paraoxybenzylpenicillin Penicillin X (III)

6 HO – C6H5 - CH2 - Phenoxymethylpenicillin Penicillin V

7 NH2

HOOC-CH(CH2)2-CH2-

Trong môi tr−ờng lên men P chrysogenum nếu khơng có chất tiền thể xuất hỗn hợp gồm - penicillin khác (bảng 8.3) Trong số nμy có penicillin G vμ V lμ chất có nhiều −u điểm nên đ−ợc sản xuất để dùng y học Dạng acid tự penicillin G khơng bền vững, th−ờng dùng dạng muối Na, K dễ tan n−ớc Penicillin G dạng bột khô bền vững, gặp ẩm dễ bị phân huỷ lọ bột khô hoμ tan vμo n−ớc phải tiêm

− đơn vị penicillin G Na = 0,60 mcg hay mg chứa 1.667 UI; − đơn vị penicillin G K = 0,64 mcg hay mg chứa 1.530 UI;

Penicillin G không bền môi tr−ờng acid: bị tác dụng dung dịch acid lỗng (ở 30°C) vịng β-lactam bị mở, hấp thu qua đ−ờng uống (15 – 30%), dùng tiêm (tốt lμ tiêm tĩnh mạch) Ngoμi penicillin G dễ bị kiềm penicillinase phân huỷ Penicillin V đ−ợc dùng đ−ờng uống (hấp thu khoảng 60%)

2.3.1 Chñng gièng

Cho đến ph−ơng pháp để sản xuất penicillin G vμ V lμ sinh tổng hợp từ nấm mốc P chrysogenum

Vμo năm 1940 – 1950, việc nghiên cứu sản xuất penicillin th−ờng sử dụng chủng P notatum vμ P baculatum Từ tr−ờng Đại học Wisconsin (Mỹ) phân lập đ−ợc chủng P chrysogenum có hoạt tính cao chủng nμy dần thay vμ từ khoảng sau năm 50 kỷ XX, tất công ty sản xuất penicillin giới sử dụng biến chủng P chrysogenum công nghiệp Biến chủng P chrysogenum Wis Q-176 (đ−ợc tuyển chọn từ chủng P chrysogenum URRL 1951) đ−ợc xem lμ chủng gốc hầu hết chủng công nghiệp sử dụng toμn giới Năng suất năm 1947 đạt từ 60 - 80 UI/ml nh−ng nhờ có kỹ thuật cơng nghệ di truyền học nh− khuếch đại gen chủng sản xuất đạt tới 85.000UI/ml (1993)

Chủng nấm mốc P chrysogenum thuộc họ nấm cúc (Aspergillaceae), chi mốc xanh (Penicillium) th−ờng gặp chất hữu mục nát, thể sợi trắng roi xám xanh Giống công nghiệp đ−ợc bảo quản lâu dμi dạng đông khô, bảo quản siêu lạnh – 70OC bảo quản nitơ lng

2.3.2 Thnh phần môi trờng dinh dỡng

Nhìn vμo cơng thức cấu tạo phân tử penicillin cho thấy lμ tripeptid vòng gồm acid amin lμ: acid aminoadipic, cystein vμ valin Theo quan điểm phổ biến acid amin nμy lμ tiền chất để tổng hợp nhân penicillin lμ 6-APA Có thể biểu diễn cấu tạo tripeptid nh− sau:

HOOC CHNH2 CH2 CH2 CH2 C

O

NH CH CO

CH2

NH CH

CH (CH3)2 COOH SH

Acid aminoadipic Cystein Valin

N

S CH3

CH3

O COOH

CONH R

COOH (CH2)3

CH H2N

HOOC CH CH2 SH

H2N

HOOC CH

H2N

HOOC CH CH3

CH3

N O CON (CH2)3

CH H2N

HOOC

H H SH CH3 COOH CH3 N

S CH3

CH3

O COOH

CONH (CH2)3

CH H2N

HOOC

N

S CH3

CH3

O COOH

H2N

Acid phenylacetic Acid L-α-aminoadipic

(D) (L) (L) (L) Isopenicillin N (h−íng I) Penicillin N (H−íng II)

Acid 6-aminopenicilanic Benzylpenicillin (penicillin G)

δ-(L-α-aminoadipyl)-L-cystein

δ-(L-α-aminoadipyl)-L-cystein-D-valin

L-valin L-cystein

Acid L--aminoadipic

Hình 8.3. Quá trình sinh tổng hợp penicillin từ acid amin

Thnh phần mơi tr−ờng dinh d−ỡng bao gồm nguồn sau: Nguồn carbon: Glucose hay lactose lμ nguồn l−ợng để nấm phát triển Nguồn hydrat carbon thích hợp lμ glucose nên pha phát triển để tăng sinh khối (48 đầu) trình, nấm đồng hố hầu nh− toμn glucose Vì chuyển sang pha thứ - pha tổng hợp phân tử penicillin nguồn l−ợng bị cạn kiệt dẫn đến giảm hiệu suất sinh tổng hợp Để khắc phục, môi tr−ờng lên men tạo penicillin cần bổ sung lactose (th−ờng tỷ lệ glucose vμ lactose lμ 1:1) Trong tr−ờng hợp khơng có lactose thay hoμn toμn glucose Song phải định l−ợng vμ bổ sung glucose suốt q trình lên men Ngoμi nấm cịn có khả đồng hố tinh bột, dextrin, saccharose, cácacid hữu nh− acid lactic, acid acetic…

xây dựng nên phân tử penicillin, mơi tr−ờng sản xuất ln có mặt cao ngơ Có thể thay phần cao ngô bột đậu t−ơng, bột lạc bột hạt bơng P chysogenum có khả tiết proteinase mạnh nên hợp chất protein cao ngô hay bột lạc dễ đ−ợc nấm sử dụng Tuy nhiên l−ợng N phải vừa đủ thiếu xảy t−ợng tự phân sợi, cịn thừa sợi phát triển nhanh lμm giảm hiệu suất sinh penicillin

Nguồn l−u huỳnh: Có ý nghĩa đặc biệt trình sinh tổng hợp penicillin tham gia vμo cấu trúc phân tử để tạo nên vòng thiazolidin Nguồn l−u huỳnh th−ờng dùng lμ muối sulfat kali, natri vμ amoni Các chất nμy tham gia vμo tổng hợp methionin, cystin, biotin, thiamin… Hay sử dụng lμ Natri thiosulfat (Na2S2O3)

Nguồn kim loại vi lợng: Mét sè kim lo¹i nh− Mg, Mn, Fe, Zn, Na, Cu thờng đợc bổ sung dới dạng muối sunfat có sẵn nớc máy nguồn nguyên liệu tạo môi trờng

Cht tin th: P chrysogenum trình phát triển tạo - penicillin có gốc R mạch bên khác có hoạt tính kháng khuẩn khác Trong cơng nghệ lên men penicillin ng−ời ta phải điều khiển để tạo penicillin G (benzyl penicillin) vμ penicillin V (phenoxymethyl penicillin) lμ hai chất có tác dụng mạnh đ−a vμo thể Thêm acid phenylacetic vμo môi tr−ờng lên men nhận thấy hiệu suất penicillin G tăng thêm 30 - 50% Trong cao ngơ có chất phenyl etylamin (C6H5CH2NH2) nên lμm tăng hiệu suất

sinh tổng hợp penicillin Ng−ời ta cho phenyl ethyllamin lμ chất tiền thể (cung cấp gốc R) để sinh tổng hợp phân tử penicillin G Để tạo phân tử penicillin V chất tiền thể dùng lμ acid phenoxyacetic Theo lý thuyết, nhu cầu phenylacetat lμ 0,47 g/g penicillin G (hoặc 0,47g phenoxylacetat/g penicillin V) Trên thực tế cấu tử nμy gây độc cho nấm nên ng−ời ta th−ờng lựa chọn giải pháp bổ sung liên tục vμ khống chế chặt chẽ nồng độ theo yêu cầu để không lμm giảm lực lên men chủng sản xut

Môi trờng nhân giống có thnh phần gåm:

− Cao ng« 20 g

− Glucose 40 g

− KH2PO4 0,5 g

− NaNO3 3,0 g

− MgSO4.7H2O 0,125 g

− CaCO3 5,0 g

Môi trờng lên men tạo penicillin có thnh phần (%):

Cao ng« 0,5

− Glucose 0,5

− Lactose 0,3

− NH4NO3 0,125 − MnSO4.5H2O 0,1 − Na2SO3.10H2O 0,05 − MgSO4.7H2O 0,002

− ZnSO4 0,002

− KH2PO4, 0,2

− CaCO3 0,3

− Acid phenylacetic 0,1

Dầu phá bọt theo nhu cầu 2.3.3 Điều kiện lên men

Nhit : Thng tiến hμnh nhân giống 30OC, lên men 23 - 25OC

pH: pH thích hợp khoảng 6,0 - 6,5 Trong q trình lên men pH mơi tr−ờng thay đổi tuỳ thuộc vμo tốc độ sử dụng chất carbon vμ nitơ Để ổn định pH ng−ời ta cho CaCO3 vμo môi tr−ờng lên men

Thơng khí: P chrysogenum lμ chủng hiếu khí nên q trình ni cấy cần thổi khí (đối với lên men bề mặt), lắc khuấy trộn kèm theo sục khí (đối với lên men chìm) Nhu cầu cấp khí có khuấy trộn liên tục lμ 1,2 - 1,5 VVM

Thêi gian: Trong - ngμy 2.3.4 Quy trình lên men

Trong năm 40 kỷ XX việc sản xuất penicillin đợc thực phơng pháp lên men, bề mặt l chất rắn lỏng Cơ chất rắn l loại hạt cám Để lên men chất lỏng ngời ta nuôi nấm chai thuỷ tinh bĐt (chai Roux) cã chøa m«i tr−êng dinh d−ìng Váng mốc sau lên men dùng cho lên men lần thứ cách cho môi trờng dinh dỡng vo dới lớp váng ny Quá trình tiÕn hμnh ë 24OC

Giáo s− Đặng Văn Ngữ, nhμ khoa học n−ớc ta sản xuất đ−ợc dịch lọc Penicillin phục vụ điều trị vết th−ơng Tuy nhiên ph−ơng pháp nμy có hiệu suất lên men thấp, đạt < 200 UI/ml môi tr−ờng nuôi cấy nên không đ−ợc áp dụng

Hiện ng−ời ta sử dụng ph−ơng pháp lên men chìm để sản xuất penicillin Penicillin G lμ kháng sinh đ−ợc sản xuất cơng nghệ lên men chìm vμo năm 1947 Q trình lên men tạo penicillin G có pha: pha sinh tr−ởng vμ pha sinh kháng sinh pha lên men thứ nấm phát triển hệ sợi mạnh, sinh khối tăng nhanh, chất dinh d−ỡng đ−ợc đồng hố nhiều, c−ờng độ hơ hấp tăng dần đến cực đại, pH tăng dần vμ penicillin G đ−ợc tạo thμnh pha lên men thứ hai hệ sợi phát triển chậm, lactose đ−ợc đồng hoá, pH tăng đến khoảng – 7,5 vμ Penicillin G đ−ợc tạo thμnh chủ yếu pha nμy Hiệu suất sinh tổng hợp phụ thuộc nhiều vμo l−ợng sinh khối môi tr−ờng

Tr−ớc hiệu suất chủng thấp, kỹ thuật lên men ch−a phát triển nên giá thμnh kg penicillin Mỹ (1943) lμ 227.270 USD Đến năm 1953 hạ xuống 169 $/kg, năm 1993 lμ 34 - 36 $/kg vμ tới năm 2000 10 $/kg hiệu suất tăng cao nhờ áp dụng công nghệ vμ có thiết bị đại lên men, áp dụng tiến di truyền học phân tử vμo cải tạo giống (chủng sản xuất đạt tới 85.000 UI/ml)

2.3.5 ChiÕt xuÊt vμ tinh chÕ penicillin

Kháng sinh penicillin đ−ợc tiết môi tr−ờng lên men Kết thúc lên men, môi tr−ờng đ−ợc bơm vμo bồn chứa Vì kháng sinh dễ bị phân huỷ nên phải hạ nhiệt độ dịch lên men đến 4°C Thêm phụ gia để lọc (th−ờng thêm 0,1% diatomits) lọc lọc chân khơng hình trống quay Dạng acid tự penicillin tan nhiều dung mơi hữu nên dịch lọc đ−ợc acid hố H2SO4 30% đến pH 2,5 Chiết penicillin máy ly tâm siêu tốc dung môi hữu không trộn lẫn với n−ớc (th−ờng dùng butyl acetat) Bốc chân không đến nồng độ định; thêm than hoạt (1%) vμo để tẩy mμu Dịch lọc sau loại than đ−ợc loại n−ớc cách hạ nhiệt độ xuống -20°C

Hình 8.4 Quá trình chiết xuất tinh chế penicillin từ môi trờng lên men

3 Sản xuất - APA v kháng sinh Penicillin bán tổng hợp 3.1 Đại cơng penicillin bán tổng hợp

Nm 1941, penicillin G lμ kháng sinh có hiệu cao, chống lại hầu hết chủng Staphylococcus aureus Tuy nhiên đến năm 1947 phần lớn vi khuẩn phân lập đ−ợc bệnh viện có tính kháng penicillin Để giải vấn đề nμy ng−ời ta nỗ lực tìm penicillin có tác dụng điều trị tốt

Về nguyên tắc, để tạo penicillin lên men sinh tổng hợp dùng ph−ơng pháp thay đổi mạch nhánh cách sử dụng tiền chất khác Tuy nhiên đ−ờng lên men trực tiếp ng−ời ta có khả tiến hμnh với penicillin G vμ V Còn để triển khai sản xuất công nghiệp, ng−ời ta sử dụng penicillin G hay V để chế tạo 6-APA lμ nguyên liệu chủ yếu trình bán tổng hợp penicillin Theo cấu trúc hoá học, penicillin tự nhiên lμ hợp chất dị vịng acid amin có tên gọi lμ acid - aminopenicillanic (6-APA) Việc tìm phân tử - APA mở h−ớng để sản xuất penicillin bán tổng hợp cách gắn kết mạch nhánh khác vμo phân tử 6-APA đ−ờng hố học hay sinh học Có hai h−ớng lμ acyl hố nhóm -NH2 vị trí số vμ ester hố nhóm -COOH vị trí số Tuỳ theo chế tác

enzym penicillinase vμ số nhỏ vi khuẩn Gram (-) nh− lậu cầu Th−ờng dùng để uống, đại diện nhóm nμy lμ phenethicillin vμ azidocillin

Nhóm 2: Phổ hoạt tính hẹp nh−ng có −u điểm kháng lại penicillinase nên đ−ợc dùng để điều trị bệnh vi khuẩn kháng lại penicillin nhóm gây Th−ờng dùng tiêm, có số có hoạt tính dùng uống nh− oxacillin, cloxacillin…

Nhóm 3: Gồm chất có phổ hoạt tính rộng lên nhiều loại vi khuẩn Gram (+), Gram (-) vμ vững bền đ−ờng tiêu hoá Đ−ợc dùng để điều trị bệnh nhiễm trùng đ−ờng hô hấp, tiết niệu, sinh dục vμ nhiễm khuẩn máu Có thể uống tiêm Tuy nhiên chúng có nh−ợc điểm lμ nhanh chóng bị phá huỷ vi khuẩn có khả sinh penicillinase (hay β - lactamase) nh− amoxicillin, ampicillin Nhóm penicillin nμy đ−ợc gọi lμ penicillin khơng pseudomonas vμ đ−ợc chia theo cấu trúc thμnh nhóm: Nhóm carboxypenicillin (ticarcillin vμ carbenicillin) vμ nhóm acylureido penicillin (piperacillin vμ mezlocillin)

Một số đại diện penicillin bán tổng hợp phổ biến lμ: − Benzathin benzylpenicillin (Benzathin penicillin G) bán tổng hợp từ

penicillin G có tính hoμ tan thấp, đ−ợc giải phóng chậm từ vị trí tiêm bắp vμ thuỷ phân thμnh penicillin G có tác dụng đặc trị để phịng vμ điều trị bệnh thấp tim trẻ em

− Ampicilin: lμ penicillin bán tổng hợp phổ rộng cầu khuẩn Gram (+) vμ (-) Cã t¸c dơng øc chÕ sinh tổng hợp mucopeptid thnh tế bo Dạng uống tiêm bắp hay tĩnh mạch thật chậm

Amoxicillin (amino penicillin) lμ penicillin bán tổng hợp bền acid, phổ tác dụng rộng penicillin G (đặc biệt có tác dụng chống trực khuẩn Gram (-), tác dụng ức chế sinh tổng hợp mucopeptid thμnh tế bμo nhiều vi khuẩn Gram (+) vμ (-) giai đoạn nhân đôi chủ động Amoxicillin đ−ợc hấp thu gần nh− hoμn toμn qua đ−ờng tiêu hoá

− Amoxicillin natri phối hợp với clavulanat kali (với biệt d−ợc Augmentin): có khả bất hoạt nhiều β - lactamase th−ờng gặp vi khuẩn đề kháng với kháng sinh β - lactam

3.2 Đại cơng 6-APA

Nh biết, cấu trúc hoá học penicillin lμ hợp chất dị vòng acid - aminopenicillanic (6-APA) - đóng vai trị nhân penicillin

N S

O

H2N CH3

CH3

6 APA (6 aminopenicillanic) đợc Kato Nhật tìm thấy vo năm 1953 môi trờng nu«i cÊy P chrysogenum kh«ng cã chÊt tiỊn thĨ

Năm 1959 Batchelor vμ cộng chiết đ−ợc - APA từ môi tr−ờng nuôi cấy P chrysogenum (W - 5120) khơng có chất tiền thể sau chiết hết penicillin Ơng cho hình thμnh - APA lμ giai đoạn gần kết thúc q trình sinh tổng hợp penicillin vμ cơng bố phát minh sản xuất – APA Sau nμy ng−ời ta phát thấy nhiều vi sinh vật (đặc biệt nhóm vi khuẩn đ−ờng ruột) nh− E coli, B megatherium tiết penicillinamidase có khả thuỷ phân penicillin G penicillin V tạo - APA vμ acid phenyl acetic

Penicillinamidase

Penicillin G (V) 6-APA + acid phenylacetic 6-APA lμ chất khơng có hoạt tính kháng sinh tụ cầu vμ bị penicillinase phá huỷ Tinh thể mμu trắng, bền, độ chảy 209 - 210OC Tan

ít nớc v dung môi hữu 3.3 Các phơng pháp sản xuất 6-APA

3.3.1 Phơng pháp hoá học

N S

COO N

O H3N

+ CH2 C OO R

H O

O

CH2 C

OR N

O -40 o C

P C l

N S

CO O S i ( C H )

CH2CONH

tert amin (CH3)3SiC l

Penicillin G

N O

CH2 C

C l

N ROH

-40C

-Hình 8.5 Sơ đồ phản ứng tổng hợp hoá học 6-APA từ penicillin G

Ph−ơng pháp hố học có hiệu suất chuyển hố cao (đến 90 - 95%) vμ tốc độ phản ứng nhanh, nhiên lại tiêu hao nhiều l−ợng, nhiều dung môi vμ chứa đựng nguy ô nhiễm môi tr−ờng cao, địi hỏi điều kiện phản ứng khó (nhiệt độ -40°C, hoá chất đắt tiền…)

Bảng 8.3. Công thức số penicillin bán tổng hợp

R Tên kháng sinh Phổ kháng khuÈn

O CH CH3

Phenethicillin

Phæ kháng khuẩn hẹp, chủ yếu chống lại vi khuẩn Gram (+) bị phân huỷ betalactamase

CH N3

Azidocillin

CH3

CH3

Methicillin Phæ kháng khuẩn hẹp, chống lại đợc vi khuẩn sinh betalactamase

O CH3

C6H5

Oxacillin

ức chế phát triển vi khuẩn Gram (+), đặc biệt tụ cầu

Staphylococcus sinh penicillinase

O C6H5Cl

CH3

Cloxacillin

ức chế phát triển vi khuẩn Gram (+), đặc biệt tụ cầu

Staphylococcus sinh penicillinase

mạnh oxacillin

Nafcillin

CH C O

NH2

Ampicillin Phæ réng, chèng lại đợc tụ cầu kháng penicillin G

CH C O

N H2

HO Amoxicillin

BÒn môi trờng acid, phổ rộng ampicillin, có hoạt tính phần lớn vi khuẩn Gram (+) Gram (-)

nhng chịu tác dụng

betalatamase

CH CO COOH

Carbenicillin T¸c dơng chđ u trªn vi khuÈn hiÕu khÝ Gram (-)

S

CH CO

COOH Ticarcillin

T¸c dơng chđ u vi khuẩn hiếu khí Gram (-), hoạt tính mạnh gÊp – lÇn carbenicillin

CH CO NH

CO N NH O

3.3.2 Phơng pháp sinh học

6-APA cú th c sản xuất ph−ơng pháp lên men từ chủng Penicillium Động học trình lên men tạo 6-APA t−ơng tự với lên men tạo penicillin: đồng hoá hydrat carbon nhanh, pH tăng dần vμ giai đoạn tạo 6-APA có lên đến 7,0 - 7,4 Thời gian lên men kéo dμi từ 108 - 120 Tuy nhiên trình nμy cho hiệu suất thấp 6-APA đ−ợc tạo thμnh đồng thời với penicillin tự nhiên khác, mặt khác chi phí cho việc tách chiết cao Vì thực tế công nghiệp ng−ời ta không sử dụng ph−ơng pháp nμy Hiện ph−ơng pháp enzym vi sinh vật lμ ph−ơng pháp phổ biến để sản xuất 6-APA công nghiệp Ng−ời ta sử dụng penicillinacylase để cắt mạch nhánh penicillin G hay V Ph−ơng pháp nμy có nhiều −u điểm, điều kiện phản ứng dễ dμng nên mang lại hiệu kinh tế cao Hiện nhiều hãng d−ợc phẩm giới sản xuất 6-APA với l−ợng lớn theo ph−ơng pháp nμy, điển hình lμ hãng d−ợc phẩm Snam Progetti (Italia) với sản l−ợng khoảng 40 tấn/năm;

N S N H

O COO H

C H C H C O

R Penicillinamidase

N S H 2N

O COO H

C H

C H 3 + R C O O -

Penicillin G, V 6-APA

Có nhiều vi sinh vật có khả sinh enzym penicillinamidase: xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc có chứa penicillinamidase ngoại bμo Loại enzym nμy có khả thuỷ phân penicillin K, F, V nhanh, penicillin G lại thuỷ phân chậm (thấp khoảng 100 lần) Penicillinamidase nội bμo chủ yếu có vi khuẩn có tác dụng thuỷ phân nhanh phân tử penicillin G, cắt đứt dây nối peptid mạch bên - APA Enzym nội bμo vμ ngoại bμo có pH hoạt động khác nhau: nội bμo hoạt động mạnh pH = 7,3 - 8,5; enzym ngoại bμo hoạt động mạnh pH = 9,0 Trong công nghiệp hay dùng E coli vμ B megatherium chúng cho hoạt tính enzym mạnh Vi khuẩn E coli 9637 hay B megatherium đ−ợc ni d−ỡng mơi tr−ờng có thμnh phần mơi tr−ờng dinh d−ỡng nh− sau:

Cao ng« 2%

Pepton 0,5%

Glucose 2%

Acid phenylacetic 0,15% Nhiệt độ 30°C Thời gian 24

bμo E.coli hay B megatherium để sản xuất 6-APA hiệu cao nh− dùng ph−ơng pháp enzym bất động Ph−ơng pháp nμy sử dụng nhiều lần vμ dịch penicillin G ch−a bị deacetyl hố sử dụng lại 6-APA đ−ợc tách vμ tinh chế sắc ký trao đổi ion, sấy phun s−ơng kết tủa điểm đẳng điện (pH = 4,3)

Ph−ơng pháp enzym bất động để sản xuất 6-APA cho hiệu suất t−ơng đối cao (90 – 95%) vμ đ−ợc áp dụng rộng rãi nhiều n−ớc, mang lại hiệu kinh tế cao Hơn 50% sản l−ợng 6-APA toμn giới đ−ợc sản xuất theo ph−ơng pháp bất động enzym Hiện số nhμ máy lên men penicillin cho xuất x−ởng thμnh phẩm lμ 6-APA

Để tạo penicillin bán tổng hợp sử dụng ph−ơng pháp hoá học vμ sinh học cách acyl hố 6-APA Tuy nhiên cơng đoạn nμy ng−ời ta sử dụng phổ biến đ−ờng hoá học nh− đề cập enzym acylase th−ờng thể đồng thời hoạt tính synthetase vμ hydrolase, thay đổi tuỳ theo điều kiện phản ứng nên cho hiu sut thp

4 Sản xuất Cephalosporin 4.1 Đại cơng

Cỏc cephalosporin l nhúm thuốc quan trọng thuốc kháng sinh Nhóm nμy đứng thứ số 10 loại thuốc dùng nhiều để điều trị bệnh nhiễm khuẩn với doanh số 7,2 tỷ đôla năm 1999, sau lμ penicillin vμ nhóm kháng sinh khác Riêng sản l−ợng cephalosporin C toμn giới khoảng 3.000 tấn/năm vμ phần lớn đ−ợc dùng để điều chế 7-ACA – nguyên liệu trung gian để bán tổng hợp nhiều cephalosporin hệ

N O CONH

S

CH2 R2

R1

R3

COOH

Có nhiều cephalosporin tự nhiên đ−ợc sinh tổng hợp từ chủng nấm mốc khác (xem bảng 8.4) nh−ng chúng hầu nh− ý nghĩa trị liệu Vì ng−ời ta tìm cách tạo cephalosporin bán tổng hợp sở cấu trúc vòng β-lactam Ưu cephalosporin lμ có tác dụng kháng khuẩn cầu khuẩn có hoạt tính β-lactamase, nhiều vi khuẩn Gram (-) vμ độc tính thấp Vì chúng nhanh chóng chiếm vị trí quan trọng trị liu

Bảng 8.4. Một vài cephalosporin cephamycin tự nhiên

Tên kháng sinh R1 R2 R3

Cephalosporin C

H O O C

CH (CH2)3

H2N - H - OCOCH3

Cephamycin A H O O C

CH (CH2)3

H2N - OCH3

OH CH

OCOC

OCH3

Cephamycin B H O O C

CH (CH2)3

H2N - OCH3 OCOC CH OH

OCH3

OH

Cephamycin C

H O O C

CH (CH2)3

H2N - OCH3 OCOC CH OS O3H

OCH3

Oganomycin G

H O O C

CH (CH2)3

H2N

- OCH3 N

N N

N S

CH3

Oganomycin H

H O O C

CH (CH2)3

H2N

- OCH3

N N

S

4.2 Cấu trúc hoá học v phân loại

Bảng 8.5. Phân loại hệ cephalosporin

Tên nhóm Tên kháng sinh Phổ tác dụng

- C¸c Cephalosporin thÕ hƯ

Cephalexin Cephalothin Cefazolin Cephradin

Streptoccoci, Staphylococcus aureus

- C¸c Cephalosporin thÕ hƯ

Cefuroxim Cefaclor Cefamandol

Các Cephamycin (đợc

xếp với cephalosporin thÕ hÖ 2)

Cefoxitin Cefmetazol Latamocef

E.coli, Klebsiella, Proteus

H.influenzae, Moraxella catarrhalis kh«ng

có tác dụng lên vi khuẩn Gram (+)

Bacteroides Pragilis Bacteroides

khác

- C¸c Cephalosporin thÕ hƯ

Cefotaxim Ceftriaxon Ceftazidim Cefoperazon Moxalactam

E.coli, Klebsiella, Proteus

H.influenzae, Moraxella catarrhalis, Ýt t¸c

dụng lên vi khuẩn Gram (+) Bacteroides pragilis Bacteroides khác

- Các Cephalosporin thế hÖ

Cefepine Cefpirome Cefaclidine

Gièng nh− thÕ hƯ nh−ng cã ho¹t tÝnh

mạnh chống lại vi khuẩn tiết betalactamase

C¸c cephalosporin vμ cephamycin cã cÊu trúc gồm vòng -lactam liên kết với dị vòng dihydrothiazin (nhân cephem) Các cephamycin khác với cephalosporin nhóm OCH3 vị trí C7 (R2)

Nhng cephalosporin cú tác dụng điều trị y học lμ cephalosporin bán tổng hợp Chúng đ−ợc phân loại thμnh hệ không chặt chẽ tuỳ theo phổ tác dụng vμ thời gian cơng bố thuốc Hiện hệ kháng sinh cephalosporin (bảng 8.5)

4.3 Quy trình sinh tổng hợp cephalosporin C

Để sản xuất Cephalosporin C ng−ời ta th−ờng sử dụng chủng giống Cephalosporium acremonium có hoạt lực cao Tuy nhiên việc hoμn thiện vμ triển khai sản xuất cơng nghiệp cephalosporin C gặp nhiều khó khăn so với sản xuất penicillin hoạt tính sinh kháng sinh chủng gốc th−ờng thấp vμ việc tuyển chọn, cải tạo hoạt tính chủng ch−a tạo chủng có lực siêu tổng hợp nh− chủng sinh penicillin Mặt khác chủng lên men cephalosporin d−ờng nh− hoạt tính enzym acyltransferase nên việc sử dụng tiền chất tạo nhánh nhằm thay đổi hoạt tính sản phẩm tạo thμnh q trình lên men cephalosporin khơng mang lại kết đáng kể

H×nh 8.3 Hình thái chủng nấm mốc C acremonium

Trong lên men công nghiệp ngời ta thờng sử dụng chủng gièng Cephalosporium acremonium ATCC 48272, 11550, 20339 vμ biÕn chñng chúng Hoạt lực khoảng 2000 mcg/ml môi trờng nuôi cÊy

Trong môi tr−ờng lên men, chủng C acremonium sinh tổng hợp đồng thời cephalosporin C, cephalosporin P1 vμ penicillin N Trong trình sinh tổng hợp cephalosporin acid amin L-alpha-aminoadipic acid, L-valin vμ L-cystein đóng vai trò nh− tiền chất tạo thμnh cấu trúc penicillin N (xem chun luận penicillin) để từ hình thμnh nên phân tử cephalosporin C theo đ−ờng trình bμy hình 8.4

Mơi tr−ờng ni cấy để sinh tổng hợp Cephalosporin có thμnh phần nh− sau (w/v):

Saacharose 36,0 g Glucose 27,0 g (NH4)2 SO4 7,5 g

C¸c yÕu tè vi lợng (K, Fe, Mn, Mg, Zn, Cu) Nớc máy vđ lÝt

pH 7,3

Về nguyên lý, quy trình lên men cephalosporin C có nhiều điểm t−ơng đồng với công nghệ lên men sinh tổng hợp penicillin thμnh phần mơi tr−ờng ni cấy, thơng khí… nh− thông số khác

N

S CH3

CH3

O COOH

CONH (CH2)3

CH H2N

HOOC

N O CONH (CH2)3

CH H2N

HOOC S CH3 COOH N O CONH (CH2)3

CH H2N

HOOC S CH3 COOH N O CONH (CH2)3

CH H2N

HOOC

S

CH2OH

COOH

N O CONH (CH2)3

CH H2N

HOOC

S

CH2OH

COOH

N O CONH (CH2)3

CH H2N

HOOC S CH2 COOH OCOCH3 Acetyl-CoA O2 + - H

Penicillin N

Cephalosporin C

Hình 8.4 Cơ chế sinh tổng hợp cephalosporin C (giai đoạn cuối từ penicillin N)

5 Sản xuất 7ACA; 7ADCA v kháng sinh bán tổng hợp nhóm Cephalosporin

5.1 Đại cơng

N O

S

COOH H2N

CH2OCCH3 O

N O

S

COOH H2N

CH3

7-ACA 7-ADCA NÕu lo¹i nhóm acetoxy vị trí C3 7-ACA nhận đợc 7.amino

deacetoxy cephalosporanic (7-ADCA) õy cng l nguyên liệu trung gian quan trọng để tạo cỏc cephalosporin bỏn tng hp

5.2 Phơng pháp sản xuÊt 7-ACA vμ 7-ADCA

Tr−ớc 7-ACA chủ yếu đ−ợc sản xuất theo ph−ơng pháp hoá học cách cắt mạch nhánh cephalosporin C Tuy nhiên ng−ời ta nhận thấy môi tr−ờng lên men Cephalosporium acremonium tồn đồng thời hỗn hợp kháng sinh cephalosporin P, cephalosporin C vμ penicillin N Sự tồn đồng thời penicillin N vμ cephalosporin C môi tr−ờng lên men gợi nên ý t−ởng bán tổng hợp kháng sinh nhóm cephalosporin từ penicillin

Bằng ph−ơng pháp hoá học, từ penicillin G ng−ời ta tổng hợp đ−ợc 7-ADCA theo sơ đồ phản ứng sau:

CH2CONH

N

O N

S CH3

CH3

COOH

CH3COOH >

O

90%

Penicilin G

N

S CH3

COOH N

O CH2CONH

O

(CH3)3SiN=C OSi(CH3)3

CH3

pyridin HBr

CH2CONH

N O N S COOH CH3 > 90% PCl5 ROH N H3N+

O N

S

COO -CH3

7 - ADCA

Từ 7-ACA vμ 7-ADCA tạo cephalosporin bán tổng hợp đ−ợc dùng y học (bảng 8.6)

B¶ng 8.6. Công thức số cephalosporin bán tổng hợp từ 7-ACA 7-ADCA

Gốc Tên KS Công thức

Cephalexin C H CONH NH2 O N S COOH CH3 Cefaclor C H CONH NH2 O N S COOH Cl Cephracin CH N H2

C ON H N O

S

C H3 C OOH Tõ 7-ADCA Cefadroxil C H CONH NH2 O H O N S COOH CH3 Cephalothin O N S COOH

CH2 - O - COCH3

S CH2 CONH

Cefazolin

N N

N N CH2 - CONH

O N

S

CH2 S

-COOH S

N N

CH3

Cefuroxim CONH

O N

S COOH

CH2 - O - CO - NH2

O

C N - OCH3

Tõ 7-ACA

Cefotaxim CONH

O N

S

COOH

CH2 - O - CO - CH3 S

N N

H2 C

6 Sinh tổng hợp Acid clavulanic 6.1 Đại cơng

Acid clavulanic lμ chất kháng sinh có cấu trúc vịng β-lactam đ−ợc Brown vμ cộng tìm vμo năm 1976 môi tr−ờng nuôi cấy Streptomyces clavuligerus (Napier vμ cs phát acid clavulanic vμo năm 1981 độc lập với nghiên cứu Brown)

Acid clavulanic lμ kháng sinh phổ rộng, tác dụng lên nhiều loμi vi khuẩn bao gồm vi khuẩn Gram (+) vμ vi khuẩn Gram (-) nh−ng hoạt tính kháng khuẩn chúng yếu Tuy nhiên −u điểm acid clavulanic lμ có hoạt tính kháng betalactamase, đặc biệt có tác dụng ức chế mạnh betalactamase truyền qua plasmid gây kháng penicillin vμ cephalosporin Vì acid clavulanic đ−ợc phối hợp với amoxicilin thμnh biệt d−ợc mang tên Augmentin đ−ợc bμo chế nhiều dạng khác nh− bột uống, viên nén bao phim, tiêm hãng Glaxo Smithkline Sự phối hợp với acid clavulanic giúp cho amoxicilin không bị betalactamase phá huỷ, đồng thời mở rộng thêm phổ kháng khuẩn amoxicilin cách hiệu với nhiều vi khuẩn thông th−ờng kháng lại amoxicilin, kháng lại penicillin vμ cephalosporin Khi sử dụng riêng ampicillin nồng độ diệt vi khuẩn tối thiểu MBC (minimum bactericidal concentration) Staphylococcus aureus lμ 500 mcg/ml, song sử dụng phối hợp với acid clavulanic nồng độ mcg/ml liều MBC hiệu giảm xuống 5000 lần – tức lμ cần 0,1 mcg/ml Việc phối hợp amoxicilin với acid clavulanic lμ ví dụ điển hình nhμ d−ợc học nghiên cứu bμo chế phối hợp d−ợc chất để tạo biệt d−ợc tác dụng tốt điều trị nhằm ngăn cản kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn

6.2 CÊu tróc ho¸ häc vμ tÝnh chÊt

Về cấu trúc acid clavulanic t−ơng tự nh− kháng sinh nhóm β-lactam khác Phân tử acid clavulanic chứa vịng β-lactam (đ−ợc xếp vμo nhóm β-lactam khơng chứa S) Ng−ời ta tìm sản phẩm lên men tự nhiên có cấu trúc t−ơng tự với acid clavulanic vμ xếp chúng vμo nhóm clavam

N

O R1

Bảng 8.7 Cấu trúc kháng sinh clavam tự nhiên

Tên clavam R1 R2

Acid clavulanic − COOH = CHCH2OH

Acid β–hydroxypropionylclavulanic − COOH = CHCH2COCH2CH2OH

Acid clavam – – cacboxylic − H − COOH

2–hydroxymethylclavam − H − CH2OH

2–formyloxymethylclavam − H − CH2OCHO

2–(3 – alanyl) – clavam − H − CH2CH(NH2)COOH

2–(2 – hydroxyethyl) – clavam − H − CH2CH2OH

Khi phối hợp với amoxicilin ngời ta sử dụng dạng muối kali acid clavulanic có công thức hoá học C8H8KNO5,ptl 237,25

N O

O

CHCH2OH

COOH

N O

O

CHCH2OH

COOK

Acid clavulanic Kali clavulanat

Clavulanat d¹ng muèi kali lμ bét tinh thĨ tr¾ng, dƠ hót Èm, tan n−íc, tan Ýt cån, rÊt Ýt tan aceton

6.3 Lên men sinh tổng hợp acid clavulanic

6.3.1 Chđng gièng

Trong cơng nghiệp ng−ời ta sử dụng chủng Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 hay NRRL 3858 để sản xuất acid clavulanic Trong môi tr−ờng ni cấy ngoμi acid clavulanic th−ờng tích tụ đồng thời vμi clavam khác, số dẫn xuất cephalosporin vμ penicillin N

6.3.2 Quy trình lên men

Quy trình sinh tổng hợp hÃng Beecham Laboratories Ltd có công đoạn sau:

Bo t giống đ−ợc ni cấy bình Roux, ni mơi tr−ờng đặc 26OC thời gian 10 ngμy Nhân giống 26OC 72 giờ, cấp khí 1VVM,

Thnh phần môi trờng lên men sinh tổng hợp (w/v):

Bột đậu tơng 3,0

Tinh bét 4,7

FeSO4.7H2O 0,01

KH2PO4 0,01

CaCO3 0,3

Dầu phá bọt 0,05

Nớc máy vđ

Môi trờng lên men đợc chỉnh pH = 7,0, tiƯt trïng b»ng h¬i ë 121OC

trong thời gian 30 phút, lμm nguội cấy truyền lít dịch giống sang Q trình lên men tiến hμnh 26OC, tốc độ khuấy 100 – 110 v/ph, cấp khí l−u

l−ợng 0,75VVM Thời gian nuôi cấy từ 90 – 100 Hiệu suất trình lên men th−ờng đạt 500 mcg/ml dịch lên men

6.3.3 T¸ch chiÕt vμ tinh chÕ acid clavulanic

Acid clavulanic lμ sản phẩm ngoại bμo vμ đ−ợc chiết cách dùng nhựa trao đổi ion (th−ờng sử dụng anionit nh− Amberlite IR4B hay Zeolite FFIP…)

Kết thúc q trình ni cấy hạ nhiệt độ dịch lên men xuống 5OC, lọc

ly tâm loại sinh khối, acid hoá dịch lọc acid hydrocloric sulfuric đến pH = 2–3, đồng thời bổ sung dung môi không tan n−ớc nh− n-butanol ethylacetat Acid clavulanic chuyển sang pha dung môi Chiết acid clavulanic khỏi pha dung môi dung dịch có pH trung tính nh− dung dịch đệm natri bicarbonat kali hydrophosphat, hỗn dịch CaCO3

n−ớc Dịch chiết đem hấp phụ nhựa trao đổi ion để thu sản phẩm tinh khiết thu chế phẩm thô dạng muối cách cô nhiệt độ thấp (≤ 40OC)

vμ áp suất giảm sấy phun để thu sản phẩm

amberlit loại muối

DD NaCl phản hấp phụ

than hoạt tảy mu

amberlit

5oC

DD HCl

pH = -

đệm pH dịch lên men

läc sinh khèi

chiÕt lÇn butanol

chiÕt lÇn

hÊp phơ

cô chân không

sấy phun

acid clavulanic

Hình 8.6. Sơ đồ cơng đoạn tách chiết tinh chế acid clavulanic

C¸c kh¸ng sinh kh¸c có cấu trúc clavam đợc xếp vo nhóm ny l sulbactam v tazobactam Đây l kháng sinh đợc sản xuất phơng pháp tổng hợp hóa học Sulbactam thờng đợc phối hợp với amoxicillin, tazobactam đợc phối hợp víi piperacillin

N

S O

O

O

N

S O O

O

CH3

CH2 N

N N COONa

Sulbactam Tazobactam

Tự lợng giá

1 Kể tên chủng vi sinh vật đ−ợc sử dụng dùng để sản xuất kháng sinh nhóm beta-lactam

2 Tìm mối liên hệ cấu trúc hoá học với chủng giống v quy trình sinh tổng hợp nhóm kháng sinh penicillin v cephalosporin Nêu phơng pháp điều khiển trình sinh tổng hỵp tõ chđng nÊm

Penicillium chrysogenum để nhận đ−ợc khỏng sinh penicillin mong mun?

4 Trình by phơng pháp sản xuất 6-APA đờng sinh học Nêu nguyên tắc sản xuất kháng sinh bán tổng hợp nhóm

cephalosporin

Chơng

sản xuất kháng sinh nhóm Tetracyclin

Mục tiêu

Sau học xong chơng ny, sinh viên phải trình by đợc:

1 Nguồn gốc kháng sinh tự nhiên v bán tổng hợp nhóm tetracyclin Quy trình lên men nhận kháng sinh cụ thể

3 Phơng pháp có hiệu phơng pháp chiết xuất kháng sinh từ dịch lên men

1 Đại cơng

Cỏc tetracyclin đ−ợc phát sớm (từ năm 1948), lμ nhóm chất kháng sinh phổ rộng ức chế hầu hết vi khuẩn Gram (-), Gram (+) vμ Rickettsia… nên đ−ợc sử dụng rộng rãi năm 80 kỷ XX, lμ n−ớc phát triển Hiện kháng sinh tự nhiên nhóm nμy nh− tetracyclin, clotetracyclin, oxytetracyclin chủ yếu đ−ợc sử dụng chăn nuôi để điều trị bệnh cho gia súc, gia cầm vμ đ−ợc phối hợp với vitamin B12 để bổ sung vμo thức ăn chăn nuôi có tác dụng kích

thích tăng trọng Các kháng sinh tetracyclin bán tổng hợp đ−ợc dùng rộng rãi để điều trị số bệnh nhiễm trùng nh− mắt hột, mắt đỏ, viêm giác mạc, viêm phế quản, viêm tiết niệu lậu cầu … vμ đặc biệt để điều trị bệnh dịch hạch

2 Công thức cấu tạo v tính chất

Các kh¸ng sinh nhãm tetracyclin cã bé khung chÝnh lμ octahydro naphtaxenic:

OH

OH O O

N(CH3)2 OH

CONH R5

R6a

R7

R6

R2

6

7

2

Bảng 9.1. Công thức cấu tạo số kháng sinh nhãm tetracyclin

Tªn R2 R5 R6a R6 R7

Clotetracyclin – H – H – OH – CH3 – Cl

Oxytetracyclin – H – OH – OH – CH3 – H

Tetracyclin – H – H – OH – CH3 – H

6-Demethyl etracyclin

– H – H – H – H – H

Demeclocyclin – H – H – OH – H – Cl

Methacyclin – H – OH = CH2 – H

Doxycyclin – H – OH – H – CH3 – H

Minocyclin – H – H – H – H – N (CH3)2

Rolitetracyclin

N CH2

– H – OH – CH3 – H

Đặc tính chung tetracyclin lμ bền với acid nên dùng để uống đ−ợc nh−ng nhiều tác dụng phụ - đặc biệt lμ tạo phức calci bền vững lμm bị vμng ố nên cấm dùng cho trẻ em d−ới 10 tuổi Một số tính chất nhóm kháng sinh nμy cần đ−ợc quan tâm trình chiết xuất lμ:

− Tính lỡng tính: Do phân tử kháng sinh nhóm tetracyclin có chứa nhóm dimetylamino có khả tạo muối với acid v nhóm hydroxyl có khả tạo muối với kiềm với ion Ca++, Mg++ (t¹o tetracyclinat)

− Dễ bị đồng phân hóa (do cấu trúc hydro naphtaxenic) dung dịch n−ớc pH 2,0 – 6,0 tạo epitetracyclin khơng có tác dụng kháng sinh Hiện t−ợng đồng phân hóa xảy nhanh tetracyclin vμ clotetracyclin

O

N(CH3)2 OH

CONH2

H

O

OH

CONH2

(CH3)2N H

Tetracyclin Epitetracyclin

− ë m«i tr−êng kiềm hay acid (pH > pH < 1) tetracyclin bị khử hoạt tính tạo thμnh c¸c dÉn chÊt anhydro vμ isotetracyclin

OH O

N(CH3)2

OH

CONH2

R1 CH3

O O

O

OH O

N(CH3)2 OH

CONH2

R1 CH3

OH O

OH

OH O O

N(CH3)2 OH

CONH2

OH H3C

R1 pH >

pH <

isotetracyclin

anhydrotetracyclin

3 Sinh tỉng hỵp Tetracyclin tự nhiên

Có gần 10 tetracyclin tự nhiên nhng thực tế ngời ta sản xuất quy mô công nghiệp sản phẩm l clotetracyclin, tetracyclin, oxytetracyclin vμ demeclocyclin

3.1 Chñng gièng

Sinh tổng hợp chuỗi oligoketidamit mạch thẳng từ nguồn hydratcarbon

Khép vòng chuỗi oligoketidamit tạo thnh khung pretetramit (hoặc 6- metylpretetramit)

− Chuyển hoá tiếp pretetramit (hoặc 6- metylpretetramit) để tạo tetracyclin

OH OH OH OH CH3

OH CONH2

OH OH OH OH CH3

OH CONH2

OH

OH OH O O

CH3

OH CONH2

O

HO

OH OH O O

CH3

OH CONH2

HO NH2

OH OH O O

CH3 OH CONH2 HO N CH3

H3C

OH O O O

CH3 OH CONH2 HO N CH3

H3C

HO

OH O O

CH3 OH CONH2 HO N CH3

H3C

HO OH (A) (B) (D) (C) Tetracyclin (E) (F)

Hình 9.1. Cơ chế sinh tổng hỵp tetracyclin tõ pretenamid (A)

OH OH O O

CH3 OH CONH2 HO N CH3

H3C

OH OH O O

CH3 OH CONH2 HO N CH3

H3C

OH

OH O OH O

OH OH CONH2 HO N CH3

H3C

OH H3C

(E)

Pretenamid (A)

Oxytetracyclin

3.2 Đặc điểm trình lên men

Các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh nhóm tetracyclin lμ chủng vi sinh vật hiếu khí nên q trình ni cấy cần lắc khuấy trộn kèm theo sục khí với l−u l−ợng khoảng 1VVM Việc đảm bảo thơng khí hợp lý vμ liên tục suốt q trình lên men có ảnh h−ởng lớn đến hiệu suất sinh kháng sinh, đặc biệt lμ – 12 (q trình bị huỷ hoμn toμn ngừng cấp oxy phút) pH tối −u cho phát triển lμ 6,6 – 7,2 Mỗi bμo tử nảy 2-4 chồi tạo thμnh hệ sợi Kháng sinh nằm sinh khối xạ khuẩn Nhiệt độ ni cấy thích hợp từ 27 – 28OC Thời gian lên men th−ờng

kho¶ng 110 – 140 giê 3.3 Nhu cÇu dinh d−ìng

Ngn hydrat carbon chủ yếu l bột ngô, bột mì, tinh bột khoai tây tinh bột ngô Ngoi ngời ta bổ sung vo môi trờng nuôi cấy số loại đờng nh glucose (thích hợp với S rimosus) maltose (thích hợp với S aureofaciens) Các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh nhóm tetracyclin khả phân giải saccharose v lactose

Nguồn nitơ: Môi trờng sản xuất cần có nguồn nitơ vô nh (NH4)2SO4 nh Nitơ hữu (cao ngô, bột đậu tơng, bột lạc )

Ngun phospho: i vi quỏ trình sinh tổng hợp tetracyclin hμm l−ợng phospho vơ hoμ tan môi tr−ờng lên men (chủ yếu từ cao ngơ) có ý nghĩa quan trọng đến hiệu suất tạo kháng sinh: thiếu phospho giống phát triển vμ hiệu suất lên men thấp, thừa phospho giống phát triển nhanh nh−ng hoạt lực kháng sinh giảm đáng kể tích tụ acid acetic vμ acid pyruvic môi tr−ờng Để tránh thừa phospho ng−ời ta bổ sung CaCO3 để tạo thμnh

phosphat calci không tan Ngoμi cịn có tác dụng giảm nồng độ kháng sinh hoμ tan để tránh độc tính kháng sinh giống

Nguồn kim loại vi l−ợng: Các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh nhóm tetracyclin cần số kim loại nh− Mg, Mn, Fe, Cu… vμ th−ờng đ−ợc bổ sung d−ới dạng muối sulfat Nếu mơi tr−ờng có cao ngơ, bột đậu, bột lạc… khơng cần bổ sung thân loại nguyên liệu nμy sẵn có muối kim loại Cần ý đặc biệt đến hμm l−ợng sắt sắt thừa kết hợp với Tetracyclin tạo phức chất khơng có hoạt tính kháng sinh

ở pha phát triển thứ điều kiện lên men chìm, chủng xạ khuẩn nμy sinh tr−ởng mạnh khoảng từ 24 – 48 vμ khối l−ợng khuẩn ty đạt tới 70 – 80% mức tối đa, l−ợng chất dinh d−ỡng tiêu thụ từ 60 – 80% B−ớc sang pha lên men thứ hai trình phát triển chậm lại nên tốc độ tiêu thụ chất dinh d−ỡng giảm nhiều, tăng sinh khối (l−ợng khuẩn ty) chậm lại dần đạt tới mức độ cực đại ổn định vμ xạ khuẩn b−ớc sang giai đoạn tự phân Trong giai đoạn nμy l−ợng chất dinh d−ỡng mơi tr−ờng cịn lại vμ hầu nh− không đ−ợc sử dụng

với Str. aureofaciens) vμ 48 - 55 (đối với Str.rimosus lμ chủng phát triển chậm hơn) L−ợng kháng sinh đạt tối đa 120 -144 Hiệu suất sinh tổng hợp lên tới 20.000 mcg/ml môi tr−ờng lên men với chủng siêu tổng hợp 3.4 Nguyên tắc chiết xuất kháng sinh từ môi tr−ờng lên men

Các kháng sinh nhóm tetracyclin có tính chất l−ỡng tính nên dùng ph−ơng pháp sau để chiết tách sản phẩm khỏi dịch lên men:

− ChiÕt b»ng dung m«i hữu có chất mang Chiết phơng pháp kÕt tña

− Chiết ph−ơng pháp trao đổi ion

Tuỳ theo loại kháng sinh cụ thể, độ tinh khiết cần thiết sản phẩm mμ ng−ời ta lựa chọn ph−ơng pháp thích hợp D−ới mơ tả quy trình sinh tổng hợp vμ chiết xuất số kháng sinh cụ thể nhóm tetracyclin

4 Sinh tỉng hỵp Clotetracyclin 4.1 Chđng gièng

Clotetracyclin có tên khác l biomycin, aureomycin v đợc tìm lần đầu vo năm 1948 môi trờng nuôi cấy chủng xạ khuẩn Str aureofaciens Trong sản xuất c«ng nghiƯp hiƯn ng−êi ta sư dơng mét sè biÕn chđng cho hiƯu st sinh tỉng hỵp cao nh−Str aureofaciens A377 (NRRL 2009), Str aureofaciens ATCC 13908-13911

Muối clohydrat clotetracyclin lμ dạng bột tinh thể mμu vμng, khơng mùi, vị đắng, bền vững khơng khí khơ nhiệt độ phịng, để ánh sáng hoạt tính Clotetracyclin bền dung dịch acid (pH 0,6 – 2,6), không bền dung dịch kim

4.2 Điều kiện lên men

Nhu cầu dinh d−ỡng vμ điều kiện lên men sinh tổng hợp chủng Str aureofaciens mang đặc điểm chung nh− phần tổng quan nêu Tuy nhiên cần ý thêm số yếu tố riêng nh− sau:

Thnh phần môi trờng lên men (%):

Bột ng« 12,0

Cao ng« 0,5

(NH4)2SO4 1,5

NaCl (hoặc NH4Cl, NH4NO3) 0,6

Muối khoáng 0,01

pH sau khử trùng 6,6 - 7,2 Nhiệt độ nuôi cấy 28OC

Thêi gian lên men 100-120 Cung cấp khí vô trùng 1VVM

Môi tr−ờng lên men phải cung cấp ion clo để tạo Clotetracyclin Thích hợp lμ amoni clorid, natri clorid amoni nitrat

Các tiền chất sử dụng sinh tổng hợp clotetracyclin lμ hợp chất mạch vịng, thích hợp lμ benzylthioxyanid (C6H5CH2-SCN) với hμm l−ợng 1-3 mg/l mơi tr−ờng lμm tăng hiệu suất n 30 - 40%

4.3 Phơng pháp chiết xuất

Có thể sử dụng ph−ơng pháp kết tủa để thu clotetracyclin từ dịch lên men theo sơ đồ hình 9.3a Các b−ớc tiến hμnh nh− sau:

Dịch lên men đ−ợc hạ nhiệt độ xuống 15OC Sau acid hố H 2SO4

30% đến pH = 4,5 Lọc loại sinh khối vμ thêm 0,1% CaCl2 Kiềm hoá NH4OH đến pH 8,5 – kháng sinh kết tủa dạng phức calci Lọc thu kết tủa

để tinh chế tiếp qua công đoạn loại tạp, tẩy mμu…

Clotetracyclin có hoạt tính kháng khuẩn mạnh gấp lần tetracyclin (Test lμ Staphyloccocus aureus) song độc tính cao Tetracyclin nên khơng dùng y học Tr−ớc có sử dụng chế phẩm mỡ tra mắt (dạng clohydrat) vμ viên nén (dạng base) Hiện clotetracyclin đ−ợc sản xuất dạng thô (chế phẩm Biovit) dùng chăn nuôi gia súc, gia cầm

Qui trình sản xuất Biovit: Có thể áp dụng hai quy tr×nh sau (h×nh 9.3b vμ c):

sấy phun dịch lên men

acid hóa

lọc

kÕt tđa

tinh chÕ

s¶n phÈm

lọc

sấy

Làm lạnh 15oC

H2SO4 30%

pH = -

CaCl2

NH4OH

Loại tạp Ca, Mg Tảy màu

<60oC 600mmHg

cô

biovit

Còn 40%

sinh khối

(a)

(b)

(c)

H×nh 9.3 Quy trình xử lý dịch lên men clotetracyclin (a): Quy trình thu clotetracyclin tinh khiÕt

Dịch lên men đ−ợc cô chân không đến 40% chất đặc, sau sấy phun thu sản phẩm Hoặc dịch lên men đem lọc lấy sinh khối (Biomaca) vμ sấy chân không nhiệt độ ≤ 60°C vμ p = 600 mmHg Sau xay thμnh bột, xác định hoạt tính kháng sinh bột nμy để phân loại sản phẩm Có loại Biovit 80, Biovit 120 hay Biovit 150 (Mỗi kg Biovit có chứa 80, 120 hay 150 g biomyxin vμ mg vitamin B12)

5 Sinh tỉng hỵp Tetracyclin 5.1 Đại cơng

Tetracyclin c phỏt lần đầu vμo năm 1953 ph−ơng pháp khử clo clotetracyclin Sau nμy ng−ời ta tìm thấy chủng xạ khuẩn Str viridifaciens có khả sinh tổng hợp tetracycline nh−ng thực tế sản xuất sử dụng chủng Str aureofaciens điều kiện nuôi cấy đặc biệt (có bổ sung chất ức chế q trình Clo hoá)

Tetracyclin base lμ bét kÕt tinh vμng sẫm, tan nớc v dung môi hữu Dạng base ny không bền nên thực tế sản xuất tetracyclin clohydrat lμ bét vμng s¸ng tan n−íc võa bền vững, vừa dễ sử dụng

5.2 Quy trình lªn men

Điều kiện vμ đặc điểm trình lên men tạo tetracyclin chủng Str aureofaciens gần giống với lên men tạo clotetracyclin Tuy nhiên điểm khác biệt quan trọng lμ thμnh phần môi tr−ờng nuôi cấy Dựa vμo thμnh phần môi tr−ờng cung cấp cho xạ khuẩn mμ ng−ời ta định h−ớng đ−ợc sản phẩm cuối trình lên men

Str.aureofaciens điều kiện ni cấy bình th−ờng tạo clotetracyclin; nh−ng nuôi d−ỡng điều kiện đặc biệt có chất ức chế q trình clo hố xạ khuẩn tạo chủ yếu tetracyclin Để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp tetracyclin phải loại vết Cl– khỏi mơi tr−ờng Trong phịng thí

nghiệm để loại ion Cl– dùng muối bạc, nhiên ph−ơng pháp nμy

kh«ng thùc tÕ HiƯn ng−êi ta dïng nh÷ng chÊt øc chÕ trình clo hoá nh brom, iod, thiocyanid Tuy nhiên tăng hm lợng bromid môi trờng xạ khuẩn tổng hợp bromtetracyclin v ức chế sinh tổng hợp tetracyclin Vì ngoi NaBr cho thêm chất ức chế trình clo ho¸ kh¸c nh− 2-mercaptobenzothiazol, - thiouracyl, dÉn chÊt cđa acid dithiocarbamic Cơ chế tác dụng chất ny cha đợc rõ chúng tác dụng cạnh tranh với ion clo, có mặt nhóm sulfuhydryl (-SH) có tác dụng kích thích phản ứng oxy hoá khử lm loại Cl khỏi phân tử kháng sinh

Thnh phần môi trờng lên men (%):

Cao ng« 0,5

NaBr 0,2

Benzylthiocyanid (C6H5CH2-SCN) 0,0001

2-mercaptobenzothiazol 0,001

CaCO3 0,5

Dầu phá bọt theo nhu cầu

pH sau khö trïng 6,8 – 7,2

Nhiệt độ ni cấy 28OC

Thêi gian lªn men 120 giê – 144 giê Cung cÊp khÝ v« trïng 0,8 – VVM 5.3 Qui tr×nh chiÕt xuÊt tetracyclin

Cịng nh− c¸c kh¸ng sinh kh¸c thc nhãm ny, tetracyclin đợc chiết phơng pháp giới thiệu phơng pháp chiết dung môi hữu cơ:

Dch lờn men xong, bm vo thùng chứa, hạ nhiệt độ xuống 15°C Thêm acid oxalic vμ hạ pH = 2,5 – 3,0 Thêm Na2CO3 khuấy pH = 3,5 Thêm

K4Fe(CN)6 khuấy tiếp 15 phút để loại sắt Lấy mẫu phân tích Ca++ vμ Fe++: yêu

cÇu Ca++ ≤ 0,4 - 0,6 g/lÝt Fe++ Trong thiết bị chiết thêm hỗn hợp

isooctanol cã chøa 1,5 - 2,5% acid oleic tỉ lệ dung môi/dung dịch kháng sinh l : - : 4, thªm NH4OH 5% vμo vμ khuÊy pH = - 9,5 Tetracyclin chuyÓn sang dung môi, dịch thải chuyển phân xởng thu hồi dung môi Dịch chiết isooctanol bơm vo thiết bị chứa với acid oxalic (dung dịch 5%) thêm vo với lợng 0,5 - 0,6% theo tỉ lệ dịch kháng sinh Tại loại Ca++ v

kim loại khác dạng oxalat Ly tâm loại oxalat Tẩy mμu than hoạt 0,25 - 0,3% Sau lọc loại than lọc hút chân khơng kết tinh tetracyclin base dung dịch NH4OH 10% Khuấy để kết tinh nhiệt độ 15°C vμ pH 3,9 - 4,5 Ly tâm thu sản phẩm vμ sấy khô máy sấy tầng sôi Hiệu suất chiết đạt 70 – 75%

Trên thực tế, tetracyclin không bền vững, ho tan nớc nên khó sử dụng Vì thờng chế tạo dạng muối clohydrat tetracyclin bền vững (có dạng viên nén) Tại môn Công nghiệp Dợc, Trờng Đại häc D−ỵc Hμ Néi lμm nh− sau:

Hiệu suất chế tạo clohydrat tetracyclin đạt 90%

lọc, ly tâm pH = 2,5 - 3,0 Hạ xuống 15oC

lọc acid hóa dịch lên men

loại tạp acid oxalic K4FeCN6

tảy mu, loại tạp

Loại Ca, Mg Tảy màu = than hoạt Chiết

isooctanol chøa a.oleic chØnh pH - 9,5

NH4OH 10% kÕt tña

tetracyclin base

butanol HCl đặc 40oC

tetracyclin HCl

lọc

sấy tầng sôi

kiĨm nghiƯm

H×nh 9.4. Quy tr×nh chiÕt tetracyclin dung môi hữu

6 Sinh tổng hợp Oxytetracyclin

Oxytetracyclin đợc phát lần đầu vo năm 1950 môi trờng nuôi cấy Str rimosus Giai đoạn đầu kháng sinh ny đợc sử dụng cho ngời dạng dihydrat hay muối clohydrat với biệt dợc Abbocin, Clinimycin, Berkmycen, Imperacin, Oxymycin HiƯn oxytetracyclin chđ u đợc dùng thú y v chăn nuôi với sản phẩm mang tên teravit, terramycin, biostat

6.1 Chđng gièng

Trong c«ng nghiƯp sư dơng Str rimosus Ngoμi c¸c chđng Str. griseoflavus, Str armilatus sinh oxytetracyclin

Môi trờng lên men (%):

Bét ng« 6,0

Cao ng« 0,5

(NH4)2SO4 0,6

CaCO3 0,6

CoCl2.6H2O 0,01

pH sau khö trïng 6,8 – 7,0

Nhiệt độ ni cấy 28OC

Thêi gian lªn men 120 giê – 144 giê

Cung cÊp khÝ v« trïng: 0,8 – thĨ tÝch kh«ng khÝ/1 thĨ tÝch m«i trờng/ phút, áp suất nồi lên men: 0,3 0,4 at

6.2 Điều kiện lên men

Trong điều kiện ni cấy chìm vμ khuấy trộn có cấp khí, giống xạ khuẩn Str rimosus phát triển chậm so với Str aureofacience Tuy nhiên tốc độ sử dụng chất béo Str rimosus nhanh Str aureofacience, q trình lên men tạo oxytetracyclin cần nhiều dầu phá bọt lên men tạo tetracyclin vμ clotetracyclin Tiến hμnh lên men 28OC, cấp khí vi lu

lợng 1VVM Thời gian lên men tõ 120 giê – 144 giê

Quá trình lên men oxytetracyclin xảy theo pha: 60 đầu xạ khuẩn phát triển mạnh Từ thứ 60 trở bắt đầu pha thứ Khuẩn ty đứt lại nảy mầm tạo thμnh hệ khuẩn ty thứ cấp mảnh Đây lμ pha sinh tổng hợp kháng sinh Trong trình nμy cần theo dõi chặt chẽ thông số nh− pH, tốc độ tạo bọt, nồng độ đ−ờng… để bổ sung kịp thời

6.3 Phơng pháp chiết xuất kháng sinh

Để chiết xuất oxytetracyclin tốt lμ dùng ph−ơng pháp kết tủa Tuy nhiên giới thiệu quy trình chiết oxytetracyclin ph−ơng pháp trao đổi ion Quy trỡnh chit bao gm cỏc bc sau:

Tạo dịch läc chøa kh¸ng sinh:

Dịch lên men đ−ợc hạ nhiệt độ xuống 15OC Thêm K

4Fe(CN)6 10% (kho¶ng

3 lít/m3) để loại sắt Thêm acid oxalic (khoảng kg/m3) vμ khuấy đến pH = 1,9 –

2,0 để loại ion Ca++ Thêm dần Na

2CO3 vμ khuấy đạt pH = 3,0 - 3,2

g/l; Fe++ kh«ng có) Dịch đợc đem lọc lọc trống quay hay Ðp khung b¶n

Dịch lọc tinh khiết đem hấp phụ cột chứa nhựa trao đổi ion Hấp ph trờn nha:

Dịch chứa kháng sinh đợc lm lạnh xuống 8OC Bơm qua lọc chứa

bông thuỷ tinh để loại protein vμ tạp khác Dịch lọc suốt đ−ợc bơm qua cột trao đổi ion (cột đ−ợc coi lμ bão hoμ kháng sinh dịch qua lọc chứa ≤ 200 đơn vị/ml Rửa cột n−ớc cất

Trong dung dÞch acid xt hiƯn cation tetracyclin cã thĨ thay thÕ cation hydro phân tử nhựa

R SO3-H+ + TC

NH+(CH3)2

OH R SO3

-TC

NH+(CH3)2 OH

+ H+

Ph¶n hÊp phơ:

Dùng dung dịch đệm borat amoni có pH = 9,6 – 10 Th−ờng dùng dung dịch NH4OH 0,3N thêm acid boric để đạt nồng độ NH4OH 0,25N Tốc độ

ph¶n hÊp phơ kho¶ng 600 l/giê Kháng sinh chuyển vo dung dịch dới dạng anion

R SO3- + TC

NH+(CH3)2

O -TC

NH+(CH3)2

OH

+ 2NH4OH RSO3-NH4+ +NH4+ + 2H2O

Để phản hấp phụ oxytetracyclin cần l−ợng amoniac cho không thay cation kháng sinh nhựa mμ đủ để hoμ tan oxytetracyclin đ−ợc đẩy Phân đoạn đầu vμ cuối để riêng để hấp phụ lại; phân đoạn đem kết tinh

KÕt tinh Oxytetracyclin base:

Trong nồi phản ứng có máy khuấy, dịch phản hấp phụ đ−ợc acid hoá HCl đến pH = – 5,5 Để kết tinh 10OC Ly tâm lấy tinh thể

Tinh chÕ:

Hoμ tan oxytetracyclin base HCl 0,1N Tẩy mμu than hoạt Lọc loại than đ−ợc dịch lọc chứa oxytetracyclin từ 30 – 40 g/l Dùng dung dịch NH4OH 10N chỉnh dịch lọc đến pH 3,8 – để kết tinh 10OC Sau

đó ly tâm lấy tinh thể Sấy chân không nhiệt độ ≤ 60OC sấy tầng sôi

Thμnh phẩm đạt khoảng 900 UI/mg Hoμn nguyên nhựa:

NH4OH

+

RSO3-Na+

NaOH

+

R SO3-NH4+

NaCl

+

RSO3-Na+

HCl

+

R SO3-NH4+

Cho dung dịch NaOH 3N chảy qua cột với tốc độ 300 l/giờ Rửa cột n−ớc loại ion đến dịch chảy có pH = – 9,0 Sau cho dung dịch HCl 1N chảy qua cột với tốc độ 400 l/giờ đến pH dịch chảy đạt – 2,5 lμ đ−ợc

tinh chÕ läc, ly t©m

pH = 2,5 - 3,0 to = 15oC

lọc acid hóa dịch lên men

loại tạp

acid oxalic K4FeCN6

phản hấp phụ

Đệm borat amoni pH = 9,6 -10,0

hÊp phô

Nhùa sulfocationit to = 8oC

kÕt tinh

dd HCl pH = 5,0 - 5,5

s¶n phÈm

7 Sản xuất số Tetracyclin bán tổng hỵp

Do nh−ợc điểm độc tính tetracyclin tự nhiên nh− trình bμy trên, ng−ời ta tìm cách tạo kháng sinh nhóm nμy Xu h−ớng tạo tetracyclin tự nhiên cách thay đổi tiền chất định h−ớng sinh tổng hợp (VD: tạo bromtetracyclin cách cung cấp ion brom thay cho clo; tạo 6-demetyl tetracyclin, clotetracyclin hay oxytetracyclin cách thêm vμo mơi tr−ờng chất ức chế q trình metyl hoá nh− dẫn suất sulfonamit…) ch−a đem lại kết khả quan Hiện kháng sinh tự nhiên nhóm Tetracyclin chủ yếu đ−ợc dùng ngμnh chăn nuôi, phần trở thμnh nguyên liệu trung gian bán tổng hợp tetracyclin Có khoảng 3.000 chất kháng sinh bán tổng hợp nhóm tetracyclin đ−ợc cơng bố, nhiên số chúng đ−ợc sử dụng điều trị tác dụng phụ (nhất lμ trẻ em) Nhóm tetracyclin bán tổng hợp đ−ợc chia thμnh loại:

7.1 C¸c kh¸ng sinh lμ dÉn xuÊt amid

Tõ tetracyclin ng−êi ta cho ph¶n øng víi formaldehyd vμ mét amid tơng ứng tạo nên kháng sinh nh rolitetracyclin (1958), limecyclin mepicyclin Các kháng sinh ny cã tÝnh tan n−íc tèt h¬n

OH O O

CH3

OH

HO N

CH3 H3C HO OH NH2 O N H

OH O O

CH3

OH

HO N

CH3 H3C

HO OH NH O N Tetracyclin Rolitetracyclin

CH2OH

Phản ứng tạo Rolitetracyclin

7.2 Các kháng sinh đợc thay nhóm chức vị trí số v Đại diện tiêu biểu nhãm nμy lμ kh¸ng sinh: methacyclin (1960), Doxycyclin (1962) vμ minocyclin (1967)

Methacyclin đ−ợc bán tổng hợp từ 6-deoxy-oxytetracyclin theo sơ đồ sau:

6-deoxy-oxytetracyclin

OH O O

OH

HO N

CH3 H3C

OH

CONH2

CH3 OH

6 6

OH O O

OH

HO N

CH3 H3C

OH

CONH2 OH

CH2

Doxycyclin đ−ợc bán tổng hợp từ methacyclin theo sơ đồ:

Methacyclin

OH O O

OH

HO N

CH3 H3C

OH

CONH2 OH

CH2

6

OH O O

OH

HO N

CH3 H3C

OH

CONH2 OH

CH3

Doxycyclin

Minocyclin đợc bán tổng hợp từ 6-demethyl-tetracyclin:

6-demethyl-tetracyclin

OH O O

OH

HO N

CH3

H3C

OH OH

CONH2

6

OH O O

OH

HO N

CH3

H3C

OH

CONH2

Minocyclin

N CH3 H3C

−u điểm kháng sinh nμy lμ liều dùng thấp nên độc vμ có tác dụng kéo dμi Trong số nμy doxycyclin đ−ợc sử dụng phổ biến d−ới dạng monohydrat hay hyclat

Doxycyclin monohydrat

.

OH

HCl

1/2

OH O OH O

CONH2

OH

H2O . . 10 11 12 CH3 H OH H

N(CH3)2

OH

C2H5OH 1/2

OH O OH O

CONH2

OH

H2O . 10 11 12 CH3 H OH H

N(CH3)2

Tự lợng giá

1 Chủng xạ khuẩn Str aureofacience điều kiện no tạo sản phẩm clotetracyclin, điều kiện no tạo tetracyclin?

2 Tại chiết xuất kháng sinh nhóm tetracyclin phải loại tạp Ca++, Mg++, Fe++?

Chơng 10

sản xuất kháng sinh nhãm aminoglycosid

Mơc tiªu

Sau học xong chơng ny, sinh viên phải trình by đợc:

1. Nguồn gốc kháng sinh tự nhiên v bán tổng hợp nhóm aminoglycosid

2 Nguyên tắc chung tìm kiếm v sản xuất kháng sinh nhóm aminoglycosid.

1 Đại cơng chung aminoglycosid 1.1 Đại cơng, phân loại

Các kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid chiếm vị trí quan trọng thứ sau nhóm beta-lactam điều trị bệnh nhiễm trùng Đây l kháng sinh có tác dụng chủ yếu vi khuẩn hiếu khí, vi khuẩn Gram (-) nh− Pseudomonas, Enterobacter…

B¶ng 10.1 Mét sè kháng sinh tiêu biểu nhóm aminoglycosid

Tên KS Năm Chủng xạ khuẩn Thế hệ

§−êng dïng

Streptomycin 1944 Str griseus I Tiêm

Dihydrostrep bán TH từ streptomycin I Tiêm

Neomycin 1949 Str fradiae I Ngoµi da, uèng

Kanamycin 1957 Str kanamyceticus I Tiªm, uèng

Paronomycin 1959 Str rimosus I Tiªm

Gentamicin 1963 M purpurea II Tiêm, mắt

Sisomicin 1970 Micromonospora inyoensis II Tiêm

Netilmicin 1975 bán tổng hợp từ sisomicin II Tiªm

Tobramycin 1975 Str tenebrarius II Tiêm, mắt

Cỏc aminoglycosid ph bin đ−ợc phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces Micromonospora, ngoμi có số chủng Bacillus có khả sinh kháng sinh nhóm nμy Các aminoglycosid đ−ợc phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces có tên gọi kết thúc -mycin, kháng sinh đ−ợc phân lập từ chủng xạ khuẩn Micromonospora có tên gọi kết thúc -micin Số l−ợng aminoglycosid tự nhiên lên tới 150 chất kháng sinh Những kháng sinh quan trọng nhóm nμy phải kể đến: amikacin, gentamicin, kanamycin, neomycin, streptomycin Các aminoglycosid chia thμnh hệ dựa độc tính vμ phổ kháng khuẩn (bảng 10.1)

Các kháng sinh hệ I nhóm aminoglycosid ngμy đ−ợc sử dụng độc tính vμ phổ kháng khuẩn kháng sinh hệ II bao gồm kháng sinh sinh tổng hợp vμ bán tổng hợp nh− gentamicin, tobramycin, amikacin, netilmicin… gentamicin đ−ợc sử dụng phổ biến

1.2 CÊu tróc ho¸ häc c¸c aminoglycosid

Bảng 10.2 Các aminocyclitol kháng sinh

Aminocyclitol Tên nhóm Cấu trúc

Kháng sinh tiªu biĨu

Streptidin

HO HO

OH

NH C NH2

NH NH C NH2 NH Streptomycin Dihydrostreptomycin Bluesin HO HO OH

NH C NH2

Actinamin

HO OH

O

-NHCH3

H3CHN O

-Spectinomycin Kasugamicin Validomycin Hygromycin Destomycin

Phần lớn chủng vi sinh vật sinh tổng hợp kháng sinh nhóm aminoglycosid trình sinh tổng hợp có khả tạo đồng thời nhiều chất có cấu trúc gần nh− chủng Str fradiae sinh tổng hợp đồng thời neomycin A, B vμ C; chủng Micromonospora purpurea sinh tổng hợp đồng thời gentamicin C1, C1a vμ C2…

Về cấu trúc aminoglycosid lμ họ gồm nhiều chất kháng sinh khác có cấu trúc phân tử gồm thμnh phần lμ nhóm amin liên kết với gốc glycosid Theo đặc điểm cấu trúc hoá học phân loại aminoglycosid dựa theo nhóm aminocyclitol chúng:

Nhóm kháng sinh chứa 2-deoxystreptamin cịn đ−ợc chia thμnh phân nhóm nhỏ với phân tử đ−ờng đ−ợc gắn vị trí số vμ (đại diện lμ neo-mycin) vμ phân tử đ−ờng đ−ợc gắn vị trí số vμ (đại diện lμ kanamycin, gentamicin)

Nhóm chứa actinamin cịn có tên gọi lμ nhóm chứa acid amin khác nhau: gồm spectinomycin, kasugamicin, validomycin, hygromycin, desto-mycin Trong số nμy có spectinomycin đ−ợc sử dụng y học, kháng sinh cịn lại chủ yếu sử dụng nơng nghiệp vμ chăn nuôi để trị bệnh cho trồng vμ gia sỳc

1.3 Tính chất hoá học chung v chÕ t¸c dơng

Phần lớn aminoglycosid dễ tan n−ớc, phổ kháng khuẩn rộng, bền với nhiệt vμ pH Hầu hết kháng sinh nhóm nμy đ−ợc sử dụng chủ yếu dạng tiêm thuốc dùng chỗ, hãn hữu có dạng uống Chỉ riêng neomycin đ−ợc dùng đ−ờng uống điều trị bệnh nhiễm khuẩn não vμ gan độc tính cao Hai phản ứng có hại chủ yếu kháng sinh aminoglycosid lμ độc cho quan thính giác vμ thận khơng hồi phục dùng kéo dμi (nhất lμ streptomycin vμ neomycin), chủ yếu lμ ốc tai (neomycin) vμ tiền đình (streptomycin)

Cơ chế tác dụng aminoglycosid l gắn kết vững với hai vị trí gắn aminoglycosid tiểu phân 30S ribosom, kết l thc øc chÕ tỉng hỵp protein cđa vi khn

thích hợp với n−ớc kinh tế cịn nghèo Ngμy kháng sinh nhóm aminoglycosid đ−ợc coi lμ chất kháng sinh dự trữ, đ−ợc sử dụng chủ yếu kháng sinh khác khơng mang lại hiệu Một số kháng sinh nhóm nμy đ−ợc sử dụng nông nghiệp nh− Nhật sử dụng kasugamicin để trị bệnh vμng lụi cho lúa chủng Piricularia oryzae gây ra; kháng sinh khác đ−ợc sử dụng chữa bệnh cho gia súc nh− hygromycin đ−ợc sinh tổng hợp từ chủng S hygroscopios, destomycin đ−ợc sinh tổng hợp từ chủng S rimofaciens, validomycin đ−ợc sinh tổng hợp từ chủng S hygroscopicus… 1.4 Cơ chế sinh tổng hợp

HO NH C NH2 NH2 C NH2 OH OH OH HN NH O H3C

OH OH CH2OH

OdTDP

O OH

OH CH2OH

NH2 NH HN OH OH OH NH2 C NH2 NH2 C NH O O CH2OH OH H3C

O

OH

OH CH2OH

NH2 ONuDP O NH HN OH OH OH NH2 C NH2 NH2 C NH O O CHO OH H3C

O

O OH

OH CH2OH

CH3NH

Demetyldihydro streptomycin Streptomycin (a) (b) (c)

Hình 10.1 Cơ chế sinh tổng hợp streptomycin từ streptidin đ−ợc phosphoryl hoá (a), dTDP-L-dihydrostreptose (b) N-metyl-glucosamin (c)

Do cấu trúc đa dạng vμ khác nhau, trình sinh tổng hợp nhóm chất aminoglycosid trải qua mắt xích trung gian vμ cần tác nhân cảm ứng hay kiềm chế khác Str Griseus, dihydrostreptomycin-6-phosphat vμ streptomycin đ−ợc hình thμnh giai đoạn cuối nhờ phản ứng kết hợp cấu tử: streptidin đ−ợc phosphoryl hố, dTDP-L-dihydrostreptose vμ N-metyl-glucozamin (hình 10.1) Từ nguồn chất glucose, cách sử dụng biến chủng vμ áp dụng chế độ công nghệ t−ơng ứng khác ng−ời ta lên men đ−ợc hμng loạt aminoglycosid khác

1.5 Qu¸ trình tách chiết sản phẩm

Cỏc khỏng sinh nhóm aminoglycosid lμ chất có tính base yếu, t−ơng đối bền với nhiệt, với pH, nhiên môi tr−ờng lên men th−ờng tồn đồng thời họ gồm nhiều kháng sinh có cấu trúc gần giống với hoạt tính kháng sinh khác Do công nghiệp ng−ời ta th−ờng lựa chọn ph−ơng pháp sắc ký nhựa trao đổi ion để tách vμ tinh chế sản phẩm Trong công đoạn tách ng−ời ta th−ờng sử dụng cationit, sau tuỳ thuộc vμo loại aminoglycosid cần tách mμ ng−ời ta chọn loại nhựa khác Các chất mang th−ờng đ−ợc lựa chọn lμ carboxymethylcellulose (CMC), CM-sepharose, sephadex, phospho-cellulose, sulfoethylcellulose… Một số cationit bán thị tr−ờng hay đ−ợc sử dụng lμ Amberlit IR-120, Amberlit IRC-50, Diaion SK-1B, Diaion PK-204, Dowex 44, Dowex 50W X2, Duolite C-3, Duolite ES-26…

2 Sinh tổng hợp Streptomycin 2.1 Đại cơng

Streptomycin đặc biệt có tác dụng trực khuẩn lao (Mycobacterium tubeculosis) vμ đ−ợc phát lần vμo tháng năm 1944 Waksman S A vμ cộng chiết đ−ợc từ môi tr−ờng nuôi cấy Streptomyces griseus Đây lμ mốc quan trọng lịch sử y học lμ chất kháng sinh có khả khống chế đ−ợc bệnh lao

Mặc dù có nh−ợc điểm lμ độc tính cao quan thính giác dùng lâu, song streptomycin lμ kháng sinh đ−ợc sử dụng để điều trị lao kết hợp với số thuốc khác có hiệu Hiện n−ớc phát triển streptomycin đ−ợc thay

một số kháng sinh bán tổng hợp khác mặt streptomycin gây tổn th−ơng cho quan thính giác, mặt khác ngμy cμng có nhiều vi khuẩn có khả kháng lại streptomycin Một số chủng xạ khuẩn đ−ợc sử dụng để sinh tổng hợp streptomycin lμ: Str reticuli, Str bikiniensis, Str raneus, Str humidus,

Str griseocarneus Tuy nhiên công nghiƯp chđ u ng−êi ta sư dơng mét sè biÕn chủng Str griseus có khả kháng actinophage cao

2.2 CÊu tróc ho¸ häc vμ tÝnh chÊt

Cơng thức hố học streptomycin đ−ợc xác định từ năm 1946 – 1948 Phân tử streptomycin bao gồm phần đ−ợc liên kết với dây nối glycosid:

1- Streptidin lµ dÉn chÊt diguanidin cđa meso - inosid

2- Streptose lµ loại đờng L có chứa nhóm aldehyd C3

3- Metyl glucosamin đờng loại L có chứa nhóm metylamin C2

Hai phần sau liên kết với dây nối glycosid tạo phân tử gồm hai loại đờng đợc gọi streptobiosamin

Streptomycin có hoạt tính phân tử cịn ngun vẹn Nếu cắt bỏ phần nμo phân tử lμm kháng sinh tác dụng Tuy nhiên khử nhóm aldehyd (bằng H2/Pd) thμnh nhóm alcol tạo dihydrostreptomycin lại có tác dụng mạnh trực khuẩn lao nên dihydrostreptomycin đ−ợc sử dụng điều trị lao Tuy nhiên sau nμy ng−ời ta nhận thấy dihydrostreptomycin độc streptomycin nh−ng lại dễ gây điếc nên không sử dụng

Streptomycin lμ bột trắng, không mùi, vị đắng, hút ẩm mạnh Dễ tan n−ớc có nhiều nhóm hydroxyl vμ amin, tan etanol, không tan ete vμ cloroform Đ−ợc sử dụng nhiều lμ dạng muối sulfat Dạng muối nμy bền khơng khí vμ ánh sáng

Streptomycin khơng hấp thu qua đ−ờng ruột nên dùng để tiêm bắp Có tác dụng diệt khuẩn cách ngăn cản trình tổng hợp protein vi

(2)

khn Phỉ kh¸ng khn cđa streptomycin gåm c¸c vi khuÈn Gram (-) hiÕu khÝ vμ mét sè vi khuẩn Gram (+), streptomycin tác dụng vi khuẩn kỵ khí

2.3 Quy trình lên men sinh tỉng hỵp

2.3.1 Chđng gièng

Trong sản xuất công nghiệp ngời ta sử dụng biÕn chñng cña Streptomyces griseus nh− ATCC11429

Xạ khuẩn S griseus lμ vi sinh vật hiếu khí mạnh nên q trình ni cấy cần lắc khuấy trộn kèm theo sục khí Nhiệt độ ni cấy thích hợp từ 26 – 28OC pH tối −u cho phát triển lμ 6,8 – 7,2 Thời gian lên men khoảng

96 – 120 giê – 144 giê 2.3.2 Điều kiện lên men

Ngun carbon: Ngun hydratcarbon Str griseus đồng hoá đ−ợc lμ tinh bột, dextrin, maltose, fructose… Chủ yếu sử dụng tinh bột vμ glucose thμnh phần cấu tạo Streptomycin có nguồn gốc từ glucose Tuy nhiên ngoμi streptomycin mơi tr−ờng lên men cịn tạo thμnh manosidostreptomycin (hay cịn gọi lμ streptomycin B) có hoạt tính kháng sinh yếu Khi mơi tr−ờng chứa q nhiều glucose tạo thμnh hỗn hợp không mong muốn loại streptomycin Nguồn carbon vừa giúp cho vi sinh vật phát triển, cung cấp l−ợng cho vi sinh vật, đồng thời tham gia trực tiếp vμo phân tử kháng sinh streptomycin

Nguồn nitơ: Nguồn nitơ vô thích hợp l muối amoni v không thích hợp víi c¸c mi nitrat

Str griseus cịn có khả sinh tr−ởng vμ tạo kháng sinh streptomycin môi tr−ờng chứa protein nh− bột đậu t−ơng, bột cá, men khơ, gluten bột mì loμi xạ khuẩn nμy có hệ protease mạnh nên có khả phân huỷ protein thμnh acid amin vμ sử dụng acid amin nμy trình trao đổi chất

Nguồn phospho: Cần phospho vơ hoμ tan có KH2PO4

giống sinh tr−ởng vμ phát triển bình th−ờng Thiếu phospho hoμ tan sinh tr−ởng khuẩn ty yếu đồng hoá carbon vμ nitơ bị chậm vμ hoạt lực kháng sinh thấp Tuy nhiên thừa phospho tăng nhanh tốc độ sử dụng hydratcarbon lμm cho trình tạo bμo tử rút ngắn, ức chế tổng hợp streptomycin

CaCO3: Trong mơi tr−ờng ni cấy cần có CaCO3 với mục đích lμm ổn

định pH

Nguồn kim loại vi l−ợng: Chủng xạ khuẩn sinh streptomycin cần số kim loại nh− Mg, Mn, Fe, Cu… vμ th−ờng đ−ợc bổ sung d−ới dạng muối sulfat Nếu mơi tr−ờng có cao ngơ, bột đậu, bột lạc… khơng cần bổ sung thân loại ngun liệu nμy sẵn có muối kim loại

Quá trình lên men kéo dμi khoảng 120 - 144 giờ, nhiệt độ thích hợp 26 - 28OC, pH mơi tr−ờng 6,8 - 7,2 Cấp khí với l−u l−ợng VVM ở pha phát triển

thứ nhất, chủng xạ khuẩn nμy sinh tr−ởng mạnh sau - Các bμo tử nảy chồi, bμo tử nảy chồi tạo thμnh hệ sợi Khuẩn ty thẳng vμ phân nhánh yếu, tế bμo chất −a kiềm B−ớc sang pha lên men thứ hai trình phát triển chậm lại hệ sợi không phát triển mμ b−ớc vμo giai đoạn tự phân ngμy thứ (khoảng 72 giờ) Chủng Str griseus nhạy cảm với phage, q trình lên men cần giữ vơ khuẩn chặt chẽ vμ cần kiểm tra độ vô trùng giờ/lần

Trong điều kiện tối −u hiệu suất sinh tổng hợp tạo streptomycin xạ khuẩn Str griseus đạt tới 20.000 – 25.000 đv/ml mơi tr−ờng

C¸c môi trờng sinh tổng hợp có thnh phần nh sau: Môi trờng giữ giống (%)

Glucose 2,0

Pepton 0,5

Cao thÞt 0,5

NaCl 0,5

Agar – agar 2,0

pH 6,8 – 7,2

Khö trïng 115OC 20

Nhiệt độ ni cấy 28OC

Thêi gian nu«i cÊy –7 ngy Môi trờng nhân giống (%) Glucose 4,0

Bét ®Ëu 3,0 (NH4)2SO4 0,6

NaCl 0,3

CaCO3 0,6

Dầu phá bọt 0,5 pH 6,8 – 7,2

Khư trïng b»ng h¬i nãng ë 120OC 60 phút Khi môi trờng hạ

nhiệt độ xuống 28 - 30OC cấy giống vμo với tỷ lệ 0,5 lít/600 lít mơi tr−ờng

Giống đ−ợc ni vịng 40 – 48 nhiệt độ 28OC Cấp khí vơ trùng với

l−u l−ợng VVM Máy khuấy với tốc độ 110 vòng/phút Phá bọt tự động dầu lạc khử trựng

Giống đợc truyền sang nồi nhân giống cấp v đợc nuôi dỡng điều kiện nh thêi gian 36 – 40 giê

M«i tr−êng lên men tạo streptomycin (%) Glucose 4,0

Bột ®Ëu 3,0 (NH4)2SO4 0,6

NaCl 0,25

CaCO3 0,6

KH2PO4 0,01 Dầu phá bọt 0,2

pH 6,8 – 7,2

Môi tr−ờng đ−ợc chuẩn bị nồi pha chế, sau bơm qua cột khử trùng liên tục 134OC Khi môi tr−ờng hạ nhiệt độ xuống 28 – 30OC truyền

gièng tõ nåi ñ sang b»ng khÝ nÐn v« trïng

Tiến hμnh lên men kháng sinh điều kiện nhiệt độ 28OC thời

gian 120 – 144 Cấp khí vơ trùng với l−u l−ợng 0,5 – 1VVM Máy khuấy với tốc độ 110 vòng/phút Phá bọt tự động dầu lạc khử trùng Cứ lấy mẫu phân tích lần để kiểm tra độ vơ trùng, có nhiễm phage hay khơng? Có cần bổ sung thμnh phần vμo mơi tr−ờng ni cấy hay khơng? Cần kiểm sốt chặt chẽ hμm l−ợng glucose mơi tr−ờng lên men để thu đ−ợc chủ yếu streptomycin A

Hiện ng−ời ta ch−a xác định đ−ợc tiền chất trình sinh tổng hợp streptomycin

2.4 Quy trình chiết xuất kháng sinh Streptomycin

Streptomycin lμ chất kháng sinh có tính base yếu nên sử dụng cacboxycationit dạng Na+ để tách chiết sản phẩm Quá trình hấp phụ

Streptomycin cationit biểu diễn phơng trình: 3R – COO–Na+ + (Str)3+ R

Dịch lên men đ−ợc xử lý tr−ớc tách chiết kháng sinh cách acid hoá dung dịch H2SO4 30% đến pH 2,5 - 3,0 Khuấy nhẹ trình kết tủa tốt Lọc lọc ép khung bản, hay lọc trống quay loại sinh khối Khuẩn ty Str griseus mảnh nên trình lọc cần cho chất trợ lọc

Khả hấp phụ streptomycin phụ thuộc vμo l−ợng tạp chất có dịch lên men, đặc biệt lμ cation Mg++, Ca++ phải loại ion

tr−ớc hấp phụ kháng sinh cách thêm oxalat natri vμo dịch lọc Khuấy 30 phút Lọc loại tủa Dịch lọc bơm vμo thiết bị chứa vμ hạ nhiệt độ đến 8°C Thêm 1% formalin để bảo quản Trung tính NaOH đến pH = 7,0 - 7,5 Dịch tinh chế lọc qua thuỷ tinh đem hấp phụ cột

Dịch lọc chứa kháng sinh cho hấp phụ cột với tốc độ 800 lít/giờ Thời gian bão hoμ cột khoảng 24 Khi nμo dịch chảy qua cịn khoảng 100 đv/ml ngừng Rửa cột n−ớc mềm để loại tạp chất hữu vμ sắc tố Hiệu suất giai đoạn hấp phụ đạt 95% Phản hấp phụ streptomycin H2SO4 5%, trình phản hấp phụ đ−ợc biểu diễn ph−ơng trình:

R3(Strep) + 3H+ 3RCOOH + (Strep)3+

Tảy màu Loại muối (cationit) Trung hoà (anionit) cô chân không

anionit 95.000UI/ml

60.000UI/ml; pH = 2,0

+ Na CO 500UI/ml, pH = 2,0

5.000UI/ml

<50UI/ml H SO 5%

cacboxycationit Loại Ca, Mg trung hoà Loại protein Lọc Làm lạnh pH 2,5 - Lọc

streptomycin

P/đoạn

P/đoạn P/đoạn

P/đoạn

tinh chế

P/đoạn phản hấp phụ

hÊp phơ

sinh khèi

DÞch läc dÞch lªn men

Phân loại dịch phản hấp phụ phân đoạn vμ có chế độ xử lý khác tuỳ theo hμm l−ợng kháng sinh phân đoạn đó:

Phân đoạn 1: Cho chảy vμo ống đến khi hoạt tính đạt 50 đv/ml Phân đoạn 2: Có hoạt tính thấp, từ 50 - 20.000 đv/ml Hoạt tính trung bình 5000đv/ml vμ có pH 3,5 Đem hấp phụ trở lại để thu hi

Phân đoạn 3: Có hoạt tính cao từ 20.000 đv/ml trở lên Trung bình l 95.000 đv/ml v pH = 6,5 Tinh chÕ tiÕp b»ng than ho¹t

Phân đoạn 4: Phần có hoạt tính cao v pH = 2,0 Hoạt tính trung bình 60.000 đv/ml đợc trung tính hoá anionit dạng OH

Phõn on 5: Hoạt tính thấp vμo khoảng 500đv/ml vμ pH = 2,0 Trung hoμ Na2CO3 hấp phụ lại để thu hồi

Phân đoạn 3, đ−ợc tẩy mμu than hoạt với l−ợng 2,5 - 3% (tính theo trọng l−ợng kháng sinh) Lọc loại than Rửa than n−ớc mềm để lấy hết kháng sinh Hiệu suất 96% (tính từ dịch đem tẩy mμu) Dịch kháng sinh tẩy mμu cho chảy qua cột trao đổi ion để loại muối Ph−ơng trình loại muối nh− sau:

R - SO3H + Na+ R – SO 3Na

+ + H+

Do xt hiƯn ion H+ nªn dung dịch kháng sinh có pH acid Dịch lại đợc

trung tÝnh ho¸ b»ng cét anionit

2R - NH4OH + SO42- (RNH

3)2SO4 + H +

Dung dịch streptomycin loại muối vμ trung tính hố đ−ợc bốc chân khơng 740 - 750 mmHg đến đậm độ 170.000 - 210.000 đv/ml, sau phun sấy để thu bột streptomycin Đóng gói điều kiện tuyệt đối vơ trùng

3 Sinh tổng hợp Gentamicin 3.1 Đại cơng

Gentamicin đ−ợc phát lần đầu vμo năm 1963 môi tr−ờng nuôi cấy chủng xạ khuẩn Micromonospora purpurea Cùng với tobramycin (1975) vμ amikacin (1976), gentamicin đ−ợc coi nh− kháng sinh hệ nhóm aminoglycosid Gentamicin đ−ợc sử dụng rộng rãi số aminoglycosid có phổ kháng khuẩn rộng vμ đặc biệt có tác dụng vi khuẩn Gram (-)

3.2 CÊu tróc ho¸ häc vμ tÝnh chÊt

ngoi phần nhá gentamicin C2a vμ gentamicin C2b C¸c chÊt nμy

đều lμ dẫn chất DOS (2-deoxystreptamin)

Gentamicin cã tác dụng vi khuẩn Gram (+) v Gram (-) Phổ diệt khuẩn chủ yếu vi khuẩn hiếu khí Gram (-) v tụ cầu khuẩn, kể chủng tạo penicillinase v kháng methicillin

Gentamicin khơng hấp thu qua đ−ờng tiêu hố, đ−ợc sử dụng dạng tiêm tĩnh mạch tiêm bắp (th−ờng bμo chế dạng dung dịch tiêm chứa 2; 10 mg/ml vμ 40; 80; 160 mg/2 ml) Gentamicin th−ờng đ−ợc dùng phối hợp với kháng sinh khác (β-lactam) với chất diệt khuẩn khác để mở rộng phổ tác dụng vμ tăng hiệu lực

B¶ng 10.3. CÊu tróc hoá học gentamicin theo Dợc điển Anh BP 2003

Tên gentamicin

Thành phần %

Công thức cấu tạo

R1 R2 R3

C1 20 - 35 C21H43N5O7 CH3 NH2CH3 H

C1a 10 - 30 C19H39N5O7 H NH2 H

C2 C20H41N5O7 CH3 NH2 H

C2a C20H41N5O7 H NH2 CH3

C2b

40 - 60

C20H41N5O7 CH3 NH2 H

3.3 Quy trình lên men sinh tỉng hỵp

3.3.1 Chđng gièng

Gentamicin mét sè chđng x¹ khn thc chi Micromonospora t¹o Trong thùc tÕ chñng M purpurea var nigrecens vμ M echinospora l chủng quan trọng đợc ứng dụng vo sản xuất công nghiệp

Micromonospora hầu nh− có khuẩn ty chất phân nhánh, khơng hình thμnh khuẩn ty khí sinh Đ−ờng kính khuẩn ty từ 0,4 – 0,8mcm Khi ch−a tạo bμo tử bề mặt khuẩn lạc có mμu vμng sáng đến mμu da cam nâu đỏ tuỳ thuộc vμo môi tr−ờng vμ điều kiện nuôi cấy

3.3.2 Quy trình lên men

Môi trờng giữ giống (%):

Pepton 0,6

Cao nÊm men 0,3

Cao thịt 0,15

Casein thuỷ phân 0,4

Glucose 1,0

(NH4)2SO4 0,35 KH2PO4 0,1 MgSO4.7H2O 0,5

Th¹ch 2%

Nớc máy vđ

pH 6,8 7,0

Nhiệt độ ni cấy 28OC

M«i tr−êng nhân giống (%): Tinh bột khoai tây 1,0 Bột đậu t−¬ng 1,0 Saccharose 1,0

CaCO3 0,4

CoCl2.6H2O 0,002 Nớc máy vđ

pH 6,8 7,0

Nhiệt độ nuôi cấy 28OC

Nhiệt độ nuôi cy 28OC

Môi trờng lên men (%): Bột ngô 2,5 Bột đậu tơng 3,0 Saccharose 1,0

CaCO3 0,4

Alpha amylase 0,001 CoCl2.6H2O 0,002 DÇu phá bọt 0,6 Nớc máy vđ

pH 6,5 6,7

Lên men tạo gentamicin đợc thực theo phơng pháp nuôi cấy chìm Quá trình ny đợc thực theo bớc bản:

Giống thạch nghiêng đợc hoạt hoá môi trờng giữ gièng ë 28OC

trong -5 ngμy cấy vμo môi tr−ờng nhân giống cấp vμ lắc 200 – 250 v/ph khoảng 48 giờ, tiếp tục nhân giống cấp với l−ợng giống cấy truyền - 4% (nếu bình nón) vμ tiếp tục nhân giống, l−ợng giống cấy vμo nồi lên men lμ 10 - 15% Quá trình lên men kéo dμi khoảng 96 – 120 giờ, nhiệt độ thích hợp 26 – 28OC, pH mơi tr−ờng 6,8 – 7,2 Cấp khí với l−u l−ợng VVM

Hiệu suất chủng lên men th−ờng không ổn định sản phẩm lμ hỗn hợp nhiều loại gentamicin, đạt tới 1500 mcg/ml cao

3.3.3 ChiÕt xuÊt vμ tinh chÕ

Dịch lên men đ−ợc acid hoá acid sulfuric 4N đến pH 2,0 – 2,5 để giải phóng kháng sinh bám vμo khuẩn ty, bổ sung chất trợ lọc, khuấy trộn lọc lọc trống hay lọc ép khung lấy dịch lọc Trung tính hoá dịch lọc dung dịch NaOH 40%, loại ion Ca++ bằngacid oxalic đến pH = – 3,5

Khuấy trộn trung tính hố lại đến pH = 7,0 – 7,5 Lọc loại tủa Dịch lọc xử lý đ−ợc chiết tách kháng sinh nhựa trao đổi ion (th−ờng sử dụng Amberlit IRC50 đ−ợc hoạt hoá dạng R-COO–Na+) Sau cột bão hoμ rửa

cột n−ớc khử ion, phản hấp phụ kháng sinh dung dịch acid sulfuric 4N Phân đoạn đậm đặc đ−ợc chỉnh pH = 4,5 trietylamin, tẩy mμu than hoạt Lọc loại than dùng methanol tủa lấy sản phẩm thô với tỷ lệ dung dịch kháng sinh: methanol lμ 1:8,5 Lọc rửa tủa thô methanol vμ aceton, sấy chân không 40OC vμ 30 – 70 mmHg Sản

phÈm thu đợc l gentamicin thô dạng muối sulfat

Q trình tinh chế gentamicin thơ đ−ợc tiến hμnh nh− sau: Hoμ gentamicin sulfat thô vμo n−ớc cất, chỉnh pH = 7,0 -7,5 Tẩy mμu than hoạt (khoảng 5%) Dịch lọc đ−ợc đem sắc ký trao đổi ion với nhựa cationit Amberlit CG50 dạng hoạt hoá NH4 Phản hấp phụ dung dịch NH4OH 0,3N Lấy phân đoạn đậm đặc Cô chân không Tảy mμu than hoạt Sau lọc loại than tủa kháng sinh methanol Rửa tủa aceton Tinh thể sấy khô chân không 40OC vμ 30 – 70 mmHg Sản phẩm thu

đ−ợc đem kiểm nghiệm v úng gúi

Tự lợng giá

1 Kể tên chủng vi sinh vật sinh kháng sinh nhóm aminoglycosid Tìm mối liên hệ cấu trúc streptomycin với thnh phần

môi trờng lên men

3 Nêu quy trình chiết xuất streptomycin từ môi tr−êng lªn men Nªu tªn chđng vi sinh vËt sinh gentamicin vμ tr×nh bμy quy tr×nh

Chơng 11

sản xuất Kháng sinh nhóm Macrolid

Mơc tiªu

Sau häc xong chơng ny sinh viên phải trình by đợc:

1. Tên chủng vi sinh vật có khả sinh kháng sinh nhóm macrolid Quy trình lên men vμ chiÕt xt erythromycin.

1 Tỉng quan vỊ Macrolid

Các Macrolid l kháng sinh có cấu trúc heterosid m phần genin l vòng lacton cã chøa nhiỊu nguyªn tư (th−êng tõ 12 – 17 nhiều hơn) v đợc chia thnh nhóm chính: nhóm kháng khuẩn v nhóm kháng nấm hay gäi lμ c¸c polyen

Nhãm macrolid kh¸ng khuÈn bao gồm macrolid có cấu trúc vòng lacton (chứa từ 12 - 17 cÊu tư – cßn gäi lμ vßng esther) cã chøa hay nhiỊu ®−êng (deoxy sugar), (th−êng lμ cladinose vμ desosamin)

O O

O O

O O

Vßng lacton 14- cÊu tư (erythromycin,

oleandomycin, clarithromycin)

Vßng lacton 15- cÊu tư (azithromycin)

Vßng lacton 16- cÊu tư (leucomycin, josamycin,

spiramycin, tylosin)

L

A B

O

Erythromycin

Oleandomycin

O

B A

L Leucomycin

Josamycin

O

B A

B

L Spiramycin

Hình 11.1 Sơ đồ cấu trúc kháng sinh nhóm macrolid

Vịng L: Vịng lacton; Vòng A: đ−ờng đơn, Vòng B: Đ−ờng chứa gốc amin; Các liên kết glycosid không

C¸c kh¸ng sinh thc nhãm macrolid thÕ hƯ II gồm số kháng sinh bán tổng hợp từ erythromycin nh azithromycin (chứa vòng lacton 15 cấu tử - đợc công bố năm 1980 với biệt dợc hÃng Pfizer 1991 l Zithromaxđ); v clarithromycin (chứa vòng lacton 14 cấu tử) Nhóm ny có phổ kháng khuẩn rộng erythromycin

Đ−ợc xếp vμo danh sách kháng sinh nhóm macrolid hệ II cịn bao gồm chất có cấu trúc vòng lacton 16 cấu tử nh− spiramycin, leucomycin, josamycin, tylosin hay tylocicin Trong tylosin chủ yếu đ−ợc sử dụng thú y

B¶ng 11.1. Một số kháng sinh nhóm macrolid

Tên Năm phát Chủng sinh KS

Nhóm kh¸ng khuÈn

Erythromycin 1952 Str erythreus

Oleandomycin 1954 Str antibioticus

Azithromycin (Zithromaxđ) 1980 Bán tổng hợp

Clarithromycin (Clacidđ) 197? Bán tổng hợp

Roxithromycin (Rulidđ) 1987 Bán tổng hợp

Spiramycin 1955 Str ambefaciens

Leucomycin 1953 Str kitasatoensis

Josamycin 1964 Streptomyces sp

Tylosin 1961 Str fradie

Terithromycin 1998 Bán tổng hợp

Nhóm kháng nấm

Nystatin 1955 Str noursei

Amphotericin B 1957 Str nodosus

Nhóm macrolid kháng nấm (cấu trúc polyen): Có tμi liệu xếp nystatin vμ amphotericin B vμo nhóm kháng sinh đại lacton (chứa 26 – 38 carbon) có tác dụng chống nấm Trong nhiều năm, amphotericin B lμ kháng sinh chống nấm toμn thân có hiệu cao có độc tính cao Nystatin th−ờng đ−ợc sử dụng để điều trị bệnh Candida albicans da, niêm mạc (miệng, đ−ờng tiêu hoá, âm đạo) vμ khơng có tác dụng nhiễm nấm toμn thân khơng hấp thu qua đ−ờng tiêu hố

O O

OH OH OH OH O

COOH OH

CH3

H3C

H3C

HO

OH

O O

CH3

OH OH NH2

Nystatin

Cơ chế tác dụng thuốc nμy lμ gắn vμo sterol (chủ yếu lμ ergosterol) mμng tế bμo nấm lμm biến đổi tính thấm mμng

2 Sinh tỉng hỵp Erythromycin 2.1 Đại cơng

Erythromycin c nhúm cỏc nh nghiên cứu hãng Lilly tách chiết từ chủng Streptomyces erythreus (sau nμy có tên lμ Saccharopolyspora erythraea) vμo năm 1949 vμ đ−a vμo sử dụng lâm sμng từ năm 1952 Đây lμ kháng sinh đ−ợc sử dụng phổ biến nhóm macrolid Erythromycin có phổ kháng khuẩn rộng, chủ yếu lμ kìm khuẩn vi khuẩn Gram (+), Gram (-) vμ vi khuẩn khác nh− Mycoplasma, Spirochetes, Chlamydia vμ

Rickettsia Tuy nhiên nồng độ cao erythromycin có tác dụng diệt khuẩn chủng nhạy cảm Cơ chế tác dụng erythromycin lμ gắn với tiểu đơn vị 50S ribosom vi khuẩn nhạy cảm vμ ức chế tổng hợp protein Thuận lợi erythromycin lμ dùng cho phụ nữ có thai vμ trẻ nhỏ; dùng tr−ờng hợp bị dị ứng với kháng sinh β-lactam vμ dùng thay penicillin dự phịng dμi hạn thấp khớp cấp tính

Erythromycin dạng base không bền, dễ bị phá huỷ dịch vị nên th−ờng đ−ợc sử dụng dạng muối để tăng sinh khả dụng Erythromycin stearat, ethylsuccinat, estolat th−ờng đ−ợc sử dụng chế phẩm dạng uống; Erythromycin gluceptat, lactobionat đ−ợc dùng ngoμi dạng mỡ tra mắt 0,5%; dung dịch 2% điều trị trứng cá

Erythromycin R1 R2

A OH OMe

B H OMe

C OH OH

Erythromycin base lμ hỗn hợp erythromycin A, B vμ C chủ yếu lμ erythromycin A Erythromycin base lμ bột tinh thể trắng ánh vμng, dễ hút ẩm, tan n−ớc (độ tan giảm nhiệt độ tăng), tan ethanol, methanol, tan acid lỗng

Chđng gièng: Streptomyces erythreus (sau nμy cã tªn lμ Saccharopolyspora erythrae

2.3 Lên men sinh tổng hợp

Saccharopolyspora erythrae lμ chủng vi sinh vật hiếu khí, nhiệt độ ni cấy thích hợp khoảng 30 – 33OC Quy trình lên men có đặc

®iĨm tơng tự nh lên men tạo kháng sinh nhóm tetracyclin Thnh phần môi trờng lên men nh sau (w/v):

Glucose 5,0 % CaCO3 0,6

Bét ®Ëu 3,0 pH 7,0

(NH4)2SO4 0,3 t0 nu«i cÊy 33OC

NaCl 0,5

Erythromycin cã thể đợc chiết khỏi dịch lên men dung môi hữu Quy trình chiết xuất tiến hnh nh sau:

40 oC Butyl acetat

Dd NaCl hay Na 2SO4

Làm lạnh pH 2,5 -

erythromycin kết tinh

cô Chiết

sinh khối dịch lªn men

läc

Dịch lên men đ−ợc lọc lọc ép khung hay lọc trống Dịch lọc đ−ợc bổ sung dung môi hữu nh− butyl acetat Khuấy trộn để tạo thμnh hỗn hợp đồng Thêm dung dịch muối vô nh− NaCl hay Na2SO4 vμ khuấy trộn kỹ Hỗn hợp phân lớp vμ kháng sinh chuyển sang pha hữu Kháng sinh đ−ợc tách khỏi dung môi hữu cách cô chân không vμ kết tinh 40OC

Tự lợng giá

Chơng 12

sản xuất kháng sinh chống ung th−

Mơc tiªu

Sau häc xong chơng ny, sinh viên phải trình by đợc:

1. Nêu đợc tên v nguồn gốc dợc phẩm đợc dùng điều trị ung th Phân loại đợc kháng sinh dùng điều trị bệnh ung th Trình by đợc quy trình lên men v chiết xuất daunorubicin.

1 Đại cơng

Cú th định nghĩa ung th− lμ tên gọi chung cho nhóm bệnh khoảng hai trăm loại khác mμ nguyên nhân chủ yếu chúng lμ phân chia khơng kiểm sốt đ−ợc tế bμo, nhanh vμ không theo quy luật trật tự Các tế bμo nμy có khả xâm lấn vμ chèn ép vμo quan vμ tổ chức xung quanh Khi ung th− chèn ép di vμo quan giữ chức sống thể nh− não, phổi, gan, thận bệnh nhân tử vong

Bệnh ung th− nguyên nhân gây Mỗi loại ung th− có nguyên nhân riêng biệt Một tác nhân sinh ung th− gây số ung th− vμ ng−ợc lại loại ung th− số tác nhân Một tác nhân gây ung th− kể đến lμ khói thuốc lá, yếu tố gây ung th− thiên nhiên tạo chế biến thực phẩm, bệnh nhiễm trùng mạn tính, số loại virus, vi khuẩn, ký sinh trùng, r−ợu… 2 Các ph−ơng pháp điều trị bệnh ung th−

Ung th− đ−ợc điều trị phẫu thuật, hố trị liệu, xạ trị liệu hay miễn dịch trị liệu Việc chọn lựa ph−ơng pháp trị liệu phụ thuộc vμo vị trí vμ độ khối u, giai đoạn bệnh nh− tình trạng bệnh nhân

Điều trị phẫu thuật: Khi khối u cịn nhỏ có khả điều trị triệt để Điều trị hoá chất (hoá trị liệu):

th−ờng độc) Có thể đ−ợc phân chia thμnh nhóm sau (vừa theo chế tác dụng, vừa theo nguồn gốc hố chất):

a Ho¸ chÊt chèng ung th−:

− Dacarbazin; busulphan; c¸c chÊt alkyl ho¸: cyclophosphamid, melphalan, iphosphamid, lomustin

− C¸c chÊt chèng chun hãa: methotrexat, mercaptopurin, cytarabin; fluorouracin (chống ung th kìm hÃm phát triĨn cđa tÕ bμo)

− Các alkaloid từ thực vật vμ sản phẩm tự nhiên khác: vinblastin, vincristin (dừa cạn); etoposid, teniposid, paclitaxel, taxoid (từ thông đỏ)

b C¸c kh¸ng sinh:

Nhãm c¸c actinomycin: dactinomycin

Các antracyclin v chất liên quan: doxorubicin (adriamycin); daunorubicin; idarubicin

Các kháng sinh độc tế bμo khác: bleomycin c Hoá chất chống ung th− khác:

Hợp chất platin hữu cơ: cisplatin, carboplatin Các methylhydrazin: procarbazin

Các chất khác: asparaginase; estramustin, tretinoin

Điều trị nội tiết: Dùng nội tiết tố kháng nội tiết tố bao gồm:

Hormon v chất liên quan nh− ethinylestradiol, megestrol, medroxyprogesteron, buserelin…

Các thuốc đối kháng hormon vμ chất liên quan: tamoxifen, formestan Điều trị miễn dịch: Mục đích kích thích miễn dịch, tăng khả đề kháng thể để diệt tế bμo ung th−, bao gồm:

− C¸c cytokin vμ c¸c chất điều ho miễn dịch

Các yếu tố kích thích tăng trởng cụm bạch cầu: filgrastim

Các interferon: tự nhiên (interferon alpha v beta) interferon alpha 2a, 2b, n1, interferon beta 1a, 1b

− C¸c interleukin: aldesleukin, interleukin

Điều trị tia xạ: Sử dụng tia phóng xạ γ để diệt tế bμo ung th− Cùng với phẫu thuật lμ ph−ơng pháp điều trị ung th− phổ biến vμ hiệu

ph−ơng pháp nμy hoá trị vμ xạ trị gây tổn th−ơng đến mơ lμnh; phẫu thuật khơng thể triệt để có di

3 C¸c kh¸ng sinh chèng ung th− nguån gèc sinh häc C¸c kh¸ng sinh cã nguồn gốc sinh học đợc sử dụng điều trị bƯnh ung th− cã thĨ chia thμnh ph©n nhãm chÝnh theo cÊu tróc ho¸ häc nh− sau:

Nhãm c¸c actinomycin Nhóm bleomycin

Nhóm chứa vòng antracyclin

Bảng 12.1. Các kháng sinh chống ung th nguồn gốc sinh học

Kháng sinh Năm phát hiện Chủng vi sinh vËt

Actinomycin F1, C… 1952 Str chrysomallus

Actinomycin D 1952 Str antibioticus

Actinomycetin 1941 Str albus

Bleomycin 1956 Str verticillus

Daunorubicin 1963 Str peuceuticus;

Str coeruleorubidus

Doxorubicin (adriamycin) 1968 Str peuceutius var caesius

Carminomycin Actinomadura carmirtana

3.1 Nhãm c¸c Actinomycin

D-e-lle

L-Thr O L Sar L-Pro

O

N

O O

CH3

CH3

O -MeVal

D-e-lle

L-Thr O L Sar

L-Pro -MeVal

Actinomycin D hay dactinomycin l chất kháng sinh có khả kìm hÃm phát triển tế bo ung th C Hackman tìm thấy vo năm 1952 đợc chiết xuất từ chủng xạ khuẩn Streptomyces antibioticus Nhóm ny cã c¸c actinomycin C, C1, K, F… nh−ng chØ cã actinomycin D đợc dùng phổ biến trị liƯu

3.2 Nhãm c¸c bleomycin

Bleomycin đ−ợc Hamao Umezawa (1914 – 1983) tìm vμo năm 1956 từ chủng xạ khuẩn Streptomyces verticillus Trong môi tr−ờng nuôi cấy chủng xạ khuẩn nμy sinh tổng hợp hỗn hợp nhiều bleomycin khác Ng−ời ta tìm bleomycin tự nhiên vμ 100 dẫn xuất bleomycin bán tổng hợp nh−ng có hỗn hợp chứa bleomycin A2 không chứa ion kim loại chiếm 55 – 70% vμ bleomycin B2 (25 – 30%) lμ dạng đ−ợc sử dụng nhiều để điều trị bệnh ung th− vẩy nến, tinh hoμn vμ ung th− bạch cầu

N S S N O R HO Me NH2 H H H

H Me HO Me

H O

N

NH H2N

O O O NH2 NH N O N O Me HN N N NH2 H O HO O OH O O OH OH O OH CONH2 OH

A2: R = -NH[CH2]3SMe2 B2: R = -NH[CH2]4NH C NH2

NH + ,xH2SO4

Hình 12.2. Cấu trúc hoá học vài bleomycin

3.3 Nhãm chøa vßng antracyclin

R1 R2

COCH3 CH3

CO CH2OH CH3

COCH3 H

Daunorubicin Adriamycin Carminomycin

O O

O

R2

OH

OH

OH

R1

CH3

OH NH2

Hình 12.3. Cấu trúc hoá học vài kháng sinh antracyclin

4 Sinh tỉng hỵp Daunorubicin 4.1 Đại cơng

Daunorubicin c tỡm ln u tiên vμo năm 1963 môi tr−ờng nuôi cấy chủng xạ khuẩn S peuceticus hay chủng S coeruleorubidus Daunorubicin vμ adriamycin lμ kháng sinh có phổ kháng khuẩn vừa phải vi khuẩn Gram d−ơng nh−ng hoạt tính yếu vi khuẩn Gram âm vμ độc Tuy nhiên chúng có khả kìm hãm phát triển tế bμo ung th− theo chế tác động trực tiếp lên cấu trúc phân tử xoắn kép lμm biến đổi cấu trúc sinh học phân tử ADN, dẫn tới kìm hãm trình chép ADN vμ trình phiên mã sang mARN Trong y học, kháng sinh nμy đ−ợc sử dụng d−ới dạng định độc lập hay phối hợp để điều trị nhiều dạng ung th− khác nhau, có hiệu lμ bệnh ung th− bạch cầu cấp tính, ung th− vú vμ ung th− phổi Tuy nhiên kháng sinh nμy có nhiều phản ứng phụ nh−: độc tính cao, kìm hãm phát triển tuỷ x−ơng, tích tụ nhiều thể gây ngộ độc tim

4.2 CÊu tróc ho¸ häc vμ tÝnh chÊt

Daunorubicin lμ mét glycosid bao gåm thnh phần: tetracyclic aglycon, daunomycinon v đờng amin lμ daunosamin

Daunorubicin hydroclorid lμ bột tinh thể mμu đỏ cam, dễ hút ẩm, tan n−ớc vμ methanol, tan ethanol, khơng tan aceton

Daunomycinon

Daunorubicin hydroclorid có dạng bột pha tiêm, cịn daunorubicin citrat có dạng vi hạt lipid dùng pha lỗng truyền tĩnh mạch Do kích ứng với mô nên daunorubicin đ−ợc dùng dạng tiêm tĩnh mạch Bảo quản tránh ánh sáng Dạng vi hạt lipid phải bảo quản - 8OC vμ trỏnh úng bng

4.3 Điều kiện lên men

Chủng xạ khuẩn sinh daunorubicin S coeruleorubidus lμ vi sinh vật hiếu khí, nhiệt độ ni cấy thích hp t 26 - 27OC

Môi trờng nhân gièng (% w/v)

Pepton 0,6

NÊm men kh« 0,3

Ca(NO3)2.H2O 4,0 Nớc máy vđ

pH 7,2

Môi trờng lên men (% w/v)

Bột đậu tơng 4,0 Dịch bà rợu 0,5

Tinh bột 4,0

Dầu đậu nnh 0,5

NaCl 1,0

Nớc máy vđ

pH 7,2

Cấp khí với lu lợng 0,5 VVM; thời gian lên men: 60 - 80 giê

Daunorubicin vμ dẫn suất khác đ−ợc hình thμnh trình lên men lμ chất độc mạnh vμ đ−ợc xem nh− tác nhân gây đột biến Vì trình tách vμ tinh chế yêu cầu độ an toμn nghiêm ngặt (th−ờng tiến hμnh dây chuyền kín)

4.4 Quy tr×nh chiÕt xuÊt

Daunorubicin lμ sản phẩm nội bμo Kết thúc lên men dịch đ−ợc acid hoá acid oxalic d− 50OC để thuỷ phân glycosid liên kết với

bằng hệ 1% NaCl methanol - n−ớc (9:1) Dịch phản hấp phụ đ−ợc đặc cịn 1/5 thể tích; chỉnh pH = 8,5 chiết cloroform (tỷ lệ khoảng nửa so với dung môi) Phân đoạn cloroform đ−ợc chân khơng xuống cịn khoảng 1/100 bổ sung vμo 10V hexan để kết tinh thu đ−ợc daunorubicin thụ

Tự lợng giá

1 Kể tên v phân loại kháng sinh chống ung th đợc sản xuất đờng sinh học

Chơng 13

sản xuất số kh¸ng sinh cã nguån gèc tõ vi khuÈn

Mục tiêu

Sau học xong chơng ny sinh viên phải trình by đợc:

1. Tên kháng sinh đợc sản xuất từ vi khuẩn công nghiệp Quy trình lên men v chiết xuÊt Polymycin

Trong danh sách kháng sinh mơ tả có đến 140 chất có nguồn gốc từ vi khuẩn, nh−ng có số chất có ứng dụng y học nh−: Polymyxin, gramicidin, bacitracin , Ngoμi cịn có nisin đ−ợc dùng chăn nuôi vμ công nghiệp thực phẩm Các chất khác khơng đ−ợc ứng dụng có độc tính cao thể Về cấu trúc hoá học, kháng sinh vi khuẩn tạo lμ polypeptid Nghiên cứu đ−ờng sinh tổng hợp kháng sinh polypeptid lμ mơ hình để tổng hợp peptid nói chung có hoạt tính sinh học lμ vấn đề có ý nghĩa lý thuyết lớn Sau giới thiệu vμi kháng sinh quan trọng vi khuẩn tạo

1 Sinh tỉng hỵp Polymyxin 1.1 Đại cơng

Polymyxin l tờn gi ca nhóm kháng sinh có cấu trúc polypeptid vi khuẩn Bacillus polymyxa vμ Bacillus circulans tạo Năm 1947, ba nhóm nhμ khoa học gồm nhóm Ainsworth, nhóm Benedict vμ nhóm Stansly phân lập đ−ợc từ chủng vi khuẩn Bacillus polymyxa hỗn hợp gồm polymyxin A, B, C, D vμ E Các nghiên cứu sau nμy cho thấy polymyxin B, D vμ E lại chia B1 - B2, D1 – D2 vμ E1 - E2 Danh sách polymyxin đ−ợc tìm thấy từ chủng vi khuẩn ngμy cμng nhiều nh− polymyxin M, polymyxin F1, F2, F3… Do độc tính cao thận nên chất lμ polymyxin B vμ polymyxin E đ−ợc dùng d−ới dạng muối sulfat để điều trị bệnh nhiễm trùng vi khuẩn Gram (-)

chất colistin A, B vμ C có hoạt tính kháng khuẩn mạnh gấp lần polymyxin mμ độc tính lại thấp Các phân tích cấu trúc hoá học sau nμy cho thấy colistin A lμ polymyxin E1

1.2 CÊu tróc ho¸ häc vμ tÝnh chÊt

Các polymyxin đ−ợc nghiên cứu kỹ, riêng polymyxin B, tổng hợp đ−ợc Về cấu tạo chúng lμ polypeptit vòng khác thμnh phần vμ số l−ợng acid amin Phân tử polymyxin M có chứa D-leucin, gốc treonin vμ gốc acid α, γ diaminobutyric (DAB) Ngoμi chứa gốc acid -6-metyloctanoic

γ Thr DAB NH2 DAB Y X D DAB DAB Z

γ NH2

Thr DAB R NH2 γ NH2 γ

Tªn R X Y Z

Polymyxin B1 (+)-6-methyloctanoyl Phe Leu DAB

Polymyxin B2 6-methylheptanoyl Phe Leu DAB

Polymyxin D1 (+)-6-methyloctanoyl Leu Thr D-Ser

Polymyxin D2 6-methylheptanoyl Leu Thr D-Ser

Thr DAB NH2 DAB Leu Leu D DAB DAB DAB

γ NH2

Thr DAB R NH2 γ NH2 γ γ Tªn R

Polymyxin E1 hay Colistin A (+)-6-methyloctanoyl

Polymyxin E2 6-methylheptanoyl

Polymyxin M

Các polymyxin có tác dụng diệt khuẩn, thuốc gắn vμo phospholipid lμm thay đổi tính thấm vμ thay đổi cấu trúc mμng tế bμo vi khuẩn Hoạt tính kháng khuẩn polymyxin B giới hạn số chủng vi khuẩn Gram (-) nh− E coli, Aerobacter aerogenes, Salmonella, Proteus… vμ đặc biệt trực khuẩn mủ xanh Ps aeruginosa Trong y học polymyxin B đ−ợc dùng chỗ, đơn độc hay phối hợp với số hợp chất khác nh− neomycin sulfat, oxytetracyclin, hydrocortison… điều trị nhiễm khuẩn mắt, tai mũi họng vμ số nhiễm khuẩn khác Polymyxin E hay colistin đ−ợc dùng y học d−ới dạng muối sulfat để điều trị chỗ nhiễm khuẩn đ−ờng tiết niệu hay đ−ờng tiêu hoá Dạng muối colistin natri mesilat đ−ợc dùng dạng tiêm để điều trị nhiễm khuẩn huyết, viêm mμng não, nhiễm khuẩn thận… vμ sử dụng không dùng đ−ợc thuốc khác độc tớnh cao

1.3 Điều kiện lên men

Để sinh tổng hợp polymyxin ngời ta nuôi cấy B polymyxa môi trờng thạch có thnh phần (%):

Cao ng« 0,5 Cao nÊm men 0,5 Glucose 2,0

Agar 2,0

pH 6,8 ÷ 7,2

Khư trïng 110°C/20 Nu«i ë 28°C thêi gian 24 giê Môi trờng nhân giống gồm (%):

Cao ngô 1,0 Bột đậu tơng 1,0

Glucose 2,0

Sulfat amoni 0,3 pH 6,8 ÷ 7,2

Khư trïng 115°C/20 CÊy gièng vμo vμ nu«i 18- 20 giê/28°C M«i trờng lên men tạo kháng sinh có thnh phần (%):

Cao ngô 1,0 Bột đậu tơng 2,0 Glucose 3,0

vμ mét sè muèi: MgSO4 7H2O; KH2PO4; NaCl

1.4 ChiÕt xuÊt polymyxin tõ m«i tr−êng lªn men

Trong cơng nghiệp để chiết polymyxin sử dụng ph−ơng pháp trao đổi ion Bản chất hoá học kháng sinh lμ polypeptid Các acid amin phân tử polymyxin có chứa nhóm amin tự do, có khả trao đổi với nhóm carboxyl phân tử nhựa loại carboxycationit Nh− KB-2, KB-HP-2, Amberlit, IRC-50 Q trình chiết tiến hμnh nh− sau:

Dịch lên men xong đ−ợc acid hoá đến pH 3,5 ữ 4,0 để giải phóng kháng sinh (có thể sử dụng acid oxalic để loại ion calci) Lọc loại sinh khối Dịch lọc trung hoμ NaOH Có thể chiết polymyxin từ dịch lọc nμy dung mơi hữu n-butanol Sau kết tủa aceton

Dịch lọc trung hoμ đ−ợc lọc qua thuỷ tinh đến suốt bơm qua cột trao đổi ion dạng Na+(R-COO-Na+) Cột bão hoμ kháng sinh rửa

bằng n−ớc cất hay n−ớc kh khoỏng

Phản hấp phụ kháng sinh acid hydrocloric hay sulfuric 10% Dịch phản hấp phụ tẩy mu than hoạt, lọc loại than Dịch lọc đem loại cation kim loại sulfocationit ví dụ: KU-2-20 hay SBS - Trung ho dịch cách cho chảy qua cét anionit d¹ng OH–

Dịch kháng sinh trung hoμ đ−ợc bốc chân không nhiệt độ ≤ 35°C, áp suất 10 – 15 mmHg Sau phun sấy để thu lấy kháng sinh

2 Sinh tổng hợp Bacitracin 2.1 Đại cơng

Bacitracin lμ kháng sinh polypeptid chủng vi khuẩn B licheniformis tạo (Johnson, Anker et al 1945) Sau Newton (1949) vμ

Abraham (1950) chiết đ−ợc từ môi tr−ờng nuôi cấy B subtilis hỗn hợp kháng sinh gọi lμ eifaivin Eifaivin có chất polypetid giống với bacitracin Thực tế công nghiệp để sản xuất bacitracin sử dụng B licheniformis 2.2 Cấu trúc hoá học

Bằng ph−ơng pháp sắc ký ng−ời ta xác định bacitracin lμ hỗn hợp gồm 10 kháng sinh khác Đólμ bacitracin A, A1, B, C, D, E, F1, F2, F3, vμ G bacitracin A chiếm khoảng 37% Độc tính kháng sinh khác Bacitracin C độc bacitracin A vμ B, bacitracin F độc

Newton vμAbraham (l953) xác định đ−ợc cấu trúc phân tử bacitracin

H×nh 13.2 CÊu tróc hãa häc cđa ph©n tư bacitracin A

Chế phẩm bacitracin chứa chủ yếu bacitracin A lμ bột trắng xám, vị đắng gắt, tan n−ớc vμ ethanol Không tan ether, chloroform, aceton Bền dung dịch acid, khơng bền dung dịch kiềm Hoạt tính kháng sinh thấp dần từ bacitracin A đến bacitracin F

Bảng 13.1 Hoạt tính kháng sinh bacitracin

Bacitracin Hoạt lực t−ơng t−ơng đối bacitracin

Corynebacterium xerosis

A

B 0,075

C 0,500

D 0,014

E 0,008

F1 0,055

F2 0,028

F3 0,014

G 0,140

Bacitracin có tác dụng kìm khuẩn hay diệt khuẩn nhờ khả ức chế tổng hợp vỏ tế bμo vi khuẩn Nó có hoạt tính cao vi khuẩn Gram (+) hoạt phổ giống với penicillin, tác dụng vi khuẩn Gram (-) Tr−ớc bacitracin đ−ợc dùng để tiêm nh−ng độc tính cao thận nên dùng chỗ để điều trị vết th−ơng ngoμi da, số bệnh mắt Th−ờng đ−ợc sử dụng d−ới dạng phức hợp bacitracin kẽm hay d−ới dạng hỗn hợp với neomycin polymyxin B

2.3 Điều kiện lên men

2.3.1 Chñng gièng

B licheniformis lμ trực khuẩn có bμo tử, sống hiếu khí, nhiệt độ ni cấy thích hợp lμ 37OC Trong cơng nghiệp để sản xuất

bacitracin sử dụng chủng có số hiệu ATCC 9945, 10716, 11945, 11946 vμ 14580 2.3.2 Môi tr−ờng dinh d−ỡng

Tỷ lệ hydrat carbon vμ nitơ quan trọng thμnh phần môi tr−ờng nuôi cấy B licheniformis để sinh tổng bợp bacitracin Nếu tỉ lệ nμy thích hợp tạo bacitracin vμ tỉ lệ khơng thích hợp tạo licheniformin có hoạt tính kháng khuẩn rt thp

Môi trờng thạch nghiêng giữ giống (w/v):

Trypton 5,0

D-glucose 1,0

DÞch chiÕt nÊm men 2,5

Agar 15,0

Môi trờng nhân giống (w/v):

Pepton 10,0

Glucose 5,0

Cao thÞt 5,0

NaCl 2,5

MnCl2 0,167

pH 7,0

Môi trờng lên men (w/v):

Citric acid 1,0

Glucose 0,5

KH2PO4 0,5

K2HPO4 0,5

MgSO4 7H2O 0,2 MnSO4 4H2O 0,01

H×nh 13.2 Trùc khuÈn

FeSO4 7H2O 0,01

Dầu phá bọt theo nhu cầu

pH 7,0

TiÕn hμnh lªn men ë 37OC B licheniformis lμ chđng hiếu khí nên cần

cp khớ mnh vi l−u l−ợng 1VVM (nhất lμ đầu) Máy khuấy tốc độ 110 vòng/phút Phá bọt dầu cọ dầu lạc Thời gian lên men khoảng 45-50

Bacitracin đ−ợc chiết xuất dung mơi hữu (n-butanol hay ethanol) theo quy trình sau: Dịch lên men đ−ợc ly tâm để loại n−ớc, acid hoá sinh khối để chiết kháng sinh khỏi tế bμo vi khuẩn Lọc loại tế bμo Dịch lọc đem chiết kháng sinh ethanol n-butanol Cô kết tinh lấy tinh thể bacitracin

Dạng muối kẽm bacitracin bền vững nên ng−ời ta tạo muối từ chiết kháng sinh khỏi môi tr−ờng lên men Ph−ơng pháp nμy hay áp dụng để lấy sản phẩm dùng chăn nuôi Kết thúc lên men thêm dung dịch ZnSO4 0,01% để tạo phức kẽm – bacitracin bền vững Dịch thu đ−ợc đ−ợc cô chân không nhiệt độ ≤ 40OC đến hμm l−ợng chất đặc lμ 40%, sau

phun sấy thu đ−ợc bột bacitracin thô dùng chăn nuôi Bảo quản chỗ khô mát, nhiệt độ ≤ 25OC

bacitracin

pH = 2,5 - 3,0

ly t©m

acid hóa

dịch lên men

Chiết

ethanol

kết tinh cô sinh khối

Sản phẩm thô cho chăn nuôi

sấy phun cô tạo phøc

(a) (b)

ZnSO4

< 40oC

hàm l−ợng chất đặc 40%

Tự lợng giá

1 Tìm mối liên hệ chung cấu trúc polymycin v bacitracin Nêu tên chủng vi sinh vật sinh tổng hợp polymycin v điều kiện

lên men tạo kháng sinh

Tμi liƯu tham kh¶o

1 KiỊu Hữu ảnh - Giáo trình vi sinh vật học công nghiÖp NXB Khoa häc vμ Kü thuËt 1999

2 Bộ môn Công nghiệp Dợc Kỹ thuật sản xuất dợc phẩm, tập 1 Trờng Đại học Dợc H nội 2001

3 Từ Minh Koóng - Cơ sở công nghệ sinh học v sản xuất dợc phẩm. NXB Y học 2004

4 Nguyễn Văn Cách Công nghệ lên men chất kháng sinh. NXB Khoa học v Kü thuËt 2004

5 Edward Alcamo - Fundamentals of microbiology (Third Edition) The Benjamin/Cummings Publishing Company Inc., 1991

6 K.P Gaponov - Process and equipments of microbiology’s production Light and food industry Moskva 1981 (b¶n tiÕng Nga)

7 John E S Biotechnology Third edition Cambridge University Press; 1996

8 Lantini D., Parenti F - Antibiotics Springer-Verlag New York Inc 1982 (b¶n tiÕng Nga)

9 Thomas D B., Michael T M., John M M., Jack P – Biology of Microorganisms. Seventh edition Prencice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey 07632