SKKN: Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp

Tham khảo bài SKKN ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp đề tài này sẽ trở thành nguồn tư liệu phong phú giúp cho mỗi giáo viên và học sinh có cái nhìn toàn diện và sâu sắc về tầm quan trọng của ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp.

… Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật nụng nghiệp” … SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HƯNG YÊN TRƯỜNG THPT TIÊN LỮ SÁNG KIẾN KINH NGHIỆM Năm học: 2012 – 2013 Mụn: Sinh học Đề tài: “ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT TRONG NÔNG NGHIỆP” Người thực hiện: ĐỖ NGỌC THÁI Tiên Lữ, tháng năm 2013 PHẦN A: ĐẶT VẤN ĐỀ I LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI Thế kỉ XXI kỉ công nghệ sinh học, trở thành ngành khoa học mũi nhọn then chốt nhiều nước Sự phát triển công nghệ sinh học tiêu chí -GV: Đỗ Ngọc Thái -1Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật nụng nghiệp” … hàng đầu để đánh giá trình độ phát triển nước Chính vậy, nước tập trung ngân sách nhân lực cho phát triển ngành công nghệ sinh học (biotechnology) Với tầm quan trọng nên tất Trường Đại học: Nông nghiệp, Lâm nghiệp, Thủy Sản, Y học Sự phạm có mơn hay khoa cơng nghệ sinh học Trong chương trình mơn Sinh học Cơng nghệ Trung học phổ thơng có khoảng từ -10 học có liên quan đến cơng nghệ sinh học Trong đề thi tuyển sinh đại học có khoảng câu hỏi trắc nghiệm có liên quan đến cơng nghệ sinh học Điều địi hỏi đồng chí giáo viên em học sinh phải có hiểu biết sâu sắc tồn diện công nghệ sinh học Tuy nhiên, nội dung nên đồng chí giáo viên em học nhiều bỡ ngỡ Xuất phát từ lí trên, nên tiến hành nghiên cứu viết sáng kiến kinh nghiệm, mạnh dạn chọn đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật nơng nghiệp” II MỤC ĐÍCH VÀ U CẦU CỦA ĐỀ TÀI 1- Mục đích : Xây dựng hồn thiện chuyên đề “ Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật nông nghiệp” trở thành nguồn tư liệu quý cho giáo viên học sinh 2- Yêu cầu : Trình bày ứng dụng cơng nghệ sinh học thực vật lĩnh vực sau: - Vi nhân giống nuôi cấy mô thực vật - Tạo đơn bội nuôi cấy hạt phấn - Chọn dòng tế bào thực vật - Lai tế bào thực vật - Chuyển gen thực vật - Thành tựu công nghệ sinh học thực vật Việt Nam III Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Sự hoàn thiện đề tài trở thành nguồn tư liệu phong phú giúp cho giáo viên học sinh có nhìn tồn diện sâu sắc tầm quan trọng ứng dụng công nghệ sinh học thực vật nông nghiệp Từ nhận thức đến hành động, biến giáo viên học sinh trở thành kĩ thuật viên, tuyên truyền viên tích cực, cổ vũ cho phát triển ngành công nghệ sinh học nước nhà -GV: Đỗ Ngọc Thái -2Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật nụng nghiệp” … Ngoài ra, đề tài giúp giáo viên học sinh dạy - học tốt mơn Sinh học nói chung chun đề ứng dụng cơng nghệ sinh học nói riêng Qua nâng cao tỉ lệ thi đỗ vào chuyên ngành khối B trường Đại học, Cao đẳng Trung cấp chuyên nghiệp IV ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu: Thực vật Phạm vi nghiên cứu: Công nghệ sinh học môn khoa học đa ngành đa lĩnh vực Tuy nhiên, với đề tài tập trung nghiên cứu ứng dụng lĩnh vực: nuôi cấy mô, tạo đơn bội ni cấy hạt phấn, chọn dịng tế bào, lai tế bào kĩ thuật chuyển gen thực vật Vì kiến thức có liên quan trực tiếp đến vần đề dạy - học ôn thi đại học cao đẳng học sinh Trung học phổ thông V PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương pháp nghiên cứu tài liệu lấy từ nguồn thơng tin giáo trình đại học cao học, chuyên đề chuyên sâu dành cho bồi dưỡng giáo viên trường chuyên, internet, Rồi tiến hành tổng hợp, so sánh, đối chiếu tài liệu để thực đề tài Phương pháp trao đổi kinh nghiệm, học hỏi đồng nghiệp chuyên gia Phương pháp tham gia hội thảo chuyên đề “ Công nghệ sinh học” Phương pháp tham quan sở Công nghệ sinh học : Viện rau trung ương, Viện công nghệ sinh học, Khoa công nghệ sinh học, Đặc biệt trực tiếp làm thí nghiệm: thời gian học cao học, trực tiếp tham gia đề tài cấp nhà nước “Chuyển gen sinh auxin gen mẫn cảm auxin hoạt động đặc thụ bầu nhụy vào cam Vinh quýt Đường canh“ Phương pháp đánh giá qua thực tiễn sư phạm PHẦN B NỘI DUNG NGHIÊN CỨU I VI NHÂN GIỐNG BẰNG NI CẤY MƠ THỰC VẬT Vi nhân giống ni cấy mơ hay cịn gọi vi nhân giống in vitro Quá trình nhân giống phải trải qua nhiều công đoạn: Chọn nguyên liệu ban đầu cho vi nhân giống quan trọng, khơng định thành cơng ban đầu mà q trình nhân Các cơng trình D.Amato (1977) cho thấy có đỉnh sinh trưởng chồi bảo đảm ổn định di truyền Tiếp đến đỉnh -GV: Đỗ Ngọc Thái -3Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật nụng nghiệp” … mô phân sinh với kích thước nhỏ, kết hợp với xử lý nhiệt để làm bệnh nguyên liệu tốt để nhân Các chồi nhân ban đầu thường tạo từ đỉnh chồi đỉnh mô phân sinh môi trường thạch chứa muối khoáng, cabonhydrat, vitamin chất điều hòa sinh trưởng (xitokinin auxin) Vi nhân giống bắt đầu tách đỉnh chồi mô phân sinh từ định nhân sau khử trùng đưa vào nuôi cấy môi trường phù hợp có xitokinin Sự phát triển nhanh mơ ni cấy phụ thuộc vào ánh sáng nhiệt độ Chồi nhân lên sau đến tuần Các chồi hình thành lại tách chuyển sang mơi trường qui trình lặp lại Để tạo rễ chồi nhân phải chuyển sang mơi trường có auxin Đây phương pháp nhân cho hệ số nhân thấp phương pháp nhân qua giai đoạn mô sẹo phôi, chồi nhân giữ lại đặc điểm phơi gốc, khơng bị thay đổi mặt di truyền Hiện nhờ phát triển môi trường hệ thống nhân phù hợp, hệ số nhân tăng lên nhiều (58 – 15 chồi/tháng) Đặc biệt nhân chồi môi trường lỏng có lắc nhân reactor Trong số trường hợp, vi nhân giống thực thông qua việc tạo phôi tái sinh thẳng từ mô sẹo Phương pháp cho hệ số nhân cao hơn, thường kéo theo biến dị sôma nên trước chuyển sang giai đoạn nhân đại trà cần kiểm tra kỹ thay đổi di truyền Vi nhân giống có ưu việt sau: - Hệ số nhân cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất - Nhân số lượng lớn diện tích nhỏ Trong m2 để tới 18.000 - Cây làm bệnh không tiếp xúc với nguồn bệnh bảo đảm giống bệnh - Thuận tiện hạ giá thành vận chuyển (một thùng 40.000 dâu tây nặng 15kg) Việc bảo quản giống thuận lợi Các giống giữ nhiệt độ 4oC hàng tháng cho tỉ lệ sống đến 95% Nhu cầu giống nhân in vitro ngày nhiều Mấy năm gần đây, hàng năm giới sản xuất khoảng 50 triệu cây, ước tính phải đạt 250 triệu cây/năm đáp ứng yêu cầu thực tiễn Một vấn đề giá trồng nhân phương pháp vi nhân cịn cao (300 8000 đ/cây) cần phải cải tiến qui trình nhân để làm hạ giá thành, đặc biệt giới hóa khâu nhân nhân giống thật q có giá trị kinh tế cao Trên thực tế nhân phương pháp vi nhân đắt giống từ hạt -GV: Đỗ Ngọc Thái -4Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật nụng nghiệp” … Hiện nhân giống thành công nhiều giống lan, hoa cúc, hoa hồng, cẩm chướng, dứa, mía, dâu tây, chuối, cam, qt, thơng Vi nhân giống việc ứng dụng để nhân nhanh số giống cây, cịn rút ngắn thời gian đưa lai loài nguyên chủng tự nhiên có đặc điểm tốt vào sản xuất nhân nhanh bố mẹ cặp lai sảnh xuất hạt lai II TẠO CÂY ĐƠN BỘI BẰNG NI CẤY HẠT PHẤN Có nhiều phương pháp tạo đơn bội, từ năm 60, việc tạo đơn bội nuôi cấy bao phấn hạt phấn phát triển Cây đơn bội nhận nuôi cấy bao phấn hạt phấn môi trường thạch (Keller & cs, 1975; Wenzell & cs, 1977) môi trường lỏng (Wernicke & cs, 1976) Trong trình ni cấy, hạt phấn phân chia, tạo mơ sẹo phơi tạo 2.1 Các yếu tố ảnh hưởng lên hình thành phơi mô sẹo 2.1.1 Các yếu tố liên quan đến nguyên liệu nuôi cấy Trạng thái sinh lý cho bao phấn hay hạt phấn ảnh hưởng lớn đến hạt phấn nuôi cấy in vitro Tuổi cây, thay đổi chu kỳ quang nhiệt độ yếu tố ảnh hưởng đáng kể đến nuôi cấy tạo đơn bội Kết nghiên cứu Dunwell (1976) cho thấy tỉ lệ phôi cao nhận sử dụng nụ hoa hình thành sớm phát triển nhiệt độ thấp ngắn ngày với cường độ chiếu sáng cao cho tỉ lệ tạo phôi từ hạt phấn cao Ở số loại hạt phấn giai đoạn nhân sớm cho tỉ lệ tạo phôi mô cao, số giống khác hạt phấn giai đoạn mitos đầu cho hiệu tốt Vấn đề kiểu gen quan trọng, Jacobsen (1978) bao phấn khoai tây nhị bội tạo từ đơn bội sử dụng để ni bao phấn có hiệu so với bao phấn từ bố mẹ Ngồi ra, xử lí bao phấn nhiệt độ thấp (3 - 10oC) gia tăng tỉ lệ tạo mô phôi từ hạt phấn (Wenzel & cs, 1977) 2.1.2.Các yếu tố liên quan đến điều kiện nuôi cấy in vitro Thành phần cacbonhydrat môi trường quan trọng, đặc biệt đường sucrose nuôi cấy bao phấn thuốc cần từ 2% - 4% Đối với khoai tây lúa cần đến 6%, chí 12% Trong chất hữu cơ, axit glutamic có tác dụng kích thích phát triển phôi số giống cải thuốc lá, serin đặc biệt cần cho phát triển phôi từ hạt phấn thuốc Các dịch chiết tự nhiên dịch chiết khoai tây, dịch chiết nấm số chất khác vitamin C, nước dừa có tác dụng tích cực cho tạo phơi, mơ sẹo tái sinh nuôi cấy bao phấn -GV: Đỗ Ngọc Thái -5Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật nụng nghiệp” … Auxin đặc biệt quan trọng cho tạo mô sẹo lại ức chế tạo phôi Vì trường hợp tạo phơi cần tránh sử dụng auxin Nói chung auxin thường có tác dụng giai đoạn ni cấy ban đầu Xytokinin quan trọng cho phản ứng hạt phấn nuôi cấy Trong số trường hợp etylen kích thích tạo mơ sẹo Wilson & cs (1978) cho biết nuôi cấy bao phấn môi trường lỏng làm tăng tần số tạo phôi thuốc lúa mạch Bổ sung vào mơi trường than hoạt tính có tác dụng loại bỏ chất ức chế làm tăng hiệu nuôi cấy bao phấn Đối với nuôi cấy hạt phấn, mật độ hạt thích hợp làm tăng hiệu ni cấy Đối với thuốc mật độ tối ưu 105 hạt/ml môi trường Đối với khác mật độ dao động từ 10 10 Ánh sáng nuôi cấy bao phấn lúa cần đến 3200 lux, thuốc cần 300500 lux Nhiệt độ bình thường từ 25-28oC thích hợp ni cấy bao phấn hạt phấn hầu hết giống 2.2 Tái sinh Việc tái sinh từ bao phấn thuốc số họ cà khác tương đối dễ, chí tái sinh môi trường tạo mô sẹo tạo phơi Đối với số lồi khác, mầm (lúa, ngơ, mì), mơi trường nuôi cấy ban đầu chứa chất sinh trưởng đường cao tái sinh cây, muốn tái sinh phải chuyển sang mơi trường khơng có chất điều hòa sinh trưởng Một số trường hợp phải dùng zeatin nước dừa tái sinh Trong trường hợp tạo qua mô sẹo, việc tái sinh xảy mơi trường khơng có chất điều hịa sinh trưởng, thường phải chuyển sang mơi trường có nồng độ auxin thấp nồng độ cytokinin Các cytokinin thường hay dùng BAP kinetin Cho thêm chất casein, lactoabumin thủy phân nước dừa thường làm gia tăng tỉ lệ tái sinh ngũ cốc Mô già lâu không cấy chuyển mô qua cấy chuyển nhiều lần thường cho tỉ lệ tái sinh thấp khả tái sinh Khi ni cấy bao phấn, ngũ cốc thường có tượng tái sinh nhiều bạch tạng (có đến 50%) Wang cs (1977) thấy tăng nhiệt độ nồng độ 2,4D nguyên nhân dẫn đến tỉ lệ bạch tạng cao Ngoài ra, bạch tạng xuất nhiều từ bao phấn chứa nhiều vi nhân (Teng Li-Ping, 1978) -GV: Đỗ Ngọc Thái -6Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật nụng nghiệp” … Phần lớn tái sinh từ hạt phấn đơn bội, số lồi có nhị bội đa bội Những kết nghiên cứu tế bào học cho thấy tạo thành nhị bội đa bội kết dung hợp nhân nhân di truyền mà khơng có phân chia nhân xảy q trình ni cấy 2.3 Ứng dụng đơn bội từ hạt phấn Các đơn bội từ hạt phấn có ý nghĩa thực tiễn lớn, trước hết làm nguyên liệu để tạo dòng Muốn tạo dịng phải lưỡng bội hóa đơn bội xử lí consixin thơng qua tạo mơ sẹo từ đơn bội sau tái sinh Như nói trên, số loại nhận nhị bội q trình ni cấy bao phấn hạt phấn, trường hợp cần kiểm tra sinh hóa tế bào học kỹ lưỡng Các dịng có ý nghĩa lớn cải biến trồng Chúng sử dụng tạo lai khỏe mạnh từ cặp lai bố mẹ bất tương hợp ( Chu & cs, 1978) rút ngắn thời gian tạo hạt lai Các dòng đơn bội kép tạo ứng dụng sản xuất lúa mạch, thuốc lá, cải dầu, lúa Trong thời gian ngắn khoảng đến năm hai giống thuốc cho suất cao chất lượng tuyệt hảo tạo phương pháp cấy bao phấn (Hu han & cs, 1978) Nhiều giống lúa Huayu1, Huayu2, Tanfong1 (Yin & cs, 1976), giống lúa mì Huapei1, Lunghua1 (Tsun, 1978) tạo phương pháp nuôi cấy hạt phấn Ngồi dịng đơn bội kép cịn sử dụng để phát triển quần thể cho việc lập đồ phân tử Trong nghiên cứu, đơn bội đối tượng tốt để nghiên cứu kết hợp đôi cặp NST, ngồi phân tích di truyền quần thể đơn bội để xác định kiểu di truyền tính trạng lặn Các đơn bội cịn dùng làm nguyên liệu tạo đa bội lệch Cây đơn bội dùng lai khác loài để rút ngắn thời gian ổn định NST Nuôi cấy bao phấn ứng dụng để nghiên cứu tạo đột biến Sơ đồ ứng dụng nuôi cấy bao phấn Bao phấn Giống hạt phấn Nuôi cấy bao phấn Cây đơn bội Lưỡng bội hóa -GV: Đỗ Ngọc Thái -7Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật nụng nghiệp” … Cây lưỡng bội Dịng Dịng siêu chủng III CHỌN DỊNG TẾ BÀO THỰC VẬT (CDTBTV) 3.1.Cơ sở khoa học Cơ sở khoa học CDTBTV tế bào thực vật mang tính tồn Mỗi lồi thực vật có khả tái sinh khác Cơ sở thứ hai mô quần thể tế bào nuôi cấy bao gồm số lượng lớn tế bào không đồng Vì quần thể tế bào ni cấy xem quần thể thực vật diễn thay đổi kiểu gen, kiểu hình tuổi Khi tế bào tái sinh thành thể thay đổi mức độ thể, chí có quần thể tế bào phát triển từ tế bào ban đầu suốt trình sinh trưởng phát triển tế bào đến hình thành thể hồn chỉnh diễn nhiều thay đổi di truyền ảnh hưởng yếu tố môi trường ni cấy, đặc biệt chất điều hịa sinh trưởng Mặt khác, có quần thể tế bào đồng mặt sinh lý, di truyền phát triển, quần thể tế bào đối tượng lí tưởng việc sử dụng chất gây đột biến để thu nhận đột biến có ý nghĩa Cũng trồng, nuôi cấy mô tế bào, quan sát thấy hai loại thay đổi kiểu hình Một loại kết thay đổi gen, gọi thay đổi di truyền, cịn loại khơng liên quan đến thay đổi gen, gọi biến đổi gen Những thay đổi ngồi gen khơng di truyền Ngồi vấn đề vừa nêu, nuôi cấy mô tế bào gặp tượng phổ biến là: phần đáng kể mô tái sinh từ cụm tế bào chí từ tế bào thay đổi số đặc điểm mà không cần áp dụng phương pháp chọn lọc Hiện tượng gọi tượng phân dịng sơma Có tác giả gọi dịng tái sinh từ tế bào ni cấy “calliclones” (Skirvin & cs, 1976), tác giả khác gọi dòng tái sinh từ protoplast “protoclones” (Sheppard & cs, 1980) Larkin va Scowcroft (1981) đưa định nghĩa có tính chất khái qt “somaclonal variation’ để tất thay đổi tái sinh từ loại tế bào nuôi cấy 3.2 Vật liệu phương pháp chọn dòng Chọn vật liệu cho thí nghiệm CDTBTV quan trọng Các vật liệu tế bào mơ phân hóa Mỗi loại vật liệu có ưu điểm nhược điểm riêng Việc chọn vật liệu hay vật liệu khác phụ thuộc vào phục phương pháp nuôi cấy loại -GV: Đỗ Ngọc Thái -8Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật nụng nghiệp” … Vật liệu thường dùng CDTBTV mô sẹo (callus) Mô sẹo dùng để chọn dòng chống chịu chịu bệnh (Chawla & Wenzel, 1987), chịu muối (McHughen, 1987; Kavi Kishor, 1988), chọn dòng cho suất chất thứ cấp cao (Nozue cs, 1987; Hiraoka, 1986) Đối với mô sẹo sử dụng phương pháp chọn lọc trực tiếp tức chọn môi trường chọn lọc chứa nồng độ định chất chọn lọc, mơ tế bào đột biến có tính chọn lọc hẳn so với quần thể, Một số tác giả khác lại sử dụng phương pháp chọn lọc bước tức mơ tế bào sống sót nồng độ định tác nhân chọn lọc lại chuyển sang nồng độ cao Ngồi sử dụng kết hợp hai phương pháp Sự ổn định mô chọn lọc khả phát triển bình thường liên tục mơi trường chọn lọc chuyển môi trường chọn lọc sau thời gian dài cấy môi trường không chọn lọc đặc điểm chọn lọc Sử dụng mô sẹo làm nguyên liệu CDTBTV có ưu điểm đơn giản nguyên liệu có số nhược điểm là: dễ tạo dạng khảm mơ chọn lọc cịn có nhiều tế bào bình thường nên tái sinh cây, quần thể tái sinh có mang đặc điểm chọn lọc mang đặc điểm giống bố mẹ, chí có phần chứa tế bào chọn lọc, phần khác chứa tế bào bình thường Để khắc phục nhược điểm giảm kích thước mô: mô nhỏ tốt Trọng lượng mô thường dùng 100150 mg, giảm xuống đến 10-20 mg (Wakaha & Widholin, 1987) Tế bào nuôi cấy dịch lỏng nhiều tác giả sử dụng CDTBTV (Kishinami & Widholin, 1986; Watad cs, 1985) Đối với loại tế bào phương pháp chọn lọc trực tiếp chọn bước tiến hành có kết nhiều đối tượng Sử dụng tế bào dịch lỏng để CDTBTV có ưu điểm tế bào cụm nhỏ tế bào tiếp xúc đồng với tác nhân chọn lọc, nhược điểm quan trọng sau chọn lọc khả tái sinh bị giảm đáng kể nhiều trường hợp hẳn Hầu hết dịng chọn lọc thông qua hệ thống tế bào dịch lỏng khơng nhận đuợc (Dix, 1990) Vì hệ thống tế bào dịch lỏng sử dụng để chọn dịng có khả tổng hợp tích lũy chất thứ cấp phù hợp Trong trường hợp tế bào dịch lỏng đáp ứng mục đích ni cấy tế bào qui mơ lớn đặc biệt việc sử dụng công nghệ nuôi tế bào thực vật qui mô công nghiệp Protoplast (tế bào trần) thực vật nguyên liệu đáp ứng nhiều mặt CDTBTV Protoplast hệ thống tế bào đơn triệt để Từng tế bào phát triển đồng môi trường, tế bào phân chia tạo quần thể tế bào mô sẹo, cuối mô sẹo tái sinh thành hồn chỉnh, tránh tượng khảm Nhiều dòng tế bào kháng thuốc (Cseplo & cs, 1985; Blonstein & cs, 1988; Hamill & cs, 1986) dòng cho -GV: Đỗ Ngọc Thái -9Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật nụng nghiệp” … suất chất thứ cấp cao (Fujita & cs, 1985) chọn lọc nhờ sử dụng hệ thống protoplast Trước việc ni cấy tái sinh từ protoplast cịn gặp nhiều khó khăn, tái sinh từ protoplast lồi có ý nghĩa kinh tế, nên việc sử dụng hệ thống nuôi cấy protoplat CDTBTV cịn bị hạn chế Hiện hệ thống ni cấy protoplast với hiệu cao nhiều loài có trồng quan trọng khoai tây, cà chua, ngơ, lúa, lúa mì cơng bố Vì protoplast trở thành vật liệu lý tưởng cho CDTBTV Cần phải nói thêm protoplast đối tượng quan trọng cải biến di truyền thực vật thông qua hệt thống nuôi cấy in vitro đặc biệt dung hợp tế bào chuyển gen Để tránh khó khăn tái sinh từ mô sẹo, tế bào nuôi cấy dịch lỏng protoplast, số tác giả sử dụng mô phân hóa mơ tách rời làm ngun liệu CDTBTV Một mơ phân hóa sử dụng phôi từ hạt (Kueh & Bright, 1981) phôi phát triển từ tế bào nuôi cấy (Chandler & Vasil, 1984) Fluhr & cs (1985) chọn dòng kháng thuốc xử lí mầm kháng sinh McCabe & cs (1989) nhận dịng kháng thuốc xử lí mảnh Bên cạnh việc sử dụng phương pháp chọn lọc in vitro mô sẹo, tế bào dịch lỏng, prptoplast mơ phân hóa kết hợp xử lí tác nhân gây đột biến để làm tăng dần số đột biến kiểu đột biến Miller & cs (1985) xử lí protoplast sau tách tia cực tím (UV) N -methyl-N-Nitro- N-Nitrosoguanidine (MNNG) Phương pháp tương tự số tác giả khác tiến hành có hiệu sử dụng N -ethyl-N-Nitrosourea (Cseplo & cs, 1985), MNNG, UV, tia X (Maliga & cs, 1981) Ngồi xử lí mẫu vật chất gây đột biến trước đưa vào nuôi cấy chọn lọc 3.3 Chọn dịng chịu bệnh Mặc dù phương pháp truyền thống tạo dòng giống chịu bệnh vài trường hợp chọn dòng chịu bệnh phương pháp chọn tốn nhiều công sức thời gian Việc gây nhiễm bệnh nhân tạo cho số lượng lớn để tạo chọn giống chịu bệnh vấn đề, ngồi gây nhiễm nhà kính nhiều không thành công Không phương pháp truyền thống việc chọn đột biến đơn gen đa gen kháng loại bệnh gặp nhiều hạn chế: thứ phải chọn bố mẹ phù hợp, thứ hai lai ngược nhiều thời gian, thứ ba không chuyển gen lặn nhiều gen lúc Đặc biệt lồi nhân vơ tính chuyển gen thực lai tạo -GV: Đỗ Ngọc Thái - 10 Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật nụng nghiệp” … Về chế trình dung hợp Nagata Melchers nghiên cứu tỉ mỉ (Nagata & Melchers, 1978) Cuối năm 70 đầu 80 số tác giả đưa phương pháp dung hợp dòng điện (Sanda & cs, 1979; Zimmermann & Sheurich, 1981; Zimmermann, 1982; Zimmermann & Vienken, 1982; Vienken & cs, 1983) Bằng phương pháp này, tác giả đạt tần số dung hợp tới 60 80% Tuy tần số dung hợp có cao vấn đề tái sinh sản phẩm dung hợp lại gặp khó khăn Chỉ gần số tác giả nhận tái sinh sau sử dụng phương pháp dung hợp (Kohn & cs, 1985) Khi dung hợp hai loại protoplast với thường có ba nguồn gen tham gia (nhân, lục lạp, ty thể) kết hợp sản phẩm dung hợp Nếu dung hợp hai loại protoplast giống ta tạo sản phẩm đồng hợp gen (homogenome) Trong trường hợp dung hợp hai loại protoplast khác tạo sản phẩm dị hợp gen (heterogenome) Các sản phẩm đồng hợp gen tạo kiểu hình giống bố mẹ với mức bội thể gấp đôi Các sản phẩm dị hợp gen tạo tế bào dị nhân với hỗn hợp lục lạp ty thể Một hai nhân bị thoái hoá hai phân ly q trình phân chia tế bào Sự thối hố phân ly nhân tế bào dị hợp gen tạo tế bào chứa tế bào chất hai loại protoplast có nhân Những tế bào kiểu gọi thể lai tế bào chất Muốn chọn thể lai sơma dung hợp protoplast sử dụng đặc điểm phối hợp, đặc điểm kháng sinh hố đột biến sắc tố, ngồi sử dụng đặc điểm khác tự nhiên loại protoplast Melcher người sử dụng phối hợp hai đột biến bạch tạng để chọn sản phẩm dung hợp thuốc (Melchers & Labil, 1974) Một số tác giả khác sử dụng phương pháp tương tự thí nghiệm lai dại loài P.innoxia (Schieder, 1977) khác loài P Parodii + P.Hybrida (Cocking 1978), N Tabacum + N Glauca (Evans & cs, 1978) Sự phối hợp đột biến tự dưỡng thiếu nitrate reductase, thiếu axit amin vitamin mẫn cảm với nhiệt độ nhiều tác giả sử dụng có kết (Schieder, 1974; Glimelius & cs, 1978; Muller & Grafe, 1978; Sidorov & cs, 1981; Sidorov & Maliga, 1982; Evola, 1983; Gebhardt & cs, 1983;Shimamoto & cs, 1983) Điều đáng ý đột biến sử dụng để chọn phối hợp phải đột biến lặn khác alen Đặc điểm kháng chất ức chế trao đổi chất sử dụng rộng rãi để chọn thể lai Power cs (1976) sử dụng actinomyxin để chọn thể lai P Parodii P Hybrida Maliga cs (1977, 1982) dùng kanamyxin streptomyxin để chọn thể lai thí nghiệm dung hợp loài thuốc với -GV: Đỗ Ngọc Thái - 19 Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật nụng nghiệp” … Một số dòng tế bào lai chọn khác khả sinh trưởng tái sinh sản phẩm dung hợp loại protoplast (Carlson & cs, 1972; Power & cs, 1977), ưu phát triển lai (Cocking & cs, 1977; Schieder, 1978; Schieder & cs, 1978; Krumbiegel & Schieder, 1979; Dudits & cs, 1979; Lonnerndoker & Schieder, 1980), hình dạng khơng bình thường mơ lai (Melchers & cs, 1978; Binding & Nehls, 1978) Năm 1977 Kao đưa phương pháp tách thể dung hợp học Phương pháp Gleba đồng nghiệp phát triển sử dụng phòng thí nghiệm (Gleba & Hofman, 1978; Gleba & cs, 1978; Gleba & Hofman, 1979) Cho đến dung hợp protoplast phương pháp hiệu để tạo lai sơma Nó cho phép tạo tổ hợp lai theo ý muốn Vấn đề phải nghiên cứu cải tiến phương pháp dung hợp, kỹ thuật ni cấy phương pháp chọnlọc Từ cơng trình lịch sử Carlson (Carlson & cs, 1972) đến phương pháp dung hợp protoplast nhà khoa học giới tạo lai sôma từ hàng trăm tổ hợp lai loài, khác loài khác chi Đây thành tựu lớn lao mà nhà khoa học đạt lĩnh vực lai sôma dung hợp protoplast Gần nhà nghiên cứu tạo lai sơma giống trồng có ý nghĩa kinh tế khoai tây, cà chua lúa (Handley & cs, 1986; O’Connell & Hasnon, 1986; Ausutin & cs, 1985, 1986; Terada & cs, 1987; Guri cs, 1988) Qua ta thấy triển vọng lớn lao việc ứng dụng phương pháp để cải biến di truyền thực vật nhằm tạo giống đáp ứng với yêu cầu đòi hỏi thực tiễn 4.2 Lai tế bào chất Ngoài việc tạo thể lai sơma chứa dị hợp nhân, dung hợp protoplast cịn tạo thể lai tế bào chất (hay gọi lai sinh chất) Trong năm gần nhiều phịng thí nghiệm Pháp, Thụy Điển, Canada, Ixraen, Nga, Ucrain Hungary đầu tư nhiều cho nghiên cứu lĩnh vực này, đến số đặc điểm chống chịu thực vật chứng minh liên quan đến vật chất di truyền tế bào chất Trong thời kỳ đầu, nhà nghiên cứu cố gắng tạo thể lai tế bào chất cách đưa bào quan tách rời vào protoplast Potrykus người công bố chuyển lục lạp vào protoplast Petunia hybrida (cây n) khơng có số liệu chứng minh chắn tồn lục lạp tế bào (Potrykus, 1973) Những cơng trình Carlson (1973), Bonnet & Erikson (1974 ) Kung ( 1975) tình trạng tương tự -GV: Đỗ Ngọc Thái - 20 Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật nụng nghiệp” … Vasil vợ ông công bố kết chuyển ty thể từ bất dục đực (BDĐ) ngô Dã yên vào protoplast bình thường tái sinh (Vasil & Vasil, 1974; Vasil, 1976) Các tác giả cịn xác định gen điều khiển tính BDĐ ngơ Những cơng trình vào lịch sử Từ đến khơng có cơng bố Sở dĩ hạn chế việc tách nhận bào quan nguyên vẹn giữ nguyên hoạt động chúng Đây vấn đề khó khăn q trình tách làm sạch, bào quan bị giảm sức sống Ngoài chúng dễ bị ảnh hưởng tác nhân trình dung hợp Mặt khác cơng trình kể hiệu suất dung hợp thấp Bắt đầu từ năm 1978 đến nhà nghiên cứu sử dụng kỹ thuật dung hợp hai loại protoplast, loại có đặc điểm di truyền lục lạp ty thể xác định để tạo lai tế bào chất Belliard cs (1978) người sử dụng thành công phương pháp Tuy nhiên tỷ lệ lai tế bào chất nhận thấp việc phân tích di truyền lai nhận bị gặp nhiều khó khăn hình thành thể lai nhân Để khắc phục hạn chế trên, Zelcer đồng nghiệp lần sử dụng phương pháp dung hợp “cho nhận“ (Zelcer & cs, 1978) Ông dùng tia X để giết nhân loại protoplast Những protoplast bị chiếu xạ khơng thể phân chia mà đóng góp tế bào chất trình tạo lai Zelcer dung hợp protoplast giết nhân (protoplast cho tế bào chấ) N Tabacum với protoplast nguyên vẹn (protoplast nhận) N Sylvestris ỡng chuyển tính BDĐ (đặc điểm ty thể) từ N Tabacum sang N Sylvestris Các đặc điểm liên quan tới lục lạp chuyển thành công nhờ phương pháp (Beversdorf & cs, 1980; Menczel & cs, 1982; Aviv & cs, 1984; Fluhr & cs, 1983, 1984, 1985; Kemble & Barsby, 1988) Ngoài việc dùng tia phóng xạ để giết nhân dùng số chất hoá học iodoacetate (Medgyey & cs, 1980), dùng ly tâm để loại bỏ nhân (Wallin & cs, 1977; Maliga & cs, 1982) Nhưng trường hợp tỷ lệ nhân sống sót cịn đáng kể Đối với đặc điểm di truyền lục lạp dễ dàng chọn lọc theo dõi sau dung hợp thị di truyền lục lạp đột biến lạp thể (Gleba & cs,1978), đột biến kháng sinh hoá kháng số độc tố nấm (Aviv & cs, 1980; Flick & cs, 1985), đột biến kháng thuốc (Medgyesy & cs, 1980; Maliga cs, 1982; Cseplo & Maliga, 1982; Cseplo & cs, 1984) đột biến kháng chất diệt cỏ ( Gressel 1984) Đại phân tử enzim ribulozo 1, difotfat carbonxylase tổng hợp nhờ thông tin di truyền lục lạp sử dụng để nghiên cứu sinh hoá lục lạp (Kung & cs, 1975) Phương pháp phân tích sinh hố xác phương pháp phân tích điện di đồ ADN lục lạp (cpADN) sau dùng enzim cắt giới hạn, cắt cpADN thành đoạn khác phân -GV: Đỗ Ngọc Thái - 21 Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật nụng nghiệp” … lập đoạn cắt điện di (Belliard & cs, 1978) Hiện phương pháp sử dụng rộng rãi nhiều phịng thí nghiệm giới Ngồi khả sử dụng với tổ hợp lai nào, phuơng pháp cịn xác cho phép xác định 1% hỗn hợp cpADN Khác với lục lạp đặc điểm liên quan tới ty thể khơng có thị để chọn nuôi cấy in vitro Một số tác giả dùng thị lục lạp để chọn (Medgyesy & cs, 1980; Menczel & cs, 1982) Trường hợp sử dụng lục lạp ty thể liên kết với theo chế Nghiên cứu hình thái hoa gíup cho việc xác định ty thể ngoại lai lai Tính BDĐ sử dụng làm thị để chọn đặc điểm ty thể thuốc (Belliard & cs, 1979) Dã yên (Izhar & Power, 1979; Izhar & Tabib, 1980) Giống lục lạp phương pháp phân tích điện di đồ ADN ty thể (mtADN) sử dụng rộng rãi để xác định ty thể lai tế bào chất Belliard cs dùng phương pháp để nghiên cứu ty thể lai thí nghiệm dung hợp protoplast thuốc phát thấy tái tổ hợp mtADN lai (Belliard & cs, 1979) Tiếp sau Nagy cs (1981), Galun cs (1982) nhiều tác giả khác sử dụng phân tích mtADN để nghiên cứu theo dõi hoạt động ty thể lai tế bào chất Số phận lục lạp ty thể ngoại lai thể lai tế bào chất vấn đề nhà nghiên cứu quan tâm hàng đầu việc biến đổi di truyền tế bào chất có ý nghĩa thơng tin di truyền lục lạp ty thể ngoại lai tồn hoạt động bình thường thể lai Những kết Kung (Kung & cs, 1975, 1977) Chen (Chen & cs, 1977) cho thấy lai N Glauca N Langsdorffii phần lớn chứa loại lục lạp (hoặc bố, mẹ) Trong cơng trình Belliard, tác giả xác định loại cpADN lai tế bào chất (Belliard & cs, 1978) Thành cs chứng minh thuốc nhận từ dung hợp protoplast hai loại khác tông Salpiglossis sinuata (cây cho lục lạp) N Tabacum (cây nhận lục lạp) chứa loại lục lạp S Sinuata (Thanh & cs, 1988) Trong vài trường hợp tác giả lại xác định hai loại lục lạp Một số tác giả khác thu kết tương tự (Aviv & cs, 1980, 1984; Glimelius, 1981; Bonnet & Glimelius, 1983) Mặc dù số công trình tác giả chứng minh tồn hai loại cpADN lai chưa thấy tượng tái tổ hợp cpADN Vấn đề tái tổ hợp cpADN thực vật bậc cao nhiều phịng thí nghiệm giới nghiên cứu, xong đến cuối năm 80 có hai cơng bố tái tổ hợp cpADN lai tế bào chất thuốc (Medgyesy & cs, 1985) lai tế bào chất thuốc khoai tây (Thanh -GV: Đỗ Ngọc Thái - 22 Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật nụng nghiệp” … & cs, 1989) Tái tổ hợp ADN lục lạp vấn đề có ý nghĩa, thơng qua tái tổ hợp cpADN tạo tổ hợp gen tế bào chất Đối với ty thể toàn cơng trình cơng bố cho thấy lai tế bào chất xảy tái tổ hợp mtADN (Belliard & cs, 1978; Nagy & cs, 1981, 1983; Clark & cs, 1986; Kemble, 1986; Robertson & cs, 1987) Kết tái tổ hợp tạo kiểu hình hoa mới, kiểu hình ổn định (Belliard & Pelletier, 1979) Tái tổ hợp mtADN xảy sau dung hợp protoplast hai giống thuốc có mtADN tương tự nhau, nhiên tái tổ hợp xảy nhiều dung hợp hai loài thuốc khác N tabacum N Plumbaginifolia (Nagy & cs, 1981, 1983) Cho đến nay, việc nhận lai tế bào chất kỹ thuật dung hợp protoplast thực chủ yếu loài thuốc lá, cải bước đầu thành công khoai tây Tuy thành tựu đạt mang lại ứng dụng thực tiễn việc cải biến trồng Chuyển lục lạp giúp cho việc khơi phục suất cải dầu –Brasica napus (Bennerot & cs, 1974; Pelletier & cs, 1983) tạo giống trồng kháng chất diệt cỏ (Benversdof & cs, 1980; Binding & cs, 1982; Gressel & cs, 1984; Pelletier & cs, 1985) Lai tế bào chất dung hợp protoplast rút ngắn thời gian tạo dịng bất dục đực 4-5 năm Chuyển tính BDĐ thành công thuốc (Zelcer & cs, 1978; Aviv &Galun, 1980; Aviv & cs, 1980; Glimelius & cs, 1981; Uchimiya, 1982; Menczel & cs, 1983; Fluhr & cs, 1984) dã yên (Izhar & Power, 1979; Izhar & Tabib, 1980; Izhar & cs, 1983, 1984; Boeshore & cs, 1983; Clark cs, 1985; Rothenbenrg & cs, 1985) Đặc biệt chuyển tính BDĐ để tạo hạt lai cải dầu mang lại lợi ích kinh tế (Pelletier & cs, 1985; Chetrit & cs, 1985) V CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT 5.1 Một số vấn đề chung chuyển gen thực vật Chuyển gen thực vật phát triển với phát triển kỹ thuật nuôi cấy mơ tế bào thực vật Nó trở thành phương tiện quan trọng để nghiên cứu sinh học thực vật Nó cho phép nghiên cứu cấu trúc điều khiển hoạt động gen Ngoài mở triển vọng chuyển gen có ý nghĩa kinh tế vào trồng Từ khám phá chuyển gen thực nhờ Agrobacterium tumefaciens (Klee & Rogers, 1989) nhà khoa học tin Arobacterium chuyển gen vào tất lồi Nhưng sau kết thực tế cho thấy chuyển gen Agrobacterium thực ngũ cốc hàng loạt kỹ thuật chuyển gen phát triển kỹ thuật chuyển gen trực tiếp (Paszkowski & cs, 1989), kỹ thuật bắn gen (Klein & cs, 1989), kỹ thuật vi tiêm (Neuhaus & cs, 1987), kỹ thuật chuyển gen qua hạt phấn (Hess & cs, 1977 ; Ohta, 1986), kỹ thuật đường dẫn ống phấn (Luo & cs, Wu, 1988), kỹ thuật ủ hạt mô với ADN (Ledoux & cs, 1974), kỹ thuật -GV: Đỗ Ngọc Thái - 23 Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật nụng nghiệp” … nhiễm vi khuẩn (Grimsley & cs, 1986), sử dụng ADN virus (Gronenborn & Matzeit,1989), Kỹ thuật điện di (Linsay & Jones, 1990), dung hợp liposom (Ahokas, 1987), phương pháp vi tiêm (De la Pena & cs, 1987), phương pháp xử lý laser (Weber & cs, 1988) Đến nhờ cải tiến vectơ chuyển gen nên kỹ thuật chuyển gen A tumefaciens thành công ngũ cốc đặc biệt lúa (Hiei cs, 1994) Kỹ thuật trở nên kỹ thuật đầy triển vọng chuyển gen thực vật Chuyển gen thực qua bước sau: - Xác định gen liên quan đến tính trạng quan tâm - Phân lập gen - Gắn gen vào vectơ biến nạp - Biến nạp vào E Coli - Tách ADN plasmid - Biến nạp vào mô tế bào thực vật - Chọn thể biến nạp - Tái sinh biến nạp - Chứng minh có mặt gen biến nạp tái sinh Khi đặt mục đích thực thí nghiệm chuyển gen cần ý số vấn đề sinh học hệ thống chuyển gen như: - Khơng phải tồn tế bào thể tính tồn - Cây biến nạp tái sinh từ tế bào có khả tái sinh khả thu nhận gen biến nạp vào genôm - Mô thực vật hỗn hợp quần thể tế bào có khả khác Cần xem xét số vấn đề như: có số tế bào có khả tái sinh biến nạp; số khác có hai khả năng; số tạo điều kiện phù hợp trở nên có khả năng; số khác hồn tồn khơng có khả tái sinh biến nạp - Thành phần quần thể tế bào xác định loài, kiểu gen, quan, giai đoạn phát triển mô quan - Cho đến gen chuyển vào tế bào có thành xellulơ Agrobacterium, virus, vi tiêm, bắn gen chuyển gen trực tiếp Khả xâm nhập gen vào genôm cách ổn định không tỷ lệ với thể tạm thời gen Các ADN khơng phải virus có genơm chưa bảo đảm gắn ổn định với genôm -GV: Đỗ Ngọc Thái - 24 Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật nụng nghiệp” … - Các ADN virus không chuyển rời từ tế bào sang tế bào kia, nơi mà đưa vào - ADN virus không xâm nhập vào genôm chủ, chuyển từ tế bào sang tế bào khác bị loại mô phân sinh 5.2 Các phương pháp chuyển gen 5.2.1 Chuyển gen Agrobacterium Chuyển gen Agrobacterium phương pháp hữu hiệu dùng để chuyển gen thực vật Phương pháp dùng Ti- plasmid A tumefaciens Ri plasmid A rhizogenes làm vectơ đưa ADN vào tế bào Ti plasmid gồm hai thành phần T -ADN vùng vir (virulence) T-ADN chuyển từ Agrobacterium vào tế bào thực vật, nhờ mà gắn gen muốn chuyển nạp vào T -ADN để đưa vào tế bào T -ADN chức gen điều hoà sinh trưởng cục gen tổng hợp chất opine Đoạn cuối có 25 cặp bazơ lặp lại, đoạn vùng xâm nhập vào phân tử ADN thực vật Vùng vir gồm sáu nhóm từ virA đến virG virC virE có tác dụng làm tăng tần số biến nạp Để thiết kế vectơ dùng cho biến nạp, trước hết cắt bỏ gen điều hoà sinh trưởng cục sau gắn thêm gen thị (kháng thuốc chất diệt cỏ) với đoạn điều khiển (promote) phù hợp để chọn thể biến nạp cuối gắn gen cần biến nạp Chuyển gen Agrobacterium thực có hiệu nhiều loại hai mầm như: thuốc lá, cà chua, khoai tây (Cheng cs, 1992), đậu tương (Hinchee & cs, 1988; Dhir & cs, 1992), (Perlak & cs, 1990), Arobidopsis, ngô (Gould & cs, 1991; Citovsky & cs, 1994) Những thành công lúa (Hiei & cs, 1994; Rashid & cs, 1996) làm cho phương pháp chuyển gen Agrobacterium trở nên hấp dẫn củng cố vị trí nhà tiền bối hy vọng từ đầu Cho đến chuyển gen thông qua Agrobacterium phương pháp cho tần số biến nạp cao xác định xâm nhập ổn định phương pháp chuyển gen (Chan & cs, 1993) 5.2.2 Phương pháp nhiễm Agrobacterium virus Phương pháp nhiễm Agrobacterium virus phương pháp gắn ADN virus vào T ADN Ti plasmid chuyển vào tế bào thực vật Khi vào tế bào ADN virus giải phóng để tạo virus hoạt động xâm nhập vào genôm tế bào gần vùng u Agrobacterium gây nên Bằng phương pháp Grimsley cs (1987) lần cho thấy khả chuyển gen ngũ cốc Agrobacterium -GV: Đỗ Ngọc Thái - 25 Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật nụng nghiệp” … 5.2.3 Phương pháp chuyển gen trực tiếp Phương pháp chuyển gen trực tiếp (Paszkowski & cs, 1988) phương pháp chuyển ADN thông qua xử lý polyethylen glycol (PEG) Đây phương pháp chuyển gen cho hiệu cao Bằng phương pháp nhận mang gen biến nạp ổn định di truyền qua hệ (Potrykus & cs, 1985) Phương pháp có ưu điểm như: tần số chuyển nạp đồng thời gen thị gen cần biến nạp cao; chuyển gen vào protoplast lồi Tuy nhiên vấn đề tái sinh từ protoplast cịn khó khăn số lồi Mặc dù có nhiều thành tựu ni cấy protoplast protoplast giống có giá trị kinh tế lúa, ngơ, l mì, đại mạch phần lớn việc tách nuôi tế bào phụ thuộc vào việc thiết lập hệ thống nuôi cấy phôi để làm nguyên liệu ban đầu mà điều dễ thực giống sản xuất 5.2.4 Phương pháp chuyển gen súng bắn gen Phương pháp bắn gen phương pháp sử dụng hạt kim loại (vàng vonfram) bao bọc ADN bắn vào tế bào Bằng phương pháp biến nạp tất loại tế bào Người ta hy vọng phương pháp giải tất vấn đề chuyển gen, tần số biến nạp phương pháp bắn gen thấp thường xuyên nhận biến nạp khảm (cây có tế bào biến nạp tế bào khơng biến nạp) Có thể nói đến số ưu điểm phương pháp bắn gen là: - Thao tác dễ dàng - Bắn lần nhiều tế bào - Nguyên liệu để bắn đa dạng (hạt phấn, tế bào nuôi cấy, mô) Cây đậu tương biến nạp nhận phương pháp (McCabe & cs, 1988) Nhiều phịng thí nghiệm nhận ngô biến nạp thời gian (Fromm & cs, 1990; Gordom- Kamm & cs, 1990) Một vấn đề tồn quan trọng tần số biến nạp ổn định thấp theo Potrykus (1991) ưu điểm thực phương pháp bắn gen ứng dụng nghiên cứu thể tạm thời gen Nhưng năm gần có hàng loạt cơng bố biến nạp thành cơng lúa (Zhang & cs, 1996), đu đủ, mía, khẳng định ưu việt phương pháp 5.2.5 Phương pháp vi tiêm Phương pháp vi tiêm P (microinjection) vào hợp tử phôi từ hạt phấn Phương pháp vi tiêm phương pháp sử dụng vi kim kính hiển vi đưa ADN vào tế bào định (Neuhaus & Spangenberg, 1990) Phương pháp tạo dòng biến nạp từ protoplast biến nạp khảm từ phôi phát triển từ hạt phấn cải dầu Giống phương pháp bắn gen, vi -GV: Đỗ Ngọc Thái - 26 Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật nụng nghiệp” … tiêm đưa ADN vào tế bào xác định có thành xellulơ Vi tiêm hạn chế bắn gen chổ phát tiêm tế bào thao tác cần khéo léo Vi tiêm có số ưu điểm sau: - Có thể tối ưu lượng ADN đưa vào tế bào - Có thể định đưa ADN vào loại tế bào - Có thể đưa cách xác chí vào tận nhân quan sát đuợc - Các tế bào có cấu trúc nhỏ hạt phấn tế bào tiền phôi hạn chế số lượng tiêm cách xác - Có thể thực ni cấy riêng rẽ tế bào vi tiêm - Có thể biến nạp giống Cho đến phương pháp kể nhận đuợc biến nạp Ngoài số phương pháp khác thực chưa có kết kết chưa khẳng định, phương pháp sau: - Phương pháp ủ hạt khô phôi dung dịch ADN - Phương pháp biến nạp thông qua hạt phấn Phương pháp dựa vào sở ADN xâm nhập vào hạt phấn giai đoạn nảy mầm di chuyển vào nhân tế bào hạt phấn hợp tử qua ống phấn (Hess, 1987) - Phương pháp đường dẫn ống phấn (Luo, 1988) Phương pháp tương tự phương pháp biến nạp thông qua hạt phấn đưa ADN vào hợp tử ống phấn - Phương pháp vĩ tiêm (macroinjection) Phương pháp sử dụng kim tiêm có đường kính lớn đường kính tế bào để đưa ADN vào tế bào, tế bào bị phá vỡ ADN xâm nhập vào tế bào bị thương sau chuyển vào tế bào bên cạnh - Phương pháp xung điện (electropoation) phương pháp này, dùng tuợng phóng điện để tạo lỗ màng tế bào làm cho việc đưa ADN vào tế bào dễ dàng hơn, ADN tiếp giáp với màng tế bào Đối với protoplast, phương pháp xung điện có số kết khích lệ (Fromm, 1987), chưa có chứng minh chắn cho biến nạp Hơn việc nuôi cấy protoplast số lồi cịn gặp nhiều khó khăn - Ahokas (1989) sử dụng điện di để vận chuyển ADN vào mô phân sinh chồi từ hạt đại mạch để xem phương pháp điện di ADN qua mơ vận chuyển gen vào tế bào hay không Kết tác giả nhận thể tạm thời gen thị (GUS) không chứng minh biến nạp ổn định - Liposom có chứa ADN sử dụng phương tiện để đưa gen ngoại lai vào tế bào thông qua dung hợp (Caboche, 1990) vi tiêm vào không bào (Lucas, 1990) Cả hai phương pháp chưa thu đựợc kết -GV: Đỗ Ngọc Thái - 27 Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật nụng nghiệp” … - Phương pháp vi laser ứng dụng để tạo lỗ hổng màng tế bào sau ủ tế bào với dung dịch ADN Weber (1990) sử dụng phương pháp chuyển gen không cần vectơ, sau thời gian dài chưa có kết chắn xâm nhập ADN vào tế bào (1995) Guo kết hợp việc xử lý tế bào với dung dịch đẳng trương để rút bớt nước từ tế bào sau chuyển vào mơi trường thẩm thấu yếu có chứa ADN ngoại lai dùng laser tạo lỗ màng tế bào để ADN xâm nhập vào tế bào Bằng phương pháp tác giả quan sát thấy thể gen biến nạp sau xử lý tế bào tái sinh 5.3 Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen nông nghiệp Trong nông nghiệp, kĩ thuật chuyển gen đem lại nhiều lợi ích: - Chuyển gen kháng sâu bệnh vào giồng trồng chuyển gen Bt vào để tạo giống kháng sâu hại - Chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ vào nhiều giống trồng ngô, bông, đậu tương Các giống Bộ nông nghiệp phát triển nông thôn Việt Nam cho trồng thử huyện Khoái Châu – Hưng Yên năm 2011 cho kết khả quan - Chuyển gen S vào tế bào chất lúa để tạo dòng lúa bất dục đực tế bào chất Đây bước thiếu sản xuất lúa lai Việt phát chuyển thành công gen S vào tế bào chất mở bước ngược lớn cho ngành sản xuất lúa lai, góp phần đảm bảo an ninh lương thực toàn cầu - Chuyển gen sinh auxin mẫn cảm auxin hoạt động đặc thù bầu nhụy vào giống cam, quýt, cà chua tạo nhiều giống ăn không hạt, qua nâng cao chất lượng giá thành hoa Mỹ nước đầu lĩnh vực - Nhờ kỹ thuật chuyển gen giúp tạo giống mang nhiều đặc tình quý, gạo vàng chứa nhiều chất tiền vitamin A (- caroten) Đây kết hợp tác nhiều nhà khoa học thuộc nước Mỹ, Đức, Thụy Sỹ vòng 20 năm tiêu tốn hết 100 triệu đôla Các nhà khoa học chuyển gen liên quan đến trình tổng hợp - caroten vào giống lúa LD309 để tạo giống lúa gạo vàng Giống lúa gạo vàng khơng ngừng hồn thiện, năm 2000 tạo giống lúa gạo vàng hệ I có hàm lượng - caroten gấp 200 lần gạo trắng, đến năm 2005 tạo giống lúa gạo vàng hệ II có hàm lượng - caroten gấp 4600 lần gạo trắng, điều mang lại nhiều hi vong cho nước nghèo tròng việc phòng chữa bệnh thiếu vitamin A Tóm lại, thành tựu bật kĩ thuật chuyển gen cho phép tái tổ hợp di truyền loài đứng xa bậc thang phân loại mà phương pháp lai không thực VI THÀNH TỰU CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT Ở VIỆT NAM -GV: Đỗ Ngọc Thái - 28 Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật nụng nghiệp” … Nuôi cấy mô thực vật phát triển Việt Nam sau chiến tranh kết thúc Phịng thí nghiệm ni cấy mơ tế bào xây dựng viện Sinh học, viện Khoa học Việt Nam (KHVN) tiến sĩ Lê Thị Muội đứng đầu Bước đầu phòng tập trung vào nghiên cứu phương pháp nuôi cấy điều kiện Việt Nam nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy mô sẹo protoplast Các kết nuôi cấy thành công bao phấn lúa thuốc công bố vào 1978 (Lê Thị Muội, 1978) Tiếp thành cơng ni cấy protoplast thuốc khoai tây (Nguyễn Đức Thành, 1981) Trong thời gian, phân viện KHVN thành phố Hồ Chí Minh muộn Đại học Nông nghiệp Hà Nội viện Khoa học kỹ thuật Nơng nghiệp Việt Nam phịng thí nghiệm cấy mô viện nghiên cứu (viện Di truyền nông nghiệp; viện Rau trung ương) mà số tỉnh sở sản xuất (Yên Bái,) Từ năm 80 trở lại đây, hướng nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật phát triển mạnh Những kết khích lệ đạt lĩnh vục nhân giống khoai tây (Viện công nghệ sinh học /CNSH, ĐHNN1, viện KHKTNNVN), dứa, chuối, mía (viện CNSH, ĐHNN1, viện DTNN, viện KHKTNNVN, viện RQTư), số hoa Phong lan (phân viện CNSH thành phố Hồ Chí Minh), Hồng, Cúc, Cẩm chướng (Viện CNSHV, viện Lâm nghiệp) Một số kết bước đầu ghi nhận lĩnh vực chọn dòng tế bào chọn dòng tế bào kháng thuốc (Lê Bích Thủy vả cs, 1994), chọn dòng chịu muối, chịu nước (Nguyễn Tường Vân cs, 1994; Đinh Thị Phòng cs, 1994) Các kết dung hợp tạo lai tế bào chất chuyển gen lục lạp thu kết lý thú (Nguyễn Đức Thành 1997) Nuôi cấy bao phấn để tạo dòng ứng dụng nhiều viện CNSH DTNN Nuôi cấy dược liệu quý để bảo tồn nguồn gen tạo dòng tế bào có hàm lượng chất sinh học quan trọng cao phát triển (Phan Huy Bảo, Phan Thị Bảy cs, 1995) Năm 2007, Viện khoa học nông nghiệp phát triển nông thôn tạo giống lúa siêu chủng phương pháp nuôi cấy bao phấn kết hợp với đột biến Việt Nam chuyển thành công số gen kháng sâu bệnh, hay gen tạo không hạt vào số giống trồng Năm 2010 Viện cơng nghệ sinh học tạo dịng Đu đủ mang gen kháng virut xoăn công nghệ chuyển gen Năm 2012 trường Đại học nông nghiệp Hà Nội thực đề tài chuyển gen sinh auxin gen mẫn cảm auxin hoạt động đặc thù bầu nhụy vào giống cam Vinh cam Đường canh nhăm dòng cam quýt không hạt, Trong năm gần Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn cho tiến hành trồng thử nhiều giống chuyển gen mang gen kháng thuốc trừ cỏ, gen Bt kháng sâu nhiều giống cây: ngô, bông, đâu tương, thu kết khả quan -GV: Đỗ Ngọc Thái - 29 Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật nụng nghiệp” … VII KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM SƯ PHẠM Đề tài tập trung nghiên cứu nội dung công nhệ sinh học thực vật nông nghiệp : vi nhân giống nuôi cấy mô, tạo đơn bội nuôi cấy mô từ hạt phấn, chọn dòng tế bào thực vật, kĩ thuật chuyển gen thực vật số thành tựu ứng dụng công nghệ sinh học nông nghiệp Việt Nam Các nội dung trình bày cách chi tiết hoàn thiện Điều PGS.TS Phan Hữu Tôn - Khoa Công nghệ sinh học -Trường ĐHNNHN PGS.TS Nguyễn Xuân Viết -Khoa Sinh - Trường ĐHSPHN đánh giá cao (10 điểm) Đề tài nhiều học viên Cao học trường ĐHSPHN xin làm tài liệu để xây dựng luận văn tốt nghiệp, phục vụ cho công tác giảng dạy sau tốt nghiệp Cao học Sau tốt nghiệp Cao học, sử dụng nguồn tài liệu giảng dạy lớp, bồi dưỡng đội tuyển học sinh giỏi trường thu kết khả quan Cụ thể năm học 2011 - 2012 : đội tuyển học sinh giỏi môn Sinh học trường đạt thành tích xuất sắc ( đồng đội cá nhân), kết thi Đại học khối B cao (có em đỗ ĐHYHN, gần 20 em đỗ ĐHYHP) Đây chứng sinh động chứng minh hiệu thực tiễn đề tài Ngày tháng năm 2013, trường THPT Tiên Lữ tổ chức hội thảo sinh học chuyên đề “Ứng dụng công nghệ sinh học thực tiễn’’ Trong buổi hội thảo đồng giáo viên em học sinh tham dự khơng nghe, nhìn, mà thưởng thức sản phẩm ứng dụng cơng nghệ sinh học Do đó, tạo ấn tượng khó quên buổi hội thảo thấy tầm quan trọng việc ứng dụng Công nghệ sinh học thực tiễn Năm 2011, bảo vệ thành công đề tài ’’Chuyển gen sinh auxin hoạt động đặc thù vào cam Vinh nhằm tạo không hạt’’ Hội đồng chấm đánh giá loại xuất sắc VIII ĐIỀU KIỆN ÁP DỤNG ĐỀ TÀI Đề tài nguồn tài liệu tham khảo cho đồng chí giáo viên trường : THPT , Năng khiếu để dạy học tốt môn Sinh học, ôn đội tuyển học sinh giỏi ơn thi Đại học, Ngồi ra, cịn nguồn tài liệu cho học sinh, sinh viên, học viên cao học tham khảo PHẦN C KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I KẾT LUẬN Đề tài tập trung nghiên cứu nội dung công nghệ sinh học thực vật nông nghiệp : vi nhân giống nuôi cấy mô, tạo đơn bội nuôi cấy mô từ -GV: Đỗ Ngọc Thái - 30 Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật nụng nghiệp” … hạt phấn, chọn dòng tế bào thực vật, kĩ thuật chuyển gen thực vật số thành tựu ứng dụng công nghệ sinh học nông nghiệp Việt Nam Nhờ phát triển phương pháp nuôi cấy mô cho phép nhân nhanh giống q hiếm, đặc biệt lồi có hệ số nhân giống tự nhiên thấp hoa Lan Đồng thời tạo dòng bệnh, chuối Tây bệnh, góp phần nâng cao suất chất lượng trồng Sự kết hợp nuôi cấy hạt phấn đa bội hóa cho phép tạo dịng siêu chủng cách nhanh chóng mà phương pháp lai khơng thể có Trước đây, trình chọn giống diễn cấp độ cá thể, phải tốn nhiều thời gian công sức Ngày nay, với phát triển nuôi cấy mô, người ta sử dụng thêm phương pháp chọn giống mới, chọn lọc cấp độ tế bào gọi chọn dòng tế bào Đây hướng chọn lọc có nhiều triển vọng Sự phát triển kĩ thuật dung hợp tế bào trần hoàn thiện kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào trần giúp tạo lai khác lồi có tính hữu thụ cao, khắc phục tượng bất thụ lai xa Thành tựu bật kĩ thuật chuyển gen cho phép tái tổ hợp di truyền loài xa hệ thống phân loại mà phương pháp lai thực Nhờ kĩ thuật chuyển gen người ta tạo nhiều giống mang gen kháng sâu bệnh, mang đặc tính quý hạt gạo vàng, Đây nguồn tài liệu quý cho đồng chí giáo viên học sinh để dạy – học tốt môn Sinh học mơn Cơng nghệ nói chung phần nội dung Cơng nghệ sinh học nói riêng Qua tăng tỉ lệ học sinh thi đỗ vào Trường Đại học Cao đẳng II- KIẾN NGHỊ Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật nông nghiệp vấn đề khó nên đồng chí giáo viên học sinh cịn nhiều bỡ ngỡ thiếu thơng tin thí nghiệm thực hành Vì vậy, Kính mong Trường THPT Sở giáo dục đào tạo mở chuyên đề hội thảo nội dung để trao đổi, học hỏi kinh nghiệm Đối với giáo viên thực giảng dạy phần : ứng dụng công nghệ sinh học môn Công nghệ 10, không nên coi phần phụ, mà phải nghiêm túc chuẩn bị nội dung, phương pháp cho học sinh thấy kiến thức hay có ý nghĩa thực tiễn cao đời sống III NHỮNG HẠN CHẾ VÀ HƯỚNG PHÁT TRIỂN TIẾP CỦA ĐỀ TÀI -GV: Đỗ Ngọc Thái - 31 Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật nụng nghiệp” … Những hạn chế Đề tài tập trung nghiên cứu nội dung công nghệ sinh học thực vật nông nghiệp : vi nhân giống nuôi cấy mô, tạo đơn bội nuôi cấy mô từ hạt phấn, chọn dòng tế bào thực vật, kĩ thuật chuyển gen thực vật số thành tựu ứng dụng công nghệ sinh học nông nghiệp Việt Nam Do hạn chế nguồn tư liệu trình độ thân, nên đề tài cịn có nhiều thiếu sót như: số lượng kênh hình cịn ít, số liệu ví dụ minh họa cho phần chưa nhiều Hướng phát triển tiếp đề tài Tập trung đề cập thêm nội dung ứng dụng công nghệ sinh học thực vật nông nghiệp : sử dụng máy PCR điện di để phát gen, sử dụng máy giải trình tự ADN, phương pháp tạo đột biến gen tia , phương pháp tạo đột biến đa bội cosixin, chọn giống thị phân tử Không dừng lĩnh vực thực vật, mà phải tiếp tục mở rộng sang đối tượng : ứng dụng công nghệ sinh học chăn ni, y học, mơi trường , Tóm lại, cố gắng thể để viết đề tài này, trình độ cịn hạn chế nên khơng thể tránh khỏi thiếu sót Vì vậy, tơi mong đóng góp ý kiến đồng chí giáo viên để đề tài hồn chỉnh Tơi xin trân thành cảm ơn ! Tiên Lữ, ngày tháng năm 2013 Người viết Đỗ Ngọc Thái TÀI LIỆU THAM KHẢO Đái Duy Ban Lữ Thị Cẩm Vân, 1994: Công nghệ gen Công nghệ sinh học ứng dụng y dược học đại, NXB Y học Đái Duy Ban, 2006: Công nghệ gen, NXB Khoa học Kỹ thuật Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1997: Sinh học phân tử, NXB Giáo dục Lê Đình Lương, 2001: Nguyên lý kỹ thuật di truyền, NXB Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Đức Thành, 2000: Nuôi cấy mô tế bào thực vật, NXB Nông nghiệp Nguyễn Lân Dũng: Thế kỷ 21- kỷ vàng công nghệ sinh học, Khoa học phổ thông, Xuân 1997 Phan Hữu Tôn, 2011: Công nghệ sinh học thực vật, NXB Nông nghiệp -GV: Đỗ Ngọc Thái - 32 Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật nụng nghiệp” … Trần Thế Thông: Công nghệ sinh học với nông nghiệp, Khoa học phổ thông, Xuân 1997 Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp, 2006: Công nghệ sinh học, NXB Giáo dục 10 Genetic IX, xuất năm 2008, London 11 Công nghệ sinh học: http://www.ctu.edu.vn/coursewares/supham/cong nghesinhhoc -GV: Đỗ Ngọc Thái - 33 Trường THPT Tiên Lữ ... chọn đề tài: ? ?Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật nơng nghiệp? ?? II MỤC ĐÍCH VÀ U CẦU CỦA ĐỀ TÀI 1- Mục đích : Xây dựng hồn thiện chuyên đề “ Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật nông nghiệp? ?? trở... Sinh học môn Cơng nghệ nói chung phần nội dung Cơng nghệ sinh học nói riêng Qua tăng tỉ lệ học sinh thi đỗ vào Trường Đại học Cao đẳng II- KIẾN NGHỊ Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật nông nghiệp. .. nhệ sinh học thực vật nông nghiệp : vi nhân giống nuôi cấy mô, tạo đơn bội ni cấy mơ từ hạt phấn, chọn dịng tế bào thực vật, kĩ thuật chuyển gen thực vật số thành tựu ứng dụng công nghệ sinh học