Phân tích hệ vi dinh vật lên men trà kombucha

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA PHẠM PHƯƠNG ĐIỀN PHÂN TÍCH HỆ VI SINH VẬT LÊN MEN TRÀ KOMBUCHA Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số : 60420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số : 60420201 PHÂN TÍCH HỆ VI SINH VẬT LÊN MEN TRÀ KOMBUCHA Cán hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Thúy Hương Học viên thực hiện: Phạm Phương Điền – MSHV: 1570254 TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2018 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM Cán hướng dẫn khoa học : PGS TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG Cán chấm nhận xét : PGS TS NGUYỄN TIẾN THẮNG Cán chấm nhận xét : TS NGUYỄN HỮU PHÚC Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG TP HCM ngày 12 tháng 01 năm 2018 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: PGS TS LÊ THỊ THỦY TIÊN PGS TS NGUYỄN TIẾN THẮNG TS NGUYỄN HỮU PHÚC TS VÕ ĐÌNH LỆ TÂM TS HUỲNH NGỌC OANH Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA………… ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Phạm Phương Điền MSHV:1570254 Ngày, tháng, năm sinh: 02/12/1982 Nơi sinh: TP Hồ Chí Minh Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số : 60420201 I TÊN ĐỀ TÀI: PHÂN TÍCH HỆ VI SINH VẬT LÊN MEN TRÀ KOMBUCHA II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Mục tiêu nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn, định danh hệ vi sinh vật lên men trà Kombucha nhằm làm tiền đề cho lên men công nghiệp Nội dung nghiên cứu - Phân lập định danh hệ vi sinh vật phương pháp truyền thống - Phân tích định danh hệ vi sinh vật phương pháp PCR-DGGE - So sánh kết hai phương pháp tuyển chọn giống vi sinh vật - Xây dựng lý lịch giống sau định danh - Lưu trữ bảo quản giống III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 16/01/2017 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 18/12/2017 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG Tp HCM, ngày 18 tháng 12 năm 2017 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên chữ ký) TRƯỞNG KHOA….……… (Họ tên chữ ký) LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, em xin gửi lời cảm ơn biết ơn chân thành, sâu sắc tới cô giáo PGS.TS Nguyễn Thúy Hương Người tạo điều kiện thuận lợi, động viên, hướng dẫn sâu sát giúp đỡ em hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn tồn thể q Thầy, Cơ Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học trường Đại Học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu; tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn chương trình học Xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến em: Ánh, Ngọc Anh, Hậu, Nhân, Ngọc giúp đỡ, động viên anh trình học thực luận văn tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn! TP Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2017 Học viên Phạm Phương Điền i TÓM TẮT Trà lên men Kombucha chứng minh có nhiều ích lợi cho sức khỏe người nhờ chứa nhiều hoạt tính sinh học quý Tuy nhiên, cịn nhiều hạn chế q trình lên men loại trà này, như: chưa sản xuất quy mô công nghiệp, dễ tạp nhiễm dẫn đến hư hỏng sản phẩm trình lên men truyền thống; chưa chủ động nguồn giống vi sinh vật nên chất lượng khơng đồng lần lên men Q trình lên men trà Kombucha có xuất nhiều nhóm vi sinh vật Thế nhưng, khơng phải tất nhóm vi sinh vật có lợi trình lên men Do đó, nghiên cứu tiến hành phân lập, định danh hệ vi sinh vật lên men có trà Kombucha phương pháp truyền thống đại PCRDGGE cần thiết nhằm tạo tiền đề quan trọng cho lên men công nghiệp xây dựng lý lịch giống vi sinh vật, bảo quản giống cho nghiên cứu liên quan khác Qua kết nghiên cứu, có khác biệt hệ vi sinh vật, song, hai phương pháp thể thống cao Kết nghiên cứu cho thấy có diện chủng nấm men: Brettanomyces bruxellensis, Candida tropicalis, Dekkera bruxellensis, Saccharomyces cerevisiae Các chủng vi khuẩn acetic: Komagataeibacter nataicola, Pseudomonas geniculata, Acetobacter tropicalis chủng vi khuẩn lactic: Enterococcus faecium, Lactobacillus pentosus ii ABSTRACT Kombucha tea has been shown to be beneficial for human thank to its rich bioactive properties However, there are still many restrictions on the fermentation process of this tea, such as: not produced on industrial scale, susceptible to contamination and damage to the product in the traditional fermentation; not active in control the source of microorganism so the quality is not uniform between fermentations There are many groups of microorganisms appear during the fermentation of Kombucha tea However, not all of them are good Therefore, the study of isolation and identification of fermentation microorganisms in Kombucha tea using traditional and modern methods of PCR-DGGE is necessary to create an important premise for industrial fermentation, construction a biography of microorganisms and preservation them for other related research Based on the results, although there are differences in the microbial population, both methods still show high consistency Research results show that the presence of yeast strains: Brettanomyces bruxellensis, Candida tropicalis, Dekkera bruxellensis, Saccharomyces cerevisiae Acetic acid bacteria: Komagataeibacter nataicola, Pseudomonas geniculata, Acetobacter tropicalis and lactic acid bacteria: Enterococcus faecium, Lactobacillus pentosus iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình trước Người nghiên cứu Phạm Phương Điền iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC HÌNH x MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan trà Kombucha 1.1.1 Nguồn gốc 1.1.2 Hệ vi sinh vật trà Kombucha 1.1.2.1 Nấm men trà Kombucha 1.1.2.2 Vi khuẩn acetic trà Kombucha 1.1.2.3 Vi khuẩn lactic trà Kombucha 1.1.3 Thành phần hóa học trà Kombucha 1.1.4 Cơ sở khoa học trình lên men trà Kombucha 10 1.1.5 Các hoạt tính sinh học q cơng dụng trà Kombucha 13 1.1.5.1 Hoạt tính kháng khuẩn 14 1.1.5.2 Hoạt tính probiotic 15 1.1.5.3 Hoạt tính kháng oxy hóa 16 1.1.5.4 Hoạt tính chống ung thư 17 1.1.5.5 Hoạt tính giải độc acid glucuronic 18 1.1.6 Những hạn chế trà Kombucha truyền thống 19 1.2 Các phương pháp phân tích hệ vi sinh vật lên men trà Kombucha 21 1.2.1 Phương pháp vi sinh truyền thống 21 1.2.2 Phân tích kỹ thuật điện di gel gradient biến tính (DGGE) 21 1.2.2.1 Cơ sở khoa học kỹ thuật DGGE 21 1.2.2.2 Những ưu điểm nhược điểm kỹ thuật DGGE 23 1.2.3 Một số kỹ thuật phân tích khác 23 1.3 Các nghiên cứu nước 24 1.3.1 Ngoài nước 24 v 1.3.2 Trong nước 25 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Thời gian địa điểm 27 2.2 Nguyên liệu, môi trường trang thiết bị 27 2.2.1 Nguyên liệu thực 27 2.2.2 Hóa chất, mơi trường trang thiết bị 27 2.2.2.1 Hóa chất, mơi trường 27 2.2.2.2 Trang thiết bị 28 2.3 Phương pháp nghiên cứu 29 2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 29 2.3.2 Phương pháp thí nghiệm 30 2.3.2.1 Phương pháp lấy mẫu trà Kombucha 30 2.3.2.2 Phân lập xác định mật độ vi sinh vật mẫu trà Kombucha 30 2.3.2.3 Kiểm tra khuẩn lạc nhóm vi sinh vật hệ vi sinh vật lên men Kombucha 31 2.3.2.4 Đánh giá định danh chủng vi sinh vật phân lập 32 2.3.2.5 Phân tích hệ vi sinh vật kỹ thuật PCR-DGGE 33 2.3.2.6 Phân tích, so sánh kết tuyển chọn giống 36 2.3.2.7 Xây dựng lý lịch giống vi sinh vật phân lập từ trà Kombucha 36 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 37 3.1 Biến động mật độ hệ vi sinh vật lên men trà Kombucha 37 3.2 Kết phân lập hệ vi sinh vật lên men trà Kombucha phương pháp truyền thống 39 3.2.1 Kết phân lập nấm men 39 3.2.2 Kết phân lập vi khuẩn acetic 43 3.2.3 Kết phân lập vi khuẩn lactic 47 3.3 Kết phân tích hệ vi sinh vật lên men trà Kombucha kỹ thuật PCR – DGGE 49 3.3.1 Kết phân tích nấm men 49 3.3.2 Kết phân tích vi khuẩn 51 vi Kết giải trình tự chủng Pseudomonas geniculate Kết giải trình tự chủng Enterococcus faecium Kết giải trình tự chủng Lactobacillus pentosus PHỤ LỤC PHỤ LỤC ... TÀI: PHÂN TÍCH HỆ VI SINH VẬT LÊN MEN TRÀ KOMBUCHA II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Mục tiêu nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn, định danh hệ vi sinh vật lên men trà Kombucha nhằm làm tiền đề cho lên men. .. học trình lên men trà Kombucha Quá trình lên men trà Kombucha xảy trình: lên men ethanol, lên men acetic lên men lactic Lên men ethanol vai trò nấm men Enzyme invertase nấm men tiết thủy phân đường... chủng phân lập Phân tích hệ vi sinh vật lên men trà Kombucha kỹ thuật PCRDGGE Định danh chủng vi sinh vật phân lập phương pháp giải trình tự Phân tích, so sánh kết chọn lọc giống vi sinh vật lên men