ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC (HOÀN CHỈNH) Nghiên cứu đặc tính của Chitinase tự nhiên và biểu hiện Chitinase tái tổ hợp từ chủng nấm Lecanicillium Lecanii

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn PGS.TS Quyền Đình Thi, PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh, giúp đỡ cán Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Các số liệu luận án trung thực, phần kết công bố tạp chí chuyên ngành cho phép đồng tác giả, phần cịn lại chưa cơng bố cơng trình khác M Tác giả luận án ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn tới PGS.TS Quyền Đình Thi định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện hóa chất, thiết bị kinh phí để tơi hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh bảo, sửa luận án để tơi hồn thành luận án Tôi xin chân thành cảm ơn Phịng Cơng nghệ sinh học Enzyme, Viện Cơng nghệ sinh học giúp đỡ nghiệm chuyên môn cho trình thực nghiệm chia sẻ kinh Nghiên cứu sản xuất sử dụng chế phẩm từ nấm Lecanicillium thơn PGS.TS Quyền Đình Thi TS Vũ Văn Hạnh làm chủ nhiệm, 20102013 Tôi xin cảm ơn Khoa Khoa học Sự sống, Phòng Đào tạo Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi q trình Tơi xin cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa Giáo dục T -K , Khoa Sinh , Phịng Khoa học Cơng nghệ Hợp tác quốc tế, Ban Giám hiệu Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên bạn đồng nghiệp ủng hộ, tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành luận án Lời cảm ơn sau tơi xin dành cho gia đình người thân, bạn bè động viên giúp đỡ, tạo điều kiện cho tơi suốt q trình làm nghiên cứu sinh Tác giả luận án ii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC HÌNH ix DANH MỤC BẢNG xii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Những đóng góp luận án 1.1 Nấm Lecanicillium lecanii 1.2 Chitinase 1.2.1 Nguồn gốc chitinase 1.2.2 Phân loại chitinase 1.2.3 Cấu trúc trung tâm hoạt động chitinase 1.2.4 Cơ chế phản ứng chitinase 12 1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính chitinase 14 1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng tới trình sinh tổng hợp chitinase 16 1.3 Ứng dụng nấm L lecanii chitinase 19 1.3.1 Trong lĩnh vực nông nghiệp bảo vệ môi trường 19 1.3.2 Trong lĩnh vực y học 23 1.3.3 Trong lĩnh vực công nghệ sinh học 24 1.4 Một số nghiên cứu gen biểu gen mã hóa chitinase 25 1.4.1 Trên giới 25 1.4.2 Ở Việt Nam 29 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 33 2.1 Vật liệu hóa chất 33 2.1.1 Chủng giống 33 2.1.2 Thiết bị 33 2.1.3 Hóa chất 33 2.1.4 Dung dịch đệm 34 2.1.5 Môi trường nuôi cấy 34 2.1.6 Địa điểm nghiên cứu hoàn thành luận án 33 2.2 Phương pháp nghiên cứu 33 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy 33 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu enzyme/protein… 35 2.2.3 Các phương pháp sinh học phân tử 42 2.2.4 Các phương pháp thử nghiệm 47 2.2.7 Xử lý số liệu 49 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 50 3.1 Sàng lọc, kiểm tra khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase từ nấm L lecanii 50 3.1.1 Sàng lọc chủng nấm L lecanii sinh tổng hợp chitinase cao 50 3.1.2 Kiểm tra chủng nấm L lecanii 43H dựa vào đoạn gen 28S rRNA 50 3.1.3 Khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase 53 3.2 Tinh đánh giá đặc tính lý hóa chitinase từ chủng nấm L Lecanii 43H 61 3.2.1 Tinh chitinase 61 3.2.2 Đánh giá đặc tính lý hóa chitinase từ chủng nấm L lecanii 43H 64 3.3 Nhân dịng gen mã hóa chitinase từ chủng nấm L lecanii 43H 67 3.4 Biểu hiện, tinh đánh giá tính chất lý hóa rChit nấm men P pastoris X33 71 3.4.1 Thiết kế plasmid pPChit biểu gen Chit nấm men 71 3.4.2 Biểu chitinase tái tổ hợp nấm men P pastoris 72 3.4.3 Tinh rChit 77 3.4.4 Đánh giá đặc tính lý hóa rChit từ nấm men P pastoris X33 79 3.5 Thử nghiệm khả ức chế rệp nấm bệnh chitinase bào tử từ nấm L lecanii 85 3.5.1 Ảnh hưởng chitinase tới phát triển nấm bệnh hại trồng 85 3.5.2 Ảnh hưởng rChit tới khả phát triển rệp 87 3.5.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả phát triển sợi nấm 88 3.5.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả nẩy mầm bào tử nấm 89 3.5.5 Khả diệt rệp chủng nấm L lecanii 43H 90 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 93 KẾT LUẬN 93 KIẾN NGHỊ 93 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO 95 DANH MỤC PHỤ LỤC 114 vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tiếng Anh Tiếng Việt BLAST Basic local alignment search tool Phần mềm so sánh trình tự bp Base pair Cặp bazơ cDNA Complement DNA DNA bổ sung Chit Gene encoding chitinase Gen mã hóa chitinase CMC Cacboxyl methyl cellulose Cacboxyl methyl cellulose DEPC Diethylpyrocarbonate Diethylpyrocarbonate DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic DNase Deoxyribonuclease Enzyme thủy phân DNA dNTPs -Deoxynucleoside - Các nucleotide triphosphate ĐC Control Đối chứng IPTG Isopropyl-beta-D- Isopropyl-beta-D- thiogalactopyranoside thiogalactopyranoside EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid Axit ethylenediamine tetraacetic EtBr Ethidium bromide Ethidium bromide kb Kilo base Kilo base kDa Kilo Dalton Kilo Dalton M Marker Thang chuẩn OD Optical density Mật độ quang PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại gen RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic RNase Ribonuclease Enzyme thủy phân RNA RT-PCR Reverse transcription polymerase Phản ứng khuếch đại gen chain reaction rChit Recombinante chitinase Chitinase tái tổ hợp SDS- Sodium dodecyl sulfate Điện di biến tính protein gel PAGE Polyacrylamide gel polyacrylamide electrophoresis Taq Thermus aquaticus Thermus aquaticus TBE Tris boric acid EDTA Tris boric acid EDTA TE Tris EDTA Tris EDTA TEMED N,N,N ,N - N,N,N ,N - Tetramethylethylenediamine Tetramethylethylenediamine v/v Volume/volume Thể tích/thể tích w/v Weight/volume Khối lượng/thể tích DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Cấu trúc bậc chitinase từ nấm C immitis 10 Hình 1.2 Cấu trúc chitinase từ vi khuẩn Ralstonia sp A-471 11 Hình 1.3 Cơ chế xúc tác chitinase B từ vi khuẩn S mecescens 12 Hình 1.4 Cơ chế thủy phân β-chitin chitinase A từ vi khuẩn B circulans 13 Hình 2.1 Đường chuẩn nồng độ N-acetyl glucosamine theo phương pháp Miller 37 Hình 2.2 Các bước tinh chitinase 38 Hình 2.3 Đường chuẩn hàm lượng albumin huyết bị theo Bradford 39 Hình 2.4 Đồ thị Lineawever-Burk 40 Hình 2.5 Sơ đồ mơ tả vị trí gắn gen Chit vào genome nấm men P pastoris X33 47 Hình 3.1 Hoạt tính chitinase chủng nấm L lecanii 50 Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ khn DNA chủng nấm L lecanii 43H; Sản phẩm Plasmid Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp XhoI XbaI 51 Hình 3.3 Trình tự đoạn gen 28S rRNA phân loại trình tự gen 28S rRNA từ chủng nấm L lecanii 43H với lồi khác…………………… 52 Hình 3.4 Ảnh hưởng thời gian nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp chitinase 53 Hình 3.5 Ảnh hưởng nồng độ chitin huyền phù nguồn nitơ đến khả sinh tổng hợp chitinase 55 52 Henrissat B., Bairoch A (1993), "New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities", Biochem J., 293, pp 781-788 53 Huang C J., Chen C Y (2004), "Gene cloning and biochemical characterization of chitinase CH from Bacillus cereus 28-9", Ann Microbiol., 54, pp 289-297 54 Huang J H., Chen C J., Su Y C (1996), "Production of chitinolytic enzymes from a novel species of Aeromonas", J Ind Microbiol., 17, pp 89-95 55 Ike M., Nagamatsu K., Shioya A., Nogawa M., Ogasawara W., Okada H., Morikawa Y (2006), "Purification, characterization, and gene cloning of 46 kDa chitinase (Chi46) from Trichoderma reesei PC-3-7 and its expression in Escherichia coli", Appl Microbiol Biotechnol., 71, pp 294-303 56 Iten W., Matile P (1970), "Role of chitinase and other lysosomal enzymes of Coprinus lagopus in the autolysis offruiting bodies", J Gen Microbiol., 61, pp 301-309 57 Jang MK, Kong B G., Jeong Y I., Lee C H., Nah J W (2004), "Physicochemical characterization of α-chitin, β-chitin, and γ-chitin separated from natural resources", J polym sci A polym chem., 42, pp 3423–3432 58 Jang M S., Lee Y M., Cho Y S., Choi Y L., Kim C H., Lee Y C (2005), "Overexpression and characterization of a novel chitinase gene from a marine bacterium Pseudomonas sp BK1", Indian J Biochem Biophys., 42, pp 339-344 59 Johansen J S (2006), "Studies on serum YKL-40 as a biomarker in diseases with inflammation, tissue remodeling, fibroses and cancer", Dan Med Bull., 53, pp 172-209 60 Johnson D L., Huang H C., Harper A M (1988), "Mortality of grasshoppers (Orthoptera: Acrididae) inoculated with a Canadian isolate of the fungus Verticillium lecanii", J Invertebr Pathol., 52, pp 335-42 61 Kang S C., Park S., Lee D G (1999), "Purification and characterization of a novel chitinase from the entomopathogenic fungus, Metarhizium anisopliae", J Invertebr Pathol., 73, pp 276-281 62 Kao P M., Huang S C., Chang Y C., Liu Y C (2007), "Development of continuous chitinase production process in a membrane bioreactor by Paenibacillus sp CHE-N1", Process Biochemistry, 42, pp 606-611 63 Kern M S F., Vom E D., Schrank A., Vainstein M H., Pasquali G (2010), "Expression of a chitinase gene from Metarhizium anisopliae in tobacco plants confers resistance against Rhizoctonia solani", Appl Biochem Biotechnol., 160, pp 1933-46 64 Khan M A., Rifat H., Mahboob A., Abdin M Z., Saleem J (2010), "Optimization of culture media for enhanced chitinase production from a novel strain of Stenotrophomonas maltophilia using response surface methodology", J Microbiol Biotechnol., 20, pp 1597-1602 65 Kiely T., Donaldson D., Grube A (2004), "Pesticides industry sales and usage, 2000 and 2001 market estimates", United States Environmental Protection Agency, pp 15-20 66 Kim C H., Tzu H., Chung S L., Ying T C., Chun Y L (2011), "The chitinolytic activities of Streptomyces sp TH-11", Int J Mol Sci., 12, pp 56-65 67 Kim H S., Timmis K N., Golyshin P N (2007), "Characterization of a chitinolytic enzyme from Serratia sp KCK isolated from kimchi juice", Appl Microbiol Biotechnol., 75, pp 1275-1283 68 Kim H Y., Lee H B., Kim U C., Kim I S (2008), "Laboratory and field evaluations of entomopathogenic Lecanicillium attenuatum CNU-23 for 110 control of green peach aphid (Myzus persicae)", J Microbiol Biotechnol., 18, pp 1915-1918 69 Kim J J (2004), "Pathologycal studies of Verticillium lecanii on the Cotton Aphid control", Agricultural Biology, pp 70 Kim J J., Kim C K (2008), "Selection of a highly virulent isolate of Lecanicillium attenuatum against cotton aphid", J Asia Pac Entomol., 11, pp 1-4 71 Kim J J., Lee M H., Yoon C S., Kim H S., Yoo J K., Kim K C (2001), "Control of Cotton aphid and greenhouse whitefly with a fungal pathogen, in biological control of greenhouse Pests", Food & Fertilizer Technology Center: Taipei, Taiwan, pp 8-15 72 Kim K J., Yang Y J., Kim J G (2003), "Purification and characterization of chitinase from Streptomyces sp M-20", J Biochem Mol Biol., 36, pp 185-189 73 Koga D., Isogai A., Sakuda S., Matsumoto S., Suzuki A., Kimura S (1987), "Specific inhibition of Bombyx mori chitinase by allosamidin", Agric Biol Chem., 51, pp 471-476 74 Kolla J P., Narayana., Muvva V (2009), "Chitinase production by Streptomyces sp ANU 6277", Braz J Microbiol., 40, pp 725-733 75 Kopparapu N K., Zhou P., Zhang S., Yan Q., Liu Z., Jiang Z (2012), "Purification and characterization of a novel chitinase gene from Paecilomyces thermophila expressed in Escherichia coli", Carbohydr Res., 347, pp 155-60 76 Kramer K J., Muthukrishnan S., Lowell J., White F (1997), "Chitinases for insect control In: N Carozzi, M Koziel (eds): Advances in insect conml: the role of transgenic plants", Taylor and Francis, Bristol, pp 185-193 77 Kuzu S B., Guvenmez H K., Denizci A A (2012), "Production of a thermostable and alkaline chitinase by Bacillus thuringiensis sp kurstaki strain HBK-51", Biotechnol Res Int., 2012, pp 1-6 78 Laemmli U K (1970), "Clevage of structure proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", Nature, 227, pp 680-685 79 Lee Y G (2002), "Selection of a highly virulent Verticillium lecanii strain against Trialeurodes vaporariorum at various temperatures", J Microbiol Biotechnol., 12, pp 145-148 80 Lee Y G., Chung K C., Wi S G., Lee J C., Bae H J (2009), "Purification and properties of a chitinase from Penicillium sp LYG 0704", Protein Expr Purif., 65, pp 244-250 81 Li D C., Chen S., Jing L U (2005), "Purification and partial characterization of two chitinases from the mycoparasitic fungus Talaromyces flavus", Mycopathologia, 159, pp 223-229 82 Lineweaver H., Burk D (1934), "The determination of enzyme dissociation constants", J Am Chem Soc., 56, pp 658-666 83 Liu B L., Kao P M., Tzeng Y M (2003), "Production of chitinase from Verticillium lecanii F091 using submerged fermentation", Enzyme Microb Technol, 33, pp 410–415 84 Lu Z X., Laroche A., Huang H C (2005), "Isolation and characterization of chitinases from Verticillium lecanii", Can J Microbiol, 51, pp 1045-1055 85 Luciana F F., Haroldo Y K., Hélia H S (2009), "Production, purification and application of extracellular chitinase from Cellulosimicrobium cellulans 191", Braz J Microbiol., 40, pp 623-630 86 Ma G Z., Gao H N., Zhang Y H., Li S D., Xie S D., Wu S J (2012), "Purification and characterization of chitinase from Gliocladium catenulatum strain HL-1-1", Afr J Microbiol Res., 6, pp 4377-4383 87 Mathivanan N., Kabilan V., Murugesan K (1998), "Purification, characterization, and antifungal activity of chitinase from Fusarium chlamydosporum, a mycoparasite to groundnut rust, Puccina arachidis", Can J Microbiol., 44, pp 646-651 88 Matroudi S., Zamani M R., Motallebi M (2008), "Molecular cloningf of chitinase 33 (CHIT33) gene from Trichoderma atroviride", Braz J Microbiol., 39, pp 433-437 89 Matsumiya M., Miyauchi K., Mochizuki A (1998), "Distribution of chitinase and b-N-acetylhexosaminidase in the organs of a few squid and a cuttlefish", Fish Sci., 64, pp 166–167 90 Matsumiya M., Mochizuki A (1996), "Distribution of chitinase and b-Nacetylhexosaminidase in the organs of several fishes", Fish Sci., 62, pp 150–151 91 Mayorga-Reyes L., Calderon-Garza E., Gutierrez-Nava A., GonzalezCervantes R., Azaola-Espinosa A., Barranco-Florido E (2012), "Characterization and expression of the chitinase chitII gene from Lecanicillium lecanii in solid-state fermentation", Rev Mex Ing Quim., 11, pp 97-104 92 Miller G L (1959), "Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars", Anal Chem., 31, pp 426-428 93 Milner R J (1997), "Prospects for biopesticides for aphid control", Biocontrol, 42, pp 227-239 94 Mizoguchi E (2006), "Chitinase 3-like-1 exacerbates intestinal inflammation by enhancing bacterial adhesion and invasion in colonic epithelial cells", Gastroenterology, 130, pp 398-411 95 Moazami N p (2002), "Biopesticides production, in Encyclopedia of Biological physiological and Health Sciences, Encyclopedia of life support systems", Encyclopedia Of Life Support Systems, pp 1-52 96 Mustafa U., Kaur G (2010), "Studies on extracellular enzyme production in Beauveria Bassiana isolates", Res India Publications, 6, pp 701-713 97 Nawani N N., Kapadnis B P (2005), "Optimization of chitinase production using statistics based experimental designs", Process Biochemistry, 40, pp 651-660 98 Nirala N K., Das D K., Srivastava P S., Sopory S K., Upadhyaya K C (2010), "Expression of a rice chitinase gene enhances antifungal potential in transgenic grapevine (Vitis vinifera L.)", Vitis, 49, pp 181-187 99 Okay S., Özdal M., Kurbnoğlu E B (2013), "Characterization, antifungal activity, and cell immobilization of a chitinase from Serratia marcescens MO-1", Turk J Biol., 37, pp 639-644 100 Okazaki K., Kawabata T., Nakano M., Hayaka S (1999), "Purification and properties of chitinase from Arthrobacter sp.NHB-10", Biosci Biotechnol Biochem., 63, pp 1644-1646 101 Okey Z (2005), "Clonging of chitinase a gene (ChiA) from Serratia marcescens BN10 and its expression in coleoptera-specific Bacillus thuringiensis", The graduate School of Natural and AppliedSciences of Middle East Technical University, pp 15-20 102 Park H., Kim K (2010), "Selection of Lecanicillium strains with high virulence against developmental stages of Bemisia tabaci", Mycobiology, 38, pp 210-214 103 Park J K., Morita K., Fukumoto I., Yamasaki Y., Nakagawa T., Kawamukai M., Matsuda H (1997), "Purification and characterization of the chitinase (Chi A) from Enterobacter sp G-1", Biosci Biotechnol Biochem., 61, pp 684-689 104 Park S K., Cho H W., Heo K W., Hur D Y., Lee H K (2009), "Role of acidic mammalian chitinase and chitotriosidase in nasal polyps", Otolaryngol Head Neck Surg, 141, pp 462-6 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 105 Patil N S., Waghmareb S R., Jadhav J P (2013), "Purification and characterization of an extracellular antifungal chitinase from Penicillium ochrochloron MTCC 517 and its application in protoplast formation", Process Biochemistry, 48, pp 176-183 106 Patil R S., Ghormade V V., Deshpande M V (2000), "Chitinolytic enzymes: an exploration", Enzyme Microb Technol., 26, pp 473–483 107 Pe’er S., Chet I (1990), "Trichoderma protoplast fusion; a tool for improving biocontrol agents", Can J Microbiol., 36, pp 6-9 108 Prasad M., Palanivelu P (2012), "Overexpression of a chitinase gene from the Thermophilic Fungus, Thermomyces lanuginosus in Saccharomyces cerevisiae and characterization of the recombinant chitinase", J Microb Biochem Technol., 4, pp 86-91 109 Purwani E Y., Maggy T S., Yaya R., Jae K H (2004), "Characteristics of thermostable chitinase enzymes from the indonesian Bacillus sp.1326", Enzyme Microb Technol., 35, pp 147-153 110 Rabeeth M., Anitha A., Srikanth G (2011), "Prufication of an antifungal endochitinase from a potential biocontrol agent Streptomyces grieus", Pak J Biol Sci., 14, pp 788-797 111 Ramirez-Coutino L., Espinosa-Marquez J., Peter M G., Shirai K (2010), "The effect of pH on the production of chitinolytic enzymes of Verticillium fungicola in submerged cultures", Bioresour Technol., 101, pp 9236-40 112 Ramirez-Coutino L., Marin-Cervantes M C., Huerta S., Revah S., Shirai K (2006), "Enzymatic hydrolysis of chitin in the production of oligosaccharides using Lecanicillium fungicola chitinases", Process Biochem., 41, pp 1106–1110 113 Ramli A N M., Mahadi N M., Rabu A., Murad A M A., Bakar F D A., Illias R M (2011), "Molecular cloning, expression and biochemical characterisation of a cold-adapted novel recombinant chitinase from Glaciozyma antarctica PI12", Microbial Cell Factories, 10, pp 94 114 Rana I A., Loerz H., Schaefer W., Becker D (2012), "Over expression of chitinase and chitosanase genes from Trichoderma harzianum under constitutive and inducible promoters in order to Increase disease resistance in Wheat (Triticum aestivum L)", Molecular Plant Breeding, 3, pp 37-49 115 Rast D M., Horsch M., Furter R., Gooday G W (1991), "A complex chitinolytic system in exponentially growing mycelium of Mucor rouxii properties and function", J Gen Microbiol., 137, pp 2797-2810 116 Rattanakit N., Plikomol A., Yano S., Wakayama M., Tachiki T (2002), "Utilization of shellfish waste as a substrate for solid-state cultivation of Aspergillus sp S1-13 evaluation of a culture based on chitinase formation which is necessary for chitin-assimilation", J Biosci Bioeng., 93, pp 550556 117 Revah-Moiseev S., Carroad P A (1981), "Conversion of the enzymatic hydrolysate of shellfish waste chitin to single-cell protein", Biotechnol Bioeng., 23, pp 1067-1078 118 Rocha-Pino Z., Vigueras G., Shirai K (2011), "Production and activities of chitinases and hydrophobins from Lecanicillium lecanii", Bioprocess Biosyst Eng., 34, pp 681-6 119 Rosenberger R F (1979), "Endogenous lytic enzymes and wall metabolism In: JH Burnett, APJ Trinci (eds): Fungal walls and hyphal growth", Cambridge University Press, pp 265-278 120 Ruiz-Sanchez A., Cruz-Camarillo R., Salcedo-Hernandez R., Ibarra J E., Barboza-Corona J E (2005), "Molecular cloning and purification of an endochitinase from Serratia marcescens (Nima)", Mol Biotechnol., 31, pp 103-111 121 Sambrook J., Russell D W (2001), "Molecular cloning: A laboratory manual", Cold spring harbor laboratory press: New York, 2, pp 1-21 122 Sandhya C., Adapa L K., Nampoothiri K M., Binod P., Szakacs G., Pandey A (2004), "Extracellular chitinase production by Trichoderma harzianum in submerged fermentation", J Basic Microbiol., 44, pp 49-58 123 Sanger F., Nicklen S., Coulson A R (1977), "DNA sequencing with chainterminating inhibitors", Proc Natl Acad Sci U S A., 74, pp 5463-5467 124 Shinde S V., Patel K G., Purohit M S., Pandya J R., Sabalpara A N (2010), "Lecanicillium lecanii (Zimm.) Zare and games an important biocontrol agent for the management of insect pests - areview", Agricultural Reviews, 31, pp 235-252 125 Singh A K., Mehta G., Chhatpar H S (2009), "Optimization of medium constituents for improved chitinase production by Paenibacillus sp D1 using statistical approach", Letters in Applied Microbiology, 49, pp 708-714 126 Songjang K., Donchai T., Chaiyawat P., Meyer C R (2006), "Cloning and expression of chitinase gene isolated from Insect pathogenic fungi, Beauveria bassiana in Escherichia coli", Chiang Mai J Sci., 33, pp 347-355 127 St Leger R J., Cooper R M., Charnley A K (1986), "Cuticle-degrading enzymes of entomopathogenic fungi: regultion of production of chitinolytic enzymes", J Gen Microbiol., 132, pp 1509-1517 128 St Leger R J., Cooper R M., Charnley A K (1991), "Characterization of chitinase and chitobiase produced by the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae", J Invertebr Pathol., 58, pp 415-426 129 Sundheim L (1990), "Biocontrol of Fusarium oxysporum with a chitinase encoding gene from Sermtia marcescens on a stable plasmid in Pseudomonas", J Cell Biochem., 13A, pp 171 130 Sutherland T E., Maizels R M., Allen J E (2009), "Chitinases and chitinase-like proteins: potential therapeutic targets for the treatment of Thelper type allergies", Clin Exp Allergy., 7, pp 943-55 131 Takao A T., Kawamoto N., Okazaki N., Nakazawa M., Miyatake K., Shinya S., Fukamizo T., Ueda M., Tamada T (2013), "Crystal structures of the catalytic domain of a novel glycohydrolase family 23 chitinase from Ralstonia sp A-471 reveals a unique arrangement of the catalytic residues for inverting chitin hydrolysis", J Bio Chem., 288, pp 18696-18706 132 Tanabe T., Kawase T., Watanabe T., Uchiada Y., Mitsutomi M (2000), "Purification and characterization of a 49-kDa chitinase from Streptomyces griseus HUT 6037", J Biosci Bioeng., 89, pp 27-32 133 Tang W., Li Y., Liu L., Zhang J., Xian H (2012), "Characterization and production optimization of a chitinase (Tachil) from Trichoderma asperellum in recombinant Pichia pastoris expression system", Wei Sheng Wu Xue Bao., 52, pp 345-352 134 Thiagarajan V., Revathia R., Aparanjinib K., Sivamanic P., Girilala M., Priyad C S., Kalaichelvana P T (2011), "Extra cellular chitinase production by Streptomyces sp PTK19 in submerged fermentation and its lytic activity on Fusarium oxysporum PTK2 cell wall", Int J Curr Sci., 1, pp 30-44 135 Thomas H., Arthur F M., Kara B., Stephen E., Rebecca C., Jon D R (2000), "The X-ray structure of a chitinase from the pathogenic fungus Coccidioides immitis", Cambridge University Press, 9, pp 544-551 136 Tikhonov V E., Lopez-Llorca L V., Salinas J., Jansson H.-B (2002), "Purification and characterization of chitinases from the nematophagous fungi Verticillium chlamydosporium and V suchlasporium", Fungal Genet Biol., 35, pp 67–78 137 Toharisman A., Suhartono M., Spindler-Barth M., Hwang J K., Pyun Y R (2005), "Purification and characterization of a thermostable chitinase from Bacillus licheniformis Mb-2", World J Microbiol Biotechnol., 21, pp 733-738 138 Tschen J S M., Li I F (1994), "Optimization of formation and regeneration of protoplasts from biocontrol agents of Trichoderma sp", Mycoscience, 35, pp 257-263 139 Tsujibo H., Yoshida Y., Miyamoto K., Imada C., Okami Y., Inamori Y (1992), "Purification, properties, and partial amino acid sequence from a marine Aeromonas sp strain O-7", Can J Microbiol., 38, pp 891-897 140 Uchiyama T., Katouno F., Nikaidou N., Nonaka T., Sugiyama J., Watanabe T (2001), "Roles of the exposed aromatic residues in crystalline chitin hydrolysis by chitinase A from Serratia marcescens 2170", J Biol Chem., 276, pp 41343-41349 141 Ulhoa C J., Peberdy J F (1991), "Regulation of chitinase synthesis in Trichoderma harzianum", J Gen Microbiol., 137, pp 2163-2169 142 Vladimir E., Tikhonov., Luis V., Lopez L., Jesus S., Hans-Borje J (2002), "Purification and characterization of chitinases from the Nematophagous Fungi Verticillium chlamydosporium and Verticillium suchlasporium", Fungal Genet Biol., 35, pp 67-78 143 Vu V H., Hong S I., Kim K (2007), "Selection of entomopathogenic fungi for aphid control", J Biosci Bioeng., 104, pp 498-505 144 Watanabe T., Kanai R., Kawase T., Tanabe T., Mitsutomi M., Sakuda S., Miyashita K (1999), "Family 19 chitinases of Streptomyces species: characterization and distribution", Microbiology., 145, pp 3353-3363 145 Xia J I., Xiong J., Xu T., Zhang C G., Zhang R I., Zhang Q., Wu S., Qiu G Z (2009), "Purification and characterization of extracellular chitinase from a novel strain Aspergillus fumigatus CS-01", J Cent South Unive Technol., 16, pp 552-557 146 Xiao L., Liu C., Xie C., Cai J., Liu D., Chen Y (2010), "Heterogeneous expression of chitinase gene from Bacillus licheniformis MY75 and the characterization of expressed ChiMY", Wei Sheng Wu Xue Bao., 50, pp 749-754 147 Zarei M., Aminzadeh S., Zolgharnein H., Safahieh A., Daliri M., Noghabi K A., Ghoroghi A., Motallebi A (2011), "Characterization of a chitinase with antifungal activity from a native Serratia marcescens B4A", Braz J Microbiol., 42, pp 1017-1029 148 Zeki N H., Muslim S N (2010), "Purification, characterization and antifungal activity of chitinase from Serratia marcescens isolated from fresh vegetables", J Pure Appl Sci., 23, pp 1-15 149 Zhang J., Cai J., Wu K., Jin S., Pan R., Fan M (2004), "Production and properties of chitinase from Beauveria bassiana Bb174 in solid state fermentation", Ying Yong Sheng Tai Xue Bao., 15, pp 863-866 150 Zhen X L., Laroche A., Hung C H (2005), "Isolation and characterization of chitinases from Verticillium lecanii", Can J Microbiol., 51, pp 1045-1055 151 Zhu Y., Pan J., Qiu J., Guan X (2008), "Isolation and characterization of a chitinase gene from entomopathogenic fungus Verticillium lecanii", Braz J Microbiol., 9, pp 314-320 120 PHỤ LỤC Bảng P1 Thành phần loại đệm dung dịch Dung dịch Thành phần, nồng độ (w/v) Dung dịch APS Ammonium persulfate 10% Dung dịch Bradford gốc 100 ml ethanol 95% (v/v), 350 mg serva blue G, 200 ml phosphoric acid 88% (v/v) Dung dịch Bradford 425 ml H2O, 15 ml ethanol 95% (v/v), 30 ml working phosphoric acid 88% (v/v), 30 ml dung dịch Bradford gốc Dung dịch A Đệm Tris-HCl 1,5M, pH 8,8 Dung dịch B Đệm Tris-HCl 0,5M, pH 6,8 Dung dịch C Acrylamide 30%, bis-acrylamide 0,8% Dung dịch D SDS 10% Dung dịch DNS DNS 0,53%, NaOH 0,99%, KNaC4H4O6 15,3%, Na2S2O5 0,415%, phenol 0,38% (v/v) Dung dịch I Tris-HCl 100 mM, EDTA 10 mM, pH 8,0 Dung dịch II NaOH 0,2 N, SDS 1% Dung dịch III Kali acetate 60%, acid acetic 11,5% (v/v), nước 28,5% Dung dịch nhuộm DNA Ethidium bromide 0,1 g/ml Dung dịch nhuộm Coomassie brilliant blue 0,1%, methanol 30% PAGE (v/v), acid acetic 10% Dung dịch tẩy PAGE Methanol 30% (v/v), acid acetic 10% (v/v) Đệm điện di protein Tris-HCl 20 mM, glycine 192 mM, SDS 0,1%, pH 8,8 Đệm 5x tra mẫu protein Brommophenol blue 0,05%, glycerol 50% pha đệm Tris-HCl M, pH 6,8 Đệm TE Tris-HCl 10 mM, EDTA mM, pH Đệm 10x TBE EDTA 20 mM, Tris-borate 900 mM, pH Đệm 6x tra mẫu DNA Brommophenol blue 0,09%, glycerol 60% Đệm rửa DNA Ethanol 70% (v/v) 0,09%, xylene xyanol ... phát từ lý trên, tiến hành lựa chọn đề tài luận án: ? ?Nghiên cứu đặc tính chitinase tự nhiên biểu chitinase tái tổ hợp từ chủng nấm Lecanicillium lecanii? ?? Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu chung nấm. .. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 50 3.1 Sàng lọc, kiểm tra khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase từ nấm L lecanii 50 3.1.1 Sàng lọc chủng nấm L lecanii sinh tổng hợp chitinase. .. Tinh chitinase 61 3.2.2 Đánh giá đặc tính lý hóa chitinase từ chủng nấm L lecanii 43H 64 3.3 Nhân dòng gen mã hóa chitinase từ chủng nấm L lecanii 43H 67 3.4 Biểu hiện,