Báo cáo đề tài nghiên cứu khao học sinh viên: Khảo sát đa dạng di truyền và xác lập chỉ thị phân tử cho việc nhận dạng một số dòng Bơ (persea americana miller) đã qua sơ bộ tuyển chọn tại Lâm Đồng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT KHOA SINH HỌC BÁO CÁO ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN ĐỀ TÀI KHẢO SÁT ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC LẬP CHỈ THỊ PHÂN TỬ CHO VIỆC NHẬN DẠNG MỘT SỐ DÒNG BƠ (Persea americana Miller) ĐÃ QUA SƠ BỘ TUYỂN CHỌN TẠI LÂM ĐỒNG Giáo viên hướng dẫn: LÊ NGỌC TRIỆU Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HOÀNG PHONG (CSK 38) NGUYỄN THANH TIỀN (CSK 38) MAI TIẾN ĐẠT (CSK 39) THÁI THẠCH BÍCH (CSK 39) ĐẶT VẤN ĐỀ   Đánh giá đa dạng di truyền, xác lập thị phân tử với khảo sát hình thái đặc điểm nơng học tập đoàn giống tiến hành phổ biến đối tượng tài nguyên thực vật Đây công việc cần thiết nhằm làm tăng hiệu cho trình nhận dạng, phát triển chọn tạo giống trồng Bơ loại ăn có giá trị kinh tế cao, có tiềm phát triên Lâm Đồng Đã có nhiều chủng giống bơ trồng nơi sở liệu cho việc nhận dạng, chọn tạo cơng nhận giống cịn chưa hồn thiện, cần phải nghiên cứu thêm Trước mặt cần triển khai ghi nhận đặc điểm sơ hình thái suất dòng bơ phát triển; đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn xác lập thị phân tử cho việc nhận dạng dòng bơ tiềm nhằm: - Bổ sung cho sở liệu nhận dạng dòng trưởng thành từ giai đoạn vườn ươm - Tạo sở cho chiến lược chọn tạo phát triển giống Đó lý đề tài đăng ký triển khai thực Vật liệu: Qua khảo sát ban đầu, có nhiều dịng/giống bơ nhập nội chọn tạo nước canh tác Lâm Đồng Tuy có 11 dịng bơ chọn tạo nước phát triển Đây đối tượng nghiên cứu đề tài 11 dòng khảo sát đặc điểm suất hình thái đánh giá đa dạng di truyền gồm: 04 05 Hải triều Hải Triều 34 36 34 lai HO TO BM00 BM02 Trong đó, 06 dịng cần xác lập thị phân tử, gồm: 04 05 Hải triều Hải Triều 34 36 Nội dung, phương pháp kết Nội dung 1: Ghi nhận sơ đặc điểm hìnhnghiên thái nơng cứu học dịng bơ khảo sát Phương pháp: Dựa vào liệu ghi nhận thực tế thu thập thông tin từ người dân, nhà nghiên cứu, kinh doanh bơ, đặc biệt tham khảo kết nghiên cứu Trung tâm Nghiên cứu phát triển trồng thành phố Bảo Lộc Các đặc điểm ghi nhận gồm: + Đặc điểm quả: màu sắc, độ dày vỏ, chất lượng thịt quả, kích thước hạt, trọng lượng hình dạng chung + Đặc điểm suất thông qua phiếu hỏi Kết quả: DÒNG BƠ 04 Địa thu mẫu: Đức Giang – Bảo Lâm Năng suất: 300kg/cây/năm Quả thon dài, thịt vàng nhạt, ráo, dẻo Khi chín vỏ màu xanh Cỡ hạt: Trung bình DỊNG BƠ 05 Địa thu mẫu: Thôn – Tâm châu – Di Linh Năng suất: 220kg/cây/năm Thịt qủa vàng, hạt nhỏ Quả thn dài Vỏ chín có màu xanh Cỡ hạt: Trung bình Trọng lượng trung bình: 600g DỊNG BƠ 34 Địa thu mẫu: khu – Phường B’Lao – Bảo Lộc Năng suất: khoảng 300kg/cây/năm Chín vỏ da màu xanh thn dài, cơm vàng, hạt bé ( có trái không hạt ) Chiều dài từ 25 cm đến 35 cm Khối lượng từ 300g đến 800g DÒNG BƠ 34 LAI Địa thu mẫu: Trang trại giống bơ Hải Triều – Đambri – Bảo Lộc Năng suất: khoảng 250kg/cây/năm Khi chín vỏ có màu xanh, trịn Hạt trung bình, khơng dính vỏ DỊNG BƠ 036 Địa thu mẫu: Trang trại PGS Nguyễn Văn Kết - Đức Trọng- Lâm Đồng Năng suất: 200- 300 kg/cây/năm Vỏ chín có màu xanh, hình bầu dục, thịt dày màu vàng đậm, dẻo, béo Trọng lượng trung bình 750g Kích cỡ hạt: Trung bình DỊNG BƠ BM00 Địa thu mẫu: Trang trại PGS Nguyễn Văn Kết Đức Trọng- Lâm Đồng Năng suất: 160 – 180 kg/cây/năm Trọng lượng quả: 380 – 450 g Vỏ già màu tím, mỏng, nhẵn bóng, cơm dày, sơ Kích cỡ hạt: Trung bình DỊNG BƠ BM02 Địa thu mẫu: Trang trại PGS Nguyễn Văn Kết Đức Trọng- Lâm Đồng Năng suất: 140 – 180 kg/cây/năm Trọng lượng quả: 180 – 200 g Quả hình trịn Vỏ chín xanh, sần, Kích cỡ hạt: Trung bình DỊNG BƠ HẢI TRIỀU Địa thu mẫu: Trang trại giống bơ Hải Triều – Đambri - Bảo Lộc Năng suất: Vẫn chưa rõ Màu chín : Xanh Hình hạng quả: Oval dài Thịt quả: Vàng nhạt, khơng sơ, đặc Hạt: Trịn, khơng lắc Khối lượng quả: 250- 475g DỊNG BƠ HẢI TRIỀU Địa thu mẫu: Trang trại giống bơ Hải Triều – Đambri - Bảo Lộc Năng suất: 650 kg/cây/năm Màu chín : Xanh Hình hạng quả: Oval dài -Hạt: Dính thịt , khơng lắc, hình trịn -Khối lượng quả: 420- 680g Nội dung 2: Tách chiết, kiểm tra nồng độ chất lượng DNA DNA từ mẫu tách chiết theo quy trình CTAB I có cải tiến (bổ sung SDS 10% vào đệm chiết) DNA sau tách chiết kiểm tra nồng độ chất lượng phương pháp kiểm tra mật độ quang bước sóng 260nm 280nm Kết + 11 mẫu DNA 11 dòng bơ khảo sát, có dịng cần phát triển marker nhận dạng với mẫu/dòng tách chiết tinh + Các mẫu DNA sau tách chiết đạt độ tinh cao với lượng đủ cho thực nghiệm Nội dung 3: Làm nảy sinh đặc trưng nhận dạng DNA dựa PCR Phương pháp: Sử dụng kỹ thuật ISSR (Khuếch đại đoạn trình tự lặp đơn giản) để làm nảy sinh đặc trưng nhận dạng DNA với 10 mồi sử dụng sau: STT Tên mồi Trình tự Ta (0C) 10 ISSR 808 ISSR 844B ISSR 17899B HB9 HB14 HB13 UBC 856C UBC 856T UBC 873 UBC 859G Tổng thể 5' –(AG)8 C-3' 5' –(CT)8 GC-3' 5'-(CA)6 GG-3' 5'-(GT)6 GG-3' 5'-(CTC)3 GC-3' 5'-(GAG)3 GC-3' 5'-(AC)8 CA-3' 5'-(AC)8 TA-3' 5'-(GACA)4 -3' 5' –(TG)8 GC-3' 52 52 54 52 52 52 52 52 52 51,5 Số band ghi nhận cho đánh giá đa dạng di truyền11 dòng bơ 10 16 10 11 11 15 98 Số band ghi nhận cho việc xác lập thị phân tử nhận dạng dòng bơ 17 18 12 14 11 10 14 13 14 02 125 Khuếch đại DNA: Phản ứng PCR thực với dung tích 20 µl chứa mM MgCl2, 0.25 mM loại dNTP, 1U Taq DNA polymerase (ThermoScientific), 0.2 µM mồi khoảng 30 ng khn mẫu DNA, BSA 0.5% Chương trình nhiệt sau: 94 0C phút; 10 chu kỳ, chu kỳ có tiến trình nhiệt 94 0C 45 giây Nhiệt độ bắt mồi thích hợp +5 (Ta +5) 0C (Ta bảng trên) 45 giâygiảm dần 0,5 0C/chu kỳ Kéo dài mạch 720C phút 30 giây; 36 chu kỳ, chu kỳ có tiến trình nhiệt 94 0C 45 giây Nhiệt độ bắt mồi thích hợp (Ta) 45 giây Kéo dài mạch 720C phút 30 giây Bước kéo dài mạch cuối 720C 15 phút (Touchdown PCR) Điện di, chụp ảnh gel: Sản phẩm khuếch đại phân tách gel agarose 2%, sử dụng đệm TBE với điện 60 Volt, gel sau điện di nhuộm với ethidium bromide (0.5 µg/ml), chụp ảnh ánh sáng cực tím có bước sóng 254/312 nm Kết quả: Ảnh gel Đặc trưng nhận dạng DNA phục vụ cho đánh giá đa dạng di truyền 11 dòng bơ theo 10 mồi Mồi ISSR 808 Mồi ISSR 844B Mồi ISSR 856C Mồi ISSR 856T Mồi ISSR 17899B Mồi ISSR HB13 Mồi ISSR UBC859G Mồi ISSR UBC873 Mồi ISSR HB9 Mồi ISSR HB14 Ghi chú: 1: dòng 04, 2: dòng 05, 3: dòng Hải Triều 2, 4: dòng Hải Triều 1, 5: dòng 34; 6: dòng 36; 7: dòng 34 lai; 8: dòng HO, 9: dòng TO; 10: dòng BM00, 11: dòng BM020 Ảnh gel Đặc trưng nhận dạng DNA phục vụ cho việc xác lập marker phân tử nhận dạng 06 dòng bơ theo 10 mồi Mồi ISSR 808 Mồi ISSR 844B Mồi ISSR 856C Mồi ISSR 856T Mồi ISSR 17899B Mồi ISSR HB9 Mồi HB13 Mồi HB14 Mồi ISSR UBC873 Mồi ISSR UBC859G Ghi chú: 1, 2, 3: mẫu dòng 04; 4, 5, 6: mẫu dòng 05; 7, 8, 9: mẫu dòng Hải Triều 2; 10, 11, 12: mẫu dòng Hải Triều 1; 13, 14, 15: mẫu dòng 34; 16, 17, 18: mẫu dòng 36 Dựa xuất hay vắng mặt band gel, thiết lập ma trận 0/1 để đánh giá đa dạng xây dựng marker cho việc nhận dạng dòng Nội dung 4: Đánh giá đa dạng di truyền Sử dụng phương pháp đánh giá đa dạng di truyền tập hợp mẫu de Vicente cs., 2003 với công cụ Microsoft Excel, tiêu: Tỷ lệ % band đa hình: Cơng thức tính : PPB = npj/ntotal × 100 Với npj số lượng band đa hình ntotal tổng số band ghi nhận Mức độ dị hợp trung bình: Cơng thức tính : He = ΣjLhj/L; hj = – Σ(pi)2 Với hj mức độ dị hợp tử locus thứ j, pi tần số allele thứ i locus thứ j, He mức độ dị hợp trơng đợi trung bình cho tất locus khảo sát L tổng số locus Ngoài ra, phần mềm Popgen32 sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền tập hợp dòng bơ khảo sát, hai số đa dạng số đa dạng gene (h) số đa dạng Shannon (I) cho tập hợp mẫu thu Kết Sử dụng công cụ Excel với cơng thức trình bày trên, thu kết đa dạng di truyền tập hợp 11 mẫu khảo sát sau: + Tỷ lệ phần trăm band đa hình: PPB = 91,84% + Mức độ dị hợp trơng đợi trung bình: He = 0,3072 Sử dụng phần mềm Popgen 32, thu kết sau: + Chỉ số đa dạng gene (tương ứng với mức độ dị hợp trơng đợi trung bình): h = 0,3072 + Chỉ số Shannon: I = 0,4608 Mức độ đa dạng di truyền tập hợp mẫu nghiên cứu thấp so với nghiên cứu trước với tập hợp mẫu lớn dòng/giống bơ thu thập từ nhiều nơi giới Điều cho thấy dịng bơ phát triển nội địa khảo sát địa bàn tỉnh Lâm Đồng có nguồn gốc gần Nội dung 5: Xây dựng marker phân tử cho việc nhận dạng 06 dòng bơ tiềm Phương pháp: Dựa Kết phân tích ảnh điện di ma trận liệu xuất hiện/thiếu vắng band cách đặc biệt gel điện di, hai kiểu thị phân tử đơn kép xác định để nhận dạng dòng Kết  Với cách thức trên, thị đơn 25 thị kép xác định để nhận dạng 06 dòng bơ khảo sát, cụ thể: + Nhận dạng dòng 04: Vắng band 520bp mồi UBC 873; Vắng band 700bp mồi UBC 856T (02 thị đơn); Vắng band 280bp mồi UBC873 đồng thời có band 400bp mồi 17899B; Vắng band 280bp mồi UBC873 đồng thời có band 400bp mồi UBC 856C; Vắng band 280bp mồi UBC873 đồng thời có band 540bp mồi 808; Vắng band 280bp mồi UBC873 đồng thời vắng band 750bp mồi 17899B Vắng band 280bp mồi UBC873 đồng thời vắng band 1500bp mồi HB13 (07 thị kép) + Nhận dạng dòng 05: Vắng band 580bp mồi HB9 đồng thời có band 400bp mồi 17899B; Vắng band 580bp mồi HB9 đồng thời có band 400bp mồi UBC 856C; Vắng band 580bp mồi HB9 đồng thời có band 540bp mồi 808; Vắng band 580bp mồi HB9 đồng thời vắng band 750bp mồi 17899B Vắng band 580bp mồi HB9 đồng thời vắng band 1500bp mồi HB13 (chỉ có 05 thị kép) + Nhận dạng dòng Hải Triều 2: Vắng band 400bp mồi 17899B; Vắng band 400bp mồi UBC 856C; Vắng band 540bp mồi 808; Có band 750bp mồi 17899B Có band 1500bp mồi HB13 (05 thị đơn); Có band 890bp mồi HB9 vắng band 700bp mồi 17899B; Vắng band 280bp mồi UBC 873 có band 520bp mồi UBC 873 Vắng band 280bp mồi UBC 873 có band 700bp mồi UBC 856T (03 thị kép) Kết + Nhận dạng dịng Hải Triều 1: Có band 790bp mồi HB14 đồng thời có band 400bp mồi 17899B; Có band 790bp mồi HB14 đồng thời có band 400bp mồi UBC 856C; Có band 790bp mồi HB14 đồng thời có band 540bp mồi 808; Có band 790bp mồi HB14 đồng thời vắng band 750bp mồi 17899B; Có band 790bp mồi HB14 đồng thời vắng band 1500bp mồi HB13 Có band 500bp mồi 844B đồng thời vắng band 700bp mồi 17899B (chỉ có 06 thị kép) + Nhận dạng dịng 34: Có band 700bp mồi 17899B (01 thị đơn); Có band 890bp mồi HB9 đồng thời có band 400bp mồi 17899B; Có band 890bp mồi HB9 đồng thời có band 400bp mồi UBC 856C; Có band 890bp mồi HB9 đồng thời có band 540bp mồi 808; Có band 890bp mồi HB9 đồng thời vắng band 750bp mồi 17899B; Có band 890bp mồi HB9 đồng thời vắng band 1500bp mồi HB13 Có band 500bp mồi 844B đồng thời có band 890bp mồi HB9 có band 400bp mồi 17899B/ band 400bp mồi UBC 856C/ band 540bp mồi 808 vắng band 750bp mồi 17899B/ band 1500bp mồi HB13 (06 thị kép) + Nhận dạng dịng 36: Có band 220bp mồi HB9 (chỉ có 01 thị đơn) ...ĐỀ TÀI KHẢO SÁT ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC LẬP CHỈ THỊ PHÂN TỬ CHO VIỆC NHẬN DẠNG MỘT SỐ DÒNG BƠ (Persea? ?americana? ?Miller) ĐÃ QUA SƠ BỘ TUYỂN CHỌN TẠI LÂM ĐỒNG Giáo viên hướng... khai ghi nhận đặc điểm sơ hình thái suất dòng bơ phát triển; đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn xác lập thị phân tử cho việc nhận dạng dòng bơ tiềm nhằm: - Bổ sung cho sở liệu nhận dạng dòng trưởng... 54 52 52 52 52 52 52 51,5 Số band ghi nhận cho đánh giá đa dạng di truyền1 1 dòng bơ 10 16 10 11 11 15 98 Số band ghi nhận cho việc xác lập thị phân tử nhận dạng dòng bơ 17 18 12 14 11 10 14 13