Nghiên cứu và nâng cao khả năng sinh tổng hợp các chất có tính hoạt kháng nấm từ chủng serratia marcescens DT3

Đại học quốc gia hà nội Tr-ờng đại học khoa häc tù nhiªn *** TRẦN THỊ THÙY LINH NGHIÊN CỨU VÀ NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CÁC CHẤT CĨ HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM TỪ CHỦNG Serratia marcescens DT3 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội 2016 Đại học quốc gia hà nội Tr-ờng đại häc khoa häc tù nhiªn *** TRẦN THỊ THÙY LINH NGHIÊN CỨU VÀ NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CÁC CHẤT CĨ HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM TỪ CHNG Serratia marcescens DT3 Chuyên ngành: Sinh hc thc nghim LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Giảng viªn h-íng dÉn: TS Đỗ Thị Tuyên TS Lê Hồng Điệp Hà Nội - 2016 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học MỞ ĐẦU Hàng năm giới, bệnh gây tổn thất to lớn cho sản xuất nông nghiệp Chúng phá hủy đến 537,3 triệu loại nông sản chủ yếu, chiếm 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp giới Trong loại bệnh bệnh nấm gây chiếm khoảng 83%, bệnh nấm Fusarium Rhizoctonia chiếm tỉ lệ tương đối lớn Nấm bệnh Fusarium Rhizoctonia gây bệnh nhiều loại rau lương thực lạc cà chua, khoai tây, cà phê, tiêu Chúng có khả tồn đất thời gian dài, phát sinh gây hại từ giai đoạn kéo dài thu hoạch khơng áp dụng biện pháp phịng trừ triệt để Biện pháp phòng trừ bệnh hại trồng phổ biến sử dụng loại thuốc hóa học Mặc dù có ưu điểm phổ tác dụng rộng, hiệu tác dụng nhanh thuốc hóa học ngày bộc lộ rõ nhược điểm hiệu ngày gây nhiễm mơi trường Chính việc sử dụng chế phẩm sinh học để phòng trừ bệnh trồng vi sinh vật gây xu hướng chủ yếu Các chế phẩm sử dụng rộng rãi nhằm tạo nơng nghiệp hữu an tồn bền vững Serratia giống trực khuẩn Gram âm, kị khí tùy nghi, họ Enterobacteriaceae Chúng có khả sinh chất có hoạt tính kháng nấm sử kiểm soát nhiều bệnh hại trồng khác Trên giới có nhiều cơng trình nghiên cứu ứng dụng Serratia để phòng trừ nấm để bảo vệ trồng, nhiều sản phẩm sản xuất thương mại hóa Tuy nhiên, kết đạt nghiên cứu sử dụng chế phẩm sinh học hạn chế Chi phí thuốc bảo vệ thực vật giới chiếm 1,9% tổng giá trị loại thuốc bảo vệ thực vật Vì vậy, việc tăng cường nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học diệt nấm cần thiết Xuất phát từ nhu cầu thực tế thực đề tài: “Nghiên cứu nâng cao khả sinh tổng hợp chất có hoạt tính kháng nấm từ chủng Serratia marcescens DT3’’ nhằm thực nội dung nghiên cứu: Trần Thị Thùy Linh K22 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học Chọn lọc môi trường nuôi cấy chủng Serratia marcescens DT3 có khả sinh tổng hợp chất có hoạt tính kháng nấm cao Tối ưu môi trường điều kiện nuôi cấy làm tăng khả sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm Tách chiết, tinh hoạt chất có hoạt tính kháng nấm từ chủng Serratia marcescen DT3 Trần Thị Thùy Linh K22 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khuẩn Serratia 1.1.1 Khái quát chủng Serratia marcescens Serratia marcescens mười bốn lồi cơng nhận chi Serratia Serratia marcescens phát vào năm 1819 Ý Các chủng vi khuẩn Serratia marcescens phân bố đất, nước, thực vật Chúng phát triển nhiệt độ từ 5400C, pH từ 5-9 Chúng tác nhân gây bệnh cho người động vật nhiên bên cạnh số chủng Serratia marcescens lại sử dụng nghiên cứu y học, quân sự, nơng nghiệp…[31] Serratia marcescens vi khuẩn hình que Màng có cấu trúc đặc trưng vi khuẩn Gram âm, di động sinh bào tử có thành tế bào mỏng cấu tạo từ lớp peptidoglycan bao bọc lớp màng bên Các màng ngồi có lipopolysaccharides loại phospholipid đặc biệt gồm axit béo gắn vào dimer phosphate glucosamine Một glucosamine gắn liền với polysaccharides cốt lõi mà mở rộng đến polysaccharides O Các màng phương tiện để điều tiết hấp thụ chất dinh dưỡng loại trừ độc tố Chủng Serratia marcescen DT3 phân lập từ mẫu đất Việt Nam Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Chi: Serratia Lồi: Serratia marcescens Hình 1.1 Hình ảnh chủng Serratia marcescens DT3 môi trường LB đặc Trần Thị Thùy Linh K22 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học 1.2 Bệnh trồng nấm Fusarium Rhizoctonia gây 1.2.1 Đặc điểm sinh học nấm Fusarium Rhizoctonia hại trồng Fusarium họ lớn nấm sợi phân bố rộng rãi đất gắn với thực vật Hầu hết loài sống kí sinh vơ hại thành viên tương đối phong phú cộng đồng vi sinh vật đất Fusarium oxysporum phân tán rộng loài Fusarium tìm thấy tồn giới F oxysporum khơng có giai đoạn sinh dục điển hình, sản xuất ba loại bào tử vơ tính: bào tử nhỏ, bào tử đính lớn bào tử hậu Bào tử nhỏ bào tử sản xuất nhiều nhất, có hình bầu dục, hình elip thận định hình sản xuất sợi nấm bề mặt Bào tử đính lớn, có 3-5 tế bào nhọn hai đầu cạnh cong, tìm thấy khối bào tử phân bề mặt bị bệnh Bào tử hậu hình thành đơn lẻ hay theo cặp đơi tìm thấy cụm chuỗi ngắn Nó bào tử trịn có vách dày sản xuất sợi nấm bào tử đính lớn Bào tử hậu khơng giống bào tử khác tồn đất thời gian dài [4,19] Hình 1.2 Hình thái nấm F oxysporum đĩa thạch PDA Nấm F oxysporum tác nhân gây bệnh đất phổ biến với mầm, làm chết phân hủy chất hữu Nó tồn đất sợi nấm loại bào tử thường tồn đất bào tử hậu Lây lan mầm bệnh theo hai cách lây lan khoảng cách ngắn qua bắn nước, thiết bị trồng trọt khoảng cách dài qua Trần Thị Thùy Linh K22 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học cấy ghép hạt giống bị nhiễm bệnh F oxysporum gây hại cho khỏe mạnh cách lây nhiễm sợi nấm nảy mầm bào tử xâm nhập mô gốc trồng qua vết thương gốc, rễ Các sợi nấm phát triển tế bào thông qua vỏ gốc xylem Một xylem, sợi nấm phát triển mạch xylem sản xuất bào tử nhỏ Bào tử nhỏ nhập vào dịng nhựa vận chuyển lên Trường hợp dòng chảy nhựa dừng bào tử nhỏ nảy mầm Cuối cùng, bào tử sợi nấm làm tắc nghẽn mạch dẫn cây, ngăn chặn trồng lấy chuyển hóa chất dinh dưỡng Cuối trồng thoát nước nhiều vận chuyển, đóng lỗ khí, héo chết Sau chết nấm xâm nhập vào tất mơ, hình thành bào tử tiếp tục lây nhiễm sang lân cận [16] Nấm Rhizoctonia solani loại nấm gây bệnh thực vật với loạt thực vật phân bố toàn giới Là tác nhân gây bệnh cách 100 năm R solani thường xuyên tồn dạng sợi sinh trưởng môi trường xem tác nhân gây bệnh truyền qua đất R solani biết đến gây bệnh thực vật khác thối rễ, héo thân R solani công chủ yếu giai đoạn sớm hạt giống nảy mầm giống, thường tìm thấy đất [36] Hình 1.3 Hình ảnh nấm R solani đĩa thạch PDA R solani nguồn bệnh hoại sinh tồn sinh sống đất, công thực vật cư trú Tác nhân gây bệnh biết gây thiệt hại trồng nghiêm trọng cách công chủ yếu rễ thân trồng có loạt Trần Thị Thùy Linh K22 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học trồng làm kí chủ, mục tiêu chúng loại thân cỏ R solani coi loại nấm đảm giai đoạn sinh sản hữu tính dồi Hiện chưa biết sản xuất bào tử vơ tính coi có vịng đời sinh sản vơ tính Thỉnh thoảng, bào tử sinh dục (basidiospores) sản xuất bị nhiễm bệnh [17] Nấm R solani kühn gây hại nhiều loại khác lúa, ngô, cà chua, khoai tây, đậu đỗ, lạc, cải bắp, bông… Tùy theo loại giai đoạn sinh trưởng mà bệnh có nhiều triệu chứng khác thối đen rễ, lở cổ rễ, thối gốc than, thối Trên cà chua, đậu đỗ gây bệnh hại vào thời kì rễ, cổ rễ, gây ũng nước chuyển sang màu nâu đen, đổ rạp gọi bệnh lở cổ rễ Trên ngô, bệnh hại bẹ, phiến lá, thân bắp ngô tạo nhiều vết lớn loang lổ, đốm vằn da hổ, hình dạng đám mây Vết bệnh lan từ phía gốc lên bắp, cờ, làm tàn lại, bắp thối, gây tổn thất lớn giống ngơ Nấm R solani tồn đất dạng hạch nấm qua nhiều năm Hạch nấm Rhizoctonia có lớp bên ngồi dày làm tăng khả sống sót chúng hoạt động cấu trúc ngủ đông cho tác nhân gây bệnh Nấm lây nhiễm vào trồng kích thích hóa học phát phát triển trồng dư lượng thực vật phân hủy Quá trình xâm nhập mầm bệnh xảy thơng qua thâm nhập trực tiếp lớp biểu bì đường qua lỗi hở tự nhiên Sợi nấm tiếp xúc với gắn với thông qua tăng trưởng, chúng bắt đầu sản xuất cấu trúc thâm nhập vào tế bào sử dụng chất dinh dưỡng từ tế bào Mầm bệnh sản xuất enzyme phân hủy thành tế bào thực vật tiếp tục phát triển bên mô chết Mầm bệnh sản xuất mô thực vật lặp lặp lại chu kì nguồn lây bệnh trở nên có sẵn [13,16] Trần Thị Thùy Linh K22 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học 1.2.2 Tình hình bệnh hại trồng nấm Fusarium Rhizoctonia gây Việt Nam Ở Việt Nam bệnh nấm F oxysporum R solani bệnh quan trọng gây hại đồng thời nhiều loại trồng cà chua, khoai tây, ngô, đậu tương, ăn quả, sầu riêng Hàng năm sản lượng nông nghiệp thất thu bệnh tới hàng chục tỉ đồng (báo cáo FAO, 2010) Người ta ước tính năm 2010 thiệt hại bệnh thực vật, bao gồm phí kiểm sốt lên tới 701,2 triệu la Hai quan trọng bị hai bệnh nấm gây hại mà có ý nghĩa kinh tế sản lượng nơng nghiệp cao ngô đậu tương Đây hai lương thực công nghiệp ngắn ngày quan trọng, mang lại hiệu kinh tế cao giới Việt Nam lại bị bệnh nấm F oxysporum R solani gây hại nặng miền Bắc Việt Nam Để sản phẩm an tồn cần có biện pháp sinh học canh tác để hạn chế bệnh nấm F oxysporum R solani gây hại đồng truyền qua hạt đậu tương ngô Bệnh đốm-cháy nấm R solani kühn gây xuất từ mọc bệnh tiếp tục phát triển mạnh cuối vụ, gây hại nặng cho vùng Đồng Nai Ngồi bơng nấm R solani kühn cịn gây hại đậu xanh, ngô, cối xay, hồng manh… Nguyễn Kim Vân tìm thấy bệnh phổ biến cải bắp vùng trồng rau Hà Nội số tỉnh lân cận bệnh thối cải bắp nấm R solani gây hại nghiêm trọng với tỉ lệ bệnh từ 26% đến 50% bệnh hại nặng giai đoạn bắp đến thu hoạch [5] Đỗ Tấn Dũng nghiên cứu cho thấy bệnh lở cổ rễ nấm R solani gây bệnh hại phổ biến nhiều loại trồng cạn thuộc họ cà, họ đậu, họ bầu bí, mức độ nhiễm bệnh kí chủ cà chua, lạc, đậu tương, đậu đũa dưa chuột khác Phạm vi ký chủ nấm R solani vùng Hà Nội năm 2005-2006 gồm cà chua, khoai tây, lạc, đậu tương, đậu xanh, đậu đũa, đậu trạch, dưa chuột [2] Bệnh lở cổ rễ hại vùng duyên hải miền Trung chủ yếu nấm R solani gây Ngồi ra, cịn có số tác nhân khác F oxysporum mức thấp Bệnh Trần Thị Thùy Linh K22 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học lở cổ rễ nấm R solani gây hại từ hạt nảy mầm giai đoạn 25 ngày tuổi, đặc biệt gây hại 2-3 thật, lớn bị ảnh hưởng Nấm gây bệnh chủ yếu tồn đất nguồn nước tưới hạt giống chưa phát 1.2.3 Biện pháp phòng trừ nấm bệnh hại trồng Biện pháp phịng trừ thuốc hóa học Biện pháp phòng trừ nấm bệnh hại trồng phổ biến sử dụng loại thuốc hóa học với ưu điểm dễ sản xuất quy mô lớn, giá thành rẻ, phổ tác dụng rộng với động lực mạnh hiệu tác dụng nhanh Tuy nhiên, ngày chúng bộc nhược điểm nhanh bị ức chế côn trùng, gây ô nhiễm đất, nguồn nước khơng khí, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người Việc sử dụng tràn lan loại thuốc bảo vệ thực vật làm cho loài gây hại biến đổi nhanh chóng dẫn đến hiệu việc sử dụng thuốc ngày thấp chi phí ngày cao Ước tính có khoảng 520 lồi trùng, 150 lồi vi sinh vật gây bệnh 273 loài cỏ dại ức chế lại thuốc [40] Một số thuốc bảo vệ thực vật có thời gian phân hủy lâu, sau sử dụng thẩm thấu phần vào đất mạch nước ngầm Các chất ngấm vào đất nguy ngộ độc thuốc diệt côn trùng cao Thuốc bảo vệ thực vật tổng hợp có độc lực mạnh, phổ tác dụng rộng Chúng không tiêu diệt đối tượng gây hại mà tiêu diệt lồi có ích động vặt ăn trùng, lồi kí sinh trùng hại trồng, tiêu diệt ong mật côn trùng thụ phấn cho làm cho nhiều trồng thụ phấn nhờ côn trùng giảm suất chất lượng [36] Việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học làm cho thực vật bị nhiễm độc gây ngộ độc cấp tính mãn tính cho người sử dụng [46] Trên giới hàng năm có khoảng 26 triệu trường hợp bị ngộ độc thuốc bảo vệ thực vật, 750 nghìn trường hợp ngộ độc mãn tính, triệu trường hợp phải nhập viện 200 nghìn trường hợp tử vong [15] Ở Việt Nam, khoảng 15-20 triệu người nhường xuyên phơi nhiễm với thuốc bảo vệ thực Trần Thị Thùy Linh K22 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học A B Hình 3.18 Hoạt tính kháng nấm F oxyporum (A) R solani (B) phân đoạn protein tinh từ chủng S marcescens DT3 (Đ/C (-): đệm potasium phosphate 20 mM pH 6,8; Đ/C (+): dịch lên cột; 8-13: protein tinh từ phân đoạn 8-13) Bảng 3.8 Tóm tắt q trình tinh protein có hoạt tính kháng nấm từ chủng S marcescens DT3 qua bước tinh Các bƣớc tinh Protein tổng số (mg) Hiệu suất (%) Dịch protein thô Dịch tủa muối 70% DEAE 10,5 Hoạt tính kháng nấm R solani 100 Hoạt tính kháng nấm F oxyporum + 5,58 53 + + 2,95 28 + + + Như qua bước tinh tủa amonium sulphate 30- 70%, cột sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose thu protein có khối lượng phân tử khoảng 56 kDa có hoạt tính kháng nấm F oxyporum mạnh Chúng tơi tiến hành tinh nhiều lần thu phân đoạn có hàm lượng protein kháng nấm cao, tập hợp phân đoạn protein tinh có băng khoảng 56 kDa để tiến hành đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ, proteinase K xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) nấm kháng nấm F oxyporum R solani dịch Trần Thị Thùy Linh 44 K22 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học protein tinh (Hình 3.19) kDa 91 66 45 35 25 M Hình 3.19 Điện di đồ phân đoạn protein tinh sau qua cột trao đổi ion DEAE – cellulose (1-7: dịch protein tinh mẻ khác từ 1-7; M: thị phân tử) 3.4.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ Dịch protein tinh chủng S marcescens DT3 xử lý với nhiệt độ khác như: 40oC; 50oC; 60oC; 80oC thời gian 30 phút, sau protein tinh bổ sung 20 µl (hàm lượng protein đạt 2,3 µg/µl) vào khoanh giấy lọc đặt nấm F oxyporum nấm R solani vào khoanh giấy chứa protein thử nghiệm (Hình 3.20) Kết cho thấy ủ protein điều kiện nhiệt độ từ 40oC; 50oC; 60oC; 80oC thời gian từ 30 phút protein tinh cịn hoạt tính kháng nấm với hai chủng nấm F oxysporum R solani mẫu đối chứng âm đệm potasium phosphate 20 mM pH 6,8 sợi nấm phát triển bình thường Điều chứng tỏ nhiệt độ khơng làm ảnh hưởng đến hoạt tính kháng nấm protein chủng S marcescens DT3 Tuy nhiên khả ức chế nấm F oxyporum mạnh nấm R solani nuôi điều kiện Trần Thị Thùy Linh 45 K22 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học A B Hình 3.20 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính kháng nấm F oxyporum (A) nấm R solani (B)Đ/C (+): mẫu không xử lý nhiệt; Đ/C (-):đệm potasium phosphate 20 mM pH 6,8; 1-4: mẫu xử lý nhiệt độ 40oC; 50oC; 60oC; 80oC, thời gian 30 phút Kết phù hợp với số nghiên cứu giới Zarei cộng (2011) tách chiết chitinase từ chủng S marcescens B4A xử lý nhiệt độ 1000C phút giữ hoạt tính kháng nấm nấm Bipolaris sp Alternaria brassicicola [33] Ngoài số protein kháng nấm tách chiết từ vi khuẩn khác bền với nhiệt độ protein tách B subtilis B29I ủ nhiệt độ 80oC 10 phút có hoạt tính kháng nấm F oxyporum [27] Protein kháng nấm từ chủng B.subtilis XL62 có hoạt tính kháng nấm mạnh ủ nhiệt độ 80oC chí 1000C 15 phút khả kháng nấm F oxyporum R solani [3] 3.4.3 Ảnh hƣởng proteinase K Proteinase K serine protease, proteinase K thường dùng phổ biến sinh học phân tử để cắt thủy phân phân tử protein Chúng tiến hành bổ sung proteinase K vào dịch protein tinh để kiểm tra xem proteinase K có làm ảnh hưởng đến hoạt tính kháng nấm chủng S marcescens DT3 hay không Trần Thị Thùy Linh 46 K22 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học Dịch protein tinh từ chủng S marcescens DT3 xử lý với proteinase K, với nồng độ từ 0,5 – µg Sau bổ sung 20 µl nồng độ vào khoanh giấy lọc, sau đặt nấm vào để vào tủ 30oC sau 3- ngày kiểm tra (Hình 3.21) A B Hình 3.21 Ảnh hưởng proteinase K đến hoạt tính kháng nấm F oxyporum (A)và nấm R solani (B); Đ/C (-): đệm potasium phosphate 20 mM pH 6,8; Đ/C (+): mẫu không xử lý với proteinase K; 1: proteinase K 0,5µg; 2-7 : mẫu xử lý với proteinase K nồng độ: 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; µg Trần Thị Thùy Linh 47 K22 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học Kết cho thấy mẫu thử nghiệm ủ proteinse K không ảnh hưởng đến khả kháng nấm F oxyporum R solani protein tinh Cụ thể bổ sung 50 µg protein ủ proteinase K nồng độ 0,5 µg; 1µg; 1,5µg; µg; 2,5 µg; µg protein có hoạt tính kháng nấm, với mẫu đối chứng đệm potasium phosphate 20 mM pH6,8 sợi nấm phát triển bình thường Trong nghiên cứu proteinase K ủ với protein tinh nồng độ 0,54 µg/ml Các số liệu cho thấy proteinase K không ảnh hưởng đến khả ức chế nấm F oxyporum R solani Như protein có hoạt tính kháng nấm khơng bị ảnh hưởng proteinase K Có thể nguyên nhân protein có hoạt tính kháng nấm bị thủy phân dạng peptid có hoạt tính kháng nấm với khối lượng phân tử nhỏ Chitarra cộng (2003) cơng bố hợp chất có hoạt tính kháng nấm từ chủng B subtilis YM 10-20 chứng minh không bị ức chế enzyme thủy phân bao gồm pronase E, proteinase K chymotrypsin [14] Rattanachuay cộng (2010) công bố dịch lọc chủng Pseudomonas sp W3 khảo sát với enzyme proteinase K mg/ml tripsin mg/ml cho thấy dịch lọc ngoại bào chủng Pseudomonas sp W3 bền với enzyme xử lý [37] 3.4.3 Hoạt tính ức chế nồng độ tối thiểu (MIC) protein với nấm F oxyporum nấm R solani Từ kết thu tinh protein, tiếp tục nghiên cứu đánh giá nồng độ ức chế tối thiểu hoạt chất tinh thu được, thử nghiệm lại hoạt tính đối kháng với hai loại nấm F oxyporum R solani theo phương pháp ức chế theo nồng độ bổ sung Trong nghiên cứu xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) protein tinh bổ sung protein nồng độ 10 µg/ml, 20 µg/ml, 40 µg/ml, 60 µg/ml, 80 µg/ml 100 µg/ml vào đĩa thạch PDA xác định hoạt tính ức chế nấm F.oxyporum nấm R solani theo đường tròn đồng tâm sau 3-5 ngày ni cấy (Hình 3.22) Trần Thị Thùy Linh 48 K22 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học A B Hình 3.22 Ức chế nồng độ tối thiểu protein tinh từ chủng S marcescens DT3 lên hoạt tính kháng nấm nấm F.oxyporum (A) nấm R solani (B) Chúng xác định khả ức chế nấm F.oxyporum nấm R solani nồng độ protein có hoạt tính kháng nấm tách chiết từ chủng S marcescens DT3 10 µg/ml đến 100 µg/ml Ở nồng độ 10 µg/ml, protein có hoạt tính kháng nấm ức chế 20% sinh trưởng phát triển nấm F.oxyporum nấm R solani Khi nồng độ hoạt chất tăng lên 60 µg/ml hoạt chất ức chế 61% nấm F.oxyporum 40% nấm R solani Khi tăng nồng độ hoạt chất lên 100 µg/ml hoạt chất ức chế 80% sinh trưởng phát triển nấm F.oxyporum nấm R solani số khoẳng 50% Điều lần chứng tỏ protein có hoạt tính kháng nấm tách chiết từ chủng S marcescens DT3 có khả ức chế sinh trưởng phát triển nấm F.oxyporum tốt nấm R solani Trần Thị Thùy Linh 49 K22 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học KẾT LUẬN Trong môi trường khảo sát môi trường NA, NYD, LB môi trường bột đậu tương 2% chọn môi trường LB để ni chủng S marcescens DT3 cho hoạt tính kháng nấm mạnh Dịch chiết ngoại bào nồng độ 50%, ức chế 71%- 81% sinh trưởng phát triển chủng nấm F oxyporum R solani Tối ưu môi trường số điều kiện ni cấy chủng S marcescens DT3 cho hoạt tính kháng nấm cao Môi trường LB sau tối ưu bao gồm: 1,25% pepton , 1% Nacl, 0,5% cao nấm men với thời gian nuôi cấy 28h, pH tối ưu 7, nhiệt độ 280C Hoạt tính kháng nấm mơi trường tối ưu tăng so với môi trường trước tối ưu lên 15 lần nấm R solani 2,6 lần nấm F oxyporum Đã tinh protein có hoạt tính kháng nấm với khối lượng phân tử khoảng 56 kDa từ chủng S marcescens DT3 Protein bền với nhiệt độ ủ nhiệt độ 800C 30 phút không làm ảnh hưởng đến khả ức chế sinh trưởng phát triển nấm F oxyporum R solani Proteinase K khơng ảnh hưởng đến hoạt tính kháng nấm với nồng độ ủ từ 0,5- µg Đặc biệt protein tinh có khả kháng nấm F oxyporum mạnh KIẾN NGHỊ Hồn thiện quy trình tinh protein có hoạt tính kháng nấm quy mơ lên men lớn ứng dụng tạo sản phẩm sinh học có khả kháng nấm phục vụ phát triển nông nghiệp bền vững Trần Thị Thùy Linh 50 K22 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 10 11 12 13 14 A Cục Y Tê Dự Phịng Và Mơi Trường - Bộ Y Tế (2009), “Gần 5000 người nhiễm độc thuốc bảo vệ thực vật.” A Đỗ Tấn Dũng (2006), “Nghiên cứu bệnh lở cổ rễ ( Rhizoctonia solani Kuhn ) số trồng vùng Hà Nội năm 2005-2006 ” A Đỗ Thị Tuyên, Lê Đình Quyền, Quyền Đình Thi, and Nguyễn Ngọc Dũng (2011), “Tinh protein có hoạt tính kháng nấm từ chủng Bacillus subtilis XL62”, Tạp chí Cơng Nghệ Sinh Học, 3, pp 1811-4989 A Đoàn Thị Thanh (2005), “Nghiên cứu đa dạng sinh học isolates nấm Fusarium spp”, Tập san BVTV A Nguyễn Kim Vân (2003), “Nghiên cứu chủng nấm Rhizoctonia solani Kuhn gây hại bắp cải bước đầu khảo sát biện pháp phòng trừ ”, Tạp chí BVTV, 192, pp 18-21 A Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Minh Anh, Phan Thị Hoài Anh, and Nguyễn Ngọc Dũng (2006), “Nghiên cứu chế kháng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh trồng số chủng vi khuẩn Pseudomonas huỳnh quang chọn lọc”, Tc Sinh học, 28, pp 77-81 A Vũ Trọng Lượng, Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Đỗ Thị Tuyên, and Nguyễn Thị Hồng Nhung (2015), “Nghiên cứu tách chiết, tinh đánh giá hoạt tính hoạt chất chống khuẩn chống nấm Prodigiosin từ chủng Seratia marcescens M6”, Y Học Việt Nam, 433, pp 190-195 Andrews, J.H (1992), “Biological control in the phyllosphere”, Annual review of phytopathology, 30, pp 603-635 Babashpour, S., S Aminzadeh, N Farrokhi, A Karkhane, and K Haghbeen (2012), “Characterization of a chitinase (Chit62) from Serratia marcescens B4A and its efficacy as a bioshield against plant fungal pathogens”, Biochemical genetics, 50 (9-10), pp 722-735 Bach E, Sant’anna V, Daroit D, Corrêa A P F, Segalin J, and Brandelli A (2012), “Production, one-step purification, and characterization of a keratinolytic protease from Serratia marcescens P3”, Process Biochemistry, 47 (12), pp 24552462 Bezuglova, O.S and G.V Motuzova (2007), “ Environmental Monitoring of Soil.”, Gaudeamus,Moscow Bradford, M.M (1976), “A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding”, Analytical biochemistry, 72, pp 248-254 Ceresini, P (2011), “rhizoctonia solani” Chitarra, G.S., P Breeuwer, M.J Nout, A.C Van Aelst, F.M Rombouts, and T Abee (2003), “An antifungal compound produced by Bacillus subtilis YM 10-20 Trần Thị Thùy Linh 51 K22 Luận văn thạc sĩ 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Khoa Sinh học inhibits germination of Penicillium roqueforti conidiospores”, Journal of applied microbiology, 94 (2), pp 159-166 David, P and H Kelsey (2007), “Public Health and Costs of Pesticides”, in Encyclopedia of Pest Management, Taylor & Francis, pp 677-680 Farr Df, G.F.B., George P Chamuris, and Amy Y Rossmanrogerson, Clarkt and B Boom (1990), “Fungi on plants and plant products in the United States ”, Brittonia, 42 (3), pp 243-246 Gerhardson, B (2002), “Biological substitutes for pesticides”, Trends in biotechnology, 20 (8), pp 338-343 Giri, A.V., N Anandkumar, G Muthukumaran, and G Pennathur (2004), “A novel medium for the enhanced cell growth and production of prodigiosin from Serratia marcescens isolated from soil”, BMC microbiology, 4, pp 11 Gordon, T.R and R.D Martyn (1997), “The evolutionary biology of Fusarium oxysporum”, Annual review of phytopathology, 35, pp 111-128 Green, A.A and W.L Hughes (1955), “Protein fractionation on the basis of solubility in aqueous solutions of salts and organic solvents”, Methods Enzymol, 1, pp 67-90 Gutiérrez-Román Mi, Holguín-Meléndez F, Dunn Mf, G.-N K, and HuertaPalacios G (2015), “Antifungal activity of Serratia marcescens CFFSUR-B2 purified chitinolytic enzymes and prodigiosin against Mycosphaerella fijiensis, causal agent of black Sigatoka in banana (Musa spp.)”, BioControl, 60 (4), pp 565-572 Huber, J., H Bochow, and H Junge (1987), “Selektion und biotechnische Herstellung von Kulturlösungen mikrobieller Antagonisten zur Unterdrückung phytopathogener Bodenpilze”, Journal of Basic Microbiology, 27 (9), pp 497503 Jin-Lan Xia, Jing Xiong, Rui-Yong Zhang, Ke-Ke Liu, Bin Huang, and Z.-Y Nie (2011), “Production of Chitinase and its Optimization from a Novel Isolate Serratia marcescens XJ-01”, Indian J Microbiol, 51 (3), pp 301-306 Kalbe, C., P Marten, and G Berg (1996), “Strains of the genus Serratia as beneficial rhizobacteria of oilseed rape with antifungal properties”, Microbiological Research, 151 (4), pp 433-439 Kamensky, M., M Ovadis, I Chet, and L Chernin (2003), “Soil-borne strain IC14 of Serratia plymuthica with multiple mechanisms of antifungal activity provides biocontrol of Botrytis cinerea and Sclerotinia sclerotiorum diseases”, Soil Biology and Biochemistry, 35 (2), pp 323-331 Laemmli, U.K (1970), “Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4”, Nature, 227 (5259), pp 680-685 Li, J., Q Yang, L.H Zhao, S.M Zhang, Y.X Wang, and X.Y Zhao (2009), “Purification and characterization of a novel antifungal protein from Bacillus subtilis strain B29”, J Zhejiang Univ Sci B, 10 (4), pp 264-272 Trần Thị Thùy Linh 52 K22 Luận văn thạc sĩ 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Khoa Sinh học Liu, X., M Bimerew, et al (2007), “Quorum-sensing signaling is required for production of the antibiotic pyrrolnitrin in a rhizospheric biocontrol strain of Serratia plymuthica”, FEMS microbiology letters, 270 (2), pp 299-305 Liu, X., J Jia, et al (2010), “Biocontrol potential of an endophytic Serratia sp G3 and its mode of action”, World J Microbiol Biotechnol, 26 (8), pp 1465-1471 Liu, X., J Jia, et al (2011), “Characterisation of two quorum sensing systems in the endophytic Serratia plymuthica strain G3: differential control of motility and biofilm formation according to life-style”, BMC microbiology, 11 (1), pp 26 Mahlen S D (2011), “Serratia infections: from military experiments to current practice”, Clinical microbiology reviews, 24 (4), pp 755-791 Nalini S and Parthasarathi R (2014), “Production and characterization of rhamnolipids produced by Serratia rubidaea SNAU02 under solid-state fermentation and its application as biocontrol agent”, Bioresource technology, 173, pp 231-238 Okay, S., M Özdal, and E.B Kurbanoğlu (2013), “Characterization, antifungal activity, and cell immobilization of a chitinase from Serratia marcescens MO-1”, Turk J Biol, 37, pp 639-644 Parani, K., G.P Shetty, and B.K Saha (2011), “Isolation of Serratia marcescens SR1 as a Source of Chitinase Having Potentiality of Using as a Biocontrol Agent”, Indian J Microbiol, 51 (3), pp 247-250 Paul D and Sarma Y (2006), “ Antagonistic effects of metabolites of Pseudomonas fluorescens strains on the different growth phases of Phytophthora capsici, foot rot pathogen of black pepper (Piper nigrum L.)”, Arch Phytopathol Plant Protect, 39, pp 311–314 Pimentel, D., H Acquay, et al (1993), “Assessment of Environmental and Economic Impacts of Pesticide Use”, in The Pesticide Question, D Pimentel and H Lehman, Editors, Springer US, pp 47-84 Rattanachuay P, Kantachote D, T M, Nitoda T, and Kanzaki H (2010), “Inhibition of shrimp pathogenic vibrios by extracellular compounds from a proteolytic bacterium Pseudomonas sp W3”, Electronic Journal of Biotechnology, 13 Shokouhfard, M., R.K Kermanshahi, R.V Shahandashti, M.M Feizabadi, and S Teimourian (2015), “The inhibitory effect of a Lactobacillus acidophilus derived biosurfactant on biofilm producer Serratia marcescens”, Iranian journal of basic medical sciences, 18 (10), pp 1001-1007 Someya, N., M Nakajima, K Hirayae, T Hibi, and K Akutsu (2001), “Synergistic Antifungal Activity of Chitinolytic Enzymes and Prodigiosin Produced by Biocontrol Bacterium, Serratia marcescens Strain B2 against Gray Mold Pathogen, Botrytis cinerea”, J Gen Plant Pathol, 67 (4), pp 312-317 Stuart, S (2003), “Development of Resistance in Pest Population” Trần Thị Thùy Linh 53 K22 Luận văn thạc sĩ 41 42 43 44 45 46 Khoa Sinh học Tariq Al, Reyaz Al, and Prabakaran J John (2011), “Purification and characterization of 56 kDa cold-active protease from Serratia marcescens”, Afr J Microbiol Res, 5, pp 5841-5847 Wan, M.H., B Wu, W Ren, and B He (2010), “Screening, characterization, and cloning of a solvent-tolerant protease from Serratia marcescens MH6”, Journal of microbiology and biotechnology, 20 (5), pp 881-888 Wang, K., P.-S Yan, L.-X Cao, Q.-L Ding, C Shao, and T.-F Zhao (2013), “Potential of chitinolytic Serratia marcescens strain JPP1 for biological control of Aspergillus parasiticus and aflatoxin”, BioMed research international, 2013 Zarei M, Aminzadeh S, et al (2011), “Characterization of a chitinase with antifungal activity from a native Serratia marcescens B4A”, Brazilian journal of microbiology : [publication of the Brazilian Society for Microbiology], 42 (3), pp 1017-1029 Zeng, H.-W., Y.-J Cai, X.-R Liao, S.-L Qian, F Zhang, and D.-B Zhang (2010), “Optimization of catalase production and purification and characterization of a novel cold-adapted Cat-2 from mesophilic bacterium Serratia marcescens SYBC01”, Ann Microbiol, 60 (4), pp 701-708 Zhou P, Zhao Y, et al (2012), “Dietary exposure to persistent organochlorine pesticides in 2007 Chinese total diet study”, Environment international, 42, pp 152-159 Trần Thị Thùy Linh 54 K22 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học PHỤ LỤC Bảng P1 Ảnh hưởng nồng độ pepton lên ức chế sinh trưởng nấm F oxysporum Nồng độ pepton Sinh trưởng Hoạt tính Hình thái tản nấm, đặc điểm phát (%) nấm (Φ:cm) ức chế (%) triển ĐC 0,5% 0,75% 1% ± 0,17 6,5 ± 0,15 2,5 ± 0,25 33±2 27,7 ± 1,7 72,2 ± 2,7 Sợi bơng màu tím nhạt Sợi màu trắng Sợi màu trắng Sợi màu tím 1,25% 1,5% ± 0,2 ± 0,12 89 ± 2,2 22,2 ± 1,3 Sợi tàn lụi Sợi màu trắng Bảng P2 Ảnh hưởng nồng độ pepton lên ức chế sinh trưởng nấm R solani Nồng độ pepton Sinh trưởng Hoạt tính Hình thái tản nấm, đặc điểm (%) nấm (Φ:cm) ức chế (%) phát triển ĐC 0,5% 0,75% 1% 3,5 ± 0,2 2,5 ± 0,25 ± 0,17 33,3 ± 2,2 72,2 ± 2,7 78 ± 1,9 Sợi xẹp màu trắng nâu đậm Sợi màu trắng nâu nhạt Sợi xẹp màu trắng nâu 1,25% 1,5% 1,2 ± 0,22 ± 0,15 86,6± 2,4 55,5 ± 1,7 Sợi tàn lụi Sợi màu trắng nâu Sợi màu trắng nâu Bảng P3 Ảnh hưởng nồng độ cao nấm mem lên ức chế sinh trưởng nấm F oxysporum Nồng độ cao Sinh trưởng Hoạt tính Hình thái tản nấm, đặc điểm phát nấm men (%) nấm (Φ:cm) ức chế (%) triển ĐC 0,1% ± 0,3 22,2 ± 3,3 Sợi màu trắng 0,25% 0,5% 0,75% 1,% 4,4 ± 0,25 0,5 ± 0,2 ± 0,17 ± 0,15 51 ± 2,7 94 ± 2,2 55,5 ± 1,8 44,4 ± 1,6 Sợi màu tím hồng Sợi nấm xẹp tàn lụi Sợi nấm xẹp trắng Sợi nấm xẹp màu trắng ngà Trần Thị Thùy Linh 55 Sợi bơng màu tím nhạt K22 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học Bảng P4 Ảnh hưởng nồng độ cao nấm mem lên solani Nồng độ cao Sinh trưởng Hoạt tính nấm men (%) nấm (Φ:cm) ức chế (%) ĐC 0,1% ± 0,3 66,7 ± 3,3 0,25% ± 0,25 55,5 ± 2,7 0,5% 1,2 ± 0,2 86,7 ± 2,2 0,75% 1% ± 2,5 4,5 ± 1,5 33,3 ± 2,7 50 ± 1,67 ức chế sinh trưởng nấm R Hình thái tản nấm, đặc điểm phát triển Sợi màu trắng nâu Sợi màu trắng nâu Sợi màu trắng nâu nhạt Sợi màu trắng nâu Sợi đổ xẹp Sợi màu trắng nâu Bảng P5 Động thái sinh trưởng chủng S marcescen DT3 Mật độ tế bào (OD600 nm) 0.14 10 3.15 24 4.9 28 5.4 32 5.1 40 4.8 48 4.3 54 3.7 60 3.4 Thời gian Trần Thị Thùy Linh 56 K22 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học Bảng P6 Bảng đo hàm lượng protein qua cột DEAE – cellulose Phân đoạn OD1 0.049 OD2 0.053 HLOD1 0.00683 HLOD2 0.008072 HLODTB 0.007451 0.059 0.062 0.009934 0.010866 0.0104 0.064 0.072 0.011487 0.01397 0.012728 0.078 0.085 0.015833 0.018006 0.01692 0.092 0.104 0.02018 0.023905 0.022042 0.148 0.152 0.037565 0.038807 0.038186 0.295 0.309 0.083203 0.08755 0.085377 0.61 0.597 0.180999 0.176963 0.178981 0.816 0.832 0.244954 0.249922 0.247438 10 0.987 0.977 0.298044 0.294939 0.296491 11 0.939 0.917 0.283141 0.276311 0.279726 12 0.855 0.841 0.257063 0.252716 0.254889 13 0.738 0.731 0.220738 0.218565 0.219652 14 0.475 0.49 0.139087 0.143744 0.141415 15 0.155 0.161 0.039739 0.041601 0.040670 16 0.11 0.127 0.025768 0.031046 0.028407 17 0.099 0.087 0.022353 0.018627 0.020490 18 0.084 0.077 0.017696 0.015523 0.016609 19 0.074 0.07 0.014591 0.013349 0.01397 20 0.067 0.069 0.012418 0.013039 0.012728 21 0.064 0.065 0.011487 0.011797 0.011642 22 0.057 0.054 0.009313 0.008382 0.008848 23 0.053 0.054 0.008072 0.008382 0.008227 24 0.048 0.046 0.006519 0.005898 0.006209 25 0.04 0.038 0.004036 0.003415 0.003725 Trần Thị Thùy Linh 57 K22 Luận văn thạc sĩ Trần Thị Thùy Linh Khoa Sinh học 58 K22 ... tăng khả sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm Sau chọn môi trường LB có khả sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm cao từ chủng S marcescens DT3, tiếp tục nghiên cứu điều kiện để làm tăng khả sinh tổng hợp. .. chủng Serratia marcescens DT3 có khả sinh tổng hợp chất có hoạt tính kháng nấm cao Tối ưu mơi trường điều kiện nuôi cấy làm tăng khả sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm Tách chiết, tinh hoạt chất có. .. dường không phù hợp cho chủng S marcescens DT3 sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm Một số nghiên cứu chứng minh môi trường NYD làm tăng khả sinh tổng hợp chất có hoạt tính kháng nấm chọn làm mơi