Phụ phẩm nônglâm nghiệp là một dạng sinh khối có thành phẩn chính chủ yếu là lignocellulose. Hiện nay mỗi năm mỗi năm nguồn sinh khối này sản sinh ra hàng trăm triệu tấn từ quá trình sản xuất nônglâm nghiệp như: bèo dâu, rơm rạ, bã cà phê, mùn gỗ, thân cây ngô, vỏ trấu và hàng chục triệu tấn bã mía, cơ chất để trồng nấm…Phần lớn được đốt bỏ thu tro làm phân bón. Cách xử lý này sẽ thải ra CO, CO2 hay CH4…, là nguyên nhân gây nên một số bệnh về mắt, phổi. Nguy hiểm hơn, chúng gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng tới môi trường sống ở cả thành thị và nông thôn. Đặc biệt, gây lãng phí lượng lớn chất hữu cơ có giá trị, trong khi đó nếu khai thác sử dụng hợp lý thì nguồn sinh khối này đem lại lợi ích vô cùng lớn. Xét về nguồn gốc, thành phần, có thể phân biệt các loại lignocellulose như: từ cây gỗ cứng, gỗ mềm cũng như từ cây trồng hàng năm (đặc biệt là cây lúa, ngũ cốc, các loại cỏ, cây mía...) và thân cây thảo.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nghiên cứu thu nhận tinh enzyme cellobiose dehydrogenase từ chủng nấm phân lập Coprinellus aureogranulatus NGUYỄN MỸ LINH linhnm.142581@sis.hust.edu.vn Chuyên ngành Kỹ thuật sinh học Giảng viên hướng dẫn: GVHD TS Nguyễn Trường Giang GVHD TS Đỗ Hữu Nghị Bộ môn Công nghệ sinh học Viện: Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm HÀ NỘI, 7/2020 ĐỀ TÀI TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Nguyễn Mỹ Linh Khóa: 59 Số hiệu sinh viên: 20142581 Viện: Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm Ngành: Kỹ thuật Sinh học Đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu thu nhận tinh enzyme cellobiose dehydrogenase từ chủng nấm phân lập Coprinellus aureogranulatus” Nội dung đề tài: • Phân lập, tuyển chọn chủng nấm tự nhiên có khả sinh enzyme cellobiose dehydrogenase (CDH) • Ni cấy thu enzyme tinh thu enzyme CDH Giảng viên hướng dẫn: Giảng viên hướng dẫn Viện Hoá học hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm KHCNVN: TS Đỗ Hữu Nghị Giảng viên hướng dẫn Viện CNSH-CNTP: TS Nguyễn Trường Giang Ngày giao nhiệm vụ đồ án: 02 tháng 01 năm 2020 Ngày hoàn thành đồ án: 10 tháng năm 2020 Ngày 10 tháng năm 2020 Trưởng môn Cán hướng dẫn Cán hướng dẫn (Ký, ghi rõ họ, tên) (Ký, ghi rõ họ, tên) (Ký, ghi rõ họ, tên) Sinh viên hoàn thành nộp đồ án tốt nghiệp ngày 10 tháng năm 2020 Người duyệt Sinh viên (Ký, ghi rõ họ, tên) (Ký, ghi rõ họ, tên) LỜI CẢM ƠN Để đồ án đạt kết tốt đẹp, em nhận hỗ trợ, giúp đỡ nhiều quan, tổ chức, cá nhân Em xin phép bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tất cá nhân quan tạo điều kiện giúp đỡ trình học tập nghiên cứu đề tài Thời gian thực tập làm đồ án vừa qua trình em tham gia học hỏi, so sánh, nghiên cứu ứng dụng kiến thức học vào công việc thực tế quan Trước hết em xin gửi tới cán phịng Sinh học thực nghiệm, Viện Hố học hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam lời cảm ơn sâu sắc Với quan tâm, dạy dỗ, bảo tận tình chu đáo anh chị cô chú, đến em hồn thành đồ án, đề tài: "Nghiên cứu thu nhận tinh enzyme Cellobiose dehydrogenase từ chủng nấm phân lập Coprinellus aureogranulatus" Đồ án thực theo nội dung Đề tài Nghị định thư Việt Nam – CHLB Đức “Nghiên cứu phát khai thác số enzyme chuyển hoá hiệu lignocellulose từ đa dạng nấm Việt Nam sở ứng dụng genomic secretomic” (NĐT.45.GER/18) TS Đỗ Hữu Nghị (Viện Hàn lâm KHCNVN) làm chủ nhiệm Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Đỗ Hữu Nghị quan tâm giúp đỡ, hướng dẫn em hoàn thành tốt đồ án thời gian qua Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến thày Nguyễn Trường Giang, viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm giúp đỡ em suốt trình học tập nghiên cứu đề tài Với điều kiện thời gian kinh nghiệm hạn chế sinh viên, đồ án khơng thể tránh thiếu sót Em mong nhận bảo, đóng góp ý kiến thầy để em có điều kiện bổ sung, nâng cao kiến thức mình, phục vụ tốt công tác thực tế sau Em xin chân thành cảm ơn! TÓM TẮT Xử lý vật liệu giàu lignocellulose phương pháp hữu không gây hại cho môi trường người xu hướng phát triển Trong đó, nấm phân giải lignocellulose nguồn sản sinh enzyme dồi dào, góp phần xử lý an tồn phụ phẩm nơng - lâm nghiệp Trong loại enzyme sinh tổng hợp loại nấm này, cellobiose dehydrogenase loại enzyme phụ trợ có vai trị vơ quan trọng Hơn nữa, loại enzyme cịn có nhiều ứng dụng thiết thực khác Do đó, em thực đề tài “Nghiên cứu thu nhận tinh enzyme Cellobiose dehydrogenase từ chủng nấm phân lập Coprinellus aureogranulatus”, nhằm thu sản phẩm enzyme tinh Sử dụng phương pháp vi sinh, hoá sinh sinh học phân tử thiết bị hỗ trợ nghiên cứu, kết đạt phù hợp với mục tiêu đặt ra: Chủng nấm phân lập định danh, enzyme cellobiose dehydrogenase tinh sau quy trình tinh nhiều bước (lọc màng MWCO 10 – 20 kDa cut-off sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel) Các nghiên cứu enzyme tiếp tục, nhằm hồn thiện quy trình thu nhận tinh Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2020 Sinh viên thực Nguyễn Mỹ Linh MỤC LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH MINH HOẠ DANH MỤC BẢNG MỞ ĐẦU I Lý chọn đề tài II Lịch sử nghiên cứu Chương TỔNG QUAN 10 I Phụ phẩm nông - lâm nghiệp giàu lignocellulose Việt Nam 10 Nguồn gốc 10 Thành phần 11 III Chuyển hóa vật liệu giàu Lignocellulose 12 IV Nấm phân giải lignocellulose 16 V Chủng nấm Coprinellus aureogranulatus 17 VI Giới thiệu enzyme Cellobiose dehydrogenase 18 Khái niệm, nguồn gốc phân loại 19 Cấu trúc 21 Cơ chế xúc tác 22 Điều kiện tối ưu 25 Đặc tính đặc hiệu chất 25 Ứng dụng 26 Các phương pháp tinh enzyme CDH 28 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 I Đối tượng nghiên cứu, hoá chất thiết bị 33 Đối tượng nghiên cứu 33 Vật liệu 33 Hoá chất 33 Thiết bị sử dụng 34 II Phương pháp nghiên cứu 34 Phân lập nấm 34 Định danh nấm 35 Nuôi cấy bảo quản nấm 36 Tinh enzyme 36 Xác định hàm lượng protein enzyme 38 Xác định hoạt độ enzyme 38 Xác định độ tinh 39 Chương Kết thảo luận 40 Phân lập sàng lọc nấm 40 Định danh quan sát hình thái nấm 42 Dựng đường chuẩn protein tổng 45 Kết lên men thu nhận enzyme 47 Kết tinh protein 47 Xác định độ tinh 51 Khảo sát điều kiện hoạt động tối thích 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 DANH MỤC VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt CBQR Cellobiose:quinone oxidoreductase CDH Cellobiose dehydrogenase CYT Cytochrome domain of CDH Vùng cytochrome CDH DET Direct electron transfer Vận chuyển điện tử trực tiếp DCIP 2,6-Dichlorophenolindophenol DH DH domain of CDH FAD Flavin adenine dinucleotide FPLC Fast protein liquid chromatography GDH Glucose dehydrogenase GMC Glucose-methanol choline IET Interdomain electron transfer LPMO Lytic polysaccharide monooxygenase MET Mediated electron transfer Miền DH CDH Nicotinamide phosphate adenine Vận chuyển điện tử nội phân tử Vận chuyển điện tử qua trung gian MWCO Molecular weight cut off NADP Sắc ký lỏng protein nhanh Siêu lọc theo khối lượng phân tử dinucleotide TLTK Tài liệu tham khảo DANH MỤC HÌNH MINH HOẠ Hình 1.1: Cấu tạo lignocellulose 11 Hình 1.2: Mặt cắt vi sợi lignocellulose 11 Hình 1.3: Cơ chế phân giải cellulose enzyme xúc tác 15 Hình 1.4: Cấu trúc in vivo CDH 15 Hình 1.5: Các dạng hình thái chủng nấm Coprinellus aureogranulatus 18 Hình 1.6: Sự phân bố xuất gene lpmo cdh genome nấm 20 Hình 1.7: Phân loại CDH 21 Hình 1.8: Cấu trúc TcCDH 22 Hình 1.9: Cơ chế xúc tác CDH mối liên hệ với LPMO 23 Hình 1.10: Dịch chuyển điện tử CDH 24 Hình 1.11: Dịch chuyển điện tử trực tiếp (DET) gián tiếp (MET) 24 Hình 1.12: So sánh pH tối ưu cho CDH loại I (bên trái) loại II 25 Hình 1.14: Cơ chế hoạt động cột trao đổi ion 30 Hình 1.15: Nhựa nhồi cột DEAE-cellulose 31 Hình 3.1: Hoạt tính CDH chủng khác nhau, xác định phiến 96 giếng 42 Hình 3.2: Chủng nấm ký hiệu MPG14 đĩa thạch 43 Hình 3.3: Khuẩn ty chủng ký hiệu MPG14 43 Hình 3.4: Điện di DNA tổng số .44 Hình 3.5 Mối quan hệ họ hàng chủng nấm MPG14 với loài/thứ chi lấy Genbank 45 Hình 3.6: Trình tự ITS chủng nấm ký hiệu MPG14 45 Hình 3.7: Đường chuẩn nồng độ protein dung dịch 46 Hình 3.8 : Đồ thị chạy cột DEAE –sepharose 47 Hình 3.9: Đồ thị chạy cột Q-sepharose 48 Hình 3.10: Kết điện di SDS-PAGE điện di pI (native isoelectric focusing) 51 Hình 3.11 So sánh hoạt tính CDH nhiệt độ khác 54 Hình 3.12 So sánh hoạt tính CDH dung dịch đệm có giá trị pH khác 55 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Sinh khối lignocellulose từ phế phẩm nông - lâm nghiệp Việt Nam 10 Bảng 1.2: Một số thông số cột Q-sepharose 31 Bảng 2.1: Các hoá chất sử dụng 33 Bảng 2.2: Các thiết bị sử dụng 34 Bảng 3.1: Hoạt tính CDH phương pháp định danh chủng nấm nghiên cứu 40 Bảng 3.2: Kết đo OD tương ứng với nồng độ protein 46 Bảng 3.3 Tổng hợp kết tinh enzyme CDH 49 MỞ ĐẦU I Lý chọn đề tài Sự đẩy mạnh sản xuất nông - lâm nghiệp thải môi trường lượng lớn sản phẩm phụ sau thu hoạch phế thải từ rừng (cành, lá), phế thải nông nghiệp (cỏ, bèo dâu, rơm rạ, bã mía, thân mì, loại vỏ,….) chất thải ngày giấy, bàn, ghế,… Hàng năm, thảm thực vật sinh lượng sinh khối khổng lồ, ước tính khoảng 4x1010 Các chất thải gọi vật liệu lignocellulose thải với thành phần chủ yếu cellulose 35 - 50 %, hemicellulose 15 – 30 % lignin 10 - 25 % Các chất thải phần lượng tái sử dụng làm thức ăn gia súc, chất độn,…phần lại thường đốt hay thải bỏ để phân hủy tự nhiên Cách xử lý thải CO, CO2 hay CH4,…Đây nguồn góp phần gây ô nhiễm môi trường hiệu ứng nhà kính Hiện nay, q trình thủy phân lignocellulose thường thực phương pháp hóa học sử dụng acid kiềm thủy phân enzyme từ vi sinh vật Quá trình thủy phân phương pháp hóa học thường xảy nhiệt độ áp suất cao dẫn đến tạo thành chất độc hại ảnh hưởng khơng tốt đến mơi trường sức khoẻ người Vì vậy, ngày nghiên cứu theo hướng sử dụng vi sinh vật để sản sinh enzyme thúc đẩy phân giải lignocellulose ưa chuộng đầu tư nghiên cứu Phương pháp vừa đạt hiệu cao, vừa thân thiện với mơi trường an tồn tiếp xúc Trong nhóm vi sinh vật sản sinh enzyme phân giải lignocellulose, nấm nhóm nghiên cứu nhiều Các loại nấm khác có khả sinh enzyme phân giải lignocellulose khác Trong loại nấm mục nấm mục nâu nấm mục trắng phổ biến Việt Nam Nấm mục có vai trị quan trọng việc phân giải cellulose, nhờ có khả sinh loại enzyme ngoại bào cellobiose dehydrogenase, lignin peroxidase, mangan peroxidase, laccase,…Đặc biệt enzyme cellobiose dehydrogenase nấm mục sinh lớn so với loại nấm khác Phụ phẩm nông nghiệp Việt Nam nơi sinh sống tốt nguồn thức ăn dồi cho chủng nấm mục có khả sinh enzyme Enzyme cellobiose dehydrogenase (CDH, EC 1.1.99.18) thuộc họ oxidoreductase, enzyme xúc tác cho chuyển điện tử từ phân tử (chất khử), gọi chất cho điện tử, đến chất khác (chất oxy hóa), gọi chất nhận điện tử CDH có khả chuyển điện tử tới enzyme phân giải thử nghiệm nghiên cứu sâu xa đặc điểm quy trình tinh loại enzyme Bảng 3.3 Tổng hợp kết tinh enzyme CDH Các bước tinh Hoạt độ tổng số, U Protein tổng số, mg Dịch thơ Siêu lọc DEAE-sepharose Superdex 75 HiTrapƠ Q FF 1817.1 1437.1 889.2 549.2 411.8 2635.6 2239.3 231.5 25.7 14.3 Hoạt độ riêng, U/mg 0.69 0.64 3.84 21.33 28.86 Hiệu Hiệu suất suất tinh thu hồi % (số lần) 100 1.0 79.1 0.9 48.9 5.6 30.2 30.9 22.7 41.9 Chủng nấm nghiên cứu sinh tổng hợp lượng CDH đáng kể trình lên men rắn với rơm để thu lượng dịch chiết thô chứa tổng hoạt độ CDH 1817,1 U (được đo với chất nhận điện tử DCIP) Trong trình tinh sạch, hoạt tính enzyme sau bước đánh giá tính tốn hoạt độ riêng, số lần tinh (purification fold) bảng Sau tinh sạch, hàm lượng CaCDH lại đạt 22.7% tinh tới 41.9 lần từ dịch lọc nuôi cấy thô với hoạt độ riêng 28,86 U/mg (tổng 411.8 U) Sau chạy cột DEAE, hàm lượng protein tổng giảm tới 89.76% từ 2239.3mg 231.5mg, loại nhiều protein tạp chất màu, tạo điều kiện thuận lợi để chạy cột Cột Superdex loại nhiều protein tạp, từ 231.5mg xuống 25.7mg protein tổng Sau bước này, hoạt độ riêng enzyme tăng đáng kể (từ 3.84U/mg lên 21.33U/mg) Cột Q-sepharose làm thất enzyme nhất, hoạt độ tổng từ 549.2U 411.8U, giảm 7% (từ 30.2% 22.7%) Năm 2009, Roland Ludwig cộng [85] đưa quy trình tinh sử dụng cột DEAE-sepharose, sau sắc ký kỵ nước HIC sử dụng cột Phenyl Sepharose FF cuối cột Mono Q, cho thấy kết hiệu suất thu hồi đạt 18.4% với độ tinh 44.1 lần, tương đồng với nghiên cứu Một số nghiên cứu khác Ursula vào năm 2001 [86] sử dụng cột DEAE – sepharose cột Phenyl FF, không dùng cột Q sepharose cho hiệu suất thu hồi cao mức 55%, nhiên số lần tinh lại đạt 25% Nhưng kết điện di SDS-PAGE lại có band vạch nhất, kết 49 chủng nấm Sclerotium (Athelia) rolfsii nghiên cứu sản sinh nhiều enzyme CDH so với loại enzyme khác Các kết tương tự đưa báo Christin Fisher (2014) [4], với hiệu suất thu hồi tới 56% số lần tinh đạt 11.3 lần Sau trình tinh enzyme dùng loại cột nhiều bước cut-off, dựa vào kết đạt tham khảo thêm nhiều tài liệu khác, em xin đưa số ý kiến để cải thiện hiệu tinh sau: 1) Sau tinh cột Q-sepharose, sản phẩm enzyme tinh sạch, nhiên kết điện di cho thấy có vùng nhiễu phía band enzyme CDH Các nghiên cứu sau thử nghiệm sử dụng nối cột HiTrap Q thay cột, sử dụng cột HiPrep hãng sản xuất 2) Các bước tiến hành kỹ khâu đoạn, bước cân cột để cột hoạt động với hiệu cao 3) Nghiên cứu thử nghiệm với tốc độ dòng khác 4) Nghiên cứu thử nghiệm dùng loại đệm khác pH khác nhau, khảo sát điểm pH phù hợp để chạy cột, đảm bảo vừa tinh enzyme, vừa không làm thất nhiều biến tính enzyme 5) Thử nghiệm loại cột khác, tham khảo thêm quy trình tinh sử dụng thêm nhiều loại cột khác để rút quy trình tinh enzyme CDH tối ưu, độ tinh lẫn hiệu suất thu hồi thu 6) Thử nghiệm phương pháp tinh từ tài liệu tham khảo khác, ví dụ sắc ký kỵ nước – HIC – Hydrophobic Interaction Chromatography, xuất nhiều tài liệu với suất độ tinh cao 50 Xác định độ tinh Hình 3.10: Kết điện di SDS-PAGE (trái) điện di pI (native isoelectric focusing) (phải) CaCDH sau tinh (lane 2, 3); Protein markers lane Độ tinh khiết C aureogranulatus CDH (CaCDH) sau bước cuối cột HiTrap Q đánh giá phân tích điện di gel polyacrylamide 12% SDS, cho thấy dải band rõ ràng với khối lượng phân tử 109 kDa (Hình 3.11) CaCDH tinh khiết thể giá trị pI pH acid yếu 5.4 xuất dạng dải protein đồng gel IEF sau nhuộm colliodal blue Kết tinh CaCDH tóm tắt bảng 3.3 Khảo sát điều kiện hoạt động tối thích Điều kiện nhiệt độ: % hoạt độ 7.1 120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% 25 30 35 40 45 50 60 70 độ C Hình 3.11 So sánh hoạt tính CDH nhiệt độ khác 51 Hoạt tính CDH thể rõ ràng dải nhiệt độ 40 - 45°C, sau giảm dần đáng kể có xu hướng giảm tăng nhiệt độ Nhiệt độ đo hoạt tính CDH nên giữ khoảng từ 35 đến 45°C để kiểm tra hoạt tính xác nhất, 80% Tuy nhiên, enzyme giữ 57% hoạt tính sau ủ phút 70°C, tức enzyme khơng bị bất hoạt tồn đưa vào môi trường nhiệt độ cao Tuy vậy, khơng thể kết luận enzyme bền nhiệt, cịn cần khảo sát thêm khả chịu nhiệt độ cao theo thời gian % hoạt độ 7.2 Điều kiện pH 120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% 4.5 5.5 6.5 7.5 pH Hình 3.12 So sánh hoạt tính CDH dung dịch đệm có giá trị pH khác Hoạt tính CDH quan sát rõ ràng pH Tại pH acid mạnh (pH 4) kiềm mạnh (pH 8), enzyme bị bất hoạt hoàn toàn (lần lượt 6% 2%) Chỉ cần có thay đổi nhỏ pH, chênh lệch 0.5 dẫn đến thay đổi đáng kể hiệu suất hoạt tính CaCDH, cịn 45% pH 4.5 66% pH 5.5 Kết tối ưu điều kiện hoạt động tương đối phù hợp với nghiên cứu enzyme CDH khác nước ngồi Một số loại CDH có khả hoạt động pH acid mạnh (pH 3), loại enzyme phân lập từ nước khác 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu, rút số kết luận sau: * Phân lập tuyển chọn: § Từ chủng nấm thu thập từ khu vườn quốc gia, phân lập 47 chủng nấm có hoạt tính phân giải lignocellulose, có chủng thể hoạt tính CDH cao nhất, CP4, CP8, CP29, MPN10 MPG14 § Trong chủng trên, MPG14 thể hoạt tính CDH vượt trội với hoạt độ 77U/L, đem nghiên cứu lên men thu nhận CDH nghiên cứu * Định danh đặc điểm hình thái kết hợp với sinh học phân tử: Chủng MPG14 có hệ khuẩn ty non màu trắng, già màu nâu, bề mặt xốp Khuẩn ty phân nhánh hình vẽ Kết hợp với sinh học phân tử, nhận thấy chủng MPG14 có độ tương đồng cao với chủng nấm Coprinellus aureogranulatus * Nuôi cấy enzyme: Chủng nấm nghiên cứu thể khả sinh enzyme có hoạt tính phân giải nguồn chất lignocellulose môi trường giàu lignocellulose mơi trường rơm Hoạt tính CDH xác định dịch chiết thô 77.40 U/L * Tinh enzyme: Sau quy trình tinh gồm bước (MWCO cut-off, cột DEAE-sepharose, cột desalting cột Q-sepharose), enzyme CDH thu nhận không bị lẫn protein tạp, thể băng gel điện di SDS-PAGE điện di IEF Sau quy trình tinh này, hàm lượng CaCDH lại đạt 22.7% tinh 41.9 lần từ dịch lọc nuôi cấy thô với hoạt độ riêng 28,86 U/mg (tổng 411,8 U) Khi so sánh kết nghiên cứu với kết số nhóm nghiên cứu khác đăng tải trước đó, nhận thấy có số điểm khác biệt đặc tính enzyme điều kiện tối ưu enzyme Điều dễ hiểu đặc tính enzyme phụ thuộc vào nhiều yếu tố, giả dụ nguồn nấm phân lập địa phương phân lập Các loại nấm phân lập từ quốc gia khác nhau, có khí 53 hậu khác nhau, vùng có đặc tính dinh dưỡng khác nhau, hay chí thân khác có đặc tính khác KIẾN NGHỊ Từ nghiên cứu đây, em bước đầu đạt chút thành việc tìm chủng nấm tự nhiên có khả phân giải chuyển hóa nguồn chất lignocellulose Em hy vọng đề tài tiếp tục phát triển thời gian tới nhằm hướng tới ứng dụng mang tính thực tế Dưới số kiến nghị em cho việc phát triển đề tài: • Tiếp tục khảo sát thêm điều kiện nuôi cấy (thành phần môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ, pH…) chủng nấm Coprinellus aureogranulatus chủng nấm khác số chủng chọn lọc hoạt tính CDH nhằm tìm điều kiện tối ưu để sinh trưởng phát triển tốt mang lại lợi ích kinh tế • Thu thập, phân lập chủng nấm khác từ địa phương khác, tăng nguồn phân lập nấm để chủng phân lập đa dạng hơn, phát nhiều chủng có hoạt tính CDH • Nghiên cứu đặc tính xúc tác đặc hiệu chất enzyme tinh • Tại Việt Nam chưa có nhóm nghiên cứu khác công bố tài liệu liên quan đến loại enzyme này, nên nghiên cứu tiền đề để phát triển nghiên cứu sâu sau, tiếp nối xu hướng 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Mai Hương, Trần Thị Hồng Hà, Đỗ Hữu Nghị (2019), Một số kết nghiên cứu định hướng ứng dụng chất có hoạt tính sinh học từ nấm lớn Việt Nam, NXB Khoa học tự nhiên Cơng nghệ Vũ Đình Giáp, Thái Thị Mỹ Hiệp, Đỗ Hữu Nghị (2020), Nghiên cứu khả sinh tổng hợp celobiose dehydrogenase từ số lồi nấm phân lập rừng mưa phía Bắc Việt Nam, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 18(1): 135-145 Stefan Scheiblbrandner, Roland Ludwig (2020), Cellobiose dehydrogenase: Bioelectrochemical insights and applications, Bioelectrochemistry Christin Fischer, Annett Krause and Thomas Kleinschmidt (2014), Optimization of production, purification and lyophilisation of cellobiose dehydrogenase by Sclerotium rolfsii, BMC Biotechnology 2014, 14:97 Barry B Hunter, J.V Hoyes and H.L Barnett (1974), The additions of aureomycin and chloramphenicol to various fungal media to prevent bacterial contamination, Penn State University Press (Schmidhalter, D.R., Canevascini, G., 1993 Isolation and characterization of the cellobiose dehydrogenase from the brown rot fungus Coneophora puteana (Schum ex Fr.) Karst Arch Biochem Biophys 300 (2), 559–563 Mussatto, S.I and Teixeira J (2010), “Lignocellulose as raw material in fermentation processes”, Current Research, Technology and Education Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology (MéndezVilas, A., Ed.), 2, pp 897-907 Lee, H., Hamid S., and Zain S (2014), “Conversion of lignocellulosic biomass to nanocellulose: structure and chemical process”, The Scientific World Journal Roland Ludwig, Roberto Ortiz, Christopher Schulz, Wolfgang Harreither, Christoph Sygmund, Lo Gorton (2013), Cellobiose dehydrogenase modified electrodes: advances by materials science and biochemical engineering, Anal Bioanal Chem 10 Martina Andlar, Tonci Rezi , Nenad Marđetko, Daniel Kracher, Roland Ludwig, Bozidar Santek (2018) , Lignocellulose degradation: An overview of 55 fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation, Engineering in Life Sciences 11 U Westermark, K Eriksson (1974), Cellobiose-quinone oxidoreductase, a new wood-degrading enzyme from white-rot fungi, Acta Chem Scand Ser B Org Chem., Biochem B 28, 209–214, https://doi.org/10.3891/acta.chem.scand.28b-0209 12 A.R Ayers, S.B Ayers, K.-E Eriksson (1978), Cellobiose oxidase, purification and partial characterization of a hemoprotein from Sporotrichum pulverulentum, Eur J Biochem 90, 171–181 13 J.D Wood, P.M Wood (1992), Evidence that cellobiose:quinone oxidoreductase from Phanerochaete chrysosporium is a breakdown product of cellobiose oxidase, Biochim Biophys Acta Protein Struct Mol Enzymol 1110, 90–96 14 R Ludwig, D Haltrich (2003), Optimisation of cellobiose dehydrogenase production by the fungus Sclerotium (Athelia) rolfsii, Appl Microbiol Biotechnol 61, 32–39 15 W Bao, S.N Usha, V Renganathan (1993), Purification and characterization of cellobiose dehydrogenase, a novel extracellular hemoflavoenzyme from the white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium, Arch Biochem Biophys 300, 705–713 16 G Vaaje-Kolstad, B Westereng, S.J Horn, Z Liu, H Zhai, M Sørlie, V.G.H Eijsink (2010), Anoxidative enzyme boosting the enzymatic conversion of recalcitrant polysaccharides, Science 330, 219–222, 17 C.M Phillips, W.T Beeson, J.H Cate, M.A Marletta (2011), Cellobiose dehydrogenase and a copper-dependent polysaccharide monooxygenase potentiate cellulose degradation by Neurospora crassa, ACS Chem Biol 6, 1399–1406 18 D Kracher, S Scheiblbrandner, A.K.G Felice, E Breslmayr, M Preims, K Ludwicka, D Haltrich, V.G.H Eijsink, R Ludwig (2016), Extracellular electron transfer systems fuel cellulose oxidative degradation, Science 352, 1098–1101 19 M.D Cameron, S.D Aust (2001), Cellobiose dehydrogenase–an extracellular fungal flavocytochrome, Enzym Microb Technol 28 129–138, 56 20 S.M Kremer, P.M Wood (1992), Production of Fenton’s reagent by cellobiose oxidase from cellulolytic cultures of Phanerochaete chrysosporium, Eur J Biochem 208 21 J.A Langston, T Shaghasi, E Abbate, F Xu, E Vlasenko, M.D Sweeney (2011), Oxidoreductive cellulose depolymerization by the enzymes cellobiose dehydrogenase and glycoside hydrolase 61, Appl Environ Microbiol 77, 7007–7015, 22 B.M Hallberg, T Bergfors, K Bäckbro, G Pettersson, G Henriksson, C Divne (2000), A new scaffold for binding haem in the cytochrome domain of the extracellular flavocytochrome cellobiose dehydrogenase, Structure 8, 79– 88 23 B Martin Hallberg, G Henriksson, G Pettersson, C Divne (2002), Crystal structure of the flavoprotein domain of the extracellular flavocytochrome cellobiose dehydrogenase, J Mol Biol 315, 421–434 24 T.-C Tan, D Kracher, R Gandini, C Sygmund, R Kittl, D Haltrich, B.M Hällberg, R.Ludwig, C Divne (2015), Structural basis for cellobiose dehydrogenase action during oxidative cellulose degradation, Nat Commun 25 R.F.H Dekker (1988), Cellobiose dehydrogenase produced by Monilia sp, Methods Enzymol 160, 454–463 26 G Henriksson, G Pettersson, G Johansson, A Ruiz, E Uzcategui (1991), Cellobiose oxidase from Phanerochaete chrysosporium can be cleaved by papain into two domains, Eur J Biochem 196, 101–106 27 M Elmgren, S.-E Lindquist, G Henriksson (1992), Cellobiose oxidase crosslinked in a redox polymer matrix at an electrode surface—a new biosensor, J Electroanal Chem 341, 257–273 28 T Larsson, M Elmgren, S.-E Lindquist, M Tessema, L Gorton, G Henriksson (1996), Electron transfer between cellobiose dehydrogenase and graphite electrodes, Anal.Chim Acta 331, 207–215 29 A Lindgren, T Larsson, T Ruzgas, L Gorton (2000), Direct electron transfer between the heme of cellobiose dehydrogenase and thiol modified gold electrodes, J Electroanal Chem 494, 105–113 57 30 K Igarashi, I Momohara, T Nishini, M Samejima (2002), Kinetics of interdomain electron transfer in flavocytochrome cellobiose dehydrogenase from the white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium, Biochem J 365, 521– 526 31 L Stoica, R Ludwig, D Haltrich, L Gorton (2006), Third-generation biosensor for lactose based on newly discovered cellobiose dehydrogenase, Anal Chem 78, 393–398 32 M Zámocký, M Hallberg, R Ludwig, C Divne, D Haltrich (2004), Ancestral gene fusion in cellobiose dehydrogenases reflects a specific evolution of GMC oxidoreductases in fungi, Gene 338, 1–14 33 V Coman, C Vaz-Domínguez, R Ludwig, W Harreither, D Haltrich, A.L De Lacey, T.Ruzgas, L Gorton, S Shleev (2008), A membrane-, mediator-, cofactor-less glucose/oxygen biofuel cell, Phys Chem Chem Phys 10, 6093 34 F Tasca, M.N Zafar, W Harreither, G Nöll, R Ludwig, L Gorton (2011), A third generation glucose biosensor based on cellobiose dehydrogenase from Corynascus thermophilus and single-walled carbon nanotubes, Analyst 136, 2033–2036 35 Leander Sützl, Gabriel Foley, Elizabeth M J Gillam, Mikael Bodén and Dietmar Haltrich (2019), The GMC superfamily of oxidoreductases revisited: analysis and evolution of fungal GMC oxidoreductases 36 A Cipri, C Schulz, R Ludwig, L Gorton, M del Valle (2016), A novel bioelectronic tongue using different cellobiose dehydrogenases to resolve mixtures of various sugars and interfering analytes, Biosens Bioelectron 79, 515–521 37 T Bobrowski, E González Arribas, R Ludwig, M.D Toscano, S Shleev, W.Schuhmann (2018), Rechargeable, flexible and mediator-free biosupercapacitor based on transparent ITO nanoparticle modified electrodes acting in μM glucose containing buffers, Biosens Bioelectron 101, 84–89 38 L Sützl, G Foley, E Gillam, M Bodén, D Haltrich (2019), The GMC superfamily of oxidoreductases revisited: analysis and evolution of fungal GMC oxidoreductases, Biotechnol Biofuels 12, 118 58 39 M Zámocký, R Ludwig, C Peterbauer, B.M Hallberg, C Divne, P Nicholls, D.Haltrich (2006), Cellobiose dehydrogenase – a flavocytochrome from wood-degrading, Phytopathogenic and saprotropic fungi, Curr Protein Pept Sci 7, 255–280 40 A Heller (1990), Electrical wiring of redox enzymes, Acc Chem Res 23, 128–134 41 B.A Gregg, A Heller (1990), Cross-linked redox gels containing glucose oxidase for amper-ometric biosensor applications, Anal Chem 62, 258–263 42 A Lindgren, T Ruzgas, L Gorton, L Stoica, A Ciucu, (1999), Development of a cellobiose dehydrogenase modified electrode for amperometric detection of diphenols, Analyst 124, 527–532 43 L Stoica, A Lindgren-Sjölander, T Ruzgas, L Gorton (2004), Biosensor based on cellobiose dehydrogenase for detection of catecholamines, Anal Chem 76, 4690–4696 44 G Safina, R Ludwig, L Gorton (2010), A simple and sensitive method for lactose detection based on direct electron transfer between immobilised cellobiose dehydrogenase and screen-printed carbon electrodes, Electrochim Acta 55, 7690–7695 45 M.N Zafar, G Safina, R Ludwig, L Gorton (2012), Characteristics of thirdgeneration glucose biosensors based on Corynascus thermophilus cellobiose dehydrogenase immobilized on commercially available screen-printed electrodes working under physiological conditions, Anal Biochem 425, 36– 42 46 W Harreither, V Coman, R Ludwig, D Haltrich, L Gorton (2007), Investigation of graphite electrodes modified with cellobiose dehydrogenase from the ascomycete Myriococcum thermophilum, Electroanalysis 19, 172– 180 47 V Coman, W Harreither, R Ludwig, D Haltrich, L Gorton (2008), Investigation of electron transfer between cellobiose dehydrogenase From Myriococcum thermophilum and gold electrodes, Chem Anal 52, 945 48 P.N Bartlett, F.A Al-Lolage (2018), There is no evidence to support literature claims of direct electron transfer (DET) for native glucose oxidase (GOx) at carbon nanotubes or graphene, J Electroanal Chem 819, 26–37 59 49 Kracher D, Zahma K, Schulz C, Sygmund C, Gorton L, Ludwig R (2015) Inter-domain electron transfer in cellobiose dehydrogenase: modulation by pH and divalent cations FEBS J 2015;282:3136–48 50 Sanchita Banerjeea, Ankit Royb, M S Madhusudhanb, Hridoy R Bairagyaa, Amit Roya (2019), Structural insights of a cellobiose dehydrogenase enzyme from the basidiomycetes fungus Termitomyces clypeatus 51 Kerem, Z., Friesem, D., Hadar, Y (1992), Lignocellulose degradation during solid‐state fermentation: Pleurotus ostreatus versus Phanerochaete chrysosporium Appl Environ Microbiol., 58, 1121–1127 52 Li, X., Pang, Y., Zhang, R (2001), Compositional changes of cottonseed hull substrate during P ostreatus growth and the effects on the feeding value of the spent substrate Bioresour Technol., 80, 157–161 53 Li, L., Li, X Z., Tang, W Z., Zhao, J et al (2008), Screening of a fungus capable of powerful and selective delignification on wheat straw Soc Appl Microbiol Lett Appl Microbio, 47, 415–420 54 Herpoël, I., Jeller, H., Fang, G., Petit‐Conil, M et al (2002), Efficient enzymatic delignification of wheat straw pulp by a sequential xylanaselaccase mediator treatment J Pulp Pap Sci., 28, 55 D Kracher, R Ludwig(2016), Cellobiose dehydrogenase: An essential enzyme for lignocellulose degradation in nature, Bodenkult, J Land Manag Food Environ 67 56 G.S Nyanhongo, B Thallinger, G.M Guebitz (2017) , Cellobiose dehydrogenase-based biomedical applications, Process Biochem 59, 37–45 57 R Ludwig, W Harreither, F Tasca, L Gorton (2010), Cellobiose dehydrogenase: a versatilecatalyst for electrochemical applications, Chem Phys Chem 11, 2674–2697 58 R Ludwig, R Ortiz, C Schulz, W Harreither, C Sygmund, L Gorton (2013), Cellobiose dehydrogenase modified electrodes: advances by materials science and biochemical engineering, Anal Bioanal Chem 403, 3637–3658 59 P Bollella, L Gorton, R Antiochia (2018), Direct electron transfer of dehydrogenases for development of 3rd generation biosensors and enzymatic fuel cells, Sensors 18, 1319 60 60 P Bollella, R Ludwig, L Gorton (2017), Cellobiose dehydrogenase: Insights on the nanostructuration of electrodes for improved development of biosensors and biofuel cells, Appl Mater Today 9, 319–332 61 L Sützl, C.V.F.P Laurent, A.T Abrera, G Schütz, R Ludwig, D Haltrich (2018), Multiplicity of enzymatic functions in the CAZy AA3 family, Appl Microbiol Biotechnol 102, 2477–2492, 62 B.M Hallberg, G Henriksson, G Pettersson, A Vasella, C Divne (2003), Mechanism of the reductive half-reaction in cellobiose dehydrogenase, J Biol Chem 278, 7160–7166 63 Gupta, R., Mehta, G., Khasa, Y P., Kuhad, R C (2011), Fungal delignification of lignocellulosic biomass improves the saccharification of cellulosics Biodegradation, 22, 797–804 64 Giles, R L., Galloway, E R., Elliott, G D., Parrow, M W (2011), Two stage fungal biopulping for improved enzymatic hydrolysis of wood Bioresour Technol., 102, 8011–8016 65 Uljé CB, Aptroot A, van Iperen A (1998), “A new Coprinus from Papua New Guinea sporulating in pure culture” Persoonia 16 (4): 549–51 66 Redhead SA, Vilgalys R, Moncalvo J-M,Johnson J & Hopple, JS Jr (2001) “Coprinus Pers and the disposition of Coprinus species sensu lato” Taxon 50 (1): 203–41 67 Shawn D Mansfield, Ed De Jong, John N (1997), Cellobiose Dehydrogenase, an Active Agent in Cellulose Depolymerization 68 Pérez-Torrado R, et al (2002), Wine yeast strains engineered for glycogen overproduction display enhanced viability under glucose deprivation conditions Appl Environ Microbiol 68(7):3339-44 69 G Wojtczak et Al (1987), A comparison of the thermostability of cellulases from various thermophilic fungi, Applied Microbiology and Biotechnology volume 27, pages82–87 70 Edward A Bayer et al (2004), The Cellulosomes: Multienzyme Machines for Degradation of Plant Cell Wall Polysaccharides, 71 Lizbeth Laureano-Perez (2005), Understanding factors that limit enzymatic hydrolysis of biomass, Applied Biochemistry and Biotechnology volume 124, pages1081–1099(2005) 61 72 D Kracher, K Zahma, C Schulz, C Sygmund, L Gorton, R Ludwig (2015), Inter-domain electron transfer in cellobiose dehydrogenase: modulation by pH and divalent cations, FEBS J 282 73 M.S Rogers, G.D Jones, G Antonini, M.T Wilson, M Brunori (1994), Electron transfer from Phanerochaete chrysosporium cellobiose oxidase to equine cytochrome c and Pseudomonas aeruginosa cytochrome c-551, Biochem J 298, 329–334 74 C Schulz, R Ludwig, P.O Micheelsen, M Silow, M.D Toscano, L Gorton (2012), Enhancement of enzymatic activity and catalytic current of cellobiose dehydrogenase by calcium ions, Electrochem Commun 17, 71–74 75 M.C Potter, Waller Augustus Desire (1911), Electrical effects accompanying the decomposition of organic compounds, Proc R Soc Lond Ser B Contain Pap Biol Character.84, 260–276 76 A.T Yahiro, S.M Lee, D.O Kimble (1964), Bioelectrochemistry: I.Enzyme utilizing bio-fuel cell studies, Biochim Biophys Acta BBA Spec Sect Biophys Subj 88, 375–383 77 X Wang, M Falk, R Ortiz, H Matsumura, J Bobacka, R Ludwig, M Bergelin, L.Gorton, S Shleev (2012), Mediatorless sugar/oxygen enzymatic fuel cells based on gold nanoparticle-modified electrodes, Biosens Bioelectron 31 (2012) 219–225 78 Gary M Scott et al, Biotechnological Applications of Lignin‐Degrading Fungi (White‐Rot Fungi) 79 M Falk, V Andoralov, Z Blum, J Sotres, D.B Suyatin, T Ruzgas, T Arnebrant, S.Shleev, (2012), Biofuel cell as a power source for electronic contact lenses, Biosens.Bioelectron 37, 38–45 80 Maria Silvia Bertran, Bruce E.Dale (1986), Determination of cellulose accessibility by differential scanning calorimetry 81 Michael E Himmel (2007), Biomass Recalcitrance: Engineering Plants and Enzymes for Biofuels Production, Science 315, 804-807 82 Alex Berlin et al, Inhibition of cellulase, xylanase and β-glucosidase activities by softwood lignin preparations 62 83 Kenneth A Jensen Jr Jr et.al (2002), An NADH:quinone Oxidoreductase Active During Biodegradation by the Brown-Rot Basidiomycete Gloeophyllum Trabeum 84 Leander Sützl, Gabriel Foley, Elizabeth M J Gillam, Mikael Bodén and Dietmar Haltrich (2019), The GMC superfamily of oxidoreductases revisited: analysis and evolution of fungal GMC oxidoreductases Wolfgang Harreither, R Ludwig (2009) Cellobiose dehydrogenase from the lignolytic Basidiomycete Ceriporiopsis subvermispora, Appl Environ Microbiol, May;75(9):2750-7 Ursula Baminger, S.S Subramaniam, Purification and Characterization of Cellobiose Dehydrogenase from the plant pathogen Sclerotium (Athelia) rolfsii, Appl Environ Microbiol 2001 Apr;67 85 86 63 ... tượng nghiên cứu Chủng nấm phân lập: 47 chủng nấm nghiên cứu phân lập, tinh từ mẫu nấm thu thập vườn quốc gia Sau tinh sạch, số chủng nấm đem định danh phương pháp sinh học phân tử phục vụ cho nghiên... sinh enzyme cellobiose dehydrogenase từ nấm lớn Việt Nam Từ sở khoa học thực tiễn làm động lực cho em chọn đề tài: “Nghiên cứu thu nhận tinh enzyme cellobiose dehydrogenase từ chủng nấm phân. .. “Nghiên cứu thu nhận tinh enzyme cellobiose dehydrogenase từ chủng nấm phân lập Coprinellus aureogranulatus” Nội dung đề tài: • Phân lập, tuyển chọn chủng nấm tự nhiên có khả sinh enzyme cellobiose