Cải biến gen mã hóa enzyme phytase từ nấm mốc aspergillus niger nhằm tăng khả năng hồi tính của phytase sau khi bị biến tính ở nhiệt độ cao

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Đặng Thị Kim Anh CẢI BIẾN GEN MÃ HÓA ENZYME PHYTASE TỪ NẤM MỐC Aspergillus niger NHẰM TĂNG KHẢ NĂNG HỒI TÍNH CỦA PHYTASE SAU KHI BỊ BIẾN TÍNH Ở NHIỆT ĐỘ CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Đặng Thị Kim Anh CẢI BIẾN GEN MÃ HÓA ENZYME PHYTASE TỪ NẤM MỐC Aspergillus niger NHẰM TĂNG KHẢ NĂNG HỒI TÍNH CỦA PHYTASE SAU KHI BỊ BIẾN TÍNH Ở NHIỆT ĐỘ CAO Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Vũ Nguyên Thành TS Trần Văn Tuấn Hà Nội – Năm 2015 Luận văn thạc sĩ Lời cảm ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Vũ Nguyên Thành, Thầy tận tình bảo, hƣớng dẫn tơi suốt trình học tập thực luận văn Thầy gƣơng đầy nhiệt huyết, say mê nghiên cứu khoa học giúp tiếp cận, trau dồi kiến thức từ định hƣớng, giải vấn đề trình nghiên cứu Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Trần Văn Tuấn thầy, cô giáo Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên nhiệt tình giảng dạy, dìu dắt tơi thời gian học tập trƣờng Trong trình thực luận văn, nhận đƣợc nhiều quan tâm giúp đỡ thầy cô giáo thuộc Bộ môn Sinh lý thực vật Hóa sinh Tơi xin chân thành cảm ơn Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới anh, chị nghiên cứu viên bạn sinh viên làm việc Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm tận tình bảo, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập làm việc Trung tâm Cuối cùng, tơi vơ biết ơn gia đình bạn bè ln bên, khích lệ động viên, giúp đỡ suốt thời gian qua Hà Nội, ngày 25 tháng 06 năm 2015 Học viên Đặng Thị Kim Anh K21-Sinh học thực nghiệm Đặng Thị Kim Anh Luận văn thạc sĩ MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG – TỔNG QUAN 1.1 AXIT PHYTIC VÀ PHYTATE 1.2 ENZYME PHÂN GIảI PHYTATE (PHYTASE) 1.2.1 Phân loại enzyme phytase 1.2.2 Nguồn phytase 1.3 ỨNG DụNG CủA PHYTASE 1.3.1 Trong chăn nuôi 1.3.2 Trong công nghệ thực phẩm 1.3.3 Trong công nghiệp giấy 1.3.4 Trong cải tạo đất 1.3.5 Trong tổng hợp dẫn xuất myo-inositol phosphate 1.4 CÁC NGHIÊN CứU TÁCH DÕNG BIểU HIệN PHYTASE TRÊN THế GIớI 10 1.5 CÁC NGHIÊN CứU Về ENZYME PHYTASE VIệT NAM 11 1.6 CấU TRƯC PROTEIN LIÊN QUAN ĐếN KHả NĂNG HồI TÍNH CủA PHYTASE Từ A NIGER VÀ A FUMIGATUS 13 CHƢƠNG – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 NGUYÊN LIỆU 18 2.1.1 Hóa chất 18 2.1.2 Vi sinh vật 19 2.1.3 Thiết bị 21 2.1.4 Môi trường nuôi cấy 21 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.2.1 Phương pháp Mega-PCR 21 2.2.2 Tinh sản phẩm PCR từ gel agarose kit GenJETTM Gel Extraction 22 2.2.3 Ghép nối plasmid 23 2.2.4 Biến nạp sản phẩm ghép nối plasmid vào E coli sốc nhiệt 23 2.2.5 Tách chiết plasmid từ vi khuẩn E.coli kit GenJETTM Plasmid Miniprep 24 2.2.6 Chuyển gen vào tế bào nấm men Pichia pastoris phương pháp biến nạp xung điện 24 K21-Sinh học thực nghiệm Đặng Thị Kim Anh Luận văn thạc sĩ 2.2.7 Tách chiết DNA tổng số Pichia pastoris 25 2.2.8 Phương pháp nuôi biểu nấm men Pichia pastoris 26 2.2.9 Phương pháp điện di protein SDS - PAGE 26 2.2.10 Xác định hoạt tính phytase 27 2.2.11 Lọc enzyme thiết bị Viva Flow 200 29 2.2.12 Tinh protein phương pháp sắc ký tương tác kỵ nước 29 CHƢƠNG – KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 29 3.1 CẢI BIẾN TRÌNH TỰ GEN MÃ HĨA PHYTASE 30 3.1.1 Phân tích đặc tính gen phyA tách dịng Viện Cơng nghiệp Thực phẩm liên quan tới tính bền nhiệt 30 3.1.2 Tạo đột biến điểm thay axit amin Mega-PCR 31 3.1.3 Tạo plamid chứa gen phyA-P12 mang đột biến điểm 34 3.2 CHUYỂN GEN PHYA VÀO TẾ BÀO NẤM MEN PICHIA PASTORIS 38 3.2.1 Chuyển gen vào tế bào Pichia pastoris X33 phương pháp biến nạp xung điện 38 3.2.2 Kiểm tra gen mã hóa phytase genome Pichia pastoris 40 3.2.3 Sàng lọc thể biến nạp sinh phytase tái tổ hợp 41 3.3 THU HỒI VÀ TINH SẠCH ENZYME PHYTASE TÁI TỔ HỢP 42 3.4 XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH CỦA ENZYME PHYTASE TÁI TỔ HỢP SAU KHI CẢI BIẾN GEN 44 3.4.1 Xác định pH tối ưu phytase tái tổ hợp 44 3.4.2 Kiểm tra độ bền với dải pH phytase tái tổ hợp 45 3.4.3 Xác định nhiệt độ tối ưu phytase tái tổ hợp 46 3.4.4 Kiểm tra khả hồi tính phytase tái tổ hợp sau bị biến tính nhiệt độ cao 47 KẾT LUẬN 50 KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC 60 K21-Sinh học thực nghiệm Đặng Thị Kim Anh Luận văn thạc sĩ BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT AOX1 Alcohol Oxidase APS Ammonium Persulfate BMGY Buffered Glycerol Complex Medium BMMY Buffered Methanol Complex Medium cDNA complementary Deoxyribonucleic acid CNTP Công nghiệp thực phẩm DNA Deoxyribonucleic acid EC Enzyme Commission FTU Đơn vị hoạt tính phytase HIV Human Immunodeficiency Virus IU International Unit kb Kilobase kDa Kilo Dalton LB Luria-Bertani medium Northern Regional Research Laboratory NRRL (hiện National Center for Agricultural Utilization Research) (Bảo tàng giống Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ) OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid rpm Revolutions per minute SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis SSC Saline Sodium Citrate TAE Tris-Acetate-EDTA TBE Tris-Borate-EDTA TCA Trichloroacetic acid TEMED Tetramethylethylenediamine YPD Yeast Extract-Peptone-Dextrose YPDS Yeast Extract-Peptone-Dextrose-Sorbitol K21-Sinh học thực nghiệm Đặng Thị Kim Anh Luận văn thạc sĩ DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu 19 Bảng 2.2 Danh sách chủng phục vụ nghiên cứu tách dòng gen mã hóa phyA 20 Bảng 2.3 Thành phần gel chạy điện di protein 27 Bảng 2.4 Tƣơng quan hàm lƣợng phospho vô OD700nm 28 Bảng 3.1 Hoạt tính phytase tái tổ hợp thể biến nạp nuôi biểu vi đĩa 24 giếng 41 Bảng 3.2 Hiệu suất thu hồi enzyme phytase tái tổ hợp phƣơng pháp lọc luân hồi Viva Flow 200 với kích thƣớc màng kDa 42 K21-Sinh học thực nghiệm Đặng Thị Kim Anh Luận văn thạc sĩ DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc phân tử myo-inositol - 1, 2, 3, 4, 5, - hexakis dihydrogen phosphate (axit phytic) Hình 1.2 Cấu trúc protein nhóm enzyme phytase Hình 1.3 Cấu trúc tinh thể enzyme phytase từ Aspergillus fumigatus 14 Hình 1.4 Các cấu trúc đóng vai trị khả hồi tính phytase A fumigatus 16 Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc vector pPICZαA, B, C 18 Hình 2.2 Phƣơng pháp Mega-PCR 22 Hình 3.1 Mơ tả thí nghiệm tạo đột biến điểm thay axit amin gen phyA 31 Hình 3.2 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR, Mega – PCR gel agarose 1% đệm TAE ×0.5 32 Hình 3.3 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR, Mega – PCR gel agarose 1% đệm TAE ×0.5 33 Hình 3.4 Kết biến nạp sản phẩm ghép nối gen phyA mang đột biến điểm vào vector pPICZαA 34 Hình 3.5 Điện di kiểm tra sản phẩm cắt giới hạn gel agarose 1% đệm TAE ×0.5 35 Hình 3.6 Kết phân tích trình tự plasmid pPICZαA/phyA/AAS1 - sau tạo đột biến điểm phần mềm Bioedit 7.2.5 36 Hình 3.7 Trình tự gen mã hóa phyA bền nhiệt từ Aspergillus niger CNTP 5131 vị trí liên kết pPICZαA chủng tái tổ hợp Pichia pastoris CNTP 9057 37 Hình 3.8 Kết điện di sản phẩm cắt giới hạn MssI gel agarose 1% đệm TAE ×0.5 39 Hình 3.9 Kết biến nạp vector pPICZαA/phyA/P12 pPICZαA/phyA/AAS5 vào tế bào Pichia pastoris X33 phƣơng pháp xung điện 39 Hình 3.10 Kết điện di sản phẩm PCR cặp mồi T-phyA-EcoRI-F/ phyAStop-XbaI-R2 gel agarose 1% đệm TAE ×0.5 40 Hình 3.11 Kết điện di phytase tái tổ hợp gel SDS – PAGE 12% 43 Hình 3.12 Xác định pH tối ƣu phytase tái tổ hợp sau thay axit amin 45 Hình 3.13 Đánh giá độ bền pH phytase tái tổ hợp sau thay axit amin 46 K21-Sinh học thực nghiệm Đặng Thị Kim Anh Luận văn thạc sĩ Hình 3.14 Xác định nhiệt độ tối ƣu phytase tái tổ hợp sau thay axit amin 47 Hình 3.15 Đánh giá độ bền nhiệt phytase tái tổ hợp sau thay axit amin 48 K21-Sinh học thực nghiệm Đặng Thị Kim Anh Luận văn thạc sĩ MỞ ĐẦU Axit phytic (myo-inositol hexakisphosphate) dạng phospho dự trữ chủ yếu thực vật Axit phytic chiếm 65 – 80% lƣợng phospho loại ngũ cốc, hạt họ đậu họ cải Ngoài chức dự trữ phospho, axit phytic liên kết chặt chẽ với nguyên tố khoáng nhƣ Ca, Mg, Fe, Zn Axit phytic có tính chất kháng tiêu hóa khả liên kết với protein, enzyme dịch tiêu hóa động vật Enzyme phytase (myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate phospho- hydrolase) có vai trị quan trọng chăn ni Phytase xúc tác cho phản ứng thủy phân axit phytic thành gốc phospho đơn vô dẫn xuất đơn giản myo-inositol Do vậy, bổ sung vào thức ăn chăn ni, phytase khơng có tác dụng làm tăng khả hấp thu phospho, nguyên tố khống mà cịn cải thiện khả tiêu hóa hợp chất khác, đồng thời làm giảm lƣợng phospho thải ngồi, góp phần bảo vệ mơi trƣờng Phytase thƣơng phẩm đƣợc sản xuất chủ yếu dựa nguồn gen từ nấm mốc Aspergillus niger Phytase từ A niger có số ƣu điểm nhƣ hoạt động pH thấp, phù hợp với môi trƣờng axit dịch dày, có tính đặc hiệu chất với phytate cao, bền với tác động pepsin Phytase từ A niger có nhƣợc điểm bền nhiệt Trong công đoạn ép viên, thức ăn chăn nuôi thƣờng đƣợc gia nhiệt tới 70-80°C để diệt Salmonella Chính vậy, enzyme bổ sung vào thức ăn chăn nuôi phải đáp ứng yêu cầu độ bền nhiệt Để đáp ứng yêu cầu kỹ thuật ngày cao, enzyme công nghiệp thƣờng đƣợc cải biến theo hƣớng thay đổi cấu trúc nội Một số nghiên cứu cấu trúc phytase bền nhiệt từ A fumigatus cho thấy liên kết hydro tƣơng tác ion cấu trúc khơng gian có vai trò đảm bảo khả “đàn hồi” nhiệt enzyme Phytase A niger khơng có liên kết nên dễ dàng bị bất hoạt khơng có khả hồi tính Việc cải biến trình tự axit amin phytase gia tăng tính “đàn hồi” nhiệt enzyme Một hƣớng nghiên cứu đƣợc thực Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm khai thác nguồn gen thiên nhiên Việt Nam nhằm tạo enzyme tái tổ hợp phục vụ ứng dụng chăn nuôi Với phytase, có 24 gen từ lồi khác thuộc chi Aspergillus đƣợc tách dòng nghiên K21-Sinh học thực nghiệm Đặng Thị Kim Anh Luận văn thạc sĩ KIẾN NGHỊ Để hƣớng tới mục tiêu sản xuất phytase phục vụ ứng dụng chăn nuôi, đƣa số kiến nghị sau: Tiếp tục nâng cao khả biểu phytase chủng tái tổ hợp thông qua việc tạo chủng Pichia pastoris mang nhiều cassette biểu gen phyA Cần xây dựng quy trình tạo chế phẩm phytase dạng bột khô nhằm đáp ứng nhu cầu sản xuất thức ăn chăn nuôi K21-Sinh học thực nghiệm 51 Đặng Thị Kim Anh Luận văn thạc sĩ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Nguyễn Thùy Châu, (2009), “Hồn thiện cơng nghệ sản xuất enzym phytaza để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi phục vụ số ngành công nghiệp”, Báo cáo dự án khoa học kỹ thuật-Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, Viện Cơ điện Nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch Vũ Duy Giảng, (2004), “Enzyme thức ăn”, Đặc san khoa học kỹ thuật thức ăn chăn nuôi, 3, tr 11-13 Đỗ Thị Ngọc Huyền, (2007), Nghiên cứu tính chất phytase tự nhiên tái tổ hợp vi khuẩn Bacillus subtilis, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Đỗ Hữu Phƣơng, (2004), “Vai trò enzyme chăn nuôi” Đặc san khoa học kỹ thuật thức ăn chăn nuôi, 1, tr 25-26 Nguyễn Văn Viết, (2008), Nghiên cứu biểu gene phyC có nguồn gốc từ Bacillus subtilis E coli BL21 (DE3) bước đầu ứng dụng enzyme tái tổ hợp cho chăn nuôi, Luận văn thạc sỹ khoa học sinh học, Trƣờng đại học Sƣ phạm Hà nội Ngô Thanh Xuân, Mai Thị Hằng, Nguyễn Phƣơng Linh, Đinh Thị Mỹ Hằng, Vũ Nguyên Thành, (2012), “Phân tích trình tự gene (phyA) mã hóa phytase thành thục từ số chủng Aspergillus niger”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 10(1), tr 115-122 Tiếng anh Anderson R J., (1914), “A contribution to the chemistry of phytin”, J Biol Chem., 17, pp 171 –190 Anno T., Nakanishi K., Matsuno R., Kamikubo T., (1985), “Enzymatic elimination of phytate in soybean milk”, J Japan Soc Food Sci Techno.l, 32, pp 174-180 Baruah K., Pal A K., Sahu N P., Jain K K., Mukherjee S C., Debnath D., (2005), “Dietary protein level, microbial phytase, citric acid and their K21-Sinh học thực nghiệm 52 Đặng Thị Kim Anh Luận văn thạc sĩ interactions on bone mineralization of Labeo rohita (Hamilton) juveniles”, Aquacult Res., 2005, 36, pp 803–812 10 Baruah K., Sahu N P., Pal A K., Debnath D., Yengkokpam S., Mukherjee S C., (2007), “Interactions of dietary microbial phytase, citric acid and crude protein level on mineral utilization by Rohu, Labeo rohita (Hamilton), juveniles”, J W Aquacult Soc., 38, pp 238–249 11 Billington D C., (1993), “The Inositol Phosphates Chemical Synthesis and Biological Significance”, Verlag Chemie Weinheim., 26, pp 38-42 12 Cheng C., Lim B L., Turner B L., Richardson A E., Mullaney E J., (2005), “Beta-propeller phytases in the aquatic environment: characterization of a novel phytase from Shewanella oneidensis MR-1 In Inositol Phosphates in the Soil-Plant-Animal System: Linking Agriculture and Environment” Proceedings of the Bouyoucos Conference to Address the Biogeochemical Interaction of Inositol Phosphates in the Environment; USA, pp 55–56 13 Copper J R., Gowing H S., (1983), “Mammalian small intestine phytase”, Br J Nutr., 50, pp 673-678 14 Correa R L T., Queiroz V M., Araujo F E., (2014), “Cloning, recombinant expression and characterization of a new phytase from Penicillium chrysogenum”, Microbiol Res., pp 201-213 15 Craxton A., Caffrey J J., Burkhart W., Safrany S T., Shears S B., (1997) “Molecular cloning and expression of a rat hepatic multiple inositol polyphosphate phosphatase”, Biochem J., 328, pp 75-81 16 Dalal R C., (1978), “Soil organic phosphorus”, Adv Agronom., 29, pp 83– 117 17 Davies N T., Vahoung G V and Kritchevsky D., (1982), “Effects of phytic acid on mineral availability”, In Dietary Fiber in Health and Disease, Eds Plenum Press, New York, pp 125-138 18 Dawei F., Huoquing H., Huiying L., Yaru W., Peilong Y., Kun M., (2008), “A highly pH-stable phytase from Yersinia kristeensenii: Cloning, expression, and characterization”, Enz Microbiol Tech., 42, pp 499-505 K21-Sinh học thực nghiệm 53 Đặng Thị Kim Anh Luận văn thạc sĩ 19 Debnath D., Pal A K., Sahu N P., Jain K K., Yengkokpam S., Mukherjee S C, (2005), “Effect of dietary microbial phytase supplementation on growth and nutrient digestibility of Pangasius pangasius (Hamilton) fingerlings”, Aquacult Res., 36, pp 180–187 20 Deshpande S S., Cheryan M., (1984), “Effect of phytic acid, divalent cations, and their interactions on alpha-amylase activity”, J F Sci., 49, pp 516-524 21 Ellestad L E., Angel R., Soares J H., (2002), “Intestinal phytase II: A comparison of activity and in vivo phytate hydrolysis in three teleost species with differing digestive strategies”, Fish Physiol Biochem., 26, pp 259–273 22 Findenegg G R., Nelemans J A., (1993), “The effect of phytase on the vailability of P from myo-inositol hexaphosphate (phytate) for maize roots”, Plant Soil, 154, pp 189-196 23 Forsberg C W., Phillips J P., Golovan S P., Fan M Z., Meidinger R G., Ajakaiye A., Hilborn D., Hacker R R., (2003), “The enviropig physiology, performance, and contribution to nutrient management advances in a regulated environment: the leading edge of change in the pork industry”, J Anim Sci., 81, pp 68–77 24 Freund W D., Mayr G W., Tietz C., Schultz J E., (1992), “Metabolism of inositol phosphates in the protozoan Paramecium”, Eur J Biochem., 207, pp 359-367 25 Greaves M P., Anderson G., Webley D M., (1967), “The hydrolysis of inositol phosphates by Aerobacter aerogenes”, Biochem Biophys Acta., 132, pp 412418 26 Greiner R and Konietzny U., (1996), “Construction of bioreactor to produce special breakdown products of phytate”, J Biotechnol., 1996, 48, pp 153-159 27 Hartig, T., (1885), “Uber das Klebermehl”, Bot Z., 13, 881–882 28 Hartig T., Weitere M., (1856), “das Klebermehl (Aleuron) betreffend”, Bot Z., 14, 257 –269 K21-Sinh học thực nghiệm 54 Đặng Thị Kim Anh Luận văn thạc sĩ 29 Hegeman C E and Grabau E A., (2001), “A novel phytase with sequence similarity to purple acid phosphatases is expressed in cotyledons of germinating soybean seedlings”, Plant Physiol., 126, pp 1598–1608 30 Hesampour A., Siadat S E R., Malboobi M A., Mohandesi N., Arab S S., Ghahremanpour M M., (2014), “Enhancement of thermostability and kinetic efficiency of Aspergillus niger phyA phytase by site direct mutagenesis”, Appl Biochem Biotechnol., pp 67-81 31 Howson S J., and Davis R J., (1983), “Production of phytate-hydrolysing enzyme by fungi” Enzyme Microbiol Technol., 5, pp 377-382 32 Inagawa J., Kiyosawa I., Nagasawa T., (1987), “Effect of phytic acid on the hydrolysis of lactose with beta-galactosidase”, Agric Biol Chem., 51, pp 3027-3032 33 Irving G C J., Cosgrove D J., (1971), “Inositol phosphate phosphatase of microbial origin, Observations on the nature of the active center of a bacterial (Pseudomonas sp.) phytase”, Austral J Biol Sci., 24, pp 1559-1564 34 Jog S P., Garchow B G., Mehta B D., Murthy P P N., (2005), “Alkaline phytase from lily pollen: Investigation of biochemical properties”, Arch Biochem Biophys., 440, pp 133–140 35 Laboure A M., Gagnon J., Lescure A M., (1993), “Purification and characterization of a phytase (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase) accumulated in maize (Zea mays) seedlings during germination”, Biochem J., 295, pp 413-419 36 Li Z., Zhao A., Wang X., Jin X., Li J., Yu M., (2013), “Cloning, expression, and functional characterization of a phytase from the genus Bacillus”, J Mol Microbiol Biotechnol., 23, pp.193-202 37 Liu B L., Rafiq A., Tzeng Y M and Rob A., (1998), “The induction and characterization of phytase and beyond” Enzyme Microbiol Technol., 22, pp 415-424 K21-Sinh học thực nghiệm 55 Đặng Thị Kim Anh Luận văn thạc sĩ 38 Mrudula V U., Jalaja V., Ashok P., (2014), “Gene cloning and soluble expression of Aspergillus niger phytase in E coli cytosol via chaperone coexpression”, Biotechnol Lett., 36, pp 85-91 39 Mullaney E., Sethumadhavan K., Stephanie B., Lei X G., Ullah A H J., (2012), “Elimination of disulfide bridges in Aspergillus niger NRRl 3135 phytase (phyA) enhances heat tolerance and optimizes its temperature versus activity profile”, Ad Bio Chem., 2, pp 372 – 378 40 Ngo Thanh Xuan, Mai Thi Hang and Vu Nguyen Thanh, (2009), “Cloning and over expression of an Aspergillus niger XP phytase gene (phyA) in Pichia pastoris”, World Academy of Science, Engineering and Technology, 56, pp 750 – 753 41 Nwanna L C., Schwarz F J., (2007), “Effect of supplemental phytase on growth, phosphorus digestibility and bone mineralization of common carp (Cyprinus carpio L)”, Aquacult Res., 38, pp 1037–1044 42 Pandey A., Szakacs G., Soccol C R., Rodriguez-Leon J A., Soccol V T., (2001), “Production, purification and properties of microbial phytases”, Bioresour Technol., 77, pp 203-214 43 Phillippy B Q., Wyatt C J., (2001), “Degradation of phytate in foods by phytases in fruits and vegetable extracts”, J F Sci., 66, pp 535–539 44 Phillippy, B Q., Bland, J M., Evens, T J., (2003), “Ion chromatography of phytate in roots and tubers”, J Agric F Chem., 51, 350–353 45 Raboy V., (2003), “myo-Inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphates”, Phytochemistry, 64, 1033–1043 46 Rao D E., Rao K V., Reddy T P., Reddy V D., (2009), “Molecular characterization, physicochemical properties, known and potential applications of phytases: An overview”, Crit Rev Biotechnol., 29(2), pp 182-98 47 Reddy N R., Pierson M D., Sathe S K., Salunkhe D K., (1989), “Phytates are cereals and legumes”, CRC Press Inc Boca Raton Fla, pp 218-227 48 Rimbach G., Pallauf J., (1992), “The effect of a supplement of microbial phytase on zinc availability”, Z Ernahrungswiss, 31, pp 269-277 K21-Sinh học thực nghiệm 56 Đặng Thị Kim Anh Luận văn thạc sĩ 49 Sajjadi M., Carter C G., (2004), “Effect of phytic acid and phytase on feed intake, growth, digestibility and trypsin activity in Atlantic salmon (Salmo salar, L)”, Aquacult Nutr., 10, pp 135–142 50 Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T., (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, pp 123-128 51 Sandberg A S., Hulthen L R., and Turk M., (1996), “Dietary Aspergillus niger phytase increases iron absorption in humans”, J Nutr., 126, pp 476-480 52 Shah V., Parekh L J., (1990), “Phytase from Klebsiella sp No PG-2: Purification and properties”, Indian J Biochem Biophys., 27, pp 98-102 53 Shieh T R., Ware J H., (1968), “Survey of microorganisms for the production of extracellular phytase”, Appl Microbiol., 16, pp 1348-1351 54 Shimizu M., (1992), “Purification and characterization of phytase from Bacillus subtilis (natto) N-77”, Biosci Biotechnol Biochem., 56, pp 1266-1269 55 Singh M., Krikorian A D., (1982), “Inhibiton of trypsin activity in vivo by phytate”, J Agr F Chem., 30, pp 799-805 56 Siren M., (1995), “Method of treating pain using inositol triphosphate”, U.S Patent 5407924, pp 23-28 57 Siren M., (1998), “Use of an ester of inositoltriphosphate for the preparing of medicaments”, U.S Patent 5846957, pp 21-28 58 Tian S W., Peng R H., Xu J., Zhao W., Gao F., Fu X F., Xiong A S., Yao Q H., (2010), “Mutations in two amino acids in phyI1s from Aspergillus niger 113 improve its phytase activity”, World J Microbiol Biotechnol., 26, pp.903-907 59 Türk M., Sandberg A S., Carlsson N., Andlid T., (2000), “Inositol hexaphosphate hydrolysis from baker‟s yeast Capacity, kinetics, and degradation products”, J Agr F Chem., 48, pp 100–104 60 Ullah A H J., (1988), “Aspergillus ficuum phytase: partial primary structure, substrate selectivity, and kinetic characterization”, Pre Biochem., 18, pp 459471 K21-Sinh học thực nghiệm 57 Đặng Thị Kim Anh Luận văn thạc sĩ 61 Ullah A H., Sethumadhavan K., Mullaney E J., Ziegelhoffer T., AustinPhillips S., (2003), “Fungal phyA gene expressed in potato leaves produces active and stable phytase”, Biochem Biophy Res Co., 306(2), pp 603-609 62 Van Weerd J H., Khalaf K H A., Aartsen F J., Tussen P A T., (1999), “Balance trials withAfrican catfish Clarias gariepinus fed phytase-treated soybean mealbased diets”, Aquacult Nutr., 5, pp 135–142 63 Viveros A., Centeno C., Brenes A., Canales R., Lozano A., (2000) “Phytase and acid phosphatase activities in plant feedstuffs”, J Agr F Chem., 48, pp 4009–4013 64 Vohra A., Satyanarayana T., (2001), “Phytase production by the yeast, Pichia anomala”, Biotechnol Lett., 23, pp 551–554 65 Volfova O., Dvorakova J., Hanzlikova A., Jandera A., (1994), “Phytase from Aspergillus niger”, Folia Microbiol, 39, pp 481-484 66 Winterstein, E., (1897), “Uber einen phosphorhaltigen Pflanzenbestandteil, welcher bei der Spaltung Inosit liefert”, Berichte Deutsch Chem Ges., 30, pp 2299 –2302 67 Xiang T., Liu Q., Deacon A M., Koshy M., Kriksunov I A., Lei G X., Hao Q., Thiel D J., (2004), “Crystal structure of a heat-resilient phytase from Aspergillus fumigatus, carrying a phosphorylated histidine”, J Mol Biol., 339, pp.437-445 68 Xiong A S., Yao Q H., Peng R H., Han P L., Li X., Fan H Q., Guo M J., Zhang S L., (2004), “Isolation, characterization, and molecular cloning of the cDNA encoding a novel phytase from Aspergillus niger 113 and high expression in Pichia pastoris”, J Biochem Mol Biol., 37(3), pp 282-291 69 Yan L., Li C., Chen H., Wu Q., Shan Z., Han X., (2013), “Site-directed mutagenesis improves the thermostability and catalytic efficiency of Aspergillus niger N25 phytase mutated by I44E, T252R”, Appl Biochem Biotechnol., pp 25- 37 K21-Sinh học thực nghiệm 58 Đặng Thị Kim Anh Luận văn thạc sĩ 70 Yan W., Xiaorong G., Giao S., Wei W., Lijia A., (2007), “Cloning, expression, and Enzyme characterization of an acid heatstable phytase from Aspergillus fumigatus WY-2”, Current microbiology, 55, pp 65-70 71 Yin H F., Fan B L., Yang B., Liu Y F., Luo J., Tian X H., Li N., (2006), “Cloning of pig parotid secretory protein gene upstream promoter and the establishment of a transgenic mouse model expressing bacterial phytase for agricultural phosphorus pollution control”, J Anim Sci., 84, pp 513–519 72 Yoon S J., Choi Y J., Min H K., Cho K K., Kim J W., Lee S C., Jung Y H., (1996), “Isolation and identification of phytase-producing bacterium, Enterobacter sp 4, and enzymatic properties of phytase enzyme, Enzyme Microbiol Technol., 18, pp 449-454 73 Zhang W., Mullaney J E., Lei X G., (2007), “Adopting selected hydrogen bonding and ionic interactions from Aspergillus fumigatus phytase structure improves the thermostability of Aspergillus niger PhyA phytase”, Applied and enviromental Microbiology, pp 3069-3076 74 Zhong Y M., Shun C P., Jing J J., Huang B., Mei Z F., Zeng Z L., (2011), “A novel thermostable phytase from the fungus Aspergillus aculeatus RCEF 4894: gene cloning and expression in Pichia pastoris”, World J Microbiol Biotechnol., 2011, 27, pp 679-686 75 http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/0103a.html K21-Sinh học thực nghiệm 59 Đặng Thị Kim Anh Luận văn thạc sĩ PHỤ LỤC So sánh trình tự axit amin liên quan đến khả bền nhiệt gen phyA trƣởng thành từ A niger Hình 3.1 So sánh trình tự axit amin liên quan đến khả bền nhiệt gen phyA trƣởng thành từ A niger CNTP 5150, CNTP 5148, CNTP 5149, CNTP 5032, CNTP K21-Sinh học thực nghiệm 60 Đặng Thị Kim Anh Luận văn thạc sĩ 5033, CNTP 5037, CNTP 5090, CNTP 5091, CNTP 5130, CNTP 5131, CNTP 5145, CNTP 5146 trình tự phyA đầy đủ từ A niger NRRL 3135 (Z16414.1) Kết tinh protein phƣơng pháp sắc ký tƣơng tác kỵ nƣớc 150.00 270 135.00 240 210 105.00 180 90.00 150 75.00 120 60.00 90 45.00 Cond (mS/cm) Phytase (IU/ml) Protein (280nm, mAU) 120.00 60 30.00 30 15.00 0.00 0.00 50.00 280 nm (mAU) 100.00 150.00 V (ml) 200.00 Phytase CNTP 9057 (IU/ml) 250.00 Cond (mS/cm) 300.00 Hình P1 Kết sắc ký tƣơng tác kỵ nƣớc cột Butyl Sephrose HP, 10ml enzyme phytase tái tổ hợp chủng X33.AAS5.2 với nồng độ muối (NH4)2SO4 M đệm Na-actate 20 mM pH5.0 300 160 270 240 120 210 100 180 150 80 120 60 Cond (mS/cm) Phytase (IU/ml) Protein (280nm, mAU) 140 90 40 60 20 30 0 0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 250.00 300.00 V (ml) 280 nm (mAU) Phytase CNTP 9056 (IU/ml) Cond (mS/cm) Hình P2 Kết sắc ký tƣơng tác kỵ nƣớc cột Butyl Sephrose HP, 10ml enzyme phytase tái tổ hợp chủng X33.P12.7 với nồng độ muối (NH4)2SO4 2.5 M đệm Na-actate 20 mM pH5.0 [ K21-Sinh học thực nghiệm 61 Đặng Thị Kim Anh Luận văn thạc sĩ Chromatogram giải trình tự vector pPICZαA/phyA/P12 pPICZαA/phyA/AAS5 pPICZαA/phyA/P12 - αfactor primer K21-Sinh học thực nghiệm 62 Đặng Thị Kim Anh Luận văn thạc sĩ pPICZαA/phyA/P12 - 3’AOX primer K21-Sinh học thực nghiệm 63 Đặng Thị Kim Anh Luận văn thạc sĩ pPICZαA/phyA/AAS5 - αfactor primer K21-Sinh học thực nghiệm 64 Đặng Thị Kim Anh Luận văn thạc sĩ pPICZαA/phyA/AAS5 - 3’AOX primer K21-Sinh học thực nghiệm 65 Đặng Thị Kim Anh ... Kim Anh CẢI BIẾN GEN MÃ HÓA ENZYME PHYTASE TỪ NẤM MỐC Aspergillus niger NHẰM TĂNG KHẢ NĂNG HỒI TÍNH CỦA PHYTASE SAU KHI BỊ BIẾN TÍNH Ở NHIỆT ĐỘ CAO Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114... tài nghiên cứu: ? ?Cải biến gen mã hóa enzyme phytase từ nấm mốc Aspergillus niger nhằm tăng khả hồi tính phytase sau bị biến tính nhiệt độ cao? ?? nhằm cải thiện đặc tính cơng nghệ enzyme tái tổ hợp... lên men thấp Để biết gen mã hóa phytase từ nấm mốc A niger sau cải biến có cải thiện khả hồi tính enzyme sau bị biến tính nhiệt độ cao đồng thời trì đƣợc khả bền pH nhƣ gen gốc hay không, cần