Báo cáo đề tài khoa học và công nghệ cấp trường: Nghiên cứu chiết tách cao neem từ lá cây neem Ấn Độ bằng các hệ dung môi khác nhau và bước đầu nghiên cứu ứng dụng trong thuốc bảo vệ thực vật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA-VŨNG TÀU BÁO CÁO ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH CAO NEEM TỪ LÁ CÂY NEEM ẤN ĐỘ BẰNG CÁC HỆ DUNG MÔI KHÁC NHAU VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG TRONG THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT Chủ nhiệm: Phạm Thị Kim Hai Hướng dẫn khoa học: TS Tống Thị Minh Thu Bà Rịa - Vũng Tàu, năm 2019 MỤC LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC SƠ ĐỒ iv LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 1.1 Giới thiệu Neem 1.1.1 Định danh 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Nguồn gốc phân bố 1.1.4 Giá trị công dụng 1.2 Các chất có hoạt tính sinh học Neem 1.2.1 Diterpenoid 1.2.2 Triterpenoid (limonvgoid) .8 1.3 Tác động hoạt chất Neem loài dịch hại 11 1.4 Cơ sở hóa học thuốc bảo vệ thực vật công nghệ sản xuất thuốc bảo vệ thực vật 12 1.4.1 Hoạt chất 12 1.4.2 Chất mang 12 1.4.3 Chất hoạt động bề mặt 12 1.4.4 Các chất phù trợ 13 1.4.5 Các dạng thuốc bảo vệ thực vật 13 1.4.6 Phân loại thuốc bảo vệ thực vật 14 1.5 Cơng trình nghiên cứu, phương pháp chiết tách phối phẩm 15 1.5.1 Trên giới 15 1.5.2 Trong nước 17 1.6 Phương pháp thử hoạt tính khuẩn 18 1.6.1 Staphylococcus aureus (Gr +) .18 1.6.2 Pseudomonas aeruginosa (Gr -) 21 1.7 Một số phương pháp chiết cao Neem .23 1.7.1 Các phương pháp truyền thống 23 1.7.2 Các phương pháp đại 24 1.8 Hoạt tính kháng oxi hóa cao Neem [21] 25 1.9 Một số phương pháp định tính, định lượng cao Neem 25 1.9.1 Phương pháp định tính phản ứng thuốc thử 25 1.9.2 Phương pháp phân tích trọng lượng 28 1.9.3 Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS) 29 1.9.4 Phương pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ (LC – MS) 30 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 32 2.1.Địa điểm nguyên vật liệu .32 2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 32 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 32 2.1.3 Dụng cụ - thiết bị hóa chất 32 2.2 Phương pháp nghiên cứu 33 2.2.1 Lý thuyết 34 2.2.2 Thực nghiệm 34 2.2.3 Quy trình chiết tách dịch chiết Neem 34 2.3 Mơ hình chiết tách thực nghiệm phịng thí nghiệm 37 2.3.1 Ngâm dầm 37 2.3.2 Soxhlet 37 2.4 Phương pháp cô quay chân khơng tuần hồn .37 2.5 Xác định thành phần hóa học từ cao Neem phương pháp GC/MS, LC/MS 38 2.6 Khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến trình chiết 38 2.6.1 Xác định ảnh hưởng thời gian chiết 38 2.6.2 Xác định ảnh hưởng tỉ lệ dung môi/nguyên liệu 39 2.7 Định tính số hợp chất có Neem 39 2.7.1 Định tính Flavonoid 39 2.7.2 Định tính Alkaloid .39 2.7.3 Định tính saponin 40 2.7.4 Định tính Cacbonhyđrat 40 2.7.5 Định tính Steroid – triterpenoid 40 2.8 Đánh giá khả kháng khuẩn cao chiết Neem .41 2.9 Xác định hoạt tính kháng oxi hóa cao Neem 43 2.10 Cách pha thuốc trừ sâu 44 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 Kết khối lượng cao Nem chiết hệ dung môi khác 45 3.1.1 Cao Neem chiết dung môi Hexan 45 3.1.2 Cao Neem chiết dung môi Chloroform .46 3.1.3 Cao Neem chiết dung môi Ethanol 96o 47 3.1.4 Cao Neem chiết dung môi Methanol 47 3.1.5 Cao Neem chiết dung môi Ethyl acetat .48 3.1.6 Cao Neem chiết dung môi Nước .49 3.1.7.So sánh khối lượng cao Neem chiết với hệ dung môi khác 50 3.2 Kết định tính nhóm chất có cao Neem 51 3.2.1 Cao Neem chiết dung môi Hexan 51 3.2.2 Cao Neem chiết dung môi Chloroform .52 3.2.3 Cao Neem chiết dung môi Ethanol 96o 53 3.2.4 Cao Neem chiết dung môi Methanol 54 3.2.5 Cao Neem chiết dung môi Ethyl Axetat 55 3.2.6 Nước 55 3.3 Hoạt tính chống oxi hóa cao Neem 57 3.4 Kết kháng khuẩn cao Neem 58 3.4.1 Cao Neem chiết dung môi Hexan 58 3.4.2 Cao Neem chiết dung môi Chloroform .60 3.4.3 Cao Neem chiết dung môi Ethanol 96o 62 3.4.4 Cao Neem chiết dung môi Methanol 64 3.4.5 Cao Neem chiết dung môi Ethyl acetate 66 3.4.6 Cao Neem chiết dung môi Nước .69 3.5 Thành phần hóa học có cao chiết 70 3.5.1 Xác định thành phần hóa học có cao Neem chiết với n – hexan 70 3.5.2 Xác định thành phần hóa học có cao chiết Ethanol 96o .73 3.5.3 Xác định thành phần hóa học có cao Neem chiết với Methanol 76 3.6 Kết thử nghiệm sâu 78 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 79 4.1 Kết luận .79 4.2 Kiến nghị 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO 81 DANH MỤC VIẾT TẮT Am: thuốc kháng sinh Amipicillin DK: Đường kính DMSO: Dimethyl sulfoxide - Hợp chất hữu lưu huỳnh với công thức (CH3)2SO DNA: Acid deoxyribonucleic - Phân tử mang thơng tin di truyền mã hóa cho hoạt động sinh trưởng, phát triển, chuyên hóa chức sinh sản sinh vật nhiều loài virus MHA: Mueller Hinton Agar - Môi trường thạch Mueller Hinton MYP Mannitol Egg Yolk Polymixin NB: Nutrient Agar PDA: Potato Dextrose Agar Môi trường dinh dưỡng PDA rpm: tốc độ vòng/ phút RNA: Acid ribonucleic Te: thuốc kháng sinh Tetracycline TSB: Tryptone Soy Broth - Môi trường dinh dưỡng TSB TT: Thuốc thử i DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Hoạt tính dược liệu chất Neem Bảng 1.2: Các thương phẩm thuốc trừ sâu từ Neem lưu hành thị trường Việt Nam .14 Bảng 2.1: Độ phân cực nhiệt độ sôi hệ dung môi khác 47 Bảng 1: Khối lượng cao Neem chiết tách với Hexan phương pháp khác .45 Bảng 3.2: Khối lượng cao Neem chiết tách với Chloroform phương pháp khác .46 Bảng 3.3: Khối lượng cao Neem chiết tách với Ethanol 96o phương pháp khác .47 Bảng 3.4: Khối lượng cao Neem chiết tách với Methanol phương pháp khác .48 Bảng 3.5: Khối lượng cao Neem chiết tách với Ethyl acetat phương pháp khác .49 Bảng 3.6: Khối lượng cao Neem chiết tách với Nước phương pháp khác .49 Bảng 3.7: Khối lượng cao Neem chiết tách với hệ dung môi khác 50 Bảng 3.8: Kết định tính nhóm chất có cao Neem chiết với Hexan 51 Bảng 3.9: Kết định tính nhóm chất có cao Neem chiết với Chloroform .52 Bảng 3.10: Kết định tính nhóm chất có cao Neem chiết với Ethanol 96o 53 Bảng 3.11: Kết định tính nhóm chất có cao Neem chiết với Methanol .54 Bảng 3.12: Kết định tính nhóm chất có cao Neem chiết với Ethyl acetate 55 Bảng 3.13: Kết định tính nhóm chất có cao Neem chiết với Nước 55 Bảng 3.14: Định tính nhóm chất cao Neem chiết với dung môi khác .56 Bảng 3.15: Mật độ quang đường chuẩn axit galic 57 ii Bảng 3.16: Kết hoạt tính chống oxi hóa cao Neem 57 Bảng 3.17: Đuờng kính vịng kháng khuẩn cao Neem với dung môi Hexan (mm) .59 Bảng 3.18: Đuờng kính vịng kháng khuẩn cao Neem với dung môi Chloroform (mm) 61 Bảng 3.19: đuờng kính vịng kháng khuẩn cao Neem với dung môi Ethanol 96o (mm) 63 Bảng 3.20: Đuờng kính vịng kháng khuẩn cao Neem với dung mơi Methanol (mm) .65 Bảng 3.21: Đuờng kính vịng kháng khuẩn cao Neem với dung môi Ethyl acetate (mm) 67 Bảng 3.22: Đường kính vịng kháng khuẩn cao Neem với dung môi Nước (mm) 69 Bảng 3.23: bảng định danh số cấu tử cao chiết n – Hexan từ Neem .71 Bảng 3.24: Bảng định danh số cấu tử cao chiết Ethanol 96o từ Neem 74 Bảng 3.25: Bảng định danh số cấu tử cao chiết Ethanol 96o từ Neem 77 ii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Bộ phận Neem Hình 1.2: Neem tricyclic diterpene .8 Hình 1.3: Nhóm protomelicin Hình 1.4: Limonoid với vịng nguyên chuỗi bên γ – hydroxybutenolid Hình 1.5: Azadirone .10 Hình 1.6: Gedunin dẫn xuất .10 Hình 1.7: Salannin 10 Hình 1.8: Nimbin 11 Hình 1.9: Azadirachtin A 11 Hình 1.10: Vi khuẩn Staphylococus kính hiển vi 20 Hình 1.11: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kính hiển vi 22 Hình 2.1: Lá Neem tươi 32 Hình 2.2: Lá Neem khơ 37 Hình 2.3: Mơ hình ngâm dầm .37 Hình 2.4: Mơ hình chiết tách phịng thí nghiệm 37 Hình 2.5: Thiết bị quay chân khơng tuần hồn 38 Hình 2.6 Mơ tả vịng kháng khuẩn 43 Hình 3.1: Biểu đồ khối lượng cao Neem chiết tách với Hexan phương pháp khác .45 Hình 3.2: Biểu đồ khối lượng cao Neem chiết tách với Chloroform phương pháp khác 46 Hình 3.3: Biểu đồ khối lượng cao Neem chiết tách với Ethanol 96o phương pháp khác 47 Hình 3.4: Biểu đồ khối lượng cao Neem chiết tách với Methanol phương pháp khác 48 Hình 3.5: Biểu đồ khối lượng cao Neem chiết tách với Ethyl acetat phương pháp khác 49 Hình 3.6: Biểu đồ khối lượng cao Neem chiết tách với Nước phương pháp khác .50 iii Hình 3.7: Định tính nhóm chất có cao Neem chiết với Hexan .52 Hình 3.8: Định tính nhóm chất có cao Neem chiết với Chloroform 53 Hình 3.9: Định tính nhóm chất có cao Neem chiết với Ethanol 96o 53 Hình 3.10: Định tính nhóm chất có cao Neem chiết với Methanol 54 Hình 3.11: Định tính nhóm chất có cao Neem chiết với Ethyl acetate 55 Hình 3.12: Định tính nhóm chất có cao Neem chiết với Nước 56 Hình 3.13: Biểu đồ phương trình đường chuẩn Acid gallic 57 Hình 3.14: Biểu đồ thể hoạt tính chống oxi hóa cao Neem 58 Hình 3.15: Khả kháng S aureus P.aeruginosa cao Neem ngâm với Hexan .60 Hình 3.16: Khả kháng S aureus P.aeruginosa cao Neem chiết với Hexan .60 Hình 3.17: Khả kháng S aureus P.aeruginosa cao Neem ngâm với Chloroform 62 Hình 3.18: Khả kháng S aureus P.aeruginosa cao Neem chiết với Chloroform 62 Hình 3.19: Khả kháng S aureus P.aeruginosa cao Neem ngâm với Ethanol 96o 64 Hình 3.20: Khả kháng S aureus P.aeruginosa cao Neem chiết với Ethanol 96o 64 Hình 3.21: Khả kháng S aureus P.aeruginosa cao Neem ngâm với Methanol 66 Hình 3.22: Khả kháng S aureus P.aeruginosa cao Neem chiết với Methanol 66 Hình 3.23: Khả kháng S aureus P.aeruginosa cao Neem ngâm với Ethyl acetate 68 Hình 3.24: Khả kháng S aureus P.aeruginosa cao Neem chiết với Ethyl acetate 68 Hình 3.25: Khả kháng S aureus P.aeruginosa cao Neem ngâm với Nước Chiết 70 Hình 3.26: Khả kháng S aureus P.aeruginosa cao Neem chiết với Nước .70 iii ... chất có cao Neem 51 3.2.1 Cao Neem chiết dung môi Hexan 51 3.2.2 Cao Neem chiết dung môi Chloroform .52 3.2.3 Cao Neem chiết dung môi Ethanol 96o 53 3.2.4 Cao Neem chiết dung môi Methanol... hệ dung môi khác 45 3.1.1 Cao Neem chiết dung môi Hexan 45 3.1.2 Cao Neem chiết dung môi Chloroform .46 3.1.3 Cao Neem chiết dung môi Ethanol 96o 47 3.1.4 Cao Neem chiết. .. Neem từ Neem Ấn Độ hệ dung môi khác bước đầu nghiên cứu ứng dụng Dược – Mỹ Phẩm – Thuốc bảo vệ thực vật? ?? Mục đích nghiên cứu - Xây dựng quy trình chiết tách hợp chất hóa học Neem - Xác định tính