Nghiên cứu biến nạp gen ca AFP vào cây gừng (zingiber officinale rosc) nhằm khả năng tăng tính kháng bệnh thối mềm củ do nấm pythium aphanidermatum

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -TRẦN THỊ NGỌC HÀ NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN Ca-AFP VÀO CÂY GỪNG (Zingiber officinale Rosc.) NHẰM KHẢ NĂNG TĂNG TÍNH KHÁNG BỆNH THỐI MỀM CỦ DO NẤM Pythium aphanidermatum CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ TP Hồ Chí Minh, 01/2011 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TRẦN THỊ NGỌC HÀ NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN Ca-AFP VÀO CÂY GỪNG (Zingiber officinale Rosc.) NHẰM KHẢ NĂNG TĂNG TÍNH KHÁNG BỆNH THỐI MỀM CỦ DO NẤM Pythium aphanidermatum Chuyên ngành: Công nghệ sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ Hƣớng dẫn khoa học: PGS TS NGUYỄN ĐỨC LƢỢNG TS NGUYỄN HỮU HỔ TP Hồ Chí Minh, 01/2011 CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HỒN THÀNH TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH VIỆN SINH HỌC NHIỆT ĐỚI TP HỒ CHÍ MINH Cán hƣớng dẫn khoa học 1: Phó giáo sƣ – Tiến sĩ Nguyễn Đức Lƣợng Cán hƣớng dẫn khoa học 2: Tiến sĩ Nguyễn Hữu Hổ Cán chấm nhận xét 1: Phó giáo sƣ – Tiến sĩ Nguyễn Thúy Hƣơng Cán chấm nhận xét 2: Tiến sĩ Lê Thị Thủy Tiên Luận văn thạc sĩ đƣợc bảo vệ Trƣờng Đại học Bách Khoa – ĐHQG Tp.HCM ngày 23 tháng 01 năm 2011 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: PGS.TS Nguyễn Thúy Hƣơng PGS.TS Nguyễn Đức Lƣợng TS Phạm S TS Lê Thị Thủy Tiên TS Huỳnh Ngọc Oanh Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Bộ môn quản lý chuyên ngành sau luận văn đƣợc sửa chữa (nếu có) Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Bộ môn quản lý chuyên ngành TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc -oOo Tp HCM, ngày 15 tháng 01 năm 2011 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: TRẦN THỊ NGỌC HÀ Phái: Nữ Ngày, tháng, năm sinh: 01/01/1986 Nơi sinh: TP Hồ Chí Minh Chuyên ngành: Công nghệ sinh học MSHV: 09310566 1-TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu biến nạp gen Ca-AFP vào gừng (Zingiber officinale Rosc.) nhằm khả tăng tính kháng bệnh thối mềm củ nấm Pythium aphanidermatum 2-NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Xây dựng hệ thống tái sinh gừng từ lát mỏng tế bào mầm củ - Xây dựng hệ thống tạo chồi từ mô phân sinh chồi in vitro bổ dọc - Thử tính chống chịu hygromycin chồi in vitro bổ dọc chồi in vitro nguyên vẹn - Chuyển gen vào gừng phƣơng pháp sử dụng vi khuẩn A tumefaciens - Kiểm tra diện gen mục tiêu Ca-AFP chồi gừng giả định chuyển gen phƣơng pháp phân tích PCR 3-NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 25/01/2010 4-NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 30/12/2010 5-HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƢỚNG DẪN: Phó giáo sƣ – Tiến sĩ Nguyễn Đức Lƣợng Tiến sĩ Nguyễn Hữu Hổ Nội dung đề cƣơng Luận văn thạc sĩ đƣợc Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua CÁN BỘ HƢỚNG DẪN CÁN BỘ HƢỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) (Họ tên chữ ký) CHỦ NHIỆM BỘ MÔN QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH (Họ tên chữ ký) KHOA QL CHUYÊN NGÀNH (Họ tên chữ ký) i LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, em chân thành cảm ơn thầy cô Bộ môn Công nghệ sinh học – Trƣờng Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh hết lịng giảng dạy truyền đạt kiến thức cho chúng em, giúp đỡ tạo điều kiện để em hoàn thành tốt luận văn Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Đức Lƣợng, ngƣời truyền đạt cho em kinh nghiệm quý báu cho em thêm lòng tin để bƣớc đƣờng khoa học đầy chông gai Em vô cảm ơn thầy Nguyễn Hữu Hổ – ngƣời thầy đáng kính Thầy tận tình bảo cho em suốt thời gian em thực tập Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp Hồ Chí Minh Thầy động viên, hƣớng dẫn giúp em vƣợt qua khó khăn, trở ngại Em cảm ơn thầy nhiều Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Nguyễn Thúy Hƣơng – chủ nhiệm kính yêu em Cô giúp em vƣợt qua khó khăn q trình thực luận văn Em thành thật cảm ơn tất thầy cô, anh chị phịng Cơng nghệ gen – Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp Hồ Chí Minh ln quan tâm bảo tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt luận văn Con xin cảm ơn ba mẹ động viên, cổ vũ tinh thần suốt thời gian qua Xin cảm ơn cám bạn bên tôi, giúp đỡ động viên Xin chân thành cảm ơn Trần Thị Ngọc Hà ii TÓM TẮT Nghiên cứu hệ thống tái sinh gừng đƣợc theo hai hƣớng 1/ Lát mỏng tế bào mầm củ (cắt ngang) đƣợc dùng để cảm ứng tạo mô sẹo phơi hóa mơi trƣờng MS bổ sung mg/l 2,4-D 0,5 mg/l BA; hình thành phơi soma tái sinh chồi sau đó, xảy mơi trƣờng MS có mg/l BA 0,2 mg/l 2,4-D 2/ Sự tạo cụm chồi trực tiếp từ mô phân sinh đỉnh chồi in vitro cho kết tốt môi trƣờng MS chứa mg/l TDZ Môi trƣờng tốt dùng để nhân giống in vitro gừng MS bổ sung mg/l BA mg/l 2-iP Nồng độ chất chọn lọc hygromycin thích hợp để chọn lọc dòng chuyển gen mg/l chồi in vitro bổ dọc mg/l chồi in vitro nguyên vẹn, cụm chồi non Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chủng LBA4404 chứa plasmid pITB-CaAFP đƣợc sử dụng thí nghiệm chuyển gen gừng Các dòng chuyển gen đƣợc xác định phƣơng pháp nhuộm GUS phân tích PCR SUMMARY Studying on in vitro plant regeneration in ginger was carried out via two pathways 1/ Transverse thin cell layers (tTCLs) that were cut from the sprout were used to induce calli and somatic embryogenic calli on MS medium (containing 2,4-D mg/l and BA 0.5 mg/l); somatic embryogenesis and shoot regeneration were only observed when somatic embryogenic calli were transferred onto MS medium that contained BA mg/l and 2,4-D 0.2 mg/l 2/ Apical meristematic tissues of young shoot induced multi-micro shoots on MS medium that contained TDZ mg/l The medium that had the best result for shoot multiplication was MS with BA mg/l and 2-iP 2mg/l Concentrations of hygromycin that were used to select transformants were 4mg/l (with apical meristematic tissues of young shoot) and mg/l (with young multi-micro shoots) Transgenic study on ginger used Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404/ pITB-CaAFP Successful transformation was confirmed by histochemical Gus assay and PCR analysis iii MỤC LỤC Lời cảm ơn .i Tóm tắt ii Danh mục hình vi Danh mục bảng viii Danh sách từ viết tắt ix MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY GỪNG 1.1.1 Đặc điểm 1.1.2 Giá trị sử dụng 1.1.3 Bệnh thối mềm củ gừng 1.2 PHƢƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT 10 1.2.1 Phƣơng pháp chung 10 1.2.2 Phƣơng pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 12 1.3 SƠ LƢỢC VỀ GEN KHÁNG NẤM Ca-AFP 20 1.3.1 Giới thiệu 20 1.3.2 Gen Ca-AFP 21 1.4 PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÂY CHUYỂN GEN 22 1.4.1 Nhuộm GUS 22 1.4.2 Phân tích PCR 23 1.5 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC LIÊN QUAN ĐẾN HƢỚNG ĐỀ TÀI 27 1.5.1 Các nghiên cứu nhân giống, tái sinh chuyển gen gừng 27 1.5.2 Các nghiên cứu defensin thực vật kháng nấm ứng dụng trồng chuyển gen 30 1.5.3 Ứng dụng gen kháng nấm Ca-AFP vào trồng chuyển gen 31 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 32 iv 2.1 VẬT LIỆU 32 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 32 2.1.2 Hóa chất 32 2.1.3 Vi khuẩn 34 2.1.4 Môi trƣờng điều kiện nuôi cấy 35 2.1.5 Sơ đồ quy trình thí nghiệm 37 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.2.1 Khử trùng mẫu 38 2.2.2 Khảo sát môi trƣờng nhân chồi 39 2.2.3 Khảo sát môi trƣờng tạo mô sẹo tái sinh từ lát mỏng tế bào mầm củ39 2.2.4 Khảo sát môi trƣờng tạo chồi từ mô phân sinh chồi in vitro bổ dọc 42 2.2.5 Khảo sát nồng độ chất chọn lọc hygromycin thích hợp cho q trình chọn lọc dịng chuyển gen 43 2.2.6 Chuyển gen chọn lọc dòng chuyển gen 44 2.2.7 Xác định dòng chuyển gen 46 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 50 3.1 KHỬ TRÙNG MẪU 50 3.2 KHẢO SÁT MÔI TRƢỜNG NHÂN CHỒI 50 3.3 KHẢO SÁT MÔI TRƢỜNG TẠO MÔ SẸO VÀ TÁI SINH TỪ LÁT MỎNG TẾ BÀO MẦM CỦ 53 3.3.1 Tạo mô sẹo có khả sinh phơi 53 3.3.2 Nhân mô sẹo sinh phôi, tạo phôi soma tạo chồi từ phôi 57 3.4 KHẢO SÁT MÔI TRƢỜNG TẠO CHỒI TỪ MÔ PHÂN SINH CHỒI IN VITRO BỔ DỌC 60 3.5 KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ CHẤT CHỌN LỌC HYGROMYCIN 65 3.5.1 Khảo sát nồng độ chất chọn lọc hygromycin tác động lên khả sống chồi gừng in vitro bổ dọc 65 3.5.2 Khảo sát nồng độ chất chọn lọc hygromycin tác động lên khả sống chồi gừng in vitro nguyên vẹn 66 3.6 CHỌN LỌC DÒNG CHUYỂN GEN BẰNG HYGROMYCIN 69 3.6.1 Mẫu chồi in vitro bổ dọc 70 3.6.2 Mẫu cụm chồi non 70 v 3.7 XÁC ĐỊNH DÒNG CHUYỂN GEN 72 3.7.1 Nhuộm GUS tạm thời 72 3.7.2 Nhuộm GUS sau trình chọn lọc 73 3.7.3 Phân tích PCR 74 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 76 4.1 KẾT LUẬN 76 4.2 ĐỀ NGHỊ 76 Tài liệu tham khảo 78 Phụ lục A 87 Phụ lục B 89 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Gừng Zingiber officinale .4 Hình 1.2 Bệnh thối mềm củ gừng Hình 1.3 Nấm Pythium aphanidermatum nhìn dƣới kính hiển vi Hình 1.4 Vịng đời nấm Pythium aphanidermatum 10 Hình 1.5 Vi khuẩn A tumefaciens bám vào tế bào thực vật (nhìn dƣới kính hiển vi) 13 Hình 1.6 Khối u thực vật A tumefaciens gây 13 Hình 1.7 Cơng thức cấu tạo opine (octopine, nopaline) 14 Hình 1.8 Sơ đồ gen Ti–plasmid vi khuẩn A tumefaciens 15 Hình 1.9 Các bƣớc biến nạp T-DNA vào tế bào kí chủ 17 Hình 1.10 Sơ đồ plasmid tái tổ hợp dựa nguyên tắc Ti-plasmid 19 Hình 1.11 Phản ứng X-gluc với β-glucuronidase 22 Hình 1.12 Ðồ thị biễu diễn mối quan hệ thời gian nhiệt độ chu kỳ phản ứng PCR 26 Hình 1.13 Phản ứng PCR với lƣợng sản phẩm tăng theo cấp số nhân 27 Hình 2.1 Gừng Zingiber officinale Rosc 32 Hình 2.2 Mơ hình cấu trúc đoạn T - DNA chuyển vào gừng 34 Hình 2.3 Plasmid CAMBIA1301 35 Hình 2.4 Sơ đồ thí nghiệm 37 Hình 2.5 Mầm gừng có kích thƣớc phù hợp đƣợc đem khử trùng 38 Hình 2.6 Cách tạo lát mỏng tế bào dùng nuôi cấy 41 Hình 2.7 Cách bổ đơi chồi in vitro 43 Hình 2.8 Vật liệu chuyển gen 45 Hình 2.9 Vi khuẩn phát triển sau ngày nuôi chung 45 Hình 3.1 Sự phát triển mầm củ sau khử trùng 50 82 34 Kambaska K.B., Santilata S., 2009 Effect of plant growth regulator on micropropagtion of ginger (Zingiber officinale Rosc.) cv- Suprava and Suruchi Journal of Agricultural Technology, (2): 271-280 35 Kavyashree R., 2009 An efficient in vitro protocol for clonal multiplication of Ginger - Var Varada India Journal Biotechnology, 8:328-331 36 Khawar K.M., Sancak C., Uranbey S., Özcan S., 2004 Effect of thidiazuron on shoot regeneration from different explants of lentil (Lens culinaris Medik.) via organogenesis Turk J Bot, 28: 421-426 37 Kiuchi F., Iwakami S., Shibuya M., Hanaoka F and Sankawa U., 1992 Inhibition of prostaglandin and leukotriene biosynthesis by gingerols and diarylheptanoids Chem Pharm Bull., 40: 387-391 38 Lincy A.K., Remashree A.B., Sasik B., 2009 Indirect and direct somatic embryogenesis from aerial stem explants of ginger (Zingiber officinale Rosc.) Acta Bot Croat., 68 (1): 93-103 39 Lisa V et al., 2003 Agrobacterium tumefaciens and the Plant: The David and Goliath of Modern Genetics Plant Physiology, 133: 948-955 40 Lu C., Nugent G., Wardley T., 1991 Agrobacterium-mediated transformation of carnation (Dianthus caryophyluss L.) Bio-Tech., 9: 864-868 41 Mendez E., Moreno A., Colilla F., Pelaez F., Limas G.G., Mendez R., Soriano F., Salinas M., 1990 Primary structure and inhibition of protein synthesis in eukaryotic cell-free system of a novel thionin, gamma-hordothionin, from barley endosperm Eur J Biochem., 194:533-539 42 Nhut D.T., Le B.V and Van K T.T., 2001 Manipulation of the morphogenetic pathways of Lilium longiflorum transverse thin cell layer explants by auxin and cytokinin In Vitro Cell Dev Biol – Plant, 37: 44-49 83 43 Nhut D.T., Le B.V., Van K.T.T and Thorpe T., 2003 Thin cell layer culture system: regeneration and transformation applications Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands 517 pages 44 Nirmal Babu K., Samsudeen K., Ratnambal M.J., 1992 In vitro plant regeneration from leaf-derived callus in ginger (Zingiber officinale Rosc.) Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 29: 71-74 45 Noguchi Y, Yamakawa O., 1988 Rapid propagation of ginger (Zingiber officinale Roscoe) by roller tube culture Japan J Breed, 38: 437-442 46 Nugent G., Wardley-Richardson T and Lu C., 1991 Plant regeneration from stem and petal of carnation (Dianthus caryophyllus L.) Plant Cell Rep., 10: 477-480 47 Raghavan C., Ong E.K., Dalling M.J and Stevenson T.W., 2006 Regulation of genes associated with auxin, ethylene and ABA pathways by 2,4dichlorophenoxyacetic acid in Arabidopsis Functional and Integrative Genomics, (1): 60-70 48 Ravindran P.N., Nirmal Babu K., 2005 Ginger: The Genus Zingiber CRC Press, USA 552 pages 49 Saingproa B., Kanchanapoom K., 1997 Clonal propagation through multiple shoot formation from ginger (Zingiber officinale Roscoe) callus and buds Suranaree J Sci Technol, (1): 1-5 50 Saitoh H., Kiba A., Nishihara M., Yamamura S., Suzuki K and Terauchi R., 2001 Production of antimicrobial defensin in Nicotiana benthamiana with potato virus X vector Mol Plant-Microbe Interact., 14: 111-115 51 Saker M.M., Hussein H.A., Osman N.H., and Soliman M.H., 2008 In vitro production of transgenic tomatoes expressing defensin gene using newly developed regeneration and transformation system Arab J Biotech., 11 (1): 5970 84 52 Sambrook J and Russel D., 2002 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Cold Spring Harbor Laboratory Press 2100 pages 53 Sanderson L., Bartlett A and Whitefield P.J., 2002 In vitro and in vivo studies on the bioactivity of a ginger (Zingiber officinale) extract twards adult schistosomes and their egg production Journal of Helminthology, 76: 241-247 54 Sharma T.R., Singh B.M., 1997 High-frequency in vitro multiplication of disease-free Zingiber officinale Rosc Plant Cell Reports, 17: 68-72 55 Singha S and Bhatia S., 1988 Shoot proliferation of pear cultivars on medium containing thidiazuron and benzylaminopurine Hort Sci., 23: 803 56 Srivastava L.S., Gupta S.R., Basnet C.P., Mahato U.P and Neopani, B 1998 Microorganisms associated with ginger in Sikkim J Hill Res., 11 (1): 120-122 57 Sticklen M.B and Oraby H.F., 2005 Invited review: Shoot apical meristem: a sustainable explant for genetic transformation of cereal crops In Vitro Cell Dev Biol.-Plant, 41: 187-200 58 Suekawa M., Ishige A., Yuasa K., Sudo K., Aburada M and Hosoya E., 1984 Pharmacological studies on ginger I Pharmacological actions of pungent constituents, (6)-gingerol and (6)-shogaol J Pharmacobiodyn., 7: 836-848 59 Sultana A et al., 2009 In vitro regeneration of ginger using leaf, shoot tip and root explants Pak J Bot., 41(4): 1667-1676 60 Suma B., Keshavachandran R., Nybe E.V., 2008 Agrobacterium tumefaciens mediated transformation and regeneration of ginger (Zingiber officinale Rosc.) Journal of Tropical Agriculture, 46 (1-2): 38-44 61 Teixeira J.A.S., Fukai S., 2003 Chrysanthemum organogenesis through thin cell layer technology and plant growth regulator control Asian J Plant Sci, 2: 505-514 85 62 Teixeira J.A.S., Van K T.T., Biondi S., Nhut D.T and Altamura M.M., 2007 Thin Cell Layers: Developmental Building Blocks in Ornamental Biotechnology Floriculture and Ornamental Biotechnology, (1): 1-13 63 Terras F.R., Eggermont K., Kovaleva V., Raikhel N.V., Osborn R.W., Kester A., Rees S.B., Torrekens S., Van Leuven F., Vanderleyden J., 1995 Small cysteine-rich antifungal proteins from radish: their role in host defense Plant Cell, 7:573-588 64 Thomas J.C and Katterman F.R., 1986 Cytokinin activity induced by thidiazuron Plant Phys., 81: 681-683 65 Thomma B.P.H.J., Cammue B.P.A and Thevissen K., 2002 Plant defensins Planta, 216: 193-202 66 Tripathi N.N and Grover R.K., 1978 Participation of exudates of susceptible and resistant plants in pathogenesis of disease caused by Pythium butleri Ptikrankh pfl schetz, 85: 15–21 67 Van K T.T 1973 In vitro control of de novo flower, bud, root and callus differentiation from excised epidermal tissues Nature, 246: 44-45 68 Vinocur B., Carmi T., Altman A and Ziv M., 1998 Cell biology and morphogenesis: Enhanced bud regeneration in aspen (Populus tremula L.) roots cultured in liquid media Plant Cell Rep, 12: 1146-1154 69 Wkerk V.N.J.P., Zimmerman R.H and Fordlham I., 1986 Thidiazuron stimulation of apple shoot proliferation in vitro Hort Sci., 12: 516-518 70 Yamahara J., Huang Q.R., Li Y.H., 1990 Gastrointestinal motility enhancing effect of ginger and its active constituents Chem Pharm Bull., 38: 430–431 71 Zapata C., Srivatanakul M., Park S.H., Lee B.M., Salas M.G and Smith R.H., 1999 Improvements in shoot apex regeneration of two fiber crops: cotton and kenaf Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 56: 185–191 86 TÀI LIỆU WEB 72 http://biologi.uio.no/plfys/haa/gen/gmo.htm 73 http://en.wikipedia.org/wiki/Zingiber_officinale 74 http://www.bsu.edu/classes/ruch/msa/barr/4-29.jpg 75 http://www.cals.ncsu.edu/course/pp728/Pythium/Pythium_aphanidermatum.ht ml 76 http://www.egohabitat.com 77 http://www.helpfulhealthtips.com/zingiber-officinalis-information-uses-andbenefits/ 78 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein 79 http://www.snv.jussieu.fr/vie/dossiers/transgenese/agrobacterium/agro.htm 80 http://www.uphcm.edu.vn/caythuoc/index.php?q=node/28 87 PHỤ LỤC A MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY MƠ THỰC VẬT Thành phần mơi trƣờng Murashige Skoog (1962) (mơi trƣờng MS) Khống đa lượng Nồng độ (mg/l) NH4NO3 1650,00 KNO3 CaCl2.2H2O 1900,00 440,00 MgSO4.7H2O 370,00 KH2PO4 170,00 Khoáng vi lượng MnSO4.H2O 23,30 ZnSO4.7H2O 8,60 H3BO3 6,20 KI Na2MoO4.2H2O 0,83 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 Na2EDTA FeSO4.7H2O 37,30 27,80 Vitamin amino acid Thiamine HCL 0.10 Acid nicotinic Pyridoxine HCL 0.50 0.50 Glycine 2.00 Thành phần vitamin B5 Vitamin amino acid Nồng độ (mg/l) Thiamine HCL 10,00 Acid nicotinic 1,00 Pyridoxine HCL 1,00 88 MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY VI KHUẨN A tumefaciens Thành phần môi trƣờng LB Tryptone 10,00 g/l Sodiumchloride 10,00 g/l Dịch chiết nấm men 5,00 g/l pH Hỗn hợp dạng bột đƣợc pha theo nồng độ 25,00 g/l nƣớc cất Môi trƣờng LB rắn dùng agar bacteriological với nồng độ 1,0% khối lƣợng/thể tích agar khống chất, ức chế tối thiểu khuếch tán kháng sinh 89 PHỤ LỤC B 1.KẾT QUẢ NHÂN GIỐNG IN VITRO 1.1.Số chồi mọc thêm sau tuần Kết thống kê: Data file: SC4T Title: sc4t Function: ANOVA-1 Data case no to 12 One way ANOVA grouped over variable (NT) with values from to Variable (SC) A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 6.093 2.031 153.575 0.0000 Within 0.106 0.013 Total 11 6.199 Coefficient of Variation = 4.04% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 7.060 2.353 0.07 0.07 3.00 7.230 2.410 0.11 0.07 3.00 7.670 2.557 0.12 0.07 3.00 12.230 4.077 0.15 0.07 -Total 12.00 34.190 2.849 0.75 0.22 Within 0.12 Bartlett's test Chi-square = 0.973 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.891 Kết xếp hạng: Data File : Keyboard Function : RANGE Error Mean Square = 0.01300 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = 90 Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0.1731 s/x = 0.06583 at alpha = 0.10 Original Order Mean Mean Mean Mean = = = = 2.350 2.410 2.560 4.080 Ranked Order B B B A Mean Mean Mean Mean = = = = 4.080 2.560 2.410 2.350 A B B B 1.2.Số chồi mọc thêm sau tuần Kết thống kê: Data file: SC6T Title: sc6t Function: ANOVA-1 Data case no to 12 One way ANOVA grouped over variable (NT) with values from to Variable (SC) A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 17.114 5.705 685.249 0.0000 Within 0.067 0.008 Total 11 17.181 Coefficient of Variation = 2.50% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 8.200 2.733 0.12 0.05 3.00 8.830 2.943 0.08 0.05 3.00 9.740 3.247 0.07 0.05 3.00 17.100 5.700 0.09 0.05 -Total 12.00 43.870 3.656 1.25 0.36 Within 0.09 Bartlett's test Chi-square = 0.570 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.958 Kết xếp hạng: Data File : Keyboard Function : RANGE 91 Error Mean Square = 0.008000 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0.1358 s/x = 0.05164 at alpha = 0.10 Original Order Mean Mean Mean Mean = = = = 2.730 2.940 3.250 5.700 Ranked Order D C B A Mean Mean Mean Mean = = = = 5.700 3.250 2.940 2.730 A B C D 2.KẾT QUẢ CẢM ỨNG TẠO MÔ SẸO TỪ LÁT MỎNG TẾ BÀO MẦM CỦ 2.1.Tỉ lệ cảm ứng tạo mơ sẹo nói chung Kết thống kê: Data file: TS-E Title: TS-E Function: ANOVA-1 Data case no to One way ANOVA grouped over variable (NT) with values from to Variable (PTS) A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 1223.973 611.987 102.028 0.0000 Within 35.989 5.998 Total 1259.962 Coefficient of Variation = 3.12% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 193.500 64.500 2.09 1.41 3.00 279.170 93.057 2.40 1.41 3.00 234.500 78.167 2.80 1.41 -Total 9.00 707.170 78.574 12.55 4.18 Within 2.45 Bartlett's test Chi-square = 0.141 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.932 92 Kết xếp hạng: Data File : Keyboard Function :RANGE Error Mean Square = 5.998 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 4.893 s/x = 1.414 at alpha = 0.050 Original Order Mean Mean Mean = = = 64.50 93.06 78.17 Ranked Order C A B Mean Mean Mean = = = 93.06 78.17 64.50 A B C 2.2 Tỉ lệ tạo mô sẹo khô Kết thống kê: Data file: TS-EK Title: TS-EK Function: ANOVA-1 Data case no to One way ANOVA grouped over variable (NT) with values from to Variable (PTK) A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 600.581 300.291 43.909 0.0003 Within 41.034 6.839 Total 641.615 Coefficient of Variation = 7.94% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 98.003 32.668 3.22 1.51 3.00 129.174 43.058 2.40 1.51 3.00 69.160 23.053 2.10 1.51 -Total 9.00 296.337 32.926 8.96 2.99 Within 2.62 Bartlett's test Chi-square = 0.322 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.851 93 Kết xếp hạng: Data File : Keyboard Function : RANGE Error Mean Square = 6.839 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 5.225 s/x = 1.510 at alpha = 0.050 Original Order Mean Mean Mean = = = 32.67 43.06 23.05 Ranked Order B A C Mean Mean Mean = = = 43.06 32.67 23.05 A B C 3.KẾT QUẢ TẠO CHỒI TỪ MÔ PHÂN SINH CHỒI IN VITRO BỔ DỌC 3.1.Tỉ lệ tạo chồi Kết thống kê: Data file: TLTS Title: tlts Function: ANOVA-1 Data case no to 18 One way ANOVA grouped over variable (NT) with values from to Variable (TLTS) A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 6241.227 1248.245 62.897 0.0000 Within 12 238.149 19.846 Total 17 6479.377 Coefficient of Variation = 10.08% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 102.080 34.027 3.18 2.57 3.00 193.750 64.583 5.51 2.57 3.00 205.620 68.540 5.28 2.57 3.00 41.670 13.890 2.41 2.57 3.00 112.500 37.500 4.17 2.57 3.00 139.580 46.527 5.24 2.57 -Total 18.00 795.200 44.178 19.52 4.60 Within 4.45 94 Bartlett's test Chi-square = 1.580 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.946 Kết xếp hạng: Data File : Keyboard Function : RANGE Error Mean Square = 19.85 Error Degrees of Freedom = 12 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 7.925 s/x = 2.572 at alpha = 0.050 Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = 34.03 64.58 68.54 13.89 37.50 46.53 Ranked Order C A A D C B Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = 68.54 64.58 46.53 37.50 34.03 13.89 A A B C C D 3.2.Số chồi trung bình mẫu (có khả tạo chồi) Kết thống kê: Data file: SCTS Title: scts Function: ANOVA-1 Data case no to 18 One way ANOVA grouped over variable (NT) with values from to Variable (SC) A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 523.406 104.681 575.540 0.0000 Within 12 2.183 0.182 Total 17 525.589 Coefficient of Variation = 2.27% 95 Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 43.080 14.360 0.51 0.25 3.00 74.060 24.687 0.43 0.25 3.00 75.760 25.253 0.34 0.25 3.00 30.090 10.030 0.56 0.25 3.00 54.840 18.280 0.41 0.25 3.00 59.800 19.933 0.24 0.25 -Total 18.00 337.630 18.757 5.56 1.31 Within 0.43 Bartlett's test Chi-square = 1.327 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.965 Kết xếp hạng: Data File : Keyboard Function : RANGE Error Mean Square = 0.1820 Error Degrees of Freedom = 12 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0.6208 s/x = 0.2463 at alpha = 0.10 Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = 14.36 24.69 25.25 10.03 18.28 19.93 Ranked Order D A A E C B Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = 25.25 24.69 19.93 18.28 14.36 10.03 A A B C D E 96 Trần Thị Ngọc Hà, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Đức Lƣợng, 2010 Nghiên cứu tái sinh in vitro gừng (Zingiber officinale Rosc.) thông qua nuôi cấy lát mỏng tế bào mầm củ Tạp chí Cơng nghệ sinh học, (3A): 639-645 ... giống gừng có khả kháng bệnh thối mềm củ vấn đề cấp thiết Trên sở đó, đề tài ? ?Nghiên cứu biến nạp gen Ca-AFP vào gừng (Zingiber officinale Rosc.) nhằm khả tăng tính kháng bệnh thối mềm củ nấm Pythium. .. BÁCH KHOA TRẦN THỊ NGỌC HÀ NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN Ca-AFP VÀO CÂY GỪNG (Zingiber officinale Rosc.) NHẰM KHẢ NĂNG TĂNG TÍNH KHÁNG BỆNH THỐI MỀM CỦ DO NẤM Pythium aphanidermatum Chuyên ngành:... Nghiên cứu biến nạp gen Ca-AFP vào gừng (Zingiber officinale Rosc.) nhằm khả tăng tính kháng bệnh thối mềm củ nấm Pythium aphanidermatum 2-NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Xây dựng hệ thống tái sinh gừng