Khảo sát in vitro sự phối hợp beta lactam với một số kháng sinh trên escherichia coli và klebsiella pneumoniae đa kháng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN QUỐC TRUNG KHẢO SÁT IN VITRO SỰ PHỐI HỢP BETA-LACTAM VỚI MỘT SỐ KHÁNG SINH TRÊN Escherichia coli VÀ Klebsiella pneumoniae ĐA KHÁNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN QUỐC TRUNG KHẢO SÁT IN VITRO SỰ PHỐI HỢP BETA-LACTAM VỚI MỘT SỐ KHÁNG SINH TRÊN Escherichia coli VÀ Klebsiella pneumoniae ĐA KHÁNG CHUYÊN NGÀNH: XÉT NGHIỆM Y HỌC Mã số: 60 72 03 33 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS.BS CAO MINH NGA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu chúng tơi Các tài liệu trích dẫn, số liệu luận văn hoàn toàn trung thực tuân theo yêu cầu đề tài nghiên cứu Đề tài chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Tác giả luận văn NGUYỄN QUỐC TRUNG ii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC HÌNH vii DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ x ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cƣơng kháng sinh 1.1.1 Lịch sử phát triển kháng sinh .4 1.1.2 Cơ chế tác động kháng sinh 1.1.3 Cơ chế đề kháng kháng sinh vi khuẩn 1.2 Beta-lactamase phổ rộng (ESBL) 1.2.1 Lịch sử ESBL 1.2.2 Phân loại ESBL 1.2.3 Nguồn gốc ES L 1.2.4 T nh chất ES L 1.2.5 Sự đa dạng loại ESBL 1.3 Tổng quan carbapenemase 12 1.3.1 Sơ lƣợc carbapenemase .12 1.3.2 Phân loại carbapenemase 13 1.4 Tình hình gây nhiễm khuẩn đề kháng kháng sinh vi khuẩn E coli K pneumoniae 16 1.5 Phối hợp kháng sinh 18 1.5.1 Lý phối hợp kháng sinh 18 1.5.2 Một số phƣơng pháp xét nghiệm phối hợp kháng sinh in vitro 20 1.5.3 Tình hình nghiên cứu phối hợp KS in vitro giới Việt Nam 24 iii Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 25 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu .25 2.1.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu 25 2.1.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu .25 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 26 2.2.2 Cỡ mẫu 26 2.2.3 Kỹ thuật chọn mẫu 26 2.2.4 Nội dung nghiên cứu 26 2.2.5 Phƣơng pháp tiến hành .27 2.2.6 Lựa chọn kháng sinh cho phối hợp kháng sinh .33 2.2.7 Lựa chọn chủng vi khuẩn để thực phối hợp kháng sinh 38 2.2.8 Phƣơng tiện, dụng cụ thực nghiên cứu .40 2.2.9 Phƣơng pháp thu thập số liệu 41 2.2.10 Kiểm soát sai lệch số liệu 42 2.2.11 Phƣơng thức xử lý phân tích số liệu 42 2.3 Vấn đề y đức 42 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 43 3.1 Tỷ lệ E coli K pneumoniae tiết men ESBL 43 3.2 Tỷ lệ E coli K pneumoniae tiết men carbapenemase 44 3.3 Khảo sát đề kháng kháng sinh 44 3.4 Thực phối hợp kháng sinh in vitro phƣơng pháp vi pha lỗng cờ (checkerboard) số chủng E coli K pneumoniae MDR 47 Chƣơng BÀN LUẬN 62 4.1 Tỷ lệ E coli K pneumoniae tiết men ESBL 62 4.2 Khả tiết men carbapenemase E coli K pneumoniae 63 4.3 Đánh giá tình hình đề kháng kháng sinh E coli K pneumoniae 64 iv 4.4 Khảo sát in vitro phối hợp kháng sinh phƣơng pháp vi pha loãng ô cờ (checkerboard) 67 KẾT LUẬN 81 KIẾN NGHỊ 84 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH MINH HỌA v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt AES Diễn giải Advanced Expert System (Hệ thống phân tích cao cấp) ATCC® American Type Culture Collection (Bộ sƣu tập chủng chuẩn Mỹ) AST Antimicrobial Susceptibility Testing (Thử nghiệm nhạy cảm kháng sinh) BA Blood Agar (Thạch máu) CA Chocolate Agar (Thạch nâu) CAMHB Cation Adjusted Mueller-Hinton Broth (Môi trƣờng lỏng Mueller-Hinton điều chỉnh cation) CDC Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm Kiểm sốt Phịng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ) CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute (Viện Tiêu chuẩn Phịng thí nghiệm Lâm sàng) DNA Deoxyribonucleic acid ESBL Extended-spectrum β-lactamase (Men beta-lactamase phổ rộng) FIC Fractional Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế phân đoạn) GARP Global Antibiotic Resistance Partnership (Dự án hợp tác toàn cầu kháng kháng sinh) GN Gram negative (Gram âm) KXĐ Không xác định KS Kháng sinh vi Chữ viết tắt Diễn giải KSĐ Kháng sinh đồ MC Mac Conkey Agar (Thạch MC) MDR Multi Drug Resistant (Đa kháng thuốc) MIC Minimum Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) MHA Mueller-Hinton Agar (Thạch Mueller-Hinton) MHB Mueller-Hinton Broth (Môi trƣờng lỏng Mueller-Hinton) PABA Para-aminobenzoic acid PBP Penicillin Binding Protein (Protein bám Penicillin) RNA Ribonucleic Acid R Resistance (Kháng) S Sensitive (Nhạy) SMART Study for Monitoring Antimicrobial Resistance Trends (Nghiên cứu giám sát xu hƣớng đề kháng kháng sinh) WHO World Health Organization (Tổ chức y tế Thế giới) vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Các vị tr tác động kháng sinh lên tế bào vi khuẩn Hình 1.2 Hình minh họa kỹ thuật phối hợp KS phƣơng pháp E-test .22 Hình 1.3 Hình minh họa thơng số pK/pD đánh giá tác động KS vi khuẩn thể .23 Hình 2.1 Card GN (REF:21341) trƣớc sau thử nghiệm định danh vi khuẩn 28 Hình 2.2 Card AST – GN67 trƣớc sau thử nghiệm KSĐ .28 Hình 2.3 Phát ESBL đĩa kết hợp .30 Hình 2.4 Hình minh họa phối hợp hai kháng sinh phƣơng pháp vi pha lỗng cờ (checkerboad) nhựa 96 giếng 32 viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Mô tả enzyme CTX-M đƣợc phát số Quốc gia .11 Bảng 3.1 Tỷ lệ đề kháng kháng sinh vi khuẩn E coli .45 Bảng 3.2 Tỷ lệ đề kháng kháng sinh K pneumoniae 46 Bảng 3.3 Kết phối hợp KS in vitro ceftazidime với amikacin chủng E coli K pneumoniae MDR 47 Bảng 3.4 Hiệu phối hợp KS in vitro amikacin nồng độ thông thƣờng với ceftazidime chủng E coli K pneumoniae MDR 48 Bảng 3.5 MIC ceftazidime, amikacin đơn kết hợp chống lại E coli K pneumoniae MDR 49 Bảng 3.6 Kết phối hợp KS in vitro ceftazidime với levofloxacin chủng E coli K pneumoniae MDR 50 Bảng 3.7 MIC ceftazidime, levofloxacin đơn kết hợp chống lại E coli K pneumoniae MDR 51 Bảng 3.8 Kết phối hợp KS in vitro imipenem với levofloxacin chủng E coli K pneumoniae kháng với carbapenems 52 Bảng 3.9 MIC imipenem, levofloxacin đơn kết hợp chống lại E coli K pneumoniae kháng carbapenems .53 Bảng 3.10 Kết phối hợp KS in vitro imipenem với amikacin 10 chủng E coli 05 chủng K pneumoniae kháng với carbapenems 54 Bảng 3.11 MIC imipenem, amikacin đơn kết hợp chống lại E coli K pneumoniae kháng carbapenems 55 Bảng 3.12 Kết phối hợp KS in vitro tigecycline lần lƣợt với ceftazidime, imipenem, levofloxacin, amikacin chủng E coli kháng carbapenems 56 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM QUY TRÌNH CẤY ĐÀM ĐỊNH LƢỢNG  Nguyên tắc: - Dùng dung dịch chứa thuốc long đàm để đánh tan mẫu đàm, tiếp tục pha loãng dung dịch NaCl 0.9% 106 Cấy định lƣợng để xác định vi khuẩn  Quan sát vi thể: - Nhuộm gram đánh giá mẫu đàm: + Mẫu đàm đạt tiêu chuẩn để cấy khi: Bạch cầu > 25TB/QT10 TB biểu mô < 10TB/QT10/20-30 QT + Nếu không đạt điều kiện xem nhƣ mẫu đàm không đạt trả phiếu xét nghiệm đề nghị lấy đàm lại + Nếu mẫu đàm đạt: ghi nhận kết nhuộm làm bƣớc - Tiến hành cấy mẫu đàm định lƣợng: đƣợc thực tủ an toàn sinh học để đảm bảo vô khuẩn tránh lây nhiễm cho nhân viên XN  Qui trình thực hiện: o Nhuộm Gram để đánh giá mẫu đàm đủ tiêu chuẩn cấy o Dùng dd NaCl 0,9% + thuốc long đàm đánh tan đàm → dùng dd NaCl 0.9% pha loãng đàm đến hệ số pha loãng 106 o Cho 0.1ml dd đàm pha loãng 106 vào cấy định lƣợng môi trƣờng MC ủ 350C/18-24h, (BA, CA) ủ 350C/18-24h/5-7% CO2 o Chọn khúm khuẩn đếm số lƣợng thạch Số lƣợng khúm khuẩn x độ pha loãng Số lƣợng khúm khuẩn /1ml đàm = 0.1 o Thực trắc nghiệm sinh hóa định danh o Làm kháng sinh đồ o Trả kết LƢU Ý: * Mẫu đàm khơng đạt tiêu chuẩn đề nghị cho bệnh nhân lấy đàm lại * Những mẫu vi khuẩn không mọc theo dõi sau ngày, trả kết quả: khơng có vi khuẩn mọc * Thực cấy mẫu đàm tủ an tồn sinh học để đảm bảo vơ khuẩn tránh lây nhiễm cho nhân viên xét nghiệm Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM QUY TRÌNH CẤY MỦ  NGUYÊN TẮC Cấy chất ngoại tiết theo yêu cầu bác sĩ lâm sàng, bệnh phẩm bao gồm: - Mủ nhọt bọc, vết thƣơng - Mủ tai, mắt, bệnh phẩm nhiễm khuẩn da - Mủ niệu đạo, âm đạo, quan sinh dục…  QUAN SÁT VI THỂ - Nhuộm Gram đánh giá vi khuẩn SỐ LƢỢNG HÌNH DẠNG VI KHUẨN THẤY ĐƢỢC Không thấy vi khuẩn 50 Trực khuẩn Gram dƣơng Trực khuẩn Gram âm Song cầu Gram âm Cầu khuẩn Gram dƣơng : xếp đôi, chuỗi hay đám Trực cầu khuẩn Gram âm Trực khuẩn ăn màu Gram thay đổi Nấm men…  QUI TRÌNH THỰC HIỆN: a Cấy bệnh phẩm vào mơi trường nuôi cấy - Cấy vào môi trƣờng tăng sinh thioglycolate lỏng ủ 350C/18 – 24h - Cấy vào môi trƣờng phân lập MC, A ủ 350C/18 – 24h ( A ủ bình nến) b Khảo sát tăng trưởng vi khuẩn môi trường phân lập sau ủ, có vi khuẩn mọc : - Chọn khúm khuẩn - Thực trắc nghiệm sinh hóa định danh - Làm kháng sinh đồ - Trả kết c Một số lưu ý trình nuôi cấy bệnh phẩm mủ - Luôn kết hợp môi trƣờng nuôi cấy với môi trƣờng thioglycolate - Nếu sau ủ ngày môi trƣờng nuôi cấy khơng thấy mọc, mà thioglycolate có dấu hiệu đục phải cấy tr ch biệt môi trƣờng nuôi cấy MC, A thêm lần cấy kỵ kh - ệnh phẩm ủ sau ngày mà không thấy mọc trả kết khơng thấy vi khuẩn mọc Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM BỆNH PHẨM DỊCH NÃO TỦY, DỊCH KHỚP, DỊCH MÀNG PHỔI, MÀNG TIM, MÀNG BỤNG TÌM VI KHUẨN GÂY BỆNH  KỸ THUẬT CẤY DỊCH : a Quan sát đại thể: - Ghi nhận dịch trong, đục nhẹ, đục, hay tồn mủ - Ghi nhận có màu sắc dịch - Ghi nhận có máu khơng a Quan sát vi thể: - Trong trƣờng hợp dịch não tủy đục có mủ, cần làm phiến phết nhuộm Gram nhuộm Ziehl – Neelsen (trong trƣờng hợp nghi ngờ viêm màng não lao), ghi nhận số lƣợng bạch cầu vi khuẩn - Các dịch khác cần ly lâm làm phiến phết nhuộm Gram - Báo cáo cho BS lâm sàng có vi khuẩn b Nuôi cấy phân lập theo sơ đồ: Lƣu ý: Nếu sau 72 ủ khơng có vi khuẩn mọc kết luận khơng có vi khuẩn tăng trƣởng báo cáo kết : Không thấy vi khuẩn mọc Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PHỤ LỤC TĨM TẮT QUY TRÌNH THỰC HIỆN ĐỊNH DANH VÀ THỬ NGHIỆM ĐỘ NHẠY CẢM KHÁNG SINH ĐỒ BẰNG MÁY VITEK COMPACT  Nguyên tắc: Phƣơng pháp định danh vi sinh vật: dùng phƣơng pháp đo màu để nhận biết t nh chất sinh vật hoá học vi sinh vật thông qua thay đổi màu giếng mơi trƣờng có sẵn thẻ (card) - Phƣơng pháp làm KSĐ: dùng phƣơng pháp đo MIC (nồng độ ức chế tối thiểu), đo độ đục để theo dõi phát triển vi sinh vật giếng card Hai phƣơng pháp đƣợc thực theo nguyên lý suy giảm cƣờng độ ánh sáng: hệ thống quang học sử dụng ánh sáng quang học để theo dõi trực tiếp phát triển vi sinh vật thông qua việc đo cƣờng độ ánh sáng bị chặn lại (hay suy giảm cƣờng độ ánh sáng) ánh sáng qua giếng Hệ thống sử dụng bƣớc sóng 660nm, 568nm, 428nm  Quy trình: Chuẩn bị mẫu: - Sử dụng bơm định lƣợng cho 3ml nƣớc muối 0,45% - 0,50% vào ống nghiệm nhựa (12mm x75mm) vô trùng dùng lần (ống dùng để định danh vi khuẩn, ống dùng làm KSĐ) - Chọn khúm khuẩn đƣợc cấy trích biệt mơi trƣờng từ loại bệnh phẩm (mủ, máu, đàm, dịch…) - Dùng khuyên cấy tăm vô trùng chuyển lƣợng vừa đủ khuẩn lạc giống sang ống chuẩn bị Pha loãng huyền dịch vi khuẩn khuấy - Đƣa ống nghiệm vào máy đo độ đục DensiCHEK™ để kiểm tra độ đục Lƣu ý: Độ đục phải nằm giới hạn nhóm vi khuẩn, vi nấm… + Nếu giá trị độ đục thấp giới hạn phải cho thêm vi khuẩn vào Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM + Nếu giá trị độ đục cao giới hạn phải cho thêm nƣớc muối vào để pha lỗng Tránh làm nhiễm khuẩn đầu vịi xả nƣớc muối Bảng đối chiếu độ đục chuẩn cho loại vi sinh vật Vi khuẩn Gram âm Vi khuẩn Gram dƣơng Nấm 0.5 – 0.63 0.5 – 0.63 McF McF Nesseria/ Haemophilus Vi khuẩn kỵ khí 1.80 – 2.20 1.80 – 2.20 2.70 – 3.30 McF McF McF Độ đục phải tuân thủ theo giới hạn bảng - Dùng pipette tự động hút huyền dịch vi khuẩn ống sang ống chuẩn bị để làm KSĐ  Đối với vi khuẩn Gram âm lƣợng mẫu cần chuyển từ ống sang ống 145µl  Đối với vi khuẩn Gram dƣơng lƣợng mẫu cần chuyển từ ống sang ống 280µl - Đƣa ống chứa card định danh ống chứa card làm KSĐ vào khay (cassette), ống định danh để trƣớc ống làm KSĐ để sau - Thời gian huyền dịch sử dụng không 30 phút trƣớc đƣa vào Card Đƣa cassette vào máy: - Đƣa cassette vào ngăn hút mẫu (buồng hút chân khơng), nhấn nút Start Fill hình máy - Sau kết thúc hút mẫu khoảng phút đèn nhấp nháy - Mở cửa ngăn hút mẫu, lấy cassette đƣa vào ngăn đọc mẫu (lƣu ý: thời gian đƣa cassette từ ngăn hút mẫu sang ngăn đọc mẫu vịng 10 phút) - Khai báo thơng tin mẫu cần định danh làm KSĐ ch nh xác vào máy (nhƣ ID cassette, ID bệnh nhân…) - Sau máy nhận Card xong, đèn ngăn đọc mẫu nhấp nháy để ta lấy cassette - Vệ sinh cassette: huyền dịch vi khuẩn thừa cho vào dung dịch khử khuẩn, ống nghiệm cho vào rác thải y tế lây nhiễm, cassette đƣợc rửa nƣớc lau khơ Tn thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Báo cáo kết quả: Mức tin cậy thơng báo ID Chính xác Rất tốt Tốt Có thể chấp nhận đƣợc Độ phân biệt thấp Không đến kết luận Vi sinh vật không xác định Các lựa chọn % xác xuất 1 96 - 99 93 - 95 89 – 92 85 – 88 Từ đến Tổng số lựa chọn = 100 >3 Không áp dụng Nhận xét Cần phân tách theo thử nghiệm bổ sung Vi sinh vật không điển hình Quản lý chất lƣợng: - Kiểm tra hạng sử dụng loại card định danh, kháng sinh đồ - Kiểm tra, bảo trì máy Vitek Compact theo định kỳ tháng để đảm bảo chất lƣợng định danh kháng sinh đồ - Thực nội kiểm tra hàng tuần nhận lô card chủng chuẩn ATCC® Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PHỤ LỤC KẾT QUẢ PHỐI HỢP KHÁNG SINH Phụ bảng Kết phối hợp KS ceftazidime với amikacin chủng E coli K pneumoniae MIC (µg/ml) thử nghiệm Chƣa kết hợp Khi kết hợp FIC Kết phối Mã số CAZ AN CAZ AN Index hợp KSĐ chủng E coli tiết men ESBL 71614 32 32 1,250 Độc lập 71692 64 0,5 1,008 Độc lập 147592