Tuyển chọn, định danh vi khuẩn có khả năng phân giải histamine phân lập từ quá trình sản xuất nước mắm và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để thu sinh khối

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ HỒNG TUYỂN CHỌN, ĐỊNH DANH VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI HISTAMINE PHÂN LẬP TỪ QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT NƯỚC MẮM VÀ TỐI ƯU HỐ ĐIỀU KIỆN NI CẤY ĐỂ THU SINH KHỐI Ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 8540101 Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Lâm Đoàn PGS.TS Nguyễn Hoàng Anh NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình khoa học tơi nhóm nghiên cứu, số liệu kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hồng i năm 2019 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, nỗ lực học hỏi thân, nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Lâm Đoàn, PGS.TS Nguyễn Hoàng Anh TS Trần Thị Thu Hằng tận tình bảo, hướng dẫn chuyên môn tạo điều kiện giúp đỡ suốt q trình nghiên cứu thực đề tài Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, quý Thầy/Cô Bộ mơn Quản lý chất lượng An tồn thực phẩm, Phịng Thí nghiệm Trung tâm khoa học công nghệ thực phẩm, Khoa Công nghệ Thực phẩm Học viện Nông nghiệp Việt Nam tạo điều kiện, giúp đỡ tơi q trình học tập, nghiên cứu, thực đề tài hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn đến thành viên tham gia nhóm nghiên cứu cộng tác, chia sẻ kiến thức, tìm kiếm phương pháp, tiến hành thí nghiệm suốt thời gian thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi, động viên, khuyến khích giúp tơi hồn thành luận văn Hà Nội, ngày tháng Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hồng ii năm 2019 MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Trích yếu luận văn viii Thesis abstract x Phần Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích – yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Nước mắm 2.1.1 Giới thiệu nước mắm 2.1.2 Quy trình sản xuất 2.2 Histamine 2.2.1 Giới thiệu chung histamine 2.2.2 Sự hình thành histamine thực phẩm 2.2.3 Phương pháp làm giảm hàm lượng histamine thực phẩm 14 2.2.4 Một số nghiên cứu vi sinh vật phân giải histamine 16 Phần Đối tượng – nội dung phương pháp nghiên cứu 20 3.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 20 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20 3.1.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 21 3.1.3 Dụng cụ 21 3.1.4 Môi trường nuôi cấy 21 3.2 Nội dung nghiên cứu 21 3.3 Phương pháp nghiên cứu 21 3.3.1 Bố trí thí nghiệm 21 iii 3.3.2 Phương pháp phân tích 23 Phần Kết thảo luận 30 4.1 Xác định khả phân giải histamine 30 4.2 Định danh chủng tuyển chọn phương pháp xác định định trình tự gene 16S rRNA 33 4.3 Xác định điều kiện ni cấy thích hợp chủng vi khuẩn lựa chọn 35 4.3.1 Ảnh hưởng nồng độ muối 35 4.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 37 4.3.3 Ảnh hưởng pH 39 4.4 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy chủng vi khuẩn 41 4.4.1 Tối ưu hóa điều kiện ni cấy chủng vi khuẩn Exiguobacterium profundum CH2.1 41 4.4.2 Tối ưu hóa điều kiện ni cấy chủng vi khuẩn Virgibacillus campisalis TT8.5 46 4.4.3 Đường cong sinh trưởng chủng CH2.1 TT8.5 với điều kiện tối ưu 50 Phần Kết luận kiến nghị 50 5.1 Kết luận 51 5.2 Kiến nghị 51 Tài liệu tham khảo 53 Phụ lục 61 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt HA Halophilic NA Nutrient Agar TSB Trypticase Soy Broth High Pressure Liquid Chromatography OD Optical density HACCP Hazard Analysis Critical Control Point GHP Good Hygiene Practices GMP Good Manufacturing Practices FDA Food and Drug Administration FAO Food and Agriculture Organization WHO World Health Organization CFU Colony – Forming Unit et al Cộng OPA ortho-phthalaldehyde SG Sehgal and Gibbons S Streptococcus P Photobacterium M Morganella R Raoultella P Photobacterium E Escherichia Abs620nm Absorbance 620nm h v DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Khả phân giải histamine chủng vi khuẩn chịu mặn 30 Bảng 4.2 Kết định tên loài chủng giải trình tự gene 16S rRNA 34 Bảng 4.3 Một số đặc điểm sáu chủng tuyển chọn 34 Bảng 4.4 Bảng mã hóa khoảng biến thiên yếu tố nghiên cứu chủng CH2.1 42 Bảng 4.5 Bảng ma trận mã hóa theo mơ hình thiết kế thí nghiệm Box-Behnken kết thực nghiệm chủng CH2.1 42 Bảng 4.6 Kết phân tích ANOVA cho mật độ đo quang chủng vi khuẩn Exiguobacterium profundum CH2.1 44 Bảng 4.7 Bảng mã hóa khoảng biến thiên yếu tố nghiên cứu chủng TT8.5 46 Bảng 4.8 Bảng ma trận mã hóa theo mơ hình thiết kế thí nghiệm Box-Behnken kết thực nghiệm chủng TT8.5 47 Bảng 4.9 Kết phân tích ANOVA cho mật độ đo quang chủng vi khuẩn Virgibacillus campisalis TT8.5 48 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cơng thức cấu tạo Hình 2.2 Cấu trúc khơng gian Hình 2.3 Sự hình thành histamine từ histidine 11 Hình 2.4 Phản ứng xúc tác enzyme diamine oxidase 17 Hình 2.5 Phản ứng xúc tác enzyme histamine dehydrogenase 17 Hình 3.1 Sắc kí đồ chuẩn histamine 25 Hình 3.2 Đồ thị đường chuẩn histamine 25 Hình 4.1 Sắc kí đồ histamine chủng vi khuẩn Nh6.2 thời điểm ngày 32 Hình 4.2 Sắc kí đồ histamine chủng vi khuẩn Nh6.2 thời điểm ngày 32 Hình 4.3 Sắc kí đồ histamine chủng vi khuẩn Nh6.2 thời điểm ngày 33 Hình 4.4 Ảnh hưởng nồng độ muối đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn Exiguobacterium profundum CH2.1 35 Hình 4.5 Ảnh hưởng nồng độ muối đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn Virgibacillus campisalis.TT8.5 36 Hình 4.6 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn Exiguobacterium profundum CH2.1 37 Hình 4.7 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn Virgibacillus campisalis.TT8.5 38 Hình 4.8 Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn Exiguobacterium profundum CH2.1 40 Hình 4.9 Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn Virgibacillus campisalis.TT8.5 40 Hình 4.10 Điều kiện ni cấy tối ưu chủng vi khuẩn Exiguobacterium profundum CH2.1 45 Hình 4.11 Điều kiện ni cấy tối ưu chủng vi khuẩn Virgibacillus campisalis TT8.5 49 Hình 4.12 Đường cong sinh trưởng chủng CH2.1 TT8.5 với điều kiện tối ưu 50 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên Tác giả: Nguyễn Thị Hồng Tên Luận văn: Tuyển chọn, định danh vi khuẩn có khả phân giải histamine phân lập từ q trình sản xuất nước mắm tối ưu hố điều kiện nuôi cấy để thu sinh khối Ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 8540101 Tên sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Tuyển chọn, định danh 1-2 chủng vi khuẩn ưa mặn, có khả phân giải histamine phân lập từ q trình sản xuất nước mắm Từ đó, tối ưu hố điều kiện ni cấy chủng để thu sinh khối Phương pháp nghiên cứu Để thực đề tài sử dụng phương pháp sau: Tuyển chọn chủng có khả phân giải histamine tiến hành theo Tapingkae et al., 2010 Định danh chủng vi khuẩn có khả phân giải histamine phương pháp xác định trình tự gen 16S rRNA tiến hành theo phương pháp Yi-Lin Chen et al., 2015 Phân tích hàm lượng histamine tiến hành theo phương pháp Saeed Tahmouzi et al., 2011 Tối ưu hóa điều kiện ni cấy mơ hình Box-Behnken Kết kết luận - 6/28 chủng có khả phân giải histamine cao sau ngày ni cấy mơi trường có bổ sung histamine Nh6.2, LT9.2, TT8.5, CH2.1, CT13.1, CH3.3 tỷ lệ phân giải histamine 44.66, 44.31%, 43.11%, 43.09%, 42.94%, 42.94% - Từ chủng CH2.1, CH3.3, LT9.2, TT8.5, CT13.1, Nh6.2 mang xác định trình tự gene 16S rRNA kết tương ứng Exiguobacterium profundum, Virgibacillus halodenitrificans, Staphylococcus arlettae, Virgibacillus campisalis, Chromohalobacter salexigens, Staphylococcus cohnii subsp urealyticus - Điều kiện thích hợp cho chủng Exiguobacterium profundum CH2.1: Nồng độ muối 5-12%, pH = 6-7, nhiệt độ: 27-370C Điều kiện thích hợp cho chủng Virgibacillus campisalis TT8.5: Nồng độ muối: 2-8%, pH =7.5- 8.5, nhiệt độ: 32-420C viii - Điều kiện phát triển tối ưu chủng Exiguobacterium profundum CH2.1: Nồng độ muối 7.84%, pH = 6.75, nhiệt độ 32.840C với giá trị Abs620nm thời điểm 96h đạt 3,8328 - Điều kiện phát triển tối ưu chủng vi khuẩn Virgibacillus campisalis TT8.5: Nồng độ muối 2.6%, pH = 8.5, nhiệt độ 320C với giá trị Abs620nm thời điểm 96h đạt 7,2425 - Khi khảo sát nuôi chủng CH 2.1 TT8.5 điều kiện tối ưu thời điểm 96h giá trị Abs620nm đạt 3,4477 với chủng CH2.1 6,1922 chủng TT.8.5 ix CT14.2 Nh6.5 Nh5.2 Nh1.3 TT9.6 Nh3.3 Nh3.1 Nh1.1 LT8.2 CT14.1 LT6.1 CH3.3 TT9.2 CH2.1 CT13.1 Nh6.2 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 126.16 126.16 126.16 126.16 126.16 126.16 126.16 126.16 126.16 126.16 126.16 126.16 126.16 126.16 126.16 126.16 78.11 75.38 75.1 74.92 77.63 75.61 76.02 76.74 80.43 80.84 107.58 98.94 92.48 100.91 91.73 100.46 78.27 75.56 75.03 74.62 77.43 75.69 76.05 76.58 80.27 81.2 107.6 98.89 92.5 100.54 91.89 100.46 78.1 75.29 75.11 74.5 77.5 75.8 75.87 76.48 80.68 80.99 107.47 99.2 92.67 100.89 92.5 100.7 78.16 75.41 75.08 74.68 77.52 75.7 75.98 76.6 80.46 81.01 107.55 99.01 92.55 100.78 92.04 100.54 62 0.095 0.137 0.044 0.216 0.101 0.095 0.096 0.131 0.207 0.181 0.07 0.166 0.104 0.208 0.406 0.139 69.24 71.33 71.35 73.25 71.36 73.75 75.36 73.87 75.03 74.87 75.86 75.46 74.35 77.45 76.23 74.12 69.79 72.13 71.24 73.04 71.97 73.24 75.78 73.78 74.25 74.76 75.35 75.13 75.86 77.35 76.04 74.02 70.43 72.48 72.81 72.95 72.64 73.9 75.81 73.33 74.16 74.92 74.45 74.71 74.31 76.56 76.81 74.04 69.82 71.98 71.8 73.08 71.99 73.63 75.65 73.66 74.48 74.85 75.22 75.1 74.84 77.12 76.36 74.06 0.596 0.589 0.876 0.154 0.64 0.346 0.252 0.289 0.478 0.082 0.714 0.376 0.884 0.488 0.401 0.053 44.66 42.94 43.09 42.07 42.94 41.64 40.04 41.62 40.96 40.67 40.37 40.47 40.68 38.87 39.47 41.29 Kết xử lý thống kê minitab: Response Surface Regression: OD-8.5 versus nhiệt độ, pH, nồng độ The analysis was done using coded units Estimated Regression Coefficients for OD-8.5 Term Coef SE Coef T P Constant 4.63358 0.1829 25.328 0.000 nhiệt độ -2.53637 0.1120 -22.640 0.000 pH -0.11854 0.1120 -1.058 0.338 nồng độ -0.33475 0.1120 -2.988 0.031 nhiệt độ*nhiệt độ -0.93585 0.1649 -5.675 0.002 pH*pH 0.03336 0.1649 0.202 0.848 nồng độ*nồng độ 0.09200 0.1649 0.558 0.601 nhiệt độ*pH -0.12811 0.1584 -0.809 0.455 nhiệt độ*nồng độ 0.11001 0.1584 0.694 0.518 pH*nồng độ 0.21770 0.1584 1.374 0.228 S = 0.316866 PRESS = 7.43109 R-Sq = 99.11% R-Sq(pred) = 86.88% R-Sq(adj) = 97.52% Analysis of Variance for OD-8.5 Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Regression 56.1443 56.1443 6.2383 62.13 0.000 Linear 52.4742 52.4742 17.4914 174.21 0.000 nhiệt độ 51.4653 51.4653 51.4653 512.58 0.000 pH 0.1124 0.1124 0.1124 1.12 0.338 nồng độ 0.8965 0.8965 0.8965 8.93 0.031 Square 3.3664 3.3664 1.1221 11.18 0.012 nhiệt độ*nhiệt độ 3.3326 3.2338 3.2338 32.21 0.002 pH*pH 0.0026 0.0041 0.0041 0.04 0.848 nồng độ*nồng độ 0.0313 0.0313 0.0313 0.31 0.601 Interaction 0.3036 0.3036 0.1012 1.01 0.462 nhiệt độ*pH 0.0657 0.0657 0.0657 0.65 0.455 nhiệt độ*nồng độ 0.0484 0.0484 0.0484 0.48 0.518 pH*nồng độ 0.1896 0.1896 0.1896 1.89 0.228 Residual Error 0.5020 0.5020 0.1004 Lack-of-Fit 0.4583 0.4583 0.1528 6.99 0.128 Pure Error 0.0437 0.0437 0.0219 Total 14 56.6463 Estimated Regression Coefficients for OD-8.5 using data in uncoded units Term Coef Constant -24.5995 nhiệt độ 2.63614 pH -1.20201 nồng độ -1.64623 nhiệt độ*nhiệt độ -0.0374341 pH*pH 0.133458 nồng độ*nồng độ 0.0102225 nhiệt độ*pH -0.0512450 nhiệt độ*nồng độ 0.00733389 63 pH*nồng độ 0.145133 Response Surface Regression: OD-2.1 versus nhiệt độ, pH, nông độ muối The analysis was done using coded units Estimated Regression Coefficients for OD-2.1 Term Coef SE Coef T P Constant 3.75560 0.08943 41.993 0.000 nhiệt độ 0.55225 0.05477 10.084 0.000 pH 0.11928 0.05477 2.178 0.081 nông độ muối -0.01449 0.05477 -0.265 0.802 nhiệt độ*nhiệt độ -1.71455 0.08061 -21.269 0.000 pH*pH -0.12580 0.08061 -1.561 0.179 nông độ muối*nông độ muối -0.22150 0.08061 -2.748 0.040 nhiệt độ*pH 0.04844 0.07745 0.625 0.559 nhiệt độ*nông độ muối 0.00706 0.07745 0.091 0.931 pH*nông độ muối -0.01973 0.07745 -0.255 0.809 S = 0.154903 PRESS = 1.62661 R-Sq = 99.12% R-Sq(pred) = 88.01% R-Sq(adj) = 97.52% Analysis of Variance for OD-2.1 Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Regression 13.4511 13.4511 1.4946 62.29 0.000 Linear 2.5553 2.5553 0.8518 35.50 0.001 nhiệt độ 2.4398 2.4398 2.4398 101.68 0.000 pH 0.1138 0.1138 0.1138 4.74 0.081 nông độ muối 0.0017 0.0017 0.0017 0.07 0.802 Square 10.8846 10.8846 3.6282 151.21 0.000 nhiệt độ*nhiệt độ 10.6596 10.8542 10.8542 452.35 0.000 pH*pH 0.0439 0.0584 0.0584 2.44 0.179 nông độ muối*nông độ muối 0.1811 0.1811 0.1811 7.55 0.040 Interaction 0.0111 0.0111 0.0037 0.15 0.922 nhiệt độ*pH 0.0094 0.0094 0.0094 0.39 0.559 nhiệt độ*nông độ muối 0.0002 0.0002 0.0002 0.01 0.931 pH*nông độ muối 0.0016 0.0016 0.0016 0.06 0.809 Residual Error 0.1200 0.1200 0.0240 Lack-of-Fit 0.0987 0.0987 0.0329 3.09 0.254 Pure Error 0.0213 0.0213 0.0107 Total 14 13.5711 Estimated Regression Coefficients for OD-2.1 using data in uncoded units Term Coef Constant -90.8881 nhiệt độ 4.37000 pH 6.26552 nông độ muối 0.459397 nhiệt độ*nhiệt độ -0.0685821 pH*pH -0.503208 nông độ muối*nông độ muối -0.0246109 nhiệt độ*pH 0.0193750 nhiệt độ*nông độ muối 0.000470556 pH*nông độ muối -0.0131556 64 Trình tự gen 16s CH2.1 TCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGCAGGAA GCCGTCTGAACCCTTCGGGGGGACGACGGTGGAATGAGCGGCGGACGGGTG AGTAACACGTAAAGAACCTGCCCATAGGTCTGGGATAACCACGAGAAATCG GGGCTAATACCGGATGTGTCATCGGACCGCATGGTCCGCTGATGAAAGGCG CTCCGGCGTCGCCCATGGATGGCTTTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGGGGT AACGGCCCACCAAGGCGACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCC ACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGG AATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAACGATG AAGGCTTTCGGGTCGTAAAGTTCTGTTGTAAGGGAAGAACAAGTGCCGCAG GCAATGGCGGCACCTTGACGGTACCTTGCGAGAAAGCCACGGCTAACTACG TGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTG GGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCCTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGG CTCAACCGGGGAGGGCCATTGGAAACTGGGAGGCTTGAGTATAGGAGAGA AGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACA CCAGTGGCGAAGGCGACTCTTTGGCCTATAACTGACGCTGAGGCGCGAAAG CGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGAT GAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGAAGCTAACGCATT AAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTG ACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCG AAGAACCTTACCAACTCTTGACATCCCCCTGACCGGTACAGAGATGTACCTT CCCCTTCGGGGGCAGGGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTG TCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTT GCCAGCATTTGGTTGGGCACTCTAGGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGG AAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGAGTTGGGCTACACA CGTGCTACAATGGACGGTACAAAGGGCAGCGAAGCCGCGAGGTGGAGCCA ATCCCAGAAAGCCGTTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATG AAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCATACTGCGGTGAATACGTTC CCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGCAACACCCGA AGTCGGTGAGGTAACCGTAAGGAGCCAGCCG CH3.3 GGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGCGG GAAGCAAGCTGATCCTCTTCGGAGGTGACGCTTGTGGAACGAGCGGCGGAC GGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACCCCGGGA 65 AACCGGGGCTAATACCGGATAATACTTTTCATCACCTGATGGAAAGTTGAA AGGTGGCTTCTTGCTACCACTTACAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTT GGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGT GATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGC AGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTG AGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGT GCCGTTCGAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCCCGGC TAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGG AATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTCCTTTAAGTCTGATGTGAAA GCCCACGGCTTAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGAGGACTTGAGTACA GAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTG GAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGG CGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCG TAAACGATGAGTGCTAGGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGAAGTT AACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAA AAGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAC GCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGCAATCGGTAGAGA TACCGAGTTCCCTTCGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCA GCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGAT CTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAAC CGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGC TACACACGTGCTACAATGGATGGAACAAAGGGAAGCAAAACCGCGAGGTC AAGCAAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGC CTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAA TACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTGGTAAC ACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGC TT8.5 TGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAG CGCGGGAAGCAAATCGATCCCCTTCGGGGGTGACGTTTGTGGAACGA GCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGATTGG GATAACTCGCGGAAACGTGAGCTAATACCGAATGACACTTTTCATCG CCTGATGGGAAGTTAAAAGGCGGCATTTGCTGTCACTTACAGATGGG CCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGATAAAAGCTCACCAAGGCAA CGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAG ACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCA ATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTT 66 TCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTATTGTTCGAAT AGGACAGTACCTTGACGGTACTTAACCAGAAAGCCCCGGCTAACTAC GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCGAGCGTTGTCCGGAAT TATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTGATGTGAA AGCCCACGGCTTAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGAGGACTTGA GTACAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTA GAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAA CTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACC CTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTAGGGGGTTT CCGCCCCTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGA GTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAAGAATTGACGGGGACCCGCAC AAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTA CCAGGTCTTGACATCCTCTGCTATCGGTAGAGATACCGAGTTCCCTTC GGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGT GAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTT GCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCG GAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGG GCTACACACGTGCTACAATGGATGGAACAAAGGGCAGCGAAGCGGC AACGTGTTAGCAAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGC TGCAACTCGCCTACATGAAGCAGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAG CATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCAC ACCACGAGAGTTGGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACACTTTTGT GAGCCAGCCGCCGAA CT13.1 GGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTA ACAGGTCCAGCTTGCTGGACGCTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCA TAGGAATCTACCCAGTCGTGGGGGATAACCTGGGGAAACCCAGGCTAATAC CGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCGGGGGCTCTTCGGACCTCGCGCGATTG GATGAGCCTATGTCGGATTAGCTGGTTGGTGGGGTAACGGCTCACCAAGGC GACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGAC ACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGC GAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCTTTCGGGTTGTA AAGCACTTTCAGTGGGGAAGAAGGCTTGTCGGCCAATACCCGGCAAGAGCG ACATCACCCACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTA ATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTA 67 GGCGGCTTGTCACGCC CGCCGGGTGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCT ACCTGGGAACGGC ATCCGGAACGGGCAG GCAGGCTAGAGTGCAGGAGAGGAAGGTAGA TAGAATTCCCGGT GTAGCGGTGAAATGC ATGCGTAGAGATCGGGAGGAATACCAGTGG GTGGCGAAGGCGG CCTTCTGGACTGACAC ACACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGT GGGTAGCAAACAG GATTAGATACCCTGGT TGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACT GACTAGCCGTTGG GTCCCTTGAGGACTTA CTTAGTGGCGCAGTTAACGCGATAAGTCGA TCGACCGCCTGGG GAGTACGGCCGCAAG CAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGG GGGGGCCCGCACAA GCGGTGGAGCATGTG TGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAAC AACCTTACCTACC CTTGACATCCTGCGAA CGAACCCGGAAGAGATTCCGGGGTGCCTTC CTTCGGGAGCGCA GAGACAGGTGCTGCA TGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAA GAAATGTTGGGTTA AGTCCCGTAACGAGC AGCGCAACCCTTGTCCCTATTTGCCAGCGA GCGATTCGGTCGGG AACTCTAGGGAGACT ACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGG GTGGGGACGACGT CAAGTCATCATGGCCC GCCCTTACGGGTAGGGCTACACACGTGCTA GCTACAATGGCCG GTACAAAGGGTTGCG TGCGAAGCCGCGAGGTGAAGCCAATCCCAG CCAGAAAGCCGGC CTCAGTCCGGATTGGA TGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCG GTCGGAATCGCTA GTAATCGTGCATCAGA CAGAATGGCACGGTGAATACGTTCCCGGGC GGGCCTTGTACAC ACCGCCCGTCACACCA ACCATGGGAGTGGACTGCACCAGAAGTGG GTGGTTAGCCTAAC TTCGGAGGGCGATC Kết xử lý JMP Kết tối ưu hóa củaa chủng c TT8.5 Actual by Predicted Plot Effect Summary Source LogWorth PValue 68 Source nhiệt độ(32,42) pH*nồng độ muối LogWorth 3.412 1.223 PValue 0.00039 0.05990 pH(7.5,8.5) pH*pH 0.814 0.620 0.15357 ^ 0.23969 nồng độ muối*nồng độ muối nồng độ muối(2,8) 0.548 0.421 0.28321 0.37958 ^ nhiệt độ*nhiệt độ nhiệt độ*pH 0.289 0.110 0.51459 0.77575 nhiệt độ*nồng độ muối 0.093 0.80654 Lack Of Fit Source Lack Of Fit Pure Error Total Error DF Su of Sum Squares Squ 3.586 3.5867315 0.043 0.0437260 3.630 3.6304576 Mean Square F Ratio 1.19558 0.02186 54.6849 Prob > F 0.0180* Max RSq 0.9993 Residual by Predicted Plot Studentized Residuals Parameter Estimates Term Intercept Estimate 4.6335833 Std Error 0.491966 69 t Ratio 9.42 Prob>|t| 0.0002* Term nhiệt độ(32,42) pH(7.5,8.5) nồng độ muối(2,8) nhiệt độ*pH nhiệt độ*nồng độ muối pH*nồng độ muối nhiệt độ*nhiệt độ pH*pH nồng độ muối*nồng độ muối Estimate -2.536369 0.5064604 0.2902458 -0.128112 0.1100083 -1.0323 -0.310852 -0.591635 -0.532998 Std Error 0.301266 0.301266 0.301266 0.426055 0.426055 0.426055 0.443452 0.443452 0.443452 t Ratio -8.42 1.68 0.96 -0.30 0.26 -2.42 -0.70 -1.33 -1.20 Prob>|t| 0.0004* 0.1536 0.3796 0.7757 0.8065 0.0599 0.5146 0.2397 0.2832 Effect Tests Source nhiệt độ(32,42) pH(7.5,8.5) nồng độ muối(2,8) nhiệt độ*pH nhiệt độ*nồng độ muối pH*nồng độ muối nhiệt độ*nhiệt độ pH*pH nồng độ muối*nồng độ muối Nparm DF 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Sum of Squares 51.465331 2.052017 0.673941 0.065651 0.048407 4.262573 0.356784 1.292428 1.048936 Box-Cox Transformations Response Surface Solution Variable nhiệt độ(32,42) pH(7.5,8.5) nồng độ muối(2,8) Critical Critic Valu Value -8.00286 002868 14.36518 365184 -33.9535 3.95358 70 F Ratio Prob rob > F 70.8800 2.8261 0.9282 0.0904 0.0667 5.8706 0.4914 1.7800 1.4446 0.0004* 0.0004 0.153 0.1536 0.379 0.3796 0.775 0.7757 0.806 0.8065 0.059 0.0599 0.514 0.5146 0.239 0.2397 0.283 0.2832 Canonical Curvature Eigenvalue nhiệt độ(32,42) pH(7.5,8.5) nồng độ muối(2,8) -0.0210 0.27833 -0 0.3351 0.96042 0.9 -1.0794 0.01153 -0.66130 0.69657 0.1 0.18291 -0.2 0.21011 0.72748 0.68604 Prediction Profiler Đạt 71 Tối ưu hóa chủng ng CH2.1 Actual by Predicted Plot Effect Summary Source nhiệt độ*nhiệt độ LogWorth 5.371 PValue 0.00000 nhiệt độ(27,37) nồng độ muối*nồng độ muối 3.784 1.393 0.00016 ^ 0.04043 pH(6,7) pH*pH 1.090 0.746 0.08130 0.17935 nhiệt độ*pH nồng độ muối(5,11) 0.252 0.096 0.55924 0.80176 ^ pH*nồng độ muối nhiệt độ*nồng độ muối 0.092 0.031 0.80935 0.93101 Lack Of Fit Source Lack Of Fit Pure Error Total Error DF Su of Sum Squares Squ 0.0986 09865389 0.0213 02131746 0.1199 11997135 Mean Square F Ratio 0.032885 0.010659 3.0852 Prob > F 0.2543 Max RSq 0.9984 Residual by Predicted Plot 72 Studentized Residuals Parameter Estimates Term Intercept nhiệt độ(27,37) pH(6,7) nồng độ muối(5,11) nhiệt độ*pH nhiệt độ*nồng độ muối pH*nồng độ muối nhiệt độ*nhiệt độ pH*pH nồng độ muối*nồng độ muối Estimate 3.7556 0.5522375 0.1192875 -0.0145 0.048425 0.00705 -0.0197 -1.714563 -0.125813 -0.221487 Std Error 0.089432 0.054766 0.054766 0.054766 0.07745 0.07745 0.07745 0.080613 0.080613 0.080613 t Ratio 41.99 10.08 2.18 -0.26 0.63 0.09 -0.25 -21.27 -1.56 -2.75 Prob>|t|