THU NHẬN VÀ NUOI CẤY PHOI IN VITRO

Chương 3.THU NHẬN VÀ NI CẤY PHƠI IN VITRO 3.1.Phơi soma Được hình thành khơng thơng qua q trình tạo mơ sẹo gọi phơi vơ tính, tế bào phơi vơ tính tạo trực tiếp nhân sinh khối hệ thống ni cấy thích hợp Những tế bào phơi vơ tính có khả tái sinh thành hoàn chỉnh dùng làm nguyên liệu sản xuất hạt giống nhân tạo với lớp bao alginate Phơi vơ tính xem kỹ thuật mang lại nhiều hiệu cao nhân giống trồng 3.1.1 Sự phát sinh phôi soma Những tế bào phôi hợp tử biểu gen cần thiết cho chương trình phát triển phơi Giai đoạn trước hình thành tế bào phơi soma gọi tế bào tiền phôi Tế bào tiền phôi phân chia để hệ thống tế bào phôi trực tiếp gọi phát sinh tế bào phơi trực tiếp Có nhiều tế bào phát sinh tế bào phôi không cần chất kích thích st , có nhiều tế bào cần Auxin để tiến hành phân bào trước phát sinh tế bào phơi Có nhiều tế bào hình thành phơi từ mô sẹo, trường hợp phát sinh phôi soma tiến hành gián tiếp Hai danh từ tế bào tiền phôi PEDC ( Preembryogenic determined cell) tế bào phát sinh phôi IEDC ( induced embryogenic determined cell) dùng để phân loại mô, thực chất trình tiếp nối nhau, kết thúc phát triển hệ thống tế bào phôi (EC- Embryogenic cell) Những tế bào mơ có quan hệ với sinh sản hạt phấn, chồi mầm có khả hệ thống tế bào phôi dễ dàng tế bào mô trưởng thành Khi mô có chứa tế bào phơi, kích thích phân chia tế bào giai đoạn cần thiết để trì tình trạng phơi hình thành tế bào phơi soma Tế bào sinh phơi hệ thống tế bào bình thường ni cấy mơi trường có auxin khơng có cytokinin Lượng cytokinin có tế bào cao thường phát sinh phôi thấp Khi tế bào phôi thu nhận, có mặt auxin gây tổn hại đến pt bt phôi Những nhân tố khác ah đến pt phôi tỉ lệ đạm amonium nitrate môi trường pH thấp Hay lặp lặp lại chu kì phát sinh phơi bị phá vỡ giảm hay bỏ hẳn auxin khỏi mơi trường Sự hình thành phơi thơng qua đưòng PEDC IEDC Con đường PEDC đường phát sinh phơi khơng qua q trình tạo mô sẹo IDEC đường thông qua q trình tạo mơ sẹo Có bước dẫn đến hệ thống phơi: Sự biệt hố tế bào có khả phát sinh phơi Sự phát triển tế bào phôi hệ thống Như có hai mơi trường cần thiết cho ni cấy phôi: Môi trường cần cho phát sinh tế bào phôi Môi trường cần cho phát triển tế bào thành tế bào có khả phát sinh phơi Bước cần có mặt auxin bước phải giảm thấp hay khơng có mặt auxin Có hai yếu tố quan trọng phát sinh phôi: Auxin nitrogen Phát sinh phôi soma kiểu mẫu tính tồn thế, khảo sát tồn tiến trình biệt hố tế bào chế thể tính tồn tế bào thực vật 3.1.2 Thiết lập hệ thống phát sinh phôi đồng hiệu suất cao Một hệ thống thích hợp thiết lập cho mục đích nghiên cứu qua việc dùng tế bào dung dịch huyền phù cà rốt Những cụm tế bào phôi chọn lọc sau lọc qua lưới để loại bỏ cụm tế bào to ly tâm dung dịch Ficoll cấy chuyển sang môi trường auxin có zeatin (10 -7M) Phát sinh phơi đồng xảy từ cụm tế bào có tần suất khoảng 90% phát sinh phôi Hệ thống cho thấy thích hợp để nghiên cứu tiến trình phát sinh phơi từ cụm tế bào có khả phát sinh phôi, gọi cụm tế bào giai đoạn Tuy nhiên từ cụm tế bào biệt hố tạo phơi mơi trường có auxin khơng có chất khác, phát sinh phơi ghi nhận thơng qua xác định cụm tế bào có khả phát sinh phơi giai đoạn Như tiến trình hình thành cụm tế bào giai đoạn từ tế bào đơn quan trọng để phân tích tiến trình phát sinh phôi Một hệ thống yêu cầu có tần suất phát sinh phơi cao từ tế bào đơn Những tế bào đơn có kích thước nhỏ, tròn tế bào chất đậm đặc gọi tế bào giai đoạn 0, thu nhận qua lọc, rây Những tế bào giai đoạn nuôi cấy mơi trường có 2,4 D (5.10-8M) ngày chuyển sang mơi trường khơng có auxin, tế bào phơi hình thành với tần suất cao Xử lí tế bào trước với auxin cho thấy cần thiết zeatin (10 -6M), Manitol (10-3 M) 02 cao (40%) có tác dụng thúc đẩy phát sinh phơi Hệ thống hệ thống có hiệu cho phép nghiên cứu tiến trình phát sinh phơi soma từ tế bào đơn Những tế bào giai đoạn ni cấy mơi trường khơng có auxin cho thấy khả thể tính tồn thế, ngược lại; tế bào giai đoạn ni cấy mơi trường có auxin cấy chuyển sang mơi trường khơng có auxin biệt hóa hình thành phơi với tần suất cao, thể tính tồn 3.2 Tính bất hợp của giao tử trước sau thụ tinh 3.2.1 Tính bất hợp giao tử trước thụ tinh - Thụ phấn (pollination): Là tiếp nhận hạt phấn từ bao phấn tới núm nhụy để thực thụ tinh hoa Ở thực vật hạt kín có hai phương thức thụ phấn thụ phấn chéo tự thụ phấn - Thụ tinh (fertilization): Ở thực vật, thụ tinh kết hợp hai giao tử đực (tinh trùng nỗn) thành hợp tử (phơi, bào tử hạt) đặc trưng sinh sản hữu tính, sinh sản lưỡng tính Ở thực vật hạt kín có phương thức thụ tinh kép Trong tự nhiên trình thụ phấn thực vật thường xảy theo trình tự sau: hạt phấn chín rơi lên núm nhụy, nảy mầm tạo ống phấn Ống phấn xuyên dọc theo nhụy tiếp cận tới noãn Lúc hai tinh tử đơn bội (1n) hạt phấn vào tới nỗn thực q trình thụ tinh kép: Một tinh tử kết hợp với tế bào noãn đơn bội tạo thành hợp tử nhị bội (2n) sau phát triển thành phơi, tinh tử cịn lại kết hợp với tế bào nội nhũ nhị bội tạo hợp bào nội nhũ tam bội (3n) để nuôi phôi Nếu hạt phấn lạ (khác loài) rơi lên núm nhụy nhụy tạo chất ức chế phát triển ống phấn làm biến dạng ống phấn ngăn cản thụ tinh Đó tính bất hợp giao tử trước thụ tinh 3.2.2 Tính bất hợp giao tử sau thụ tinh Trong số trường hợp khác, hạt phấn loài lạ rơi lên núm nhụy, ống phấn mọc bình thường trình thụ tinh xảy ra, hạt không phát triển Nguyên nhân chủ yếu nội nhũ phơi hình thành chế ức chế phát triển phôi Đây trường hợp hay gặp tiến hành lai xa (lai khác loài khác chi) 3.3 Thụ phấn in vitro Tính bất hợp giao tử khắc phục kỹ thuật thụ phấn ống nghiệm Điều kiện phải nuôi cấy thành công bầu hay noãn phân lập chủ động điều khiển trình nảy mầm hạt phấn mơi trường ni cấy vô trùng Thụ phấn thụ tinh điều kiện in vitro tạo hội sản xuất phơi lai lồi thực vật khơng thể lai phương pháp gây giống trồng truyền thống Trong tự nhiên, lai khác chi (intergeneric) lai khác lồi (interspecific) khó thành cơng có hàng rào gây trở ngại cho sinh trưởng ống phấn núm nhụy vòi nhụy Trong trường hợp vòi nhụy phần tách hạt phấn đặt bề mặt vết cắt bầu chuyển qua lỡ thành vịi nhụy đến bầu Kỹ thuật gọi thụ phấn bên bầu (intraovarian pollination) ứng dụng thành công nhiều loài Papaver somniferum, Eschscholtzia californica, Argemone mexicana A ochroleuca Một hướng khác nhằm vượt qua hàng rào để ống phấn sinh trưởng thụ phấn trực tiếp noãn in vitro (in vitro ovular pollination) noãn tách giá noãn (placenta) gọi thụ phấn giá noãn in vitro (in vitro placental pollination) Thụ phấn giá noãn ứng dụng thành cơng để vượt qua tính tự bất hợp (self-in compatibility) Petunia axillaris Các kỹ thuật khác phát triển nhằm loại bỏ hàng rào giai đoạn tiền hợp tử để thụ tinh, bao gồm: thụ phấn nụ (bud pollination), thụ phấn gốc (stub pollination), xử lý nhiệt vòi nhụy, chiếu xạ thụ phấn tổ hợp Phát triển hạt thơng qua thụ phấn in vitro nỗn trần mô tả “thụ tinh ống nghiệm” (test-tube fertilisation), trình tạo hạt nhờ thụ phấn núm nhụy nhụy hoa hồn chỉnh ni cấy in vitro xem “thụ phấn in vitro” (in vitro pollination) Ở hai trình này, thụ tinh trứng xuất bên noãn giao tử phân phối nhờ ống phấn Ngược lại, tượng “thụ tinh ống nghiệm” hệ thống động vật đòi hỏi dung hợp in vitro trứng tách rời nhờ tinh tử bơi tự (free floating sperms) gọi giao tử đực Thực tế, giao tử đực thực vật không bơi tự mà phân phối nhờ ống phấn Thuật ngữ chung “thụ phấn in vitro” dùng cho thụ phấn noãn (ovular pollination-gắn hạt phấn vào noãn tách rời), thụ phấn bầu (ovarian pollination-gắn hạt phấn vào bầu tách rời), thụ phấn giá nỗn (placental pollination-gắn hạt phấn vào nỗn đính giá noãn) thụ phấn núm nhụy (stigmatic pollination-gắn hạt phấn vào núm nhụy) điều kiện in vitro Thụ phấn ống nghiệm nghĩa thực trình tạo hợp tử khơng phụ thuộc vào thể mẹ Công việc bao gồm bước sau: - Kích thích hạt phấn nảy mầm - Kích thích sinh trưởng ống phấn - Ni nỗn thụ tinh nỗn - Nuôi hợp tử thành hạt Một thời gian dài phương pháp thụ phấn in vitro thành công số đối tượng thuộc họ thuốc phiện (Papaveraceae), họ cẩm chướng (Caryophyllaceae) họ cà (Solanaceae) Ở họ bầu chứa nhiều noãn nên tương đối dễ ni cấy Ở họ Hịa thảo (Poaceae) bầu có nỗn khó ni cấy, đồng thời hạt phấn khó kích thích nảy mầm Tuy nhiên, sau gần mười năm tập trung nghiên cứu người ta thu số kết đối tượng hòa thảo; Sladkas Havel (1976) bước đầu nghiên cứu ngô (Zea mays); Nitzsche Hennig (1976) nuôi thành công bầu Lobium thụ phấn với Festuca; Glunewald (1976) thụ phấn in vitro thành công noãn đại mạch hạt phấn mạch đen (Hordeum) lúa mì (Triticum) 3.3.1 Phương pháp thụ phấn in vitro 3.3.1.1 Nguyên liệu Hình 3.1 Cấu tạo hoa, bầu phơi Các bầu (ovaries) có nhiều noãn (ovules) nguyên liệu thực nghiệm tốt Ở loài thuộc họ Solanaceae (Nicotiana tabcum, N alata, N rustica, Petunia hybrida), họ Papaveraceae (Papaver somniferum, Eschscholtzia californica, Argemone mexicana) họ Caryophyllaceae (Melandrium album, M rubrum, Agrostemma githago, Dianthus caryophyllus), giá noãn bao phủ hàng trăm nỗn Do có số lượng lớn nỗn khơng bị tổn thương phân lập giá nỗn, nên góp phần vào thành công thụ phấn in vitro chúng phát triển hạt Một nguyên liệu thay khác hạt phấn (pollen), cần phải tạo sinh trưởng tốt ống phấn nuôi cấy, nảy mầm hạt phấn in vitro gặp khó khăn số họ khắc phục cách ngâm nỗn (ví dụ: Brassica oleracea) ngày trước thụ phấn CaCl2 1% nhân tố thích hợp cho sinh trưởng ống phấn Một số vấn đề quan trọng bỏ qua thụ phấn ống nghiệm là: tuổi bao phấn, cách giải phẩu bao phấn, nảy mầm ống phấn noãn, khả sống sót nỗn thụ tinh bên túi phơi Sự xâm nhập hồn tồn ống phấn vào lỡ nỗn quan sát kính hiển vi 3.3.1.2 Khử trùng nguyên liệu Các nụ hoa sử dụng cho nuôi cấy trước bao phấn giai đoạn nứt Các nhụy hoa (pistils) sau loại bỏ đài tràng hoa, bầu riêng rẽ, khử trùng sơ cách rửa nhanh với EtOH 70%, khử trùng bề mặt tác nhân thích hợp, cuối rửa nước cất vơ trùng Bầu sau bóc vỏ cẩn thận dao mổ, forcep, kim để lộ phần noãn gắn vào giá noãn Giá noãn hồn tồn, phần có mang nỗn, dùng thụ phấn giá noãn Để thực thụ phấn núm nhụy in vitro, nhụy tách rời khử trùng cẩn thận bề mặt dung dịch khử trùng sau thấm khơ núm nhụy Hình 3.2 Qui trình ni cấy bao phấn lúa Phân lập hạt phấn điều kiện vô trùng, bao phấn loại bỏ khỏi nụ hoa hoa mở giữ đĩa petri có giấy lọc vô trùng nứt ra, hạt phấn sau đặt nỗn ni cấy, giá noãn núm nhụy tùy thuộc vào chất thí nghiệm Nói chung, hạt phấn đặt trực tiếp lên phận nhụy nuôi cấy tốt dàn trải mơi trường chung quanh nỗn 3.3.1.3 Ni cấy noãn bầu - Noãn Sinh trưởng ống phấn gắn noãn trần (bare ovules) thường bị ức chế có mặt nước bề mặt nỗn Màng nước phải làm khơ giấy lọc sau đó, nỗn khơ phủ hạt phấn Các hạt phát triển từ noãn có phơi hình cầu phơi già dễ dàng phân biệt, số kết đạt Gynandrophát sinhis gynandra, Impatiens balsamina, Nicotiana tabacum Allium cepa Tuy nhiên, noãn sau thụ phấn in vitro mang hợp tử đơn bào (single-celled zygote) cần điều kiện sinh trưởng phức tạp Kỹ thuật cho noãn tự thụ phấn thụ phấn chéo giống Trong phát triển giai đoạn phát sinh phơi nỗn tự thụ phấn thường giữ giá noãn tạo thành hạt, ngược lại noãn thụ phấn chéo cần giá nỗn từ 6-8 ngày ni cấy Sau đó, chúng chuyển tới mơi trường ni khơng có giá nỗn - Bầu qua Kỹ thuật nuôi cấy bầu phát triển Nitsch (1951), ông nuôi thành công bầu tách từ hoa thụ phấn in vitro để phát triển thành chín (Cucumis Lycopersicum) Các mang hạt nảy mầm chúng có kích thước nhỏ phát triển điều kiện tự nhiên Các tác giả khác nuôi cấy thành cơng nỗn tách rời từ số lồi (Linaria macroccana, Tropaeolum majus, Iberis amara, Hyoscyamus niger) môi trường chứa muối khoáng sucrose Bổ sung vitamin B vào mơi trường giúp đạt kích thước bình thường hạt nảy mầm Các mơi trường nuôi cấy ngày giàu dinh dưỡng bổ sung IAA nước dừa, chí cho có kích thước lớn hình thành điều kiện in vivo (Anethum graveolens) Thành phần bao hoa mày hoa bắc có vai trị quan trọng phát triển phôi mầm Các bầu tách rời sớm sau thụ phấn Triticum aestivum T spelta phát triển q trình ni cấy bao hoa trì nguyên vẹn Nếu thiếu nhân tố này, tổng hợp DNA kéo dài tế bào tế bào phơi lúa mạch xảy phân chia tế bào không xuất Hình 3.3 Qui trình nhân nhanh giống rừng nuôi cấy phôi từ hạt 3.3.2 Các nhân tố ảnh hưởng hình thành hạt sau thụ phấn in vitro 3.3.2.1 Trạng thái sinh lý mẫu vật Trạng thái sinh lý nhụy thời điểm tách rời nỗn ảnh hưởng đến hình thành hạt sau thụ phấn in vitro Bề mặt noãn núm nhụy (trong thụ phấn núm nhụy) ẩm ướt ảnh hưởng xấu đến nảy mầm hạt phấn phát triển ống phấn hình thành hạt Sự nảy mầm hạt phấn núm nhụy sinh trưởng ống phấn dọc theo vịi nhụy có ảnh hưởng đến tổng hợp protein, nhân tố đơi ức chế hoàn toàn ống phấn bầu Do đó, cần phải xác định phận nhụy tồn hàng rào ngăn cản Để cải thiện khả thụ phấn in vitro, mức độ bất hợp phải giảm xuống cách tách phận tổng hợp protein ức chế thụ phấn trực tiếp phần cịn lại nhụy điều kiện thí nghiệm Thời gian tách noãn khỏi nhụy ảnh hưởng đến hình thành hạt sau thụ phấn in vitro Các noãn tách sau nở hoa từ 1-2 ngày cho khả hình thành hạt cao tách nỗn vào ngày hoa Ở ngơ bơng, thụ phấn in vitro sau xuất râu tơ từ 3-4 ngày cho kết tạo hạt tốt 3.3.2.2 Môi trường nuôi cấy Maheshwari (1958) nuôi cấy thành cơng nỗn mơi trường dinh dưỡng bao gồm muối khoáng theo Nitsch, vitamin theo White , 5% sucrose Noãn Papaver rhoeas P somniferum tách ngày sau thụ phấn (DAP- days after pollination) thu hợp tử tiền phơi có hai tế bào (two-celled proembryo) chứa vài nhân nội nhũ (endosperm nuclei) Sinh trưởng phôi giai đoạn đầu thấp sau giai đoạn hình cầu sinh trưởng nhanh đạt kích thước 0,93 mm so với 0,65 mm phôi in vivo Bổ sung kinetin CH cần thiết để kích thích sinh trưởng ban đầu phơi Một số nỗn hoa lan (orchids) phân lập từ bầu thụ phấn sinh trưởng tốt dung dịch đơn giản có sucrose 10%, nỗn Zephyranthes (mang hợp tử nhân nội nhũ sơ cấp) cần bổ sung nước dừa casamino acid vào môi trường Nitsch Ở Trifolium repens, noãn (1-2 DAP) phát triển thành hạt trưởng thành môi trường nuôi cấy bổ sung dịch chiết loại non dưa chuột dưa hấu Trong nuôi cấy in vitro nỗn thụ phấn hầu hết lồi mơi trường Nitsch có cải biến sử dụng rộng rãi Tuy nhiên, môi trường Steward Hsu (S-H) thích hợp cho ni cấy thể lai lồi khác lồi sau thụ tinh nỗn non Mơi trường ni cấy chứa IAA 10 µg/L kinetin 0,1 µg/L làm tăng số lượng hạt tạo thành từ noãn Nồng độ cao kinetin thường gây ức chế Nguồn nitrogen (hỗn hợp amino acid hồn chỉnh) khơng ảnh hưởng đến tần số thụ tinh bầu ngô thụ phấn in vitro, cần thiết cho sinh trưởng phát triển tối thích hạt Áp lực tthẩm thấu môi trường ảnh hưởng đến phát triển nỗn tách rời, nỗn chứa phơi hình cầu phát triển thành hạt trưởng thành môi trường chứa sucrose từ 4-10%, noãn non thụ tinh có hợp tử vài nhân nội nhũ, noãn vừa thụ tinh cần 6% 8% sucrose 3.3.2.3 Điều kiện ni cấy Nói chung, nhiệt độ ánh sáng có ảnh hưởng đến q trình thụ tinh ống nghiệm Thơng thường bước trình xảy nhiệt độ phịng khơng cần chiếu sáng đặc biệt Chỉ giai đoạn sau, nuôi cấy bầu cần trì 22-26 oC điều kiện thích hợp khác có lợi cho phát sinh phơi Sau thụ phấn ống nghiệm vài ngày, số nỗn mở rộng, ống phấn chui hồn tồn vào túi phôi, phôi lẫn nội nhũ phát triển Hiện tượng xác minh thí nghiệm tế bào-phơi học (cytoembryology) Bang 3.1 Mơi trường Nitsch-sửdụng phổbiến nuôi cấy các noãn thụ phấn in vitro Thành phần Nồng độ (mg/L) Thành phần Nồng độ (mg/L) CaNO3 KNO3 KH2PO4 MgSO4.7H2O CuSO4.5H2O Na2MoO4 ZnSO4.7H2O MnSO4.4H2O H3BO3 500 125 125 125 0,025 0,025 0,5 0,5 FeC6O5H7.5H2O Glycine Ca-pantothenate Pyridoxine HCl Thiamine HCl Niacin Sucrose Agar 10 7,5 0,25 0,25 0,25 1,25 50000 7000 Bang 3.2 Môi trường Steward Hsu (S-H)-ni cấy các thểlai cùng lồi vàkhác loài từcác noãn non được thụtinh Thành phần Nồng độ (mg/L) Thành phần Nồng độ (mg/L) 8,6 KHả NĂNGO3 NH4NO3 KH2PO4 MgSO4.7H2O CaCl2.2H2O FeSO4.7H2O Na2-EDTA CuSO4.5H2O 5055 1200 272 493 441 8,3 11 0,025 KI MnSO4.4H2O H3BO3 Acid nicotinic Pyridoxine HCl Thiamine HCl Inositol D-Fructose 0,83 16,9 6,18 0,49 0,82 1,35 180 CoCl2.6H2O Na2MoO4.2H2O ZnSO4.7H2O 0,024 0,24 Sucrose IAA 3600 40000  10-5 mol/L Bang 3.3 Môi trường Gengenbach cóhỡn hợp các amino acid hồn chỉnh-cần thiết cho sinh trưởng vàphát triển tối thích của hạt ngô Thành phần Nồng độ Thành phần Nồng độ KH2PO4 MgCl2.6H2O CaCl2.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O Fe-EDTA Na2MoO4.2H2O ZnSO4.7H2O KI MnSO4.4H2O H3BO3 Glycine Thiamine HCl Acid folic Niacin Sucrose IAA Agar Aspartate 3750* 1500* 1200* 0,1* 0,1* 50* 1* 10* 5* 100* 100* 168** 0,4** 0,044** 1,2** 150*** Threonine Serine Glutamate Proline Alanine Cystein Valine Methionine Isoleucine Leucine Tyrosine Phenylalanine Lysine Histidine Arginine Asparagine Glutamine Tryptophan 198** 347** 1761** 621** 476** 160** 330** 117** 237** 1009** 262** 387** 88** 164** 150** 300** 292** 204** 5,5*** 500** Chú thích: * : µmol/L, ** : mg/L, *** : g/L 3.3.2.4 Kiểu gen Phản ứng bầu in vitro mối liên quan với hình thành hạt tùy thuộc vào loài Hạt phấn lồi họ cải khó nảy mầm ni cấy người ta phải cải tiến kỹ thuật nuôi cấy cho phù hợp cách nhúng noãn Brassica oleracea dung dịch CaCl2 1%, sau gieo chúng lớp gelatin 10% mỏng (10 µm) thụ phấn với hạt phấn Lớp gelatin mỏng bảo quản đĩa petri có phủ giấy lọc gắn vào nắp hộp Sau 24 ni, nỗn thụ tinh chuyển lên mơi trường Nitsch có agar tạo hạt 3.3.3 Ứng dụng thụ phấn in vitro Được ứng dụng lĩnh vực: vượt qua tự bất hợp (self-in compability), vượt qua bất hợp lai (cross-inuôi cấyompability) giao tử sản xuất thể đơn bội thông qua trinh sản (parthenogenesis) Các loài Petunia axillaris P hybrida tự bất hợp Hạt phấn nảy mầm tốt nhụy tự thụ phấn tồn hàng rào ngăn cản bầu cản trở phát triển ống phấn, làm cho ống phấn thụ tinh với noãn Các hàng rào taxon vượt qua thụ phấn in vitro hình thành hạt xuất bình thường Ở lồi P axillaris tính bất hợp vượt qua nhờ thụ phấn nụ hoa in vivo (in vivo bud pollination) Ni cấy thành cơng nỗn thụ phấn in vitro tăng khả sản xuất thể lai Lai loài (intraspecific), khác loài (interspecific), khác chi (intergeneric) khác họ (interfamilia) tiến hành thơng qua thụ phấn giá nỗn noãn in vitro Một ứng dụng khác thụ phấn in vitro sản xuất thể đơn bội Mimulus luteus cv Tigrinus grandiflorus cách thụ phấn nỗn tách tời với Torenia fournieri Thể đơn bội M luteus phát triển trinh sản Sự phát triển trinh sản thể đơn bội ni cấy từ nỗn thụ phấn không thụ tinh thông báo loài Hordeum vulgare, Nicotiana tabacum Triticum aestivum 3.4 Nhân giống trồng qua nuôi cấy phát sinh phôi 3.4.1 Các kiểu nuôi cấy phôi 3.4.1.1 Nuôi cấy phôi non Kiểu nuôi cấy dùng chủ yếu cho phơi non có nguồn gốc từ hạt lai hạt non nảy mầm Tách phơi khó khăn mơi trường nuôi cấy chúng phức tạp Cơ hội thành công loại nuôi cấy phụ thuộc lớn vào giai đoạn phát triển phôi phân lập 3.4.1.2 Nuôi cấy phôi trưởng thành Các phôi trưởng thành tách từ hạt chín ni cấy, chủ yếu để tránh ức chế hạt nảy mầm Kiểu nuôi cấy tương đối dễ dàng phơi cần mơi trường dinh dưỡng đơn giản chứa muối khoáng, đường agar để sinh trưởng phát triển Để thu phôi tuổi đặc biệt, thụ phấn nhân tạo hoa cần thiết người ta có khả xây dựng mối quan hệ giai đoạn sinh trưởng khác phát triển phôi với DAP 3.4.2 Kỹ thuật nuôi cấy 3.4.2.1 Khử trùng bề mặt Phôi thực vật có hạt thường phát triển bên nỗn bao bọc bầu Vốn chúng tồn sẵn mơi trường vơ trùng khử trùng bề mặt phôi không cần thiết trừ vỏ hạt bị tổn thương xuất nhiễm hệ thống Vì hạt trưởng thành, nỗn nguyên vẹn, khử trùng bề mặt phôi vô trùng tách khỏi mô chung quanh Khử trùng bề mặt tiến hành cách ngâm nguyên liệu vào dung dịch khử trùng thương mại có hypochlorite (Clorox 5-10%, sodium calcium hypochlorite 0,45%) 5-10 phút EtOH (70-75%) phút Nồng độ thấp chất hoạt dịch (surfactant) Tween 20, Tween 80, Teepol, Mannoxol bổ sung vào dung dịch khử trùng làm tăng tính thấm mơ Đối với hạt ngô, phôi tách rời: ngâm EtOH 70% cộng với 5-10 phút khử trùng sodium hypochlorite 2,6% 3.4.2.2 Phân lập phôi Phân lập phôi phải thực điều kiện vô trùng laminar (laminar air flow hood) Phôi trưởng thành phân lập tương đối dễ cách giải phẩu hạt Ngâm hạt có vỏ cứng (Iris, Cyclamen) nước từ vài đến vài ngày trước khử trùng để giải phẩu dễ dàng Phân lập phơi nhỏ phơi non địi hỏi giải phẩu phải đặc biệt cẩn thận chúng bọc nội nhũ dạng lỏng Trong trường hợp cần mở rãnh đầu lỡ nỗn nỗn non gây áp lực gây đầu đối diện để thu phôi thông qua rãnh nứt 3.4.2.3 Môi trường dinh dưỡng Nhu cầu dinh dưỡng phơi q trình phát triển in vivo chia làm hai pha: pha dị dưỡng (heterotrophic phase)-pha sớm, pha phôi nhận chất dinh dưỡng từ nội nhũ pha tự dưỡng (autotrophic phase)-pha muộn, pha phơi có khả tổng hợp chất cần thiết cho sinh trưởng chúng Giai đoạn phôi chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang trạng thái tự dưỡng khác tùy lồi Thành phần mơi trường cho sinh trưởng phôi non chưa trưởng thành khác với phôi trưởng thành Monnier (1976), xây dựng phương pháp cho phép phát triển hồn chỉnh phơi non Caphát sinhella (giai đoạn hình cầu sớm) nảy mầm mà không cần chuyển chúng khỏi vị trí ni cấy đĩa petri Theo hướng này, Không cs (1983) thu sinh trưởng liên tục phôi chưa trưởng thành lúa Hình 3.4 Phương pháp ni cấy phơi non nảy mầm mà không cần chuyển chúng khỏi vị trí ni cấy đĩa petri a Muối khoáng Các chất dinh dưỡng môi trường MS, B5 White có cải biến định sử dụng cho hầu hết thí nghiệm ni cấy phơi Chẳng hạn, môi trường nuôi cấy phôi Caphát sinhella có nồng độ potassium cao (bổ sung 350 mg/L KCl) nồng độ calcium (CaCl 2) gấp đôi, nồng độ NH4NO3 Fe-EDTA giảm gần nửa, nồng độ muối vi lượng theo MS gấp đôi b Nguồn carbon Sucrose nguồn carbon chủ yếu sử dụng để cung cấp lượng cho phôi nuôi cấy in vitro Trong nuôi cấy phôi số lồi (ví dụ: ngơ) cần bổ sung maltose, lactose, raffinose, mannitol Một số loài thuộc họ Rosaceae loài lai thuộc chi Lilium bổ sung glucose tỏ có ưu sucrose Phơi Heracleum spondylum sinh trưởng hiệu môi trường chứa glucose, fructose, galactose, mannose, mannitol Glucose cần thiết cho sinh trưởng rễ phôi Ginkgo trưởng thành Glucose sucrose ngồi vai trị dinh dưỡng, cịn có khả trì áp suất thẩm thấu mơi trường (phải lưu ý đến tuổi phôi) Phôi trưởng thành sinh trưởng tốt nồng độ sucrose thấp phơi non thường địi hỏi nồng độ carbonhydrate cao Nói chung, nồng độ khác sucrose dùng nuôi cấy phôi phụ thuộc vào lồi kích thước/tuổi phơi c Nguồn nitrogen Phơi có hệ thống enzyme tốt biến đổi nitrite thành nitrate sau thành amonium Amonium nitrate có ưu quan trọng so với KNO 3, NaNO3 (NH4)2HPO4 Sự có mặt ion NH4+ cần thiết cho sinh trưởng phân hóa phôi Các amino acid khác amide chúng thử nghiệm cho nuôi cấy phôi Một số tác giả cho asparagine tăng khả sinh trưởng phôi, tác giả khác lại thấy glutamine nguồn nitrogen có ưu sinh trưởng cho phơi số lồi (ví dụ: Caphát sinhella bursa-pastoris, Arabidophát sinhis thaliana, Reseda odorata) asparagine lại ức chế mạnh sinh trưởng chúng Các amino acid khác có tác dụng kích thích ức chế Dịch thủy phân casein (CH), phức hợp amino acid, sử dụng rộng rãi để bổ sung vào môi trường nuôi cấy phôi Nồng độ CH tối ưu cho Hoderum vulgare khoảng 500 mg/L, phôi Datura tatula sinh trưởng nồng độ CH 50 mg/L Các amino acid, CH amide khử trùng autoclave với chất dinh dưỡng môi truờng d Dịch chiết thực vật tự nhiên Nếu môi trường bổ sung thêm nước dừa không khử trùng autoclave, phôi tăng chiều dài khơng có dấu hiệu nảy mầm sớm Nhiều tác giả gợi ý có mặt “nhân tố phơi” (embryo factor) nội nhũ dạng lỏng nước dừa thay cho thiếu hụt đường, amino acid, hormone sinh trưởng chất khác mơi trường ni cấy Nước dừa có hiệu kích thích sinh trưởng phơi non tách rời mía đường, lúa mạch, cà chua, cà rốt loài dương xỉ Các dịch chiết tự nhiên từ phần mơ lồi thực vật kích thích sinh trưởng phơi ức chế nảy mầm sớm phôi lúa mạch chưa trưởng thành cách bổ sung vào môi trường nuôi cấy dịch chiết chuối, dịch chiết chà là, dịch thủy phân lúa mì-gluten dịch chiết cà chua Các dịch chiết có hiệu tương tự nước dừa Dịch chiết Datura Sechium có hiệu nước dừa, dịch chiết từ hạt Lupinus lại có hiệu gấp đơi Người ta cố gắng thay “nhân tố phơi” nước dừa hóa chất xác định Để kích thích sinh trưởng tiền phơi lúa mạch, nước dừa thay mơi trường White giàu phosphate bổ sung thêm hai amino acid glutamine alanine năm amino acid khác có vai trị nguồn cung cấp nitrogen, pH 4,5 Tỷ lệ sống sót phơi tăng lên nồng độ KCl, KNO3 thành phần hữu định tăng lên từ 5-10 lần e Các chất điều khiển sinh trưởng Auxin cytokinin không sử dụng nhiều nuôi cấy phôi chúng cảm ứng tạo callus Ở nồng độ thấp (0,01 mg/L) GA kích thích phát sinh phơi phơi non lúa mạch mà không cần cảm ứng nảy mầm sớm, kích thích sinh trưởng phơi tách rời dạng hình tim Phaseolus Cũng có số kết cho ABA có hiệu tương tự phôi lúa mạch Phaseolus f pH môi trường Các phơi tách rời sinh trưởng tốt mơi trường có pH 5,0-7,5 Đây phạm vi pH dịch noãn (6,0) Nói chung pH mơi trường điều chỉnh 0,5 đơn vị cao giá trị pH mong muốn để bù đắp cho thay đổi điều chỉnh q trình khử trùng g Điều kiện ni cấy Nói chung nhiệt độ 25 ± 2oC thích hợp cho sinh trưởng nảy mầm phôi Một nhiệt độ tối ưu cho ni cấy phơi khác genotype loài Các lồi Zamia, Phaseolus, bơng thích hợp với nhiệt độ ấm (27-30 oC), nhiệt độ nuôi cấy phôi lồi lai Brassica, lúa, lúa mạch thích hợp từ 17-22oC Trước đây, nhiều tác giả cho ánh sáng không ảnh hưởng nhiều đến sinh trưởng phôi in vitro, nghiên cứu gần nuôi cấy phơi chưa trưởng thành lúa mạch, lanh, lồi lai Aegilopst × Hordeum, cá thể lai khác loài Allium lại tiến hành tối trước chuyển chúng sang điều kiện sáng để nảy mầm Các phơi sơ cấp dạng hình tim lồi Ilex mẫn cảm với ánh sáng Các phôi thứ cấp khó sinh trưởng hoạt động chúng tách rời nuôi điều kiện chiếu sáng 4.000 lux chiếu sáng suốt ngày nuôi Nhiều tác giả cho nuôi tối giai đoạn ban đầu (bốn ngày) cần thiết theo chúng sinh trưởng tới giai đoạn trưởng thành chí điều kiện chiếu sáng liên tục 3.4.3 Một số khó khăn nuôi cấy phôi 3.4.3.1 Môi trường dinh dưỡng Các môi trường dinh dưỡng sử dụng thường có áp suất thẩm thấu thấp dịch nỗn ni cấy mơi trường Rất mơi trường khơng hồn tồn thích hợp Vì vậy, người ta tìm cách sử dụng dịch chiết xuất từ nội nhũ để đưa cơng thức mơi trường thích hợp hơn, chẳng hạn: - Môi trường dinh dưỡng - Nội nhũ khoẻ - Phơi lai Nội nhũ khỏe cung cấp cho phôi lai chất cần thiết Cây cho nội nhũ lồi khác chi 3.4.3.2 Phát sinh callus Khi nuôi phơi non tổ hợp lai: Hordedum vulgare × Secale cerale, người ta thấy phôi phát triển thành khối callus Điều giải thích mối tương tác phôi môi trường dinh dưỡng khơng bình thường phơi nội nhũ Dù sau tái sinh hồn chỉnh từ khối callus tái sinh mang nhiều thay đổi callus thường khơng ổn định mặt di truyền Ternovsky cs (1976) đạt kết lý thú thu thuốc có tính chống chịu ni phơi từ hạt lai không nảy mầm 3.5 Nuôi cấy tế bào phôi tâm (nucellar) Rangaswamy (1959) người công bố nuôi cấy mô phôi tâm- nucellar Citrus Khi nuôi cấy môi trường bổ sung casein, tế bào nucellar C microcarpa tạo mơ sẹo, phân hố mạnh thành “pseudobulbils” (dạng giả củ) từ phát triển thành (Rangaswamy, 1959) Randhawa cộng (1960) tạo phơi thành cơng có múi đơn phơi C grandis, C limon C reticulata x C sinensis Không giống C microcarpa C reticulata, có nguồn gốc nucellar hình thành phơi cách trực tiếp Bitter cộng (1963) mở rộng nghiên cứu sang có múi không hạt, đơn phôi đa phôi C temple, C reticulata, C limon (chanh Meyer), C maxima, C sinensis (Robertson navel), C latipes C latifolia (chanh không hạt) 3.5.1 Sự phát triển phôi nucellar Ở số giống Citrus, ngồi phơi hữu tính cịn có phôi không sinh từ tế bào túi phôi mà từ tế bào soma phôi tâm (nucellus) lớp tế bào bao quanh túi phôi hạt non Sau tế bào trứng nằm túi phôi thụ tinh phân chia lần thứ nhất, phơi tâm có số tế bào lớn với nhân to nguyên sinh chất đậm đặc Một số tế bào bắt đầu phân chia, tạo khối nhỏ hình thành phơi vơ tính Phơi vơ tính phát triển song song với phơi hữu tính cịn gọi phôi nucellar (Toxopeus, 1930) Phôi nucellar phát triển phân bào nguyên phân bình thường tế bào nucellus, khơng có tham gia tế bào sinh dục không xảy phân bào giảm nhiễm tế bào mẹ Vì vậy, phát triển từ phôi nucellar thường giống hệt với mẹ cấu trúc di truyền Sự sinh sản vơ tính có ý nghĩa quan trọng tiến hố, chọn tạo giống có múi 3.5.2 Ni cấy tế bào nucellar sự hình thành phơi từ nucellar điều kiện in vitro Các bước chuẩn bị nuôi cấy mô tế bào phôi tâm - nucellar in vitro sau: 11 Bao kín nụ hoa vào ngày hoa nở để tránh pha tạp di truyền mẫu cấy 22 Khử đực thụ phấn với phấn cam ba (P trifoliata) Lý việc thụ phấn có kiểm sốt tạo đánh dấu khác biệt dễ nhận biết sau Vì tất từ hợp tử (phơi hữu tính) mang ba thuỳ giống mẹ, khác với có nguồn gốc nucellar 33 Thu hạt từ non thời điểm khác (tuần) để xác định giai đoạn thích hợp cho ni cấy Việc lựa chọn thời gian thu mẫu thay đổi tuỳ theo giống 44 Sau xác định thời điểm tối ưu nhất, hái phát triển, rửa sạch, khử trùng bề mặt hypoclorit canxi 10-15 phút, rửa lại nước cất vô trùng ba lần 55 Cắt đôi điều kiện vô trùng Tách hạt non, bỏ vỏ lụa, lấy phần lại hạt đem nuôi cấy cắt hạt non theo chiều dọc quan sát kính hiển vi soi Loại bỏ phôi hợp tử nội nhũ Gắp nucellus đặt vào môi trường nuôi cấy 66 Môi trường nuôi cấy tế bào nucellar môi trường MS bổ sung thêm auxin, cytokinin phụ gia khác casein hydrolysate hay dịch chiết malt cần, tuỳ thuộc vào lồi ni cấy (Bảng 16) 77 Mẫu cấy giữ điều kiện nhiệt độ 25 oC, độ ẩm 50-60% chế độ ánh sáng 16h sáng/ 8h tối ánh sáng khuếch tán (1000 - 1500 lux) Khi mơ sẹo hình thành, cấy chuyển sang môi trường (Murashige Tucker, 1969) Thời gian lần cấy chuyển 3- tuần/ lần Các chồi hình thành cấy chuyển sang môi trường chứa axit gibberellic (1- mg/l) 10 Để kích thích hình thành rễ, ni chồi môi trường lỏng thông qua cầu giấy lọc 411 Cấy chuyển có rễ phát triển tốt bầu (chậu) với hỗn hợp đất vô trùng che túi nhựa để giữ ẩm 512 Tuỳ thuộc vào phát triển cây, cấy chuyển nhà kính đảm bảo độ ẩm cao - ngày bỏ túi nhựa giữ ẩm Bang 3.4 Các chất bổ sung môi trường sử dụng để kích thích sự tạo phôi từ tế bào nucellar điều kiện in vitro Giống Chất bổ sung (mg/l) C microcarpa Casein hydrolysate (400) C reticulata x C sinensis (Temple orange) Adenin sulfat (25), NAA (0.5) C grandis pummello) Casein hydrolysate (500) (Pong yau C limon (Ponderosa lemon) Chiết xuất malt (500) C sinensis navel) Axit ascorbic (40), nước dừa (15%), (Washington C sinensis Shamouti) Adenin sulfat (40), chiết xuất malt (400), casein hydrolysate (400) (Valencia, Chiết xuất malt (500), kinetin (0,1-1,0), IAA (0,1-1,0), nước dừa (15%), GA3 (1) C aurantifolia NAA (0,1) C sinensis Adenin sulfat (25-50), kinetin (0,5-2,0), casein hydrolysate (200 -600), chiết xuất malt (100-300), nước dừa (15%) C sinensis (Hamlin, Pell navel, Pineapple) Chiết xuất malt (500), 2,4-D (0,01) C paradissi seedless) BAP (0,1) (Marsh C reticulata (Owari) Daminozide (0,1) 3.6 Chọn tạo giống sạch bệnh từ phôi vô tính (trường hợp ăn qua có múi Citrus) 3.6.1.Hiện tượng đa phôi ứng dụng chọn tạo giống bệnh Đa phơi tượng có từ hai phơi trở lên hạt, Citrus có hai kiểu đa phơi: 1- Nhiều phơi vơ tính hình thành từ lớp tế bào nucellar noãn mẹ; 2- Hai nhiều phơi hữu tính hình thành phân chia trứng thụ tinh (hiện tượng đa phôi trứng) có nhiều trứng thụ tinh nỗn (đa phơi khác trứng) 3.6.2.Phơi vơ tính Phơi vơ tính phơi hình thành từ tế bào soma nucellar (khơng có tham gia giảm phân thụ tinh giao tử đực, cái) Do vậy, từ phơi vơ tính giống hệt với mẹ cấu trúc di truyền tính trạng sinh học khác (trừ trường hợp có biến dị tế bào soma) Phơi vơ tính cịn gọi phơi soma (somatic embryo), hay phôi sinh dưỡng (vegetative embryo), có múi cịn gọi phơi nucellar hay phơi tâm Hình 3.5 Hình dạng hạt phấn số loại trồng Hơn 200 loài trồng nhân giống phơi vơ tính (Nishimura cs, 1993) Phơi vơ tính tái sinh từ tế bào mơ sẹo phơi hố in vitro Phơi vơ tính sau làm khơ bảo quản lâu dài cho nảy mầm vào thời vụ thích hợp Hạt nhân tạo hình thành từ phơi vơ tính gieo máy gieo hạt Nhân giống số nhọn thông từ hạt nhân tạo đạt quy mô công nghiệp (Attree and Fowke, 1993) Nhân giống phơi vơ tính có ưu điểm sau: - Hệ số nhân giống cao Các mô tế bào sinh dưỡng ni cấy in vitro tạo phơi vơ tính cách trực tiếp thơng qua giai đoạn trung gian mô sẹo Tế bào mô sẹo phân chia theo cấp số nhân phân hố thành phơi vơ tính tạo số lượng phơi vơ tính khổng lồ thời gian ngắn Ví dụ, cà phê người ta tạo 600.000 phơi vơ tính từ gram sinh khối ban đầu vài tháng với tỷ lệ tái sinh từ phơi vơ tính đạt 47% (Ducos cs, 1993) - Phơi vơ tính chứa lượng chất dinh dưỡng tương tự với nội nhũ phơi hữu tính, có mầm chóp rễ chồi đỉnh, nảy mầm trực tiếp thành (Ammirrato, 1983) - Phơi vơ tính sau tạo hạt nhân tạo bảo quản lưu giữ dài hạn 1- Khả cơng nghiệp hố tự động hố q trình nhân giống quy mô lớn, đặc biệt nhân giống bioreactor (Takayama and Akita , 1994) Các yếu tố di truyền, đặc tính mơ ni cấy, thành phần mơi trường yếu tố hố lý khác có tác động mạnh mẽ lên q trình phân hố tế bào thành phơi vơ tính Thidiazuron chất có hoạt tính cực mạnh tạo phơi vơ tính số trồng, đặc biệt lâm nghiệp ăn (Huetteman Preece, 1993), chè (Sandal cs., 2001) Kỹ thuật tạo phôi vô tính áp dụng thành cơng nhân nhanh hàng loạt trồng, ví dụ: nhân giống xoan ấn Độ (Azadirach thaindica A Jus.) (Murthy and Saxena, 1998), thông (Garin cs.,1998), đu đủ (Jordan and Velozo, 1996; Castllo cs, 1998), loa kèn (Tribulato cs.1997) 3.6.3 Phơi hữu tính Phôi tạo thụ tinh tế bào trứng giao tử đực (do lai tự thụ) Phơi hữu tính có tên gọi phơi sinh sản (generative), phôi hợp tử (zygotic) hay phôi giao tử (gametic) Tên thông dụng phôi hợp tử Hiện tượng đa phơi có múi nhiều tác giả nghiên cứu Số phơi trung bình hạt phụ thuộc chặt chẽ vào giống (genotype) điều kiện ni cấy Do vậy, giống có múi chia thành giống đơn phôi giống đa phôi Các giống đa phôi khác nhau, vài giống hầu hết hạt có từ hai phơi trở lên, đa số giống có tỷ lệ nhỏ hạt đa phôi Các phôi hạt đa phơi thường có kích thước hình dạng mầm khác Số lượng phôi trung bình hạt thường lớn nhiều so với số nảy mầm từ hạt Cây thường hình thành từ phơi lớn Nhiều thí nghiệm cho thấy phơi vơ tính hạt khơng hình thành thụ tinh thụ phấn có ý nghĩa kích thích hình thành phơi vơ tính Trong số trường hợp, giống bất tự hoà hợp, có thụ phấn ống phấn khơng mọc nên thụ tinh không xảy Kết vài hạt lép tạo thành Các hạt lép tạo từ lớp tế bào nucellar kích thích ống phấn khơng có thụ tinh nên nội nhũ hạt không phát triển dẫn đến lép (Nagai Tanikawa, 1928) Trong nuôi cấy in vitro, phơi vơ tính hạt lép dễ dàng tái sinh thành Frost Soost (1968) tổng hợp nghiên cứu tượng đa phôi 53 giống có múi khác cho biết đa phôi tương phổ biến đa số giống lồi có múi, riêng 11 giống thuộc nhóm bưởi pumelo khơng thấy tượng đa phơi Tính đa phơi xem đặc điểm phân biệt bưởi pummelo với nhóm bưởi grapefruit Trong nhóm quýt C reticulata, nhiều giống bao gồm Ponkan, Satsuma có nhiều phơi tỷ lệ phơi vơ tính cao Giống quýt King (nguồn gốc châu - dạng cam Sành) có tỷ lệ hạt đa phơi tỷ lệ từ phơi vơ tính thấp, giống Kunenbo tương tự giống King (có nguồn gốc từ Nhật Bản) lại có tỷ lệ đa phơi cao (Tanaka, 1954) hay giống Kinnow Kara (giống King bố mẹ hai giống này) lại có nhiều phơi hạt tỷ lệ mọc từ phơi hữu tính thấp, chí khơng có phơi hữu tính Giống Wilking Kinuôi cấy (giống King bố mẹ giống này) lại giống đơn phôi khơng có phơi vơ tính Giống Temple Clementine (là giống lai không rõ bố mẹ) giống đơn phơi có phơi hữu tính Rất nhiều giống quýt đơn phơi (monoembryonic) Trong nhóm cam C sinensis, số phơi hạt thường trung bình cao Số phơi vơ tính thường cao đa số giống, khơng có giống đơn phơi nhóm Các giống bưởi quý nước ta chủ yếu thuộc nhóm pummelo đơn phơi 3.6.4.Sự tương tác phơi vơ tính phơi hữu tính Trong hạt có đến từ đến 3, đơi phơi chí phơi, số phơi nảy mầm thành thường thấp Trong trình phát triển, phơi vơ tính phơi hữu tính cạnh tranh với Đối với nhiều giống, hạt thường nảy mầm thành đến vài từ phôi vô tính, khơng thấy phơi hữu tính tái sinh thành Phơi hữu tính tỏ yếu so với phơi vơ tính Kết tất mọc từ hạt phơi vơ tính Ngược lại, nhiều hạt đa phôi lại phơi vơ tính Khi tiến hành thí nghiệm lai ba giống đơn phôi Clementine, Wilking Siamese với phấn hoa giống cam ba lá, tính trạng ba chẽ tính trạng trội, Ozsan Cameron (1963) nhận nhiều hạt đa phôi, tất phơi hữu tính (mang tính trạng trội cam ba lá) Trong nhiều trường hợp, hai ba phôi hạt phôi hữu tính 3.6.5 Những đặc tính từ phơi vơ tính 1- Giống mẹ ban đầu mặt di truyền đặc tính nơng học khác Phơi vơ tính bảo tồn đặc tính ưu lai mẹ mẹ có ưu lai cao 2- Không mang theo bệnh virus chủ yếu mà mẹ nhiễm phải Do vậy, từ phơi vơ tính gần bệnh hồn tồn Cho đến nay, loại bệnh virus lây truyền qua hạt, có múi thấy có hai loại bệnh virus, blind pocket chảy gơm (concave gum) có khả truyền qua hạt (Tucker, 1993) Trong thực tiễn sản xuất, tạo từ phơi vơ tính phương pháp truyền thống có giá trị tạo giống bệnh có múi 3.6.6 Các phương pháp nhận biết từ phơi vơ tính 1 Có giống hệt mẹ trường hợp sau: 1+ Cây mẹ lai dị hợp tử 2+ Cây mẹ thụ phấn chéo với giống cho phấn khác 3+ Cây mẹ giống tam bội, lệch bội 2 Khi so sánh từ dòng lai F1 (lai với bố mẹ khác nhau), khơng thấy có phân ly tính trạng biến đổi di truyền quần thể F2: 1+ Khơng thấy có đặc tính trội lai mẹ mang gen lặn với bố mang gen trội (gen thị) Ví dụ, trường hợp bố cam ba mang gen trội có ba chẽ lai với mẹ khác nhau, sinh khơng có tính trạng ba chẽ từ phơi vơ tính 2+ Có tượng hữu thụ cao khơng bình thường lệch bội (aneuploid), tam bội lai xa khác lồi Các thơng thường bất dục, không tạo hạt đường hữu tính giao tử đực vơ sinh 33 Để phân biệt phơi vơ tính từ phơi vơ tính, ngày người ta sử dụng phương pháp sinh hoá sinh học phân tử khác phân tích isozyme, thị phân tử (DNAhybridization, DNA-fingerprinting ), để thu kết nhanh, nhạy xác 3.6.7 Nghiên cứu hạt nhân tạo Murashige người đề xuất khái niệm hạt nhân tạo Hội thảo quốc tế lần thứ IV Nuôi cấy mô tế bào năm 1978 Hạt nhân tạo (artificial seed) khái niệm rộng Hạt nhân tạo chủ yếu tạo từ phôi vô tính với cấu trúc tương tự phơi hữu tính Tuy nhiên, hạt nhân tạo chồi mầm, chồi đỉnh, đốt lá, củ siêu nhỏ, protocorm (ở phong lan) bọc màng nhân tạo với khả lưu giữ, bảo quản nảy mầm thành hoàn chỉnh điều kiện thích hợp (Ara cs., 2000; Brischia cs., 2002; Kosky cs., 2002) Màng nhân tạo làm chất chiết tự nhiên từ rong biển (agar, caragreenan, alginate), trồng, chất gơm (chất dính) hạt sinh khối vi sinh dextran, gellan gum Dịch lỏng chất làm cứng hoá trộn nhỏ giọt vào dung mơi điện ly thích hợp sulphát đồng, chlorit canxi amonium chlorit Bổ sung số chất khống, chất kích thích sinh trưởng, chất diệt nấm khuẩn… vào mô sống bên màng mang lại kết tốt (Wendy Shu,2001) Thêm polyethylene glycol (PEG), số chất điều hoà sinh trưởng GA 3, zeatin vào môi trường nuôi cấy làm tăng đáng kể phân hố phơi, số lượng chất lượng phôi hạt nhân tạo số trồng (Jones and Van Staden, 2001; Fiegert cs., 2000) Các bước tạo hạt nhân tạo từ phôi vơ tính: - Tạo mơ sẹo phơi hố (somatic embryogenic callus) - Nuôi nhân cụm tế bào dịch lỏng (Suspension - huyền phù tế bào) bình tam giác bioreactor - Lọc lấy cụm tế bào phơi hố nhỏ hay cụm tế bào tiền phơi, có kích thước đồng lưới lọc (Lọc bỏ cụm lớn nhỏ mắt lưới khác nhau) Hình Hạt nhân tạo cà phê - Đưa cụm tế bào vào môi trường chín phơi (Phơi phát triển, tích luỹ chất dự trữ thục) - Làm khô, bọc màng nhân tạo - Bảo quản hạt nhân tạo - Làm cho hạt nhân tạo nẩy mầm Người ta thấy phơi vơ tính trải qua giai đoạn phát triển phơi hữu tính: khối tế bào hình cầu, chuyển sang dạng hình tim, hình thuỷ lơi (hình thn dài có rãnh), sau xuất dạng mầm, tích luỹ chất tương tự nội nhũ, đạt trọng lượng khô khoảng 1-2 mg/ phôi (Lai and McKersie, 1994) Tỷ lệ phôi nảy mầm phụ thuộc vào số yếu tố chất lượng phôi, nồng độ sodium alginate; nồng độ chất khoáng vỏ bọc nhân tạo, thường chất khoáng với thành phần hàm lượng hoạt chất môi trường nuôi cấy; thời gian xử lý hạt dung dịch CaCl2… (Castillo cs., 1998) Trong việc sản xuất hạt nhân tạo thông qua phôi vô tính từ ni cấy dịch lỏng, nồi phản ứng sinh học (bioreactor) thiết bị thay Do phơi vơ tính nảy mầm phát triển thành hoàn chỉnh, nên kỹ thuật hạt nhân tạo nghiên cứu ứng dụng thành cơng nhiều nước Có nhiều loại polymer tự nhiên thử nghiệm dùng cho công nghệ phôi vơ tính, alginate coi tốt Alginate polymer sinh học, chiết từ rong biển mà chủ yếu loài thuộc chi Sargassum Aliginate phân tử manuronic acid gắn với tạo thành, giống phân tử glucose tạo nên cellulose Đặc điểm quan trọng alginate chúng dạng hòa tan nước kết hợp với ion hóa trị (monovalent) như: Na +, K+, NH 4 … chuyển sang dạng không tan nước kết hợp với ion hóa trị hai (divalent) đa hóa trị (polyvalent) như: Ca2+, Mg2+, Al3+,… Nếu nhỏ giọt dung dịch sodium alginate vào dung dịch CaCl sodium alginate phần diện tích ngồi giọt chuyển hóa thành calcium alginate tạo nên màng không thấm nước Các viên alginate hình thành *Nghiên cứu áo bao hạt nhân tạo Những nghiên cứu hạt giống nhân tạo bắt đầu 1985, Drew (1979) tạo hạt có chứa phơi nhiều giọt tái sinh thành đưa vào mơi trường khơng có carbohydrate, Kitto (1981) bao phơi hay cụm tế bào Redenbang (1986) thành công dùng giá thể hòa tan nước Ca-alginate hay Na-alginate để tạo hạt Dùng hệ thống SEM hay tia X nghiên cứu cấu tạo hạt tự nhiên cho thấy có lớp: lớp nhu mơ giậu, lớp chịu áp lực lớp nhu mô mềm Ba lớp cấu tạo K, Ca ,S P… Nhiều chất liệu nghiên cứu để tạo lớp vỏ hạt tương tự tự nhiên * Bao hạt làm khô hạt nhân tạo Có nhiều máy giới bao hạt 10 hạt/giây, có nhiều cải tiến sản xuất qui mô lớn Hiện người ta nhỏ hạt tay Na- alginate làm tan nước với nồng độ 2-4 %, dùng pipet nhỏ giọt vào dung dịch CaCl2 (2,5%) sinh phản ứng trao đổi ion Na-Ca Hình.3.6 Qui trình bao hạt Na- alginate Sau hạt hình thành đủ độ cứng thích hợp chuyển qua ngâm nước làm cứng hạt ngăn chặn phản ứng Dùng Ca-alginate thường hạt ln ẩm ướt bề mặt, người ta dung loại polymer Elavax 4360 để bao cứng lớp alginate Giai đoạn làm khô hạt để giúp hạt nhân tạo dễ dàng tồn trữ nảy mầm cần thiết Người ta đặt hạt caroot khay cóchứa 25% polyoxyethylene để làm nước, làm ướt lại hạt tái sinh phát triển thành hoàn chỉnh * Tồn trữ nảy mầm hạt nhân tạo Chưa phát phương pháp hoàn chỉnh nhất, thường tồn trữ lạnh, với thời gian dài khả nảy mầm giảm đáng kể Có báo cáo cho thấy tồn trữ tháng parafilm hạt nảy mầm với tỉ lệ cao Hình 3.7 Nhân giống thông hạt giống nhân tạo Hạt giống cà rốt, làm khô tồn trữ 0C, w= 67%, suốt thời gian hai tháng tồn trữ hạt không nảy mầm, sau hai tháng đưa điều kiện bình thường hạt nảy mầm gần 100% Hầu hết khả nảy mầm hạt thấp do: - Phôi nuôi cấy kéo dài dung dịch lỏng, tế bào khả tái sinh - Vật liệu dung để tạo vỏ bao có khả trao đổi khí cung cấp dinh dưỡng * Hệ thống cấy chuyển hạt nhân tạo Ngày hầu hết hệ thống tái sinh phôi yêu cầu bước trung gian trước tái sinh thành hoàn chỉnh cấy chuyển ruộng Speigel (1984) phát triển hệ thống nuôi cấy tái sinh Citrus địi hỏi phải phải ni cấy chuyển nhiều lần từ môi trường Agar sang môi trường lỏng Sau đạt chiều cao thích hợp cấy chuyển vào ống nghiệm đặt cầu giấy để tiếp tục phát triển trước chuyển đất Như phải 16-18 tuần để từ phôi soma phát triển thành đạt yêu cầu nuôi cấy vườn uơm 3.6.8 Công nghệ bioreactor tạo phôi hạt nhân tạo nhân giống công nghiệp Công nghệ bioreactor ứng dụng sản xuất tế bào quy mô lớn để chiết rút dược chất chống ung thư Các bioreactor quy mơ 20.000 lít sử dụng sản xuất công nghiệp số nước (Robert and Shuler, 1997) Hai nhà khoa học Nhật Bản Takayama Misawa người công bố việc sử dụng bioreactor vào nhân giống thực vật Kỹ thuật nhân giống sau áp dụng cho hàng loạt trồng khoai tây, Lilium (loa kèn), Gladiolus (lay ơn), Anthurium (hồng môn), Dioscorea (củ mài), Asparagus (măng tây), cà phê nhiều khác bioreactor dung tích từ đến 2.000 lít Bioreactor ứng dụng để nhân nhanh phơi vơ tính, chồi, củ, thân ngầm v.v… (Takayama and Akita ,1994), ví dụ nhân củ siêu nhỏ khoai tây, nhân củ giống loa kèn Nhật Bản (Akita and Takayama 1988), nhân giống cỏ với công suất khoảng 200.000 chồi bioreactor 500 lít (Takayama and Akita ,1994) Bên cạnh đó, bioreactor sử dụng để nhân nhanh hoa lan hồ điệp Phalaenopshis thông qua thể cấu trúc (protocorm- like body) tạo từ mảnh (Young cs., 2000; Datta cs.,1999) Hình 3.8 Một số dạng Biorector Có thể nói nhân giống phơi vơ tính, hạt nhân tạo kết hợp với cơng nghệ bioreactor có khả tạo số lượng giống vô hạn từ ban đầu, đáp ứng sản xuất thương mại