NGHIÊN CỨU THU NHẬN DỊCH ĐẠM THỦY PHÂN TỪ THỊT ĐỎ CÁ NGỪ BẰNG ENZYME PROTEASE VI SINH VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - TRẦN VĂN KHIÊM TRẦN VĂN KHIÊM CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU THU NHẬN DỊCH ĐẠM THỦY PHÂN TỪ THỊT ĐỎ CÁ NGỪ BẰNG ENZYME PROTEASE VI SINH VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHỐ K32 Đà Nẵng – Năm 2018 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - TRẦN VĂN KHIÊM NGHIÊN CỨU THU NHẬN DỊCH ĐẠM THỦY PHÂN TỪ THỊT ĐỎ CÁ NGỪ BẰNG ENZYME PROTEASE VI SINH VẬT Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số : 60420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS Nguyễn Hoàng Minh Đà Nẵng – Năm 2018 i LỜI CẢM ƠN Luận văn hoàn thành thiếu hướng dẫn, giúp đỡ, động viên hỗ trợ nhiệt tình nhiều thầy, cô bạn bè Trước tiên, xin bày tỏ kính trọng lịng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Hồng Minh, giảng viên BM Cơng nghệ sinh học, Khoa Hóa, Trường ĐH Bách Khoa Đà Nẵng tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ tơi trình nghiên cứu viết luận văn Những nhận xét đánh giá Cô, đặc biệt gợi ý hướng giải vấn đề suốt trình nghiên cứu, thực học vô quý giá tôi, không trình viết luận văn mà hoạt động nghiên cứu chuyên môn sau Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến TS Lê Lý Thùy Trâm, Trưởng BM Cơng nghệ sinh học, Khoa Hóa, Trường ĐH Bách Khoa Đà Nẵng, Cô động viên, hỗ trợ, giúp đỡ lúc cảm thấy khó khăn nhất, tuyệt vọng giúp tơi vượt qua trở ngại để trọn vẹn đường cao học Tôi xin gửi cảm ơn sâu sắc đến PGS TS Đặng Minh Nhật, Phó trưởng Khoa Hóa, Trường ĐH Bách Khoa Đà Nẵng, Thầy giúp đỡ từ bước đầu định hướng đề tài nghiên cứu đặc biệt tạo điều kiện để tơi tiếp tục thực đề tài luận văn hoàn thành chương trình cao học Tơi xin cảm ơn Ban Giám hiệu tập thể giảng viên Khoa Hóa, Trường ĐH Bách Khoa Đà Nẵng dạy bảo, chia sẻ, động viên tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình tơi, đồng nghiệp bạn bè giúp đỡ tinh thần lẫn vật chất suốt trình học cao học làm luận văn Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn! Học viên Trần Văn Khiêm ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn thạc sĩ “Nghiên cứu thu nhận dịch đạm thủy phân từ thịt đỏ cá ngừ enzyme protease vi sinh vật” cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu tài liệu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu Tất tham khảo kế thừa trích dẫn tham chiếu đầy đủ Học viên Trần Văn Khiêm iii NGHIÊN CỨU THU NHẬN DỊCH ĐẠM THỦY PHÂN TỪ THỊT ĐỎ CÁ NGỪ BẰNG ENZYME PROTEASE VI SINH VẬT Học viên: Trần Văn Khiêm Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201 Khóa: K32 Trƣờng Đại học Bách khoa - ĐHĐN Tóm tắt - Hiện có mối quan tâm tăng cao hƣớng đến việc sản xuất lƣợng lớn enzyme protease từ vi sinh vật để thủy phân thịt đỏ cá ngừ - nguồn phế phẩm đƣợc tạo năm ngành chế biến thủy sản thành axit amin giá trị Hƣớng đến mục tiêu này, gen nprC10 mã hóa protease trung tính NPRC10 từ vi khuẩn Bacillus subtilis C10 đƣợc biểu vi khuẩn Escherichia coli M15 sử dụng hệ vector biểu pQE30 Trong nghiên cứu này, yếu tố ảnh hƣởng đến q trình ni cấy nhƣ nguồn nitơ, nồng độ IPTG, thời gian cảm ứng đƣợc khảo sát Kết cho thấy hoạt tính protease cao (6,694 U/mL) thu đƣợc E.coli M15 mang plasmid tái tổ hợp đƣợc nuôi cấy môi trƣờng LB cải tiến 370C với thời gian nuôi cấy sau cảm ứng 1mM IPTG giá trị OD600 đạt 2-3 19h Protease sau tủa ammonium sulphate 70% độ bão hịa có hoạt tính 31,725 U/mL, gấp 4,6 lần so với trƣớc tủa Quan trọng cả, hiệu suất thu hồi nitơ đạt 86% sử dụng protease NPRC10 để thủy phân thịt đỏ cá ngừ với thông số tối ƣu (5 thủy phân thịt đỏ cá ngừ, tỷ lệ enzyme/cơ chất = 1,6/100 (v/w) nhiệt độ phản ứng 500C) Từ khóa - protease; Bacillus subtilis; E.coli M15; ammonium sulfate; thịt đỏ cá ngừ; hiệu suất thu hồi nitơ STUDY OF THE PRODUCTION OF PROTEIN HYDROLYSATE FROM TUNA RED USING MICROBIAL PROTEASE Abstract - There is an increasing interest toward production of large amount of microbial protease to degrade protein-rich byproducts such as tuna red meat from fish processing industry into valuable amino acids For this aim, the coding region of nprC10 gene corresponding to mature neutral protease (NPRC10) from Bacillus subtilis C10 was heterologously expressed in Escherichia coli M15 by using pQE30 expression system In this study, various factors related to cultivation such as nitrogen source, IPTG concentration, induction time were investigated The result indicated that the highest activity of protease NPRC10 (6,694 U/mL) was obtained after induction by mM IPTG at OD600 of 2-3 for 19h at 370C with pepton as nitrogen source The precipitation by ammonium sulfate (70% saturation) offered protease activity of 31,725 U/mL, 4,6 times higher than activity of protease in culture filtrate More importantly, nitrogen recovery in soluble fraction was approximately 86% when using the purified protease NPRC10 to hydrolyse tuna red meat under optimized conditions (hydrolysis time: hours; ratio of enzyme/tuna red meat:1,6/100 (v/w); hydrolysis temperature: 500C) Key - protease; Bacillus subtilis; E.coli M15; ammonium sulfate; tuna red meat; nitrogen recovery iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii NGHIÊN CỨU THU NHẬN DỊCH ĐẠM THỦY PHÂN TỪ THỊT ĐỎ CÁ NGỪ BẰNG ENZYME PROTEASE VI SINH VẬT iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH ix MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục đích nghiên cứu Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu Phƣơng pháp nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Cấu trúc luận văn Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan protease 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Phân loại enzyme protease 1.1.3 Nguồn thu nhận protease 1.1.4 Thu nhận enzyme 1.1.5 Thủy phân protein enzyme protease 1.1.6 Ứng dụng protease 1.2 Tổng quan cá ngừ 11 1.2.1 Giới thiệu cá ngừ 11 1.2.2 Thành phần hóa học cá ngừ 12 1.3 Tổng quan công nghệ DNA tái tổ hợp 14 1.3.1 Công nghệ DNA tái tổ hợp 14 1.3.2 Hệ thống biểu E coli 15 1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu protease tái tổ hợp 17 1.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 17 1.4.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc 18 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Vật liệu nghiên cứu 21 2.1.1 Chủng vi sinh vật 21 v 2.1.2 Nguyên liệu hóa chất 21 2.1.3 Thiết bị sử dụng 22 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Phƣơng pháp bảo quản giống 22 2.2.2 Các phƣơng pháp nuôi cấy E.coli M15 22 2.2.3 Phƣơng pháp xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng E.coli M15 23 2.2.4 Phƣơng pháp định tính protease 23 2.2.5 Khảo sát biểu vi khuẩn E coli M15 tái tổ hợp 23 2.2.6 Đánh giá hoạt độ enzyme protease thu đƣợc từ q trình ni cấy E.coli M15 24 2.2.7 Phƣơng pháp kết tủa enzyme protease 25 2.2.8 Xác định thông số phản ứng enzyme để thủy phân thịt đỏ cá ngừ enzyme protease tái tổ hợp 25 2.2.9 Xử lý thống kê 27 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Khảo sát khả sinh trƣởng sinh enzyme protease chủng vi khuẩn E.coli M15 28 3.1.1 Đƣờng cong sinh trƣởng vi khuẩn E.coli M15 28 3.1.2 Xác định khả sinh enzyme protease vi khuẩn E.coli M15 29 3.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp enzyme protease NprC10 vi khuẩn E.coli M15 tái tổ hợp 30 3.2.1 Ảnh hƣởng nguồn nitơ lên khả sinh tổng hợp enzyme protease NprC10 E coli M15 tái tổ hợp 30 3.2.2 Ảnh hƣởng thời gian lên khả sinh tổng hợp enzyme protease NprC10 E coli M15 sau cảm ứng 31 3.2.3 Ảnh hƣởng nồng độ chất cảm ứng lên khả sinh tổng hợp enzyme protease NprC10 E coli M15 32 3.3 Kết nghiên cứu trình kết tủa protease E.coli M15 34 3.4 Xác định thông số phản ứng ảnh hƣởng đến hiệu thủy phân thịt đỏ cá ngừ enzyme protease tái tổ hợp 36 3.4.1 Kết ảnh hƣởng tỷ lệ enzyme/cơ chất đến hiệu thủy phân enzyme protease NPRC10 36 3.4.2 Xác định ảnh hƣởng thời gian đến hiệu thủy phân enzyme protease NPRC10 37 3.4.3 Xác định nhiệt độ phản ứng enzyme phù hợp 38 3.4.4 Kết luận khảo sát đơn biến 39 vi KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT OD U : Optical density – mật độ quang : Unit – Đơn vị hoạt độ protease UV-Vis v/w : Ultraviolet–visible spectroscopy – quang phổ tử ngoại khả kiến : volume/weigh – thể tích/khối lƣợng MTTUCB : Mơi trƣờng tối ƣu LB : Luria Bertani B subtilis : Bacillus subtilis E.coli TCA : Escherichia coli : Trichloroacetic acid viii DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu Tên bảng Trang Bảng 1.1 Một số tính chất Protease (P) vi sinh vật Bảng 1.2 Thành phần hóa học số cá ngừ đại dƣơng 12 Bảng 1.3 Hàm lƣợng chất lƣợng 100 g thịt đỏ cá ngừ 13 Bảng 1.4 Hàm lƣợng số acid amin có thịt đỏ cá ngừ 13 Bảng 1.5 Hàm lƣợng chất khống có thịt đỏ cá ngừ 13 Bảng 3.1 Các phƣơng pháp phá mẫu 34 Bảng 3.2 Thông số phản ứng thủy phân thịt đỏ cá ngừ 39 t: Thời gian hỗn hợp phản ứng v: Thể tích dịch lọc đem phản ứng 2.2 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng ni-tơ tổng số protein thô theo phƣơng pháp Kjeldahl 2.2.1 Nguyên tắc Tất dạng ni-tơ có thể hay mô đƣợc gọi ni-tơ tổng số Ni-tơ có thành phần amino acid protein ni-tơ protein Ni-tơ khơng có thành phần protein nhƣ muối vô cơ, acid nitric, ure dẫn xuất ure, purin, pyrimidin, ni-tơ phi protein Ni-tơ tổng số = ni-tơ protein + ni-tơ phi protein Trƣớc tiên mẫu đƣợc vơ hóa H2SO4 đặc nhiệt độ cao có chất xúc tác Các phản ứng q trình vơ hóa xảy nhƣ sau: H2SO4  2H2O + 2SO2 +O2 Oxi tạo thành phản ứng lại oxi hóa nguyên tố khác Các phân tử chứa ni-tơ dƣới tác dụng H2SO4 tạo thành NH3 Ví dụ protein bị thủy phân thành amino acid , C H amino acid tạo thành CO2 H2O, ni-tơ đƣợc giải phóng dƣới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dƣ tạo thành (NH4)2SO4 tan dung dịch 2NH3 + H2SO4  (NH4)2SO4 Các nguyên tố P, K, Ca, Mg….chuyển thành dạng oxit: P2O5, MgO, CaO, K2O Đuổi amoniac khỏi dung dịch NaOH: (NH4)2SO4 + 2NaOH  Na2SO4 + H2O + 2NH3 NH3 bay với nƣớc sang bình hứng, bình hứng chứa H3BO3 NH4OH + H3BO3  (NH4)2B4O7 2.2.2 Dụng cụ - Máy cất đạm - Bình Kjeldahl dung tích 250, 500 ml - Bình định mức dung tích 100 ml - Ống đong dung tích 10, 100 ml - Buret 25 ml - Pipet 10, 20, 50 ml - Bình nón, dung tích 250 ml - Chén cân, thìa nhựa - Phễu thủy tinh - Bếp điện - Giấy đo pH - Cân phân tích, độ xác 0.001 g + 7H2O 2.2.3 Hóa chất  Mẫu phân tích  Axit sunfuric (H2SO4) đậm đặc  Dung dịch HCl 0.1 N  Natri hydroxyt (NaOH), dung dịch 40 %  Hỗn hợp xúc tác: đồng sunfat (CuSO4) + Kali sunfat (K2SO4), tỷ lệ 1/10 (theo khối lƣợng)  Phenolphtalein % etanol 60 % 2.2.4 Cách tiến h nh Đốt đạm: Cho g mẫu, g chất xúc tác (K2SO4 CuSO4) 10 ml H2SO4 đậm đặc vào bình Kjeldahl đun bếp từ từ thu đƣợc dung dịch suốt khơng màu có màu xanh lơ CuSO4 (khơng đƣợc có màu vàng nhạt) mặt bình hồn toàn Ngừng đun, để nguội Chú ý: Quá trình vơ hóa mẫu bình Kjeldahl giải phóng khí SO2 nên phải tiến hành tử hút Trong trình đốt nên đặt bình nằm nghiêng bếp khoảng 40° Trong trình đun, thấy mẫu không trắng, ngừng đun, để nguội, cho thêm khoảng 0.5 g chất xúc tác vào tiếp tục đun Nếu thấy mẫu cịn đen mà cạn, lấy để nguội, cho thêm khoảng ml axit sunfuric đậm đặc vào tiếp tục đun dung dịch đạt yêu cầu nhƣ Cất đạm: Cho cẩn thận dịch vơ hóa vào bình cất định mức 500 ml, tráng rửa bình Kjeldahl phễu nhiều lần nƣớc tráng hết phản ứng với acid (thử giấy đo pH) Cho vào bình định mức khoảng 10÷15 ml NaOH 40% vài giọt phenolphthalein %, sau thêm nƣớc cất vừa đủ 300 ml Chuẩn bị dung dịch bình hứng NH3: dùng pipet cho vào bình hứng khoảng 10 ml acid Boric, sau lắp vào hệ thống cho đầu ống sinh hàn ngập dung dịch acid Boric Bắt đầu trình cất đạm dung dịch bình hứng đạt khoảng 150 ml Chuẩn độ: Lấy bình hứng đem chuẩn độ HCl 0.1N Tiến hành xác định mẫu trắng với tất lƣợng hóa chất nƣớc cất bƣớc thí nghiệm nhƣ trên, khơng có mẫu thử 2.2.5 Tính ết Hàm lƣợng nitơ tổng số (Ntổng) tính phần trăm theo công thức: Ntổng = (V1  V2 ) * 0.0014 * 100 m Trong đó: V1: Thể tích dung dịch HCl 0.1N tiêu tốn chuẩn độ mẫu thử, tính ml V2: Thể tích dung dịch HCl 0.1N tiêu tốn chuẩn độ mẫu trắng, tính ml m: khối lƣợng mẫu thử, tính g 0.0014: Số g nitơ tƣơng ứng với ml dung dịch HCl 0.1 N 100: Hệ số tính phần trăm Phƣơng pháp tính hàm lƣợng prơtein thơ Hàm lƣợng nitơ trung bình phân tử protein sản phẩm thủy sản 16 % Vì hàm lƣợng protein thơ mẫu thử hàm lƣợng nitơ tổng số nhân với hệ số 6.25 Hàm lƣợng protein thơ (X) tính phần trăm theo công thức: X = Ntổng 6.25 Trong đó: Ntổng – Hàm lƣợng nitơ tổng số, tính phần trăm; 6.25 – Hệ số chuyển nitơ tổng số protein thô (100:16 = 6.25) 2.3 Xác định hàm lƣợng protein phƣơng pháp Bradford 2.3.1 Nguyên tắc: Khi Coomassie Brilliant Blue G 250 kết hợp với protein, thuốc nhuộm thay đổi màu từ đỏ sang xanh xanh hấp thụ cực đại bƣớc sóng từ 465nm đến 595nm Sự thay đổi hấp thụ 595nm tƣơng ứng với nồng độ protein có mẫu 2.3.2 Tiến hành: a Chuẩn bị dung dịch Bradford: Hòa tan 100mg Coomassie Blue G250 50ml ethanol 95% Sau cho thêm 100ml acid phosphoric 85% khuấy Bổ sung thêm nƣớc cấ`t lít Sau lọc giấy lọc Whatman N o1và trữ chai tối nhiệt độ phịng Thuốc thử sử dụng hai tuần nhƣng thời gian thuốc thử bị tủa nên sử dụng cần phải lọc lại b.Chuẩn bị dung dịch protein chuẩn: Cân 10mg BSA, hòa tan 1ml nƣớc cất Ta thu đƣợc dung dịch BSA mẹ có nồng độ 10 mg/ml Giữ -20oC c Xây dựng đường chuẩn Chuẩn bị ống nghiệm thêm vào chất theo bảng sau: Ống nghiệm Nƣớc cất (ml) 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 BSA 0,1mg/ml (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 [BSA] (µg/ml) 10 20 30 40 50 Thuốc thử Bradford (ml) 5 5 5 Lắc ống để yên phút Định chuẩn máy quang phổ với dung dịch đệm (ống 1) bƣớc sóng 595nm Chỉnh OD giá trị Tiến hành đo ống lại Ghi nhận kết Tính giá trị trung bình lần lặp lại thí nghiệm Vẽ biểu đồ đƣờng chuẩn BSA thể mối tƣơng quan tuyến tính nồng độ protein (µg/ml) với độ hấp thụ (OD) bƣớc sóng 595nm d Định lượng protein có mẫu: Hàm lƣợng protein có mẫu đƣợc tiến hành đo đồng thời với việc dựng đƣờng chuẩn Cũng lấy ml mẫu cho vào ml thuốc thử tiến hành đo OD bƣớc sóng 595 nm Ghi nhận kết quả, lấy giá trị trung bình ống Mẫu đƣợc đo phải có giá trị OD595 nằm khoảng OD595 đƣờng chuẩn Nếu giá trị OD lớn giá trị lớn đƣờng chuẩn phải tiến hành pha lỗng mẫu Sau lấy dịch pha loãng tiến hành phản ứng định lƣợng nhƣ Từ phƣơng trình đƣờng chuẩn ta suy đƣợc hàm lƣợng protein dung dịch đo