Xác định chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen ph3 và khảo nghiệm các tổ hợp lai cà chua mang gen ph3 vụ xuân hè tại gia lâm hà nội

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM BÙI THỊ THÊU XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ PHÂN TỬ LIÊN KẾT CHẶT VỚI GEN Ph3 VÀ KHẢO NGHỊÊM CÁC TỔ HỢP LAI CÀ CHUA MANG GEN Ph3 VỤ XUÂN HÈ TẠI GIA LÂM- HÀ NỘI Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Ngọc Hùng GS.TS Phan Hữu Tôn NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NƠNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng bảo vệ để lấy học vị Tôi xin cam đoan rằng, giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn, thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận án Bùi Thị Thêu i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới GS TS Phan Hữu Tôn TS Trần Ngọc Hùng tận tình hướng dẫn, dành nhiều thời gian, công sức tạo điều kiện cho suốt trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Sinh học phân tử CNSH ứng dụng, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán viên chức Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Nghiên cứu Rau giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Bùi Thị Thêu ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Trích yếu luận văn viii Thesis abstract ix Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Tổng quan cà chua 2.1.1 Danh pháp phân loại 2.1.2 Nguồn gốc, lịch sử cách sử dụng cà chua 2.1.3 Tình hình sản xuất cà chua giới Việt Nam 2.2 Nghiên cứu bệnh sương mai cà chua 2.2.1 Triệu chứng dấu hiệu bệnh sương mai 2.2.2 Nguyên nhân gây bệnh 11 2.2.3 Đặc điểm phát sinh, phát triển gây hại bệnh 12 2.3 Chỉ thị phân tử ứng dụng thị phân tử chọn giống trồng 13 2.3.1 Chỉ thị phân tử 13 2.3.2 Ứng dụng thị phân tử chọn tạo giống trồng 18 2.4 Tình hình nghiên cứu tính kháng bệnh sương mai chọn tạo giống cà chua kháng bệnh 19 2.4.1 Các nghiên cứu nước 19 2.4.2 Các nghiên cứu nước 24 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 26 iii 3.1 Địa điểm nghiên cứu 26 3.2 Thời gian nghiên cứu 26 3.3 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 26 3.4 Nội dung nghiên cứu 26 3.5 Phương pháp nghiên cứu 26 3.5.1 Phương pháp xác định thị phân tử liên kết chặt với gen Ph3 26 3.5.2 Phương pháp xác định kiểu gen Ph3 tổ hợp lai cà chua 32 3.5.3 Đánh giá suất, đặc điểm nông sinh học tình hình sâu bệnh tổ hợp lai cà chua vụ Xuân Hè Gia Lâm- Hà Nội 32 3.5.4 Phương pháp xử lý số liệu 34 Phần Kết thảo luận 35 4.1 Kết khảo sát đa hình với gen Ph3 thị phân tử 35 4.2 Kết xác định mức độ liên kết thị phân tử thông qua đánh giá tương đồng kiểu gen kiểu hình tính kháng bệnh 38 4.3 Kết ứng dụng thị phân tử LB3 xác định kiểu gen Ph3 tổ hợp lai cà chua mang gen Ph3 44 4.4 Kết đánh giá suất, đặc điểm nơng sinh học tình hình sâu bệnh tổ hợp lai cà chua vụ Xuân Hè Gia Lâm - Hà Nội 48 4.4.1 Kết đánh giá đặc điểm sinh trưởng tổ hợp lai cà chua 48 4.4.2 Kết đánh giá đặc điểm tổ hợp lai cà chua 49 4.4.3 Kết đánh giá suất tổ hợp lai cà chua 51 4.4.4 Tình hình nhiễm sâu bệnh ngồi đồng ruộng tổ hợp lai 52 Phần Kết luận kiến nghị 54 5.1 Kết luận 54 5.2 Kiến nghị 54 Tài liệu tham khảo 56 Phụ lục 62 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa Tiếng Việt AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism AVRDC Agriculture Vegetables Reseacher and Development Center Bp Base pair CAPs Cleaved Amplified Polymorphic Sequence cM centiMorgan DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate ĐC Đối chứng FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations FAVRI Fruit and Vegetable Research Institue F- Primer Forward Primer IPM Intergrated Pest Management kb Kilobase MAS Marker Assisted Selection PCR Polymerase Chain Reaction QTL Quantitative Trait Loci RADP Random Amplified Polymorphic DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RNA Ribonucleic Acid R- Primer Reserve Primer SCAR Sequence Characterised Amplification Regions SSR Simple Sequence Repeat TAE Tris – Acetate – EDTA TE Tris- EDTA Tm Melting temperature v DANH MỤC BẢNG Bảng Diện tích sản lượng cà chua tồn giới giai đoạn 2012- 2014 Bảng 2 Diện tích sản lượng cà chua nước giai đoạn 2014- 2016 Bảng Diện tích, suất sản lượng cà chua số tỉnh trồng nước giai đoạn 2014- 2016 Bảng 3.1 Danh sách giống cà chua nghiên cứu 27 Bảng Thành phần phản ứng PCR với mồi 29 Bảng 3 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 29 Bảng Các tổ hợp lai cà chua tiến hành xác định kiểu gen Ph3 32 Bảng Đặc điểm thị phân tử thể tính đa hình với gen Ph3 35 Bảng Kiểu hình, kiểu gen trao đổi chéo quần thể F2 tổ hợp lai 08TP03-15-3-1 × 08TP73-10-4 39 Bảng Khoảng cách di truyền thị phân tử 44 Bảng 4 Kiểu gen Ph3 tổ hợp lai cà chua khảo nghiệm 45 Bảng Đánh giá tính kháng bệnh sương mai tổ hợp lai cà chua khảo nghiệm 46 Bảng Chiều cao dạng hình sinh trưởng tổ hợp lai cà chua vụ Xuân Hè năm 2017 Gia Lâm- Hà Nội 48 Bảng Đặc điểm tổ hợp lai cà chua vụ Xuân Hè năm 2017 Gia LâmHà Nội 50 Bảng Năng suất tổ hợp lai cà chua vụ Xuân Hè năm 2017 Gia LâmHà Nội 51 Bảng Biểu bệnh hại đồng ruộng tổ hợp lai cà chua vụ Xuân Hè năm 2017 Gia Lâm- Hà Nội 53 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Năng suất cà chua nước hai miền Nam Bắc giai đoạn 2014- 2016 Hình 2 Triệu chứng bệnh sương mai thân, cà chua 10 Hình Chu kỳ vòng đời nấm Phytophthora infestans 12 Hình Nguyên tắc phản ứng PCR 15 Hình 2.5 Vị trí gen Ph3 đồ thị phân tử RFLP vai dài nhiễm sắc thể số (Botstein et al., 2006) 22 Hình 2.6 Bản đồ liên kết gen (QTL) liên quan đến tính kháng bệnh sương mai cà chua: LB-1 LB-2- QTL kháng bệnh sương mai (Fray et al., 1998); Ph1, Ph2, Ph3 - gen kháng bệnh sương mai (Chunwongse et al., 2002) 23 Hình 2.7 Ảnh điện di thị SCAR phát triển từ thị AFLP (L87) ( Park et al., 2010) (1- kháng bệnh, 2-6 nhiễm bệnh, 7-16 kháng bệnh) 24 Hình Vùng khảo sát thị phân tử liên kết với gen Ph3 nhiễm sắc thể số 28 Hình 3.2 Sơ đồ tạo quần thể F2 tổ hợp lai 08TP03-15-3-1 x 08TP73-10-4 30 Hình 3.3 Lây nhiễm bệnh nhân tạo tách rời 31 Hình Quá trình phân lập nấm sương mai (A-mẫu bệnh, B- Phân lập mơi trường V8, C- Hình dạng bọc bào tử động kính hiển vi) 31 Hình Ảnh điện di sản phẩm PCR thị TOM 236 36 Hình Ảnh điện di sản phẩm PCR thị SSR383 36 Hình Ảnh điện di sản phẩm PCR thị SSR69 37 Hình 4 Ảnh điện di sản phẩm PCR thị LB3 37 Hình Ảnh điện di sản phẩm PCR thị SCU602F3R3 37 Hình Ảnh điện di sản phẩm PCR thị LB3 quần thể F2 cá thể từ đến 35 (08TP03-15-3-1 x 08TP73-10-4) 43 Hình Ảnh điện di sản phẩm PCR thị SCU602F3R3 quần thể F2 cá thể từ đến 37 (08TP03-15-3-1 x 08TP73-10-4) 43 Hình Ảnh điện di thị LB3 tổ hợp lai cà chua khảo nghiệm 45 Hình Đánh giá tính kháng bệnh sương mai tổ hợp lai cà chua mang gen Ph3 47 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Bùi Thị Thêu Tên luận văn: Xác định thị phân tử liên kết chặt với gen Ph3 khảo nghiệm tổ hợp lai cà chua mang gen Ph3 vụ Xuân Hè Gia Lâm- Hà Nội Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Tên sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: Xác định thị phân tử DNA liên kết chặt với gen Ph3 tuyển chọn tổ hợp lai cà chua lai F1 mang gen Ph3 triển vọng vụ Xuân Hè Gia Lâm – Hà Nội Phương pháp nghiên cứu: Tiến hành khảo sát đa hình thị TOM236, SSR383, SSR69, LB3 SCU602F3R3 với vật liệu giống thí nghiệm (đã biết kiểu gen Ph3) xác định mức độ liên kết thị phân tử thông qua đánh giá tương đồng kiểu gen kiểu hình kháng bệnh lây nhiễm nhân tạo (phương pháp tách rời) với chủng nấm sương mai (Phytophthora infestans) thu thập phân lập Viện Nghiên cứu Rau Quả quần thể F2 từ tổ hợp lai (08TP03-15-3-1 x 08TP73-10-4) Ứng dụng thị phân tử xác định liên kết chặt với gen Ph3 thu từ thí nghiệm để xác định kiểu gen Ph3 đánh giá kiểu hình tổ hợp lai cà chua (V1, V2, V3, V4 V5) mang gen Ph3 Bố trí thí nghiệm theo khối ngẫu nhiên hồn tồn, lần nhắc lại với tổ hợp lai cà chua từ V1 đến V5, V1 giống Savior dùng làm đối chứng để tiến hành khảo nghiệm Kết kết luận: Qua kết đánh giá, so sánh tương đồng kiểu gen Ph3 thị nghiên cứu kiểu hình kháng lây nhiễm 96 cá thể ngẫu nhiên quần thể F2 từ tổ hợp lai (08TP03-15-3-1 x 08TP73-10-4), lựa chọn thị: LB3 với khoảng cách di truyền 2,3 cM thị SCU602F3R3 với khoảng cách 3,1 cM, liên kết chặt với gen Ph3 kháng bệnh sương mai cà chua Kết sở giúp chọn tạo giống cà chua chứa gen kháng hữu hiệu Ph3 thị phân tử đạt độ xác cao Kết đánh giá kiểu gen Ph3 sử dụng thị phân tử LB3 khảo nghiệm tổ hợp lai cà chua mang gen Ph3 vụ Xuân Hè Gia Lâm- Hà Nội cho thấy tổ hợp lai triển vọng phục vụ sản xuất: V4 (08TP85-2-3-5-1-1-1-10 x 11FAV-10-3) mang gen Ph3 trạng thái dị hợp tử; có nhiều đặc điểm tốt thuộc nhóm sinh trưởng vơ hạn, có khối lượng trung bình đạt 100g, độ Brix 3,5%, suất thực thu đạt 76,23 tấn/ha, suất cà chua thương phẩm đạt 72,63 tấn/ha, chống chịu tốt với chủng nấm bệnh sương mai nghiên cứu viii THESIS ABSTRACT Master candicate: Bui Thi Theu Thesis title: Identification of DNA molecular marker closely linked to Ph3 resistant gene and evaluation of tomato hybrid combinations containing Ph3 gene in Spring Summer season at Gia Lam- Hanoi Major: Biotechnology Code: 60 42 02 01 Education organization: Vietnam National University of Agriculture Research Objectives: To identify DNA molecular markers closely linked to Ph3 gene and find out a promising tomato hybrid combinations containing Ph3 gene in Spring Summer season at Gia Lam- Hanoi Materials and Methods: We have evaluated the polymorphism of markers TOM236, SSR383, SSR69, LB3 SCU602F3R3 on experimental varieties (Ph3 genotype was denified) and identified marker linkage level by assessing Ph3 genotype and resistant phenotype of F2 population of cross combination (08TP03-15-3-1 x 08TP73-10-4) after infecting (by detached – leavflets method) with the isolates of Phytophthora infestans which were collected and isolated at Fruit and Vegetable Research Institute From above markers, a marker closely linked with Ph3 gene were used for identification Ph3 genotype and evaluate phenotype of tomato cross combinations (V1, V2, V3, V4 and V5) that containing Ph3 gene Experiment were designed by randomized Complete Block with replications of tomato cross combinations above, in which V1 (Savior) was used as the control variety for testing Main findings and conclusions: After assessing Ph3 genotype and resistant phenotype of 96 F2 randomized individuals of cross combination (08TP03-15-3-1 x 08TP73-10-4), we have identified markers closely linked to Ph3: LB3 marker and SCU602F3R3 marker with genetic distance of 2,3 cM and 3,1 cM , respectively This result is the basis for breeding tomato varieties containing Ph3 resistant gene through molecular marker The result of identification Ph3 genotype by using LB3 marker and testing tomato cross combinations containing Ph3 gene in the Spring Summer season at Gia Lam- Ha Noi shown that: V4 (08TP85-2-3-5-1-1-1-10 x 11FAV-10-3) is a promising variety containing Ph3 heterozygous genotype with many good characteristics such as infinite growth, average fruit weight reach 100 g, Brix ~ 3,5 %, actual yield reach 76.23 tons/ha, commercial yield reach 72.63 tons/ha and strongly resistant to studied isolate of Phytophthora infestans ix T V1 V2 V3 V4 V5 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 Thursday, September 17, 2017 DUONG KINH QUA 12:19 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Model Error Mean Square F Value Pr > F 245.9746667 Corrected Total Squares 40.9957778 4.4146667 14 0.5518333 250.3893333 R-Square Coeff Var Root MSE 0.982369 1.386613 0.742855 Source DF 74.29 F 0.8826667 1.60 0.2604 61.0523333 110.64 F 0.02814227 Corrected Total Squares 0.00469038 0.01732613 14 0.00216577 0.04546840 R-Square Coeff Var Root MSE 0.618941 4.606791 0.046538 Source DF 2.17 0.1541 Anova SS Y Mean 1.010200 Mean Square F Value Pr > F K 0.00353320 0.00176660 0.82 0.4760 T 0.02460907 0.00615227 2.84 0.0975 Thursday, September 17, 2017 CHI SO HINH DANG QUA 12:16 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t 0.002166 2.30600 Least Significant Difference 0.0876 69 Means with the same letter are not significantly different t Grouping A Mean N T 1.04667 V3 1.03667 V4 1.03433 V1 A A A A A B A 0.99667 V5 B B 0.93667 V2 KHỐI LƯỢNG TRUNG BÌNH QUẢ KHOI LUONG QUA 07:04 Thursday, September 17, 2017 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values K 123 T V1 V2 V3 V4 V5 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 KHOI LUONG QUA 70 07:04 Thursday, September 17, 2017 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Model Error Mean Square F Value Pr > F 4422.996000 Corrected Total Squares 737.166000 36.397333 14 4.549667 4459.393333 R-Square Coeff Var Root MSE 0.991838 2.463991 2.132995 Source DF 162.03 F 0.13 0.8774 242.97 F 2.28800000 0.38133333 0.09600000 Corrected Total 14 0.01200000 2.38400000 R-Square Coeff Var Root MSE 0.959732 4.087482 0.109545 Source DF 31.78 F K 0.08400000 0.04200000 3.50 0.0809 T 2.20400000 0.55100000 45.92 F 1.84800000 0.30800000 74 19.66 0.0002 Error Corrected Total 0.12533333 14 0.01566667 1.97333333 R-Square Coeff Var Root MSE 0.936486 1.822814 0.125167 Source DF Anova SS Y Mean 6.866667 Mean Square F Value Pr > F K 0.00133333 0.00066667 0.04 0.9586 T 1.84666667 0.46166667 29.47 F 0.89866667 0.05733333 14 0.14977778 20.90 0.0002 0.00716667 0.95600000 Coeff Var Root MSE 76 Y Mean 0.940028 2.534616 Source DF 0.084656 Anova SS 3.340000 Mean Square F Value Pr > F K 0.07600000 0.03800000 5.30 0.0342 T 0.82266667 0.20566667 28.70 F 0.46 0.6482 T 1934.180000 483.545000 68.29 F 7174.540000 1195.756667 13.917333 1.739667 14 7188.457333 R-Square Coeff Var Root MSE 0.998064 2.700213 1.318964 Source DF 687.35 F 3.88 0.0665 1029.08