Là quá trình truyền DNA ngoại lai vào một tế bào nhận, chẳng hạn sphaeroplast hoặc protoplast, và có thể hợp nhất trong nhiễm sắc thể nhờ sự tái tổ hợp tương đồng hoặc được biến[r]
(1)PGS TS Nguyễn Hoàng Lộc (chủ biên) TS Lê Việt Dũng - TS Trần Quốc Dung
Giáo trình
Cơng nghệ DNA tái tổ hợp
NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh
2007
(2)Phụ lục
Một số thuật ngữ
Adapter. Một oligodeoxyribo tương tự linker,
nhưng có đầu đầu lồi 5’ tương ứng với vị trí cắt hạn chế
vector có đầu tương đồng (xem thêm linker)
Adenosine diphosphate (ADP). Một ribonucleoside 5’-diphosphate cấu tạo từ adenine, đường ribose (5C) hai gốc phosphate ADP có tác dụng nhận phosphate chu trình lượng tế bào
Adenosine triphosphate (ATP). Một ribonucleoside 5’-triphosphate cấu tạo từ adenine, đường ribose (5C) ba gốc phosphate ATP phân tử chứa lượng hóa học tế bào,
(mitochondria) (chloroplast) Các gốc phosphate ATP có mang liên kết bị thủy phân phóng thích lượng
tự lớn
,
ADP thích
hóa sinh nội Đơi
thủy p (adenosine monophosphate) để
phóng thích nhiều
Amino acid Là phân tử nhỏ mang gốc amine (-NH3)
gốc carboxyl (-COOH) liên kết với nguyên tử carbon Amino acid đơn vị cấu trúc sở chuỗi polypeptide Có 20 amino acid khác chuỗi polypeptide
amino acid chuỗi polypeptide
polypeptide
Ampicillin (Amp)
đ
(tái tổ hợp) tạo
(3)BAC (bacteria artificial chromosome) Nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn, dựa sở plasmid F-factor, sử dụng làm vector tạo dịng BAC tái E coli với đoạn chèn DNA có kích thước lên đến 300 kb
Bản đồ cắt hạn chế (restriction map). Trình tự vị trí nhận biết (recognition sites) tất enzyme hạn chế (restriction enzyme hay restriction endonuclease, RE) phân tử DNA
Bazơ (analog base). hóa
base nitrogen
base
, base bắt
base Ví dụ: base
adenine (A) 2-aminopurine gắn
adenine bắt e
(G)
ặp - -C
Bazơ nitơ (nitrogen base). cấu n nucleic acid
(DNA RNA) nitrogen base nucleic acid adenine,
guanine, cytosine thymine (DNA) uracil (RNA)
acid
cơ thể sinh vật
Bắt cặp bổ sung (complementary base pairing) Sự kết hợp thành
từng đôi nitrogen base nằm hai mạch đơn chuỗi xoắn kép DNA-DNA, DNA-RNA RNA-RNA thông qua mối liên kết hydrogen Sự bắt cặp mang tính đặc hiệu: guanine bắt cặp với cytosine, adenine bắt cặp với thymine DNA uracil RNA.
Biến nạp (transformation). Là trình truyền DNA ngoại lai vào tế bào nhận, chẳng hạn sphaeroplast protoplast, hợp nhiễm sắc thể nhờ tái tổ hợp tương đồng biến đổi đơn vị chép tự trị (autonomous replicon) Sự biến nạp xuất điều kiện tự nhiên số vi khuẩn (ví dụ: Bacillus, Haemophilus, Neisseria Streptococcus), nhiều vi khuẩn (ví dụ: E coli) thể sinh vật eukaryote biến nạp xuất
những tế bào “thấm” DNA phương pháp nhân tạo như: hóa
(4)Biến nạp điện (electroporation) Kỹ thuật dùng xung điện tạo lỗ thủng tạm thời màng sinh chất để đưa DNA ngoại lai vào bên tế bào vật chủ
Biến tính (denaturation). Là tượng chuyển từ dạng mạch kép sang dạng mạch đơn DNA RNA thường nhiệt gây nên Biến tính protein tượng chuyển từ cấu hình hoạt động thành dạng không hoạt động
Biểu gen (gene expression). Là trình phiên mã (transcription) dịch mã (translation) gen để tạo sản phẩm protein
Cặp base (base pair, bp) Là liên kết A-T C-G phân tử DNA mạch kép, đơn vị đo chiều dài phân tử DNA
Chromosome walking Kỹ thuật dùng để lập đồ nhiễm sắc
thể từ tập hợp đoạn DNA cắt hạn chế chồng lên (overlapping) Bắt đầu từ thư viện chứa đoạn DNA nói tạo dòng Một đoạn DNA mang gen biết lựa chọn sử dụng mẫu dò để nhận dạng (ví dụ: cách lai khuẩn lạc) đoạn khác, đoạn chồng lên chứa gen Sau đó, trình tự nucleotide đoạn phân tích nhờ xác định toàn đoạn nhiễm sắc thể Từ đó, đồ vùng đặc biệt xây dựng
Chu trình sinh tan (lylic cycle) Một kiểu chu trình sống thực
khuẩn thể (bacteriophage) xâm nhiễm vi khuẩn, điều khiển hoạt động sinh sản sinh trưởng gen sinh bacteriophage hệ
C (lysogenic cycle) Là tượng hệ gen
bacteriophage diện trạng thái ổn định không sinh tan tế bào vật chủ sống Các tế bào vật chủ tiếp tục sinh trưởng phân chia, chép hệ gen bacteriophage (prophage) phối hợp với nhiễm sắc thể vật chủ cho tế bào phân chia prophage chuyển vào hai tế bào Prophage trì cách hợp nhiễm sắc thể vật chủ (ví dụ: bacteriophage λ, bacteriophage Φ105) plasmid bên nhiễm sắc thể (ví
(5)dụ: bacteriophage P1 bacteriophage F116) Tế bào vật chủ khơng thể biểu kiểu hình biến đổi
Chuỗi contig (contiguous sequence). M trình tự d
ên (overlapping)
Chu (concatemer).
Chuỗi mã hóa (coding sequence). Đoạn phân tử DNA mang mã di truyền xác định để phiên mã thành mRNA sau dịch mã thành chuỗi polypeptide
Ch (transgenic). Quá trình chuyển ngoại lai
(foreign DNA) kỹ thuật khác (Agrobacterium, vi tiêm, bắn
gen, xung điện ) vào thể vật chủ (vi sinh vật, động vật thực vật)
Chuyển nhiễm (transfection). Kỹ thuật đưa DNA phage DNA
virus vào tế bào vật chủ
Cosmid. Vector lai (hybrid vector)
của vị trí cos ( h) λ
Công nghệ DNA tái tổ hợp (DNA recombinant technology) Hệ thống phương pháp phòng thí nghiệm cho phép cắt đoạn DNA từ sinh vật để ghép nối vào DNA sinh vật khác tạo phân tử DNA tái tổ hợp Phân tử đưa vào sinh vật khác để tạo giống chủng vi sinh vật, thực vật động vật có phẩm chất đặc biệt, đáp ứng nhu cầu ngày cao sản xuất đời sống người Cơng nghệ có ứng dụng rộng rãi y học, dược học, nông nghiệp nhiều ngành công nghiệp khác
Công nghệ sinh học (biotechnology) Theo nghĩa rộng trình cơng nghiệp có sử dụng vi sinh vật tế bào động vật thực
vật (công nghệ sinh học ) Theo nghĩa phổ biến
những trình sản xuất sử dụng giống sinh vật mới, tạo công nghệ DNA tái tổ hợp (công nghệ sinh học )
Trong công nghệ sinh học ( , bia,
, chăn ni ) trước tiên
thích hợp
(6)Hình 7.13 Phân tích SDS-PAGE nhuộm Coomassie Blue sản phẩm protein sau tinh sắc ký lực 1: Chuẩn khối lượng phân tử protein 2: Protein hịa tan tổng số 3: Protein dung hợp (protein đích GST) rửa giải khỏi cột glutathione sepharose 4: Protein dung hợp cắt PresCission Protease cho băng GST protein đích 5: Protein đích tinh sau cho qua IMAC
Khó khăn chủ yếu dung hợp lực để tinh protein phải loại bỏ thành công đuôi lực tác nhân sử dụng Vấn đề giải phần biến nạp di truyền điểm đặc hiệu cao cho protease cho cắt bỏ liên kết acid không bền chỗ nối protein tái tổ hợp đuôi lực Nhiều phương pháp phân cắt gợi ý Sử dụng protease đặc hiệu thích hợp cả, ứng dụng điều kiện “nhẹ nhàng”, chủ yếu thrombin, enterokinase Factor Xa Tất protein hoạt động 37oC phân cắt
các vị trí bên protein quan tâm, tính đặc hiệu từ nhiễm bẩn protease Cuối cùng, bước sắc ký yêu cầu để loại bỏ đuôi lực phân cắt protease
Trong phát triển gần lĩnh vực này, người ta sử dụng dạng tái tổ hợp protease 3C từ rhinovirus người Protease có kích thước nhỏ (20 kDa) có tính đặc hiệu hạn chế Nó biểu protein tái tổ hợp dung hợp với glutathione-S-transferase Điều có vài ưu điểm, thân protease tinh
Protein dung hợp (protein đích + GST)
GST Protein đích
(7)sạch sắc ký lực glutathione-Sepharose Nếu protein đích biểu dung hợp với glutathione-S-transferase tinh cột glutathione-Sepharose Sau xử lý với protease, protein đích phân tách khỏi glutathione-S-transferase protease cách chuyển qua cột glutathione-Sepharose thứ hai
Một cách khác, phản ứng phân cắt đặt cột glutathione-Sepharose thứ cách bổ sung protease vào đệm cột, tránh cần thiết cho cột thứ hai Protease có sẵn dạng thương mại tên PreCission Protease Amersham Pharmacia Biotech sản xuất (Hình 7.12 7.13)
tham khảo/đọc thêm
1 Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K 2002 Short Protocol in Molecular Biology Vol and 5th ed
John Wiley & Sons, Inc USA.
2 Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J 1989 Molecular Cloning-A Laboratory Manual Cold Spring Habor Laboratory Press, USA
3 Ohman DE 1989 Experiments in Gene Manipulation Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, USA
4 Primrose SB, Twyman R and Old RW 2001 Principles of Gene Manipulation 6th ed Blackwell Science, Oxford, UK
5 Rapley R and Walker JM 1998 Molecular Biomethods Handbook
Humana Press Inc New Jersey, USA
6 Rosenberg IM. 1996 Protein Analysis and Purification-Benchtop Techniques Birkhäuser, Boston, USA
7 Surzycki S 2000 Basic Techniques in Molecular Biology Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, Germany
8 Walker JM 2002 The Protein Protocols Handbook 2nd ed Humana Press Inc Totowa, New Jersey, USA