Giáo trình CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP - Chương 2 potx

Công nghệ DNA tái tổ hợp 24 Chương 2 di gel I. Nguyên lý chung được dùng để phân tách và một đôi khi để tinh sạch đại -đặc biệt là các protein và acid- kích thước/ , và cấu hình . Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch chuyển hướng đến cực dương (+) hoặc cực âm (-) tùy theo điện tích của chúng. Ngược với protein, loại phân tử có điện tích thực hoặc dương hoặc âm, các nucleic acid có một điện tích âm không đổi nhờ khung phosphate của mình, và vì thế chỉ dịch chuyển hướng đến cực dương. Các phân tử protein và nucleic acid có thể được chạy điện di trên một khuôn đỡ (support matrix) như giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc polyacrylamide gel. Trong đó gel của agarose và polyacrylamide được sử dụng phổ biến nhất. Thông thường, gel là một khuôn đúc dạng phiến mỏng có các giếng để nạp (loading) mẫu. Gel được ngâm trong đệm điện di cung cấp các ion để dẫn truyền dòng điện và một vài loại đệm để duy trì pH ở một giá trị không đổi tương đối. I Agarose (polysaccharide) có khối lượng phân tử xấp xỉ 120.000 Da (Hình 2.1) là một trong hai thành phần chính của agar 1 chiếm khoảng 70%, phần kia là agaropectin chiếm khoảng 30%. Agarose là một polymer mạch thẳng không bị sulphate hóa chứa hai gốc xen kẽ nhau là D-galactose và 3,6- anhydro-L-galactose. Agarose gel là một chất trong suốt (transparent) hoặc trong mờ (transluent) giống như agar, được tạo thành khi hỗn hợp agarose và nước (hoặc đệm điện di) được đun nóng tới >100 o C và sau đó được làm lạnh; dạng gel xuất hiện ở khoảng 40-45 o C. Agarose gel được ứng dụng rộng rãi để làm giá thể cho các nucleic acid trong kỹ thuật điện di ngang 1 Agar: một galactan phức hợp tách chiết từ một số loài tảo đỏ như Gelidium và Gracilaria spp., được sử dụng rộng rãi ở dạng gel làm giá thể rắn hoặc bán rắn cho môi trường nuôi cấy vi sinh vật và thực vật. Công nghệ DNA tái tổ hợp 25 (horizontal electrophoresis) hoặc làm giá thể cho môi trường nuôi cấy bacteriophage (top agarose). Hình 2.1. Cấu trúc phân tử của agarose. Đơn vị agarobiose (ví dụ: hai phân tử đường) là một monomer trong agarose polymer. Có khoảng 400 monomer trên một chuỗi polymer. phân tử nucleic acid c , (EtBr) và (ultraviolet-UV). : - Ước lượng kích thước của các phân tử DNA sau khi thực hiện phản ứng cắt hạn chế (ví dụ: lập bản đồ hạn chế của DNA được tạo dòng…). - Phân tích các sản phẩm PCR (ví dụ: trong chẩn đoán di truyền phân tử hoặc in dấu di truyền…). - Phân tách DNA hệ gen đã được cắt hạn chế trước khi thẩm tích Southern, hoặc RNA trước khi thẩm tích Northern. Ưu điểm của phương pháp này là gel được rót dễ dàng, không gây biến tính mẫu, và bền vững vật lý hơn polyacrylamide. Mẫu cũng dễ thu hồi. Nhược điểm là agarose gel có thể bị nóng chảy trong quá trình điện di, đệm có thể bị tiêu hao, và các dạng khác nhau của nucleic acid có thể chạy không ổn định. OH O AGAROBIOSE MONOMER O CH 2 OH O O CH 2 OH OH O Công nghệ DNA tái tổ hợp 26 yếu tố 10 khối lượng 2.2). Do đó, các phân tử DNA có kích thước càng lớn (khối lượng phân tử lớn) thì tốc độ dịch chuyển càng chậm. 2.2 (  (  :   r o K loglog Trong đó 0,5% 0,9% 1,2% 1,4% 0,7% 5 4 3 2 Log 10 của các cặp nucleotide đệm: 0,5 x TBE – 0,5 μg/mL EtBr điện di: 1 V/cm trong 16 giờ 1 2 3 4 5 6 Công nghệ DNA tái tổ hợp 27  o . K r . 2.1). Nồng độ agarose cao có khả năng phân tách các đoạn DNA nhỏ, trong khi đó nồng độ agarose thấp lại cho phép phân tách các đoạn DNA lớn hơn. ng agarose gel (%) trong gel 0,3 60-5 0,6 20-1 0,7 10-0,8 0,9 7-0,5 1,2 6-0,4 1,5 4-0,2 2,0 3-0,1 Hình 2.3 minh họa sự dịch chuyển của tập hợp các đoạn DNA trong hai mẫu ở ba nồng độ khác nhau của agarose, tất cả chúng ở trong một khay gel và được điện di ở cùng một điện áp (voltage) trong một thời gian xác định. Kết quả cho thấy, các đoạn lớn được phân tách tốt hơn ở gel 1%, trong khi các đoạn nhỏ thích hợp với gel 2%. Công nghệ DNA tái tổ hợp 28 Hình 2.3. Điện di các mẫu DNA giống nhau ở các nồng độ agarose khác nhau. A: 1%, B: 1,5% và C: 2%. - - - . Nhìn chung, DNA của các plasmid mạch vòng dịch chuyển nhanh hơn DNA của plasmid cùng loại nhưng có dạng mạch thẳng. Hầu hết plasmid mạch vòng chứa ít nhất hai dạng DNA có cấu trúc không gian khác nhau là dạng vòng đóng (siêu xoắn) và vòng đứt. Hình 2.4 minh họa kết quả điện di với plasmid mạch vòng bên trái và plasmid cùng loại mạch thẳng ở bên phải. Hình 2.4. Điện di các plasmid có cấu hình khác nhau DNA mạch vòng DNA mạch thẳng Dạng vòng đứt Dạng vòng đóng 1 2 1 2 1 2 A B C Công nghệ DNA tái tổ hợp 29 4 o C đến 30 o . thường được dùng Tr - - - - - - - . Các đoạn DNA sẽ dịch chuyển với các tốc độ hơi khác nhau một chút trong ba loại đệm trên do sự khác nhau về cường lực ion của đệm. Đệm không những thiết lập một giá trị pH, mà còn cung cấp các ion để hỗ trợ cho độ dẫn (conductivity). Nếu chúng ta dùng nước thay vì là đệm trong quá trình điện di, thì sẽ không có sự dịch chuyển cần thiết của DNA trong gel. Ngược lại, nếu sử dụng đệm nồng độ đậm đặc (ví dụ: dung dịch stock ×10), thì nhiệt độ trong gel có thể tăng cao và làm nóng chảy nó. - - t - - - - . Công nghệ DNA tái tổ hợp 30 ) TAE 0,04 M Tris-acetate 0,002 M EDTA (50) 242 g Tris base 57,1 mL acetic acid băng 100 mL EDTA 0,5 M (pH 8) TPE 0,08 M Tris-phosphate 0,008 M EDTA (10) 108 g Tris base 15,5 mL H 3 PO 4 85% (1,679 g/mL) 40 mL EDTA 0,5 M (pH 8) TBE 0,089 M Tris-borate 0,002 M EDTA (5) 54 g Tris base 27,5 g boric acid 20 mL EDTA 0,5 M (pH 8) không cao. Sau khi nhuộm, EtBr sẽ xen vào giữa các base của nucleic acid và cho phép phát hiện dễ dàng chúng ở trong gel. (0,5  agarose gel để phản ứng nhuộm xảy ra trong suốt quá trình điện di điện di chạy điện di hoặc RNA Công nghệ DNA tái tổ hợp 31 2 (0,5  . gây . Vì thế, . sulphate hoạt tính (RE, ligase, kinase, polym khối lượng < , khi khối lượng ). Có nhiều phương pháp thu hồi và tinh sạch DNA từ agarose gel, dưới đây là một vài phương pháp chính: 2.4.1. Dùng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp (low melting temperature) Mẫu agarose gel có nhiệt độ nóng chảy thấp chứa đoạn DNA quan tâm được cắt ra khỏi bản gel và cho vào trong đệm với tỷ lệ 1:1, bổ sung muối đến nồng độ 0,5 M, sau đó được nóng chảy ở 70 o C để hòa tan hoàn toàn trong đệm. Dung dịch gel có DNA được chiết bằng phenol/chloroform và kết tủa. Lưu ý DNA được tách chiết bằng phương pháp này không thích hợp cho mọi phương thức thao tác tiếp theo, do sự hiện diện của các nhân tố ức chế trong agarose. 2.4.2. Ly tâm Mẫu agarose gel có chứa băng DNA quan tâm được cắt ra và cho vào đệm chiết, làm nóng để hòa tan hoàn toàn, sau đó cho dung dịch gel lên trên một lớp (màng) bông thủy tinh đã silicon hóa đặt trong một cột lọc nhỏ loại Công nghệ DNA tái tổ hợp 32 0,5 mL (còn gọi là spin column). Cột này được cho vào một tube vi ly tâm loại 1,5 mL và được ly tâm ở tốc độ cao 10.000-15.000 rpm trong 10-15 phút. DNA sẽ liên kết với màng còn dung dịch đệm sẽ đi qua lớp bông thủy tinh vào tube vi ly tâm. Cho đệm rửa vào cột và rửa cột vài lần bằng cách ly tâm nhanh. Thay tube vi ly tâm mới, cho đệm hòa tan DNA vào cột và ly tâm để dung ly (elution) DNA ra khỏi màng vào tube. Dung dịch DNA thu được có thể được tinh sạch thêm nếu cần. Cũng có thể đông lạnh mẫu gel trước khi dùng phương pháp ly tâm để cải thiện hiệu suất thu hồi DNA. 2.4.3. Điện di vào bẫy Một cái rãnh nhỏ được cắt trong agarose gel ngay phía trước của băng DNA quan tâm. Rãnh này được làm đầy bằng glycerol và gel được điện di nhanh trở lại để chuyển DNA từ gel vào trong dung dịch glycerol (quá trình điện di có thể được kiểm soát bằng UV). Dung dịch glycerol-DNA sau đó được chiết bằng pipette. Hoặc sau khi điện di, một khe nhỏ được cắt trong gel ngay phía trước băng DNA quan tâm và đặt trong khe một mẫu giấy loại NA-45. Gel sau đó được điện di trở lại và băng DNA quan tâm sẽ dịch chuyển vào trong mẫu giấy. Mẫu giấy sau đó được rửa và DNA được dung ly trong đệm bằng cách đun nóng mẫu giấy tới 70 o C. DNA sau đó có thể được tách chiết bằng phenol và kết tủa. 2.4.4. Dùng hạt thủy tinh Mẫu gel quan tâm được hòa tan trong dung dịch muối NaI (một loại chaotropic salt) ở nồng độ khoảng 4 M. Các hạt thủy tinh sau đó được bổ sung vào dung dịch để liên kết hiệu quả với các đoạn DNA được phóng thích ở nồng độ đã cho của NaI. RNA, protein và các tạp chất khác không liên kết với các hạt thủy tinh. Tiếp theo là các chu kỳ rửa và kết tủa tiểu thể, DNA tinh sạch được dung ly khỏi hạt thủy tinh trong đệm muối thấp. Tuy nhiên, phương pháp này mặc dù nhanh và hiệu quả nhưng lại có phạm vi tối ưu hẹp. Thu hồi các đoạn DNA nhỏ (500-800 bp) là không hiệu quả lắm và các đoạn lớn (>15 kb) có thể liên kết với các hạt thủy tinh khác nhau và các sợi DNA có thể bị phá vỡ trong suốt các chu kỳ rửa. Công nghệ DNA tái tổ hợp 33 Cho 1% type- - 100 mL 0,5 60 o - . : DNA (1 g/1 µL) 1 L (10 loading dye) 1 L Nước 9 L Tổng số 11 L 11 L . Lưu ý m  . 0,5 g micropipette loại 20-200  đen. Khi tăng điện áp của quá trình điện di, các đoạn DNA lớn thường dịch chuyển nhanh hơn so với các đoạn nhỏ. Tuy nhiên, để có độ phân giải (resolution) tốt nhất đối với các đoạn DNA có kích thước lớn hơn 2 kb thì đ áp chứ (Hình 2.5). 0,5  - [...]... (1977): - X Công nghệ DNA tái tổ hợp 41 - -tube (eppendorf tube) 1 -2 th (0,5 M ammonium acetate, 10 mM magnesium acetate, 1 -tube 37o (< - - Hình 2. 8 Hình ảnh điện di DNA có đánh dấu 32P trên polyacrylamide gel ở phim X-quang 4o - - - hai - hai 4 i nhau o 4oC Công nghệ DNA tái tổ hợp 42 200 L - Hòa t 3 M sodium acet 25 L hai - hòa 10 L 10 L 2 L - 2 Điện di protein 2. 1 Điện di SDS-PAGE 2. 1.1... 3,5 1.00 0 -2 .000 5,0 8 0-5 00 8,0 6 0-4 00 12, 0 4 0 -2 00 15,0 2 5-1 50 20 ,0 6-1 00 1 20 cm - DNA (>1  : 1.1.1 Công nghệ DNA tái tổ hợp : 37 - -acrylamide) - 1 TBE - 10% ammonium persulphate 1 silicon lúc để miếng đệm 1 2. 4) 35  1 3,5% 5,0% 8,0% 12, 0% 20 ,0% 11,6 16,6 26 ,6 40,0 66,6 67,6 62, 7 52, 7 39,3 12, 7 5 TBE 20 ,0 20 ,0 20 ,0 20 ,0 20 ,0 10% ammonium persulphate 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 30% acrylamide -acrylamide)... mẫu DNA vào giếng e Chạy điện di Hình 2. 5 Sơ đồ minh họa các bước trong quá trình điện di agarose gel ( = 3 02 nm) (Hình 2. 6) hình ảnh DNA (Gel Documentation System) để phân tích và lưu trữ Công nghệ DNA tái tổ hợp 34 Chiều dịch chuyển của DNA Giếng 1 2 3 SM Hình 2. 6 Hình ảnh điện di DNA chạy trên agarose gel 1%, 3 Volts/cm và nhuộm bằng EtBr Các băng DNA có màu sáng SM: Chuẩn kích thước của DNA (1... Các đường 1, 2 và 3: mẫu plasmid DNA được cắt bằng 3 enzyme hạn chế khác nhau I : CH2 = CH – C – NH2 O persulphate (N,N,N’,N’-tetramethylethylene Khi bisacrylamide (N,N’ 20 %) Công nghệ DNA tái tổ hợp 35 Ngoài protein, polyacrylamide gel cũng được dùng để điện di DNA (kể cả RNA và DNA/ RNA) Gel ph (gel spacers) (Hình 2. 7 cathode Mẫu Đệm điện di Giếng Khung kính giữ gel anode Đệm điện di Hình 2. 7 Sơ đồ... Công nghệ DNA tái tổ hợp á từ 5 -2 .000 bp Nồng độ polyacrylamide gel được 36 sử dụng trong khoảng DNA quan tâm H : - tách bằng urea và formamide (sequencing gel) tách Phần này chỉ giới thiệu polyacrylamide gel không biến tính là loại gel hay được sử dụng nhất tách DNA trong loại gel này vào (B 2. 3), kích thước và điện tích của DNA tách DNA trong polyac Acrylamide (% w/v) ch (nucleotide) 3,5 1.00 0 -2 .000... màu trong khoảng từ vài giây đến vài phút - Dừng phản ứng phát triển màu khi thu được hình ảnh tối ưu càng nhanh càng tốt bằng cách dùng acetic acid lạnh (4oC) 7,5% 1 .2. 3 +K Nếu chỉ muốn quan sát kết quả điện di thì có thể tiến hành nhanh như sau: Công nghệ DNA tái tổ hợp 40 -7 0 - o + (sấy o ở 80 C trong điều kiện chân không từ 1 -2 giờ) dấu 32 35  ) (Hình 2. 8) 1 ép và ngâm” (crush and soak) polyacrylamide... chúng Kỹ thuật điện di 2 chiều (2D-PAGE, 2 dimension polyacryamide gel electrophoesis) được dùng để phân tách hỗn hợp protein, và đặc biệt hữu ích Công nghệ DNA tái tổ hợp 46 cho việc so sánh các mẫu liên quan như mẫu mô bình thường và mẫu mô đột biến Comparative 2D-PAGE cũng có thể được dùng để tìm kiếm các protein mà sự biểu hiện của chúng rất tương đồng dưới cùng một tập hợp các điều kiện (những... trong suốt quá trình điện di SDS _ + WM 1 2 3 4 5 6 7 8 Hình 2. 9 Điện di protein bằng kỹ thuật SDS-PAGE và nhuộm bằng Coomassie blue WM: Chuẩn khối lượng phân tử của protein Các đường 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 và 8: Mẫu protein 2. 1 .2 Khử SDS-PAGE Bên cạnh việc bổ sung SDS, protein có thể được đun nóng nhanh gần đến sôi với sự có mặt của một tác nhân khử, ví dụ như dithiothreitol (DTT) hoặc 2- mercaptoethanol... có thể kết hợp với nhau tạo nên kỹ thuật điện di 2 chiều Điện di protein trên polyacrylamide gel cho phép phân đoạn, xác định khối lượng phân tử và phân lập protein Ngoài ra, khối lượng protein còn được xác định chính xác bằng phương pháp sắc ký khối phổ Công nghệ DNA tái tổ hợp 47 Tài liệu tham khảo/đọc thêm 1 Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K 20 02 Short Protocol... (quantitative preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis, QPNC-PAGE) là một phương pháp mới Công nghệ DNA tái tổ hợp 44 để phân tách các metalloprotein nguyên thể trong các khuôn sinh học phức tạp 2. 1.3 Điện di và nhuộm Các protein biến tính sau đó được nạp vào một đầu của khuôn polyacrylamide gel đặt trong đệm thích hợp Dòng điện được sử dụng từ đầu này đến đầu kia của gel, sẽ làm cho các . mạch vòng DNA mạch thẳng Dạng vòng đứt Dạng vòng đóng 1 2 1 2 1 2 A B C Công nghệ DNA tái tổ hợp 29 4 o C đến 30 o . thường được dùng Tr - - - - - - - . Các đoạn DNA sẽ dịch. biến tính (1977): - . X . - . Công nghệ DNA tái tổ hợp 42 - -tube (eppendorf tube) . - 1 -2 th (0,5 M ammonium acetate, 10 mM magnesium acetate, 1 -tube. - 37 o (< - - . . - 4 o - . - - hai i nhau. - hai 4 o 4 o C. Hình 2. 8. Hình ảnh điện di DNA có đánh dấu 32 P trên polyacrylamide gel ở phim X-quang Công nghệ DNA tái tổ hợp 43 - Hòa t 20 0 L 25 L 3