Nghiên cứu tình trạng methyl hoá chỉ thị phân tử septin 9 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng việt nam​

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRẦN HỒI NAM Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TÌNH TRẠNG METHYL HOÁ CHỈ THỊ PHÂN TỬ SEPTIN Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG VIỆT NAM Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Cơng nghệ sinh học Lớp : 48-CNSH Khoa : CNSH-CNTP Khóa học : 2016-2020 Người hướng dẫn : PGS.TS Dương Văn Cường Th.S.Vũ Hoài Nam Thái Nguyên, năm 2020 i LỜI CẢM ƠN Trong q trình học tập nghiên cứu để hồn thành khoá luận tốt nghiệp với nỗ lực cá nhân, em nhận hướng dẫn, giúp đỡ, bảo động viên thầy cơ, bạn bè gia đình Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS Dương Văn Cường, TS Hoàng Phú Hiệp, Th.S Vũ Hoài Nam, người trực tiếp hướng dẫn giúp đỡ em suốt thời gian thực đề tài q trình hồn chỉnh luận văn tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn thầy cô khoa CNSH - CNTP dạy dỗ giúp đỡ em suốt thời gian vừa qua Em xin chân thành cảm ơn đến tới cán bộ, anh chị làm việc Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên giúp đỡ tạo điều kiện để em học tập nghiên cứu Cuối em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè động viên, chia sẻ giúp đỡ em vượt qua khó khăn q trình học tập, nghiên cứu hoàn thiện thân Em xin chân thành cảm ơn ! Thái Nguyên, ngày tháng Sinh viên Trần Hoài Nam năm 2020 ii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Bảng liệt kê hoá chất cần sử dụng q trình thí nghiệm 20 Bảng 3.2 Bảng liệt kê dụng cụ cần thiết trình thí nghiệm 21 Bảng 3.3: Bố trí thí nghiệm tách chiết DNA với bốn phương pháp 23 Bảng 3.4 Quy trình tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde phương pháp A 23 Bảng 3.5 Quy trình tách chiết DNA từ mẫu mô người cố định formaldehyde phương pháp B 24 Bảng 3.6 Quy trình tách chiết DNA từ mẫu mô người cố định formaldehyde phương pháp C 25 Bảng 3.7 Quy trình tách chiết DNA từ mẫu mô người cố định formaldehyde Tissue Genomic DNA Extraction Mini Kit [Theo hướng dẫn nhà sản xuất FavorPrep] 26 Bảng 3.8 : Bố trí thí nghiệm tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde bệnh nhân ung thư đại trực tràng 28 Bảng 3.9: Bố trí thí nghiệm 29 Bảng 3.11: Thành phần phản ứng PCR 31 Bảng 3.12: Bố trí thí nghiệm chạy PCR khuếch đại gene FAT1 32 Bảng 4.1: Thống kê độ tuổi phát bệnh ung thư đại trực tràng 34 Bảng 4.2 : Thống kê giới tính bệnh nhân ung thư đại trực tràng 34 Bảng 4.3: Thống kê giai đoạn phát bệnh 35 Bảng 4.4: Thống kê tỷ lệ phát bệnh bị di nghiên cứu tỷ lệ tương tự Hoa Kỳ (được công bố Hiệp hội ung thư Hoa Kỳ) 35 Bảng 4.5 : Kết đo nồng độ DNA 38 Bảng 4.6 : Kết đo tỷ số OD260/280 39 Bảng 4.7 : Kết đo tỷ số OD260/230 40 Bảng 4.8: Kết mức độ nhiễm tạp chất phenol mẫu DNA bốn phương pháp 41 Bảng 4.9: Thống kê phương pháp 42 Bảng 4.10 : Kết đo nồng độ DNA 44 iii Bảng 4.11: Kết đo tỷ số OD260/280 45 Bảng 4.12: Kết đo tỷ số OD260/230 45 Bảng 4.13 : Trình tự promoter gene SEPT9 47 iv DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 : Hình ảnh vị trí đại tràng trực tràng người 13 Hình 2.2: Q trình xác định mức độ methyl hố DNA 17 Hình 3.1: Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gene FAT1 30 Hình 3.2: Chu trình nhiệt chạy PCR khuếch đại gene FAT1 31 Hình 3.3 : Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gene FAT1 32 Hình 4.1 DNA tách chiết từ mẫu mơ cố định formaldehyde tách chiết từ KIT chuẩn công ty Clini Sciences 36 Hình 4.2: Kết điện di sản phẩm DNA tách từ phương pháp A, B, C KIT 37 Hình 4.3: Kết điện di sản phẩm DNA tách chiết từ mẫu mô 14173 - U phương pháp B 43 Hình 4.4: Vị trí kích thước gene SEPT9 46 Hình 4.5: Thiết kế mồi khuếch đại promoter gene SEPT9 47 Hình 4.6: Kết chạy khuếch đại gene FAT1 48 Hình 4.7: Kết PCR khuếch đại gene FAT1 49 Hình 4.8: Kết PCR gen FAT1 49 v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iv MỤC LỤC v Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.1 Mục tiêu đề tài 1.1.1 Mục tiêu tổng quát 1.1.2 Mục tiêu cụ thể 1.2 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.2.1 Ý nghĩa khoa học đề tài 1.2.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10 2.1 Ung thư 10 2.1.1 Khái niệm ung thư 10 2.1.1 Cơ chế hình thành bệnh ung thư 10 2.2 Ung thư đại trực tràng 12 2.2.1 Khái niệm 12 2.2.2 Các yếu tố nguy ung thư đại trực tràng 13 2.2.3 Tình hình ung thư đại trực tràng Error! Bookmark not defined 2.3 Mối liên hệ Methyl hoá DNA ung thư đại trực tràng 14 2.3.1 Methyl hoá DNA 14 2.4 Nguyên lý kỹ thuật xác định mức độ methyl hóa DNA dựa biến đổi bisulfite 16 2.5 Giới thiệu kỹ thuật xác định methyl hóa DNA hiệu cao Illumina Infinium 450K 17 2.6 Nghiên cứu nước quốc tế methyl hóa gene SEPT9 bệnh nhân ung thư đại trực tràng 17 vi Phần ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Đối tượng nghiên cứu phạm vi nghiên cứu 20 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20 3.1.2 Phạm vi nghiêm cứu 20 3.1.3 Vật liệu dụng cụ thí nghiệm 20 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 21 3.3 Nội dung nghiên cứu 21 3.4 Phương pháp nghiên cứu 22 3.4.1 Phương pháp thu thập đánh giá số liệu ung thư CRC bệnh viện K TW 22 3.4.2 Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde 22 3.4.3 Thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hoá phương pháp thiết kế Insilicon 28 3.4.4 Q trình chuyển hố bisulfite cho mẫu DNA 29 Phần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 4.1 Kết thu thập phân tích số liệu lâm sàng 151 mẫu bệnh phẩm bệnh nhân ung thư đại trực tràng thu thập ngẫu nhiên bệnh viện K TW 34 4.1.1 Kết phân tích độ tuổi phát ung thư 34 4.1.2 Kết phân tích giới tính 34 4.1.3 Kết phân tích giai đoạn phát bệnh 35 4.1.4 Khảo sát tỷ lệ mức độ bệnh phát bị ung thư đại trực tràng bệnh viện K TW 35 4.2 Kết tách chiết DNA 36 4.2.1 Kết lựa chọn phương pháp phù hợp tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde 37 4.2.3 Kết tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde B tối ưu phương pháp sử dụng Tissue Genomic DNA Extraction Mini Kit 43 4.3 Kết thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hoá 46 4.3.1 Thu thập thông tin gene SEPT9 từ sở liệu database 46 4.3.2 Xác định trình tự promoter gene SEPT9 47 4.3.3 Thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hóa 47 vii 4.4 Kết chuyển hoá bisulfite DNA tách chiết từ mẫu mô cố định formaldehyde bệnh nhân ung thư đại trực tràng 48 4.4.1 Kết chất lượng DNA chuẩn bị cho trình biến đổi bisufite 48 4.4.2 Kết chuyển đổi bisufite 50 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 5.1 Kết luận 51 5.2 Kiến nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ung thư đại trực tràng (Colorectal cancer - CRC) loại ung thư phổ biến người Trên giới, CRC xếp thứ tỷ lệ người mắc bệnh sau ung thư phổi ung thư tuyến tiền liệt nam giới, đứng thứ sau ung thư vú nữ giới Ở Việt Nam, tỷ lệ người mắc CRC đứng thứ năm sau ung thư gan, phổi, dày vú Tỉ lệ mắc CRC chiếm 8,7% tổng số bệnh nhân ung thư.[1] Hằng năm, có 945.000 người mắc bệnh ung thư đại trực tràng giới có khoảng 492.000 bệnh nhân tử vong, số bệnh nhân châu Á chiếm 51,3% tổng số ca mắc toàn giới Theo dự đoán chuyên gia Hội thảo Ung thư Việt Pháp lần thứ diễn Hà nội, tới năm 2025 ung thư đại trực tràng vươn lên hàng thứ hai nam giới thứ tư nữ giới Việc sàng lọc thường xuyên giúp phịng ngừa phát sớm ung thư đại trực tràng Theo thống kê Hiệp hội phịng ngừa Hoa Kỳ cơng bố năm có khoảng 60% bệnh nhân bị ung thư đại trực tràng tử vong, sàng lọc định kỳ thường xuyên tỷ lệ bệnh nhân mắc bệnh sống thêm năm tăng từ 46% đến 73% Vì việc sàng lọc thường xuyên giúp kéo dài thời gian sống phát kịp thời.[5] Trong số chế gây nên ung thư nói chung ung thư đại trực tràng nói riêng, chế methyl hố DNA có vai trị quan trọng Những biến đổi di truyền ngoại gen (epigenetic) có liên quan tới q trình phát sinh ung thư Nghiên cứu tình trạng methyl hố DNA có tiềm ứng dụng cao sàng lọc, chẩn đoán lâm sàng theo dõi điều trị ung thư Gen SEPT9 người thị sinh học hàng đầu để giúp phát chẩn đoán lâm sàng số bệnh ung thư có ung thư đại trực tràng.[5] Trên giới có nghiên cứu tình trạng methyl hoá gene SEPT9 bệnh nhân ung thư đại trực tràng, nhiên nghiên cứu đa số nghiên cứu đối tượng người da trắng người da đen Mặt khác, methyl hố DNA có phần nguyên nhân phụ thuộc vào sắc tộc môi trường sống Hiện nay, theo tìm hiểu chúng tơi chưa có nghiên cứu nghiên cứu tình trạng methyl hố DNA gene SEPT9 bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam Xuất phát từ luận điểm trên, thực đề tài: “ Nghiên cứu tình trạng methyl hố thị phân tử SEPT9 bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam” 1.1 Mục tiêu đề tài 1.1.1 Mục tiêu tổng quát Thiết lập số kỹ thuật làm tảng cho nghiên cứu khảo sát mức độ methyl hóa thị SEPT9 khối u bệnh nhân CRC Việt Nam 1.1.2 Mục tiêu cụ thể - Thu thập phân tích số liệu lâm sàng tập hợp 151 mẫu bệnh phẩm bệnh nhân ung thư đại trực tràng thu thập ngẫu nhiên Việt Nam - Tìm tối ưu phương pháp thích hợp để tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde Tách chiết khoảng 50 mẫu DNA đánh giá chất lượng - Phân tích in silico cấu trúc gene SEPT9 thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hoá - Thực kỹ thuật PCR đặc hiệu methyl hóa 1.2 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.2.1 Ý nghĩa khoa học đề tài Nghiên cứu tình trạng methyl hố thị phân tử SEPT9 bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam tạo tiền đề cho nghiên cứu methyl hoá gen thị phân tử khác bệnh ung thư 1.2.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài Nghiên cứu tình trạng methyl hố thị phân tử SEPT9 bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam mở hướng nghiên cứu liên quan đến ứng dụng sàng lọc, chẩn đoán hỗ trợ điều trị bệnh ung thư đại trực tràng 301 CTGAGGACCCCGGATGAACAGTGGGGAACAGCACTGATCCCCCAGTGGGGCCCCGAGTTC :||||||:::++||||||:|||||||||:||:|:||||:::::|||||||:::++||||: 301 TTGAGGATTTCGGATGAATAGTGGGGAATAGTATTGATTTTTTAGTGGGGTTTCGAGTTT 361 CCGGAGAGGAAGACTCGCTCCCTCCCAGGGGACGGCTAGAGACTCACTGACTCATGCGTG :++||||||||||:|++:|:::|:::||||||++|:||||||:|:|:|||:|:|||++|| 361 TCGGAGAGGAAGATTCGTTTTTTTTTAGGGGACGGTTAGAGATTTATTGATTTATGCGTG 421 TGTGGTAGGAATCTTCCAGGAAGTCCCCGTCCCGTTCGCCCTCTCTGCCTGGGCGGGGAC ||||||||||||:||::|||||||:::++|::++||++:::|:|:||::||||++||||+ 421 TGTGGTAGGAATTTTTTAGGAAGTTTTCGTTTCGTTCGTTTTTTTTGTTTGGGCGGGGAC 481 GGCAACTGCCTCTGTCACTGCAGACTAATGGGACGGAGGGGGGTGACTTCTCAGGGTTCC +|:||:||::|:|||:|:||:|||:||||||||++|||||||||||:||:|:||||||:: 481 GGTAATTGTTTTTGTTATTGTAGATTAATGGGACGGAGGGGGGTGATTTTTTAGGGTTTT 541 TCCTGGGCAGGTGCTCCGGAACCTTTTCTCAGCACGCTGGCCTGGGGCACGGCCGTTCCT |::||||:|||||:|:++|||::||||:|:||:|++:|||::|||||:|++|:++||::| 541 TTTTGGGTAGGTGTTTCGGAATTTTTTTTTAGTACGTTGGTTTGGGGTACGGTCGTTTTT 601 CCTGCCCAGCCACGTTGGGGTACAGGGTGAAGAAGGGCTGGGGCCAGCCCAGGACAGAGG ::||:::||::|++||||||||:||||||||||||||:|||||::||:::||||:||||| 601 TTTGTTTAGTTACGTTGGGGTATAGGGTGAAGAAGGGTTGGGGTTAGTTTAGGATAGAGG 661 AAGGCGAGGCAGGCACGCAGGAACTGGGCTTTTTAAACCCTTAAGCCCAAGGAAATCGTA ||||++|||:|||:|++:|||||:||||:||||||||:::|||||:::||||||||++|| 661 AAGGCGAGGTAGGTACGTAGGAATTGGGTTTTTTAAATTTTTAAGTTTAAGGAAATCGTA 721 GCATCGCGGGACAGGGAAAATGAAAGACTTTGGAAGTCGTCAGGAATTTGACTCTGTGAG |:||++++|||:|||||||||||||||:|||||||||++|:||||||||||:|:|||||| 721 GTATCGCGGGATAGGGAAAATGAAAGATTTTGGAAGTCGTTAGGAATTTGATTTTGTGAG 781 TTGGTTTCCAAGAGTCTAAGTTAAGCATCTCCAAGTGGATATTAAAAAGGAGCAGCAAGC |||||||::||||||:|||||||||:||:|::||||||||||||||||||||:||:|||: 781 TTGGTTTTTAAGAGTTTAAGTTAAGTATTTTTAAGTGGATATTAAAAAGGAGTAGTAAGT M>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> U>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> 841 CTCGGGGCGGCGGGGGCTGGAGGAGGTGGAGAGAGGAGGCTGCCGGAAGCCGCACTCGGG :|++|||++|++||||:||||||||||||||||||||||:||:++||||:++:|:|++|| 841 TTCGGGGCGGCGGGGGTTGGAGGAGGTGGAGAGAGGAGGTTGTCGGAAGTCGTATTCGGG >>>>> >>>>> 901 ACCTCTGCAGCCACCGACCAGACCGGGCGGCCGGGACTCTGGGACTCTCGCAGGCAGACC |::|:||:||::|:++|::|||:++||++|:++|||:|:|||||:|:|++:|||:|||:: 901 ATTTTTGTAGTTATCGATTAGATCGGGCGGTCGGGATTTTGGGATTTTCGTAGGTAGATT 961 CGGTGGTCTGCCGGACTCCTCGGGGCCCACTTCGGGCCCTCTCTCCTGCCTCCTATTTTT ++|||||:||:++||:|::|++|||:::|:||++||:::|:|:|::||::|::||||||| 961 CGGTGGTTTGTCGGATTTTTCGGGGTTTATTTCGGGTTTTTTTTTTTGTTTTTTATTTTT 1021 GGATTTCTCTCCTTTGCTCCCTTTTTCCTCCCGTTTTGAAGAGACAATGCTACTTCAGTT ||||||:|:|::||||:|:::|||||::|::++|||||||||||:||||:||:||:|||| 1021 GGATTTTTTTTTTTTGTTTTTTTTTTTTTTTCGTTTTGAAGAGATAATGTTATTTTAGTT M>> >>>>>> 781 GCACGGTGCCCAGCGCAGGGAGAACAAATGATCATCTGTCCAACGCGCCCATTTACAGGT +:|++|||:::||++:||||||||:|||||||:||:|||::||++++:::|||||:|||| 781 GTACGGTGTTTAGCGTAGGGAGAATAAATGATTATTTGTTTAACGCGTTTATTTATAGGT M>>>>>>> 421 CTGCACAATGGCGAGCCTGTCCGGAGGGGCGCGCCGCGGCCAGACAGCCATGCTCTGTGC :||:|:|||||++||::|||:++||||||++++:++++|::|||:||::|||:|:||||+ 421 TTGTATAATGGCGAGTTTGTTCGGAGGGGCGCGTCGCGGTTAGATAGTTATGTTTTGTGC M< U