Thiết kế vector biểu hiện gen organophosporus hydrolase ophc2 phục vụ tạo cây chuyển gen phân hủy thuốc trừ sâu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN MẠNH CƯỜNG THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN ORGANOPHOSPHORUS HYDROLASE (OPHC2) PHỤC VỤ TẠO CÂY CHUYỂN GEN PHÂN HỦY THUỐC TRỪ SÂU LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC 1Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn THÁI NGUYÊN - 2012 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN MẠNH CƯỜNG THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN ORGANOPHOSPHORUS HYDROLASE (OPHC2) PHỤC VỤ TẠO CÂY CHUYỂN GEN PHÂN HỦY THUỐC TRỪ SÂU Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.80 LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS LÊ VĂN SƠN 2Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn THÁI NGUYÊN - 2012 MỤC LỤC Trang Mục lục i Danh mục chữ viết tắt iii Danh mục bảng luận văn v Danh mục hình luận văn vi MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 VẤN ĐỀ Ô NHIỄM MÔI TRƢỜNG VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI 1.1.1 Ơ nhiễm khơng khí 1.1.2 Ô nhiễm nƣớc 1.1.3 Ô nhiễm đất 1.1.3.1 Tình hình nhiễm đất Việt Nam giới 1.1.3.2 Ô nhiễm đất sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật 1.1.3.3 Các phƣơng pháp xử lý nhiễm hóa chất bảo vệ thực vật 10 1.1.4 Xử lý ô nhiễm môi trƣờng thực vật 14 1.2 XỬ LÝ Ô NHIỄM MÔI TRƢỜNG BẰNG CÂY CHUYỂN GEN 17 1.2.1 Tác động chuyển gen tới môi trƣờng 17 1.2.2 Nghiên cứu chuyển gen xử lý ô nhiễm môi trƣờng 18 1.2.3 Nghiên cứu tạo chuyển gen phân hủy thuốc bảo vệ thực vật 20 1.3 KỸ THUẬT CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT 20 21 1.3.2 Chuyển gen gián tiếp thông qua Agrobacterium 21 1.3.3 Giới thiệu vector pBI121 22 1.3.4 Gen OPHC2 25 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên i http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ 26 2.1.1 Vật liệu 26 2.1.2 Hóa chất, thiết bị 27 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 Hình 2.2 Minh họa tóm tắt q trình thí nghiệm thiết kế vector chuyển gen pBI121/OPHC2opt trình chuyển gen OPHC2opt vào thuốc thông qua A tumefaciens 29 2.2.1 Thiết kế cấu trúc OPHC2opt 29 2.2.2 Thiết kế vector chuyển gen OPHC2opt 34 2.2.3 Chuyển cấu trúc mang gen OPHC2opt vào thuốc 37 2.2.4 Phƣơng pháp đánh giá dòng thuốc chuyển gen 38 2.2.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu 39 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 THIẾT KẾ CẤU TRÚC MANG GEN OPHC2opt 40 3.1.1 Đổi mã gen OPHC2 tối ƣu biểu thực vật (OPHC2opt) 40 3.1.2 Thiết kế mồi đặc hiệu cho gen OPHC2opt 43 3.1.3 Kết tổng hợp mồi gen OPHC2opt 43 3.2 THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN OPHC2opt 45 3.2.1 Thiết kế vector tái tổ hợp pBI121 mang gen OPHC2opt 45 3.2.2 Kết tạo dòng A tumefaciens 51 3.3 KẾT QUẢ TẠO CÂY THUỐC LÁ MANG GEN OPHC2opt 52 3.3.1 Kết chuyển gen OPHC2opt vào mảnh 52 3.3.2 Kết kiểm tra thuốc mang gen 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 Kết luận 57 Kiến nghị 57 CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC 64 4Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ii http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT aa amino acid - axit amin BAP 6- benzyl amino purine Bp Base pair Bt Bacillus thuringiensis BVTV Bảo vệ thực vật cs Cộng DDT Dichloro-diphenyl-trichloroethane DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxy Nucleotide Triphosphate EDTA Ethylene diamine tetra- acetic acid E coli Escherichia coli GM Germination medium - Môi trƣờng nảy mầm hạt GMO Genetically modified organism - Sinh vật biến đổi gen GMP Genetically modified plant - Thực vật biến đổi gen gus - Glucuronidase gene ( Gen mã hóa enzyme - Glucuronidase) IBA Indole - butyric acid IPTG Isopopyl -D-1 thiogalactopyranoside Kb Kilo base LB Luria Bertani MS Môi trƣờng nuôi cấy mô theo Murashige Skoog MSI Dung dịch I (muối đa lƣợng) dùng để pha môi trƣờng MS MSII Dung dịch II (muối đa lƣợng) dùng để pha môi trƣờng MS MSIII Dung dịch III (|sắt) dùng để pha môi trƣờng MS MSIV Dung dịch IV (muối vi lƣợng) dùng để pha môi trƣờng MS MSV Dung dịch V (vitamin) dùng để pha mơi trƣờng MS 5Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên iii http://www.lrc-tnu.edu.vn OD Optical density OP Organophosphorus OPH Organophosphorus hydrolase Opt optimization-Tối ƣu hóa PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi polymerase PM10 Particulate matter 10 - Những hạt bụi có kích thƣớc bé 10 micromet RM Rooting medium - Môi trƣờng rễ RDX Royal Demolition eXplosive – Chất độc gây nổ (hexahydro1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine hay (CH2-N-NO2)3) TAE Tris - Acetate - EDTA Taq Thermus aquaticus UOW The University of Wollongong – Trƣờng đại học Wollongong TNT Trinitrotoluen v/p vòng / phút X-gal 5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactopyranoside WHO World Health Organization – Tổ chức y tế giới 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid 2,4,5-T 2,4,5-Trichlorophenoxyacetic acid 6Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên iv http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN Trang Bảng 1.1 Thời gian tồn lƣu đất số nông dƣợc Bảng 1.2 Lƣợng thuốc trừ sâu sử dụng Việt Nam qua năm Bảng 1.3 Dƣ lƣợng thuốc bảo vệ thực vật đất nghiên cứu (µg/kg) Bảng 2.1 Các vector sử dụng thí nghiệm 26 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 31 Bảng 2.3 Thành phần hóa chất tách chiết plasmid 32 Bảng 2.4 Thành phần dung dịch đệm tách chiết DNA 33 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng 34 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng ghép nối 36 Bảng 3.1 Trình tự mồi nhân gen OPHC2opt 43 Bảng 3.2 Kết tạo thuốc chuyển gen OPHC2opt 53 7Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên v http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN Trang Hình 1.1 Thực vật xử lý ô nhiễm môi trƣờng 15 Hình 1.2 Mơ hình hấp thụ chất thực vật 15 Hình 2.1 Sơ đồ trình chuẩn bị cấu trúc gen OPHC2opt 28 Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen OPHC2opt vào thuốc 29 Hình 2.3 Cấu trúc gen chuyển vector pBI121 35 Hình 3.1 Trình tự nucleotide gen OPHC2 40 Hình 3.2 Trình tự aa protein quy định gen OPHC2 40 Hình 3.3 Trình tự nucleotide gen OPHC2opt 41 Hình 3.4 So sánh trình tự gen OPHC2 P.pseudoalcaligenes (OPHC2) OPHC2 sửa đổi (OPHC2opt) 42 Hình 3.5 Sơ đồ cấu trúc OPHC2opt chuyển vào thực vật 42 Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR pBluescipt II SK/ OPHC2opt 44 Hình 3.7 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt vector pBI121 BamHI SacI 45 Hình 3.8 Hình ảnh điện di sản phẩm gel vector pBI121 cắt mở vòng enzyme BamHI SacI 46 Hình 3.9 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt 47 plasmid pBluescript II SK/OPHC2opt enzyme BamHI SacI 47 Hình 3.10 Hình ảnh điện di sản phẩm gel cấu trúc OPHC2opt 48 Hình 3.11 Hình ảnh đĩa ni cấy E coli DH5α biến nạp pBI121/OPHC2opt 49 Hình 3.12 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pBI121/OPHC2opt 49 Hình 3.13 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt kiểm tra vector pBI121/OPHC2opt 50 8Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên vi http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 3.14 Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR khuẩn lạc A tumefaciens Cv58A1 cặp mồi đặc hiệu OPHC2-F/OPHC2-R 52 Hình 3.15 Ảnh minh họa giai đoạn chuyển gen vào thuốc 54 Hình 3.16 Hình ảnh so sánh khả phát sinh rễ thuốc 55 sau nuôi cấy môi trƣờng rễ 55 Hình 3.17 Hình ảnh điện di mẫu DNA tổng số mẫu 55 thuốc chuyển gen OPHC2opt 55 Hình 3.18 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen OPHC2opt 56 từ thuốc chuyển gen cặp mồi đặc hiệu 56 9Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên vii http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Việc sử dụng tràn lan thuốc bảo vệ thực vật sản xuất nông nghiệp nguyên nhân gây ô nhiễm đất nhiều khu vực sản xuất nông nghiệp, ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sức khoẻ ngƣời trồng [25], [41] Một lƣợng thuốc trừ sâu phát tán môi trƣờng sau lắng đọng dần xuống, ngấm vào đất Thuốc trừ sâu tồn dƣ lâu đất dẫn đến ô nhiễm nƣớc ngầm Chất độc từ thuốc trừ sâu ngấm vào giếng khoan, cơng trình nƣớc sinh hoạt, hồ, ao, sông, suối ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sức khỏe, sức sinh sản ngƣời động vật , làm đất nhiễm q trình cấp thiết nhằm bảo vệ nguồn tài nguyên đất, nƣớc sức khỏe ngƣời Để xử lý đất ô nhiễm ngƣời ta thƣờng sử dụng phƣơng pháp truyền thống nhƣ: rửa đất, cố định chất ô nhiễm phƣơng pháp hoá học phƣơng pháp vật lý, xử lý nhiệt, trao đổi ion, oxy hoá khử chất ô nhiễm, đào đất bị ô nhiễm để chuyển đến nơi chơn lấp thích hợp, Các phƣơng pháp thƣờng tốn kinh phí, giới hạn kỹ thuật hạn chế diện tích Gần đây, nhờ hiểu biết , ngƣời ta bắt đầu ý đến khả sử dụng thực vật để xử lý môi trƣờng nhƣ công nghệ môi trƣờng đặc biệt Việc sử dụng thực vật công tác làm loại đất bị ô nhiễm thuốc bảo vệ thực vật (phytoremediation) công nghệ đƣợc áp dụng nhiều nƣớc giới, đem lại hiệu cao công nghệ nhƣ tiết kiệm tiền bạc Những nghiên cứu đƣợc tiến hành nhiều đối tƣợng thực vật nhƣ lúa, Arabidopsis thaliana dƣơng Tuy nhiên loại trồng truyền thống thƣờng có hạn chế định 10Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 3.14 Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR khuẩn lạc A tumefaciens Cv58A1 cặp mồi đặc hiệu OPHC2-F/OPHC2-R (M): Thang marker DNA kb (1 – 8): Các dòng khuẩn lạc A tumefaciens Cv58A1 Kết điện di hình 3.14 cho thấy: 7/8 dịng khuẩn lạc đƣợc lựa chọn cho kết dƣơng tính thực phản ứng PCR với băng có kích thƣớc khoảng 971 bp Với kết PCR đạt tỷ lệ 87,5%, khẳng định chúng tơi biến nạp thành công vector pBI121/OPHC2opt vào vi khuẩn A tumefaciens Cv58A1 Các chủng vi khuẩn 1, 2, 3, 4, 5, 6, phục vụ cho việc chuyển gen vào thực vật 3.3 KẾT QUẢ TẠO CÂY THUỐC LÁ MANG GEN OPHC2opt 3.3.1 Kết chuyển gen OPHC2opt vào mảnh Sau biến nạp thành công vector pBI121/OPHC2opt vào vi khuẩn A tumefaciens, tiếp tục tiến hành chuyển gen OPHC2opt thông qua việc biến nạp chủng vi khuẩn A tumefaciens mang cấu trúc gen OPHC2opt vào tế bào mảnh thuốc Nicotiana tabacum K326 đƣợc cắt tổn thƣơng cạnh nuôi cấy môi trƣờng cảm ứng GM trƣớc ngày Sau hai ngày đồng nuôi cấy tối (hình 3.12.A), chúng tơi tiến hành rửa khuẩn cefotaxim 500 mg/l, cấy chuyển mảnh sang 61Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 http://www.lrc-tnu.edu.vn mơi trƣờng GM có bổ sung cefotaxim 500 mg/l, kanamycin 50 mg/l BAP mg/l (hình 3.12.B) Sau 2-3 tuần xuất chồi nhỏ (hình 3.12.C) Số mảnh sống sót mơi trƣờng chọn lọc kháng sinh 284/600 Từ mảnh lá, tiến hành tách chồi nhỏ cấy lên môi trƣờng MS có bổ sung cefotaxim 250 mg/l, kanamycin 50 mg/l để nhân nhanh chồi Sau 4-5 tuần, thu đƣợc nhiều chồi từ mảnh cảm ứng tạo mô sẹo, chồi đƣợc cấy chuyển sang mơi trƣờng RM có bổ sung cefotaxim 250 mg/l, kanamycin 50 mg/l (hình 3.12.D) Tỷ lệ chọn lọc sơ mảnh môi trƣờng chọn lọc qua lần biến nạp đƣợc thể qua bảng 3.2 Bảng 3.2 Kết tạo thuốc chuyển gen OPHC2opt Số Số mảnh mảnh Biến Tổng lá nạp mảnh sống sống sót sau sót sau tuần tuần Số Số mảnh mảnh Số rễ sống sót cảm mơi sau ứng tạo trƣờng tuần chồi chọn lọc Lần 200 161 98 77 76 135 Lần 200 174 112 93 80 156 Lần 200 187 126 114 98 173 Tổng 600 522 336 284 254 464 Qua bảng 3.2, nhận thấy số lƣợng mảnh sống sót mơi trƣờng chọn lọc giảm dần theo thời gian, điều cho thấy khả mảnh tồn phát triển đƣợc mơ mang tế bào 62Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 http://www.lrc-tnu.edu.vn đƣợc chuyển gen Sau - tuần, có 254/600 mảnh sống sót mơi trƣờng chọn lọc qua lần biến nạp Sau – tuần, 464 thuốc chuyển gen hoàn chỉnh đƣợc tạo thành (hình 3.12.F) Hình 3.12 mơ tả tồn q trình chuyển gen tạo đƣợc thuốc mang gen OPHC2opt Hình 3.15 Ảnh minh họa giai đoạn chuyển gen vào thuốc A: Mảnh sau nhiễm khuẩn cấy môi trường GM B: Mảnh chuyển sang mơi trường GM có bổ sung cefotaxim 500 mg/l, kanamycin 50 mg/l C: Các cụm chồi tạo thành sau hai tuần nuôi cấy môi trường GM có bổ sung cefotaxim 500 mg/l, kanamycin 50 mg/l D: Các chồi màu xanh tách môi trường tạo rễ RM có bổ sung cefotaxim 250 mg/l, kanamycin 50mg/l E: Chồi không chuyển gen sau tuần mơi trường tạo rễ RM có bổ sung cefotaxim 250 mg/l, kanamycin 50 mg/l F: Chồi chuyển gen sau tuần mơi trường tạo rễ RM có bổ sung cefotaxim 250 mg/l, kanamycin 50 mg/l 63Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 3.15 F cho thấy thuốc chuyển gen OPHC2opt có xanh tốt, thân to khỏe, rễ phát triển hồn thiện Trong thuốc khơng chuyển gen có vàng, phiến nhỏ, khơng phát sinh rễ (hình 3.15.E) Hình 3.16 Hình ảnh so sánh khả phát sinh rễ thuốc sau nuôi cấy môi trƣờng rễ A: Bộ rễ không chuyển gen sau tuần mơi trường tạo rễ RM có bổ sung cefotaxim 250 mg/l, kanamycin 50 mg/l B: Bộ rễ chuyển gen sau tuần môi trường tạo rễ RM có bổ sung cefotaxim 250 mg/l, kanamycin 50 mg/l Hình 3.16 A, B cho thấy khác biệt rõ ràng rễ chuyển gen (hình 3.16.B) khơng chuyển gen (hình 3.16.A) 3.3.2 Kết kiểm tra thuốc mang gen Để kiểm tra có mặt gen chuyển thuốc chuyển gen, tiến hành tách DNA tổng số từ mẫu 30 thuốc chuyển gen OPHC2opt ngẫu nhiên Kết tách DNA tổng số đƣợc thể hình 3.17 Hình 3.17 Hình ảnh điện di mẫu DNA tổng số mẫu thuốc chuyển gen OPHC2opt 64Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 http://www.lrc-tnu.edu.vn Kết điện di hình 3.17 khẳng định 29 mẫu tách chiết DNA tổng số sử dụng đƣợc cho phản ứng PCR Để kiểm tra có mặt gen OPHC2opt cây, dùng phƣơng pháp PCR để nhân gen cặp mồi đặc hiệu OPHC2-F/OPHC2-R Phản ứng có nhiệt độ gắn mồi 550C Vì số gen thƣờng so với mẫu vi khuẩn nên phản ứng PCR phải kéo dài nên thí nghiệm chúng tơi cho lặp lại phản ứng 45 chu trình Hình 3.18 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen OPHC2opt từ thuốc chuyển gen cặp mồi đặc hiệu (M): Thang marker DNA 1kb; (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29): Các mẫu ADN dòng thuốc chuyển gen (+): Đối chứng dương ( Sản phẩm PCR plasmid pBluescript II SK /OPHC2opt) Kết thể hình 3.18 cho thấy, sản phẩm PCR điện di có 20/29 mẫu có sản phẩm PCR, kích thƣớc khoảng 971 bp, giống với kết mẫu đối chứng dƣơng Kích thƣớc hồn toàn phù hợp với chiều dài cấu trúc OPHC2opt chuyển gen Vì vậy, khẳng định gen OPHC2opt đƣợc chuyển vào thuốc Hiệu suất chuyển gen đạt tỉ lệ 68,9% Nhƣ vậy, bƣớc đầu thu đƣợc thuốc chuyển gen OPHC2opt 65Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 http://www.lrc-tnu.edu.vn KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1.1 Đã tổng hợp đƣợc cấu trúc mang gen OPHC2 có trình tự nucleotid biểu phù hợp thực vật 1.2 Thiết kế thành công vector chuyển gen pBI121/OPHC2opt biến nạp vào chủng vi khuẩn A tumefaciens Cv58A1 với tỉ lệ 87,5% 1.2 Đã tạo thuốc mang gen OPHC2opt phịng thí nghiệm phƣơng pháp chuyển gen gián tiếp qua Agrobacterium Hiệu suất chuyển gen OPHC2opt vào thuốc đạt 68,9% Kiến nghị 2.1 Đánh giá sơ dòng thuốc chuyển gen khả phân hủy thuốc trừ sâu Mep môi trƣờng 2.2 Chuyển gen OPHC2opt vào loại trồng khác có khả ứng dụng cao xử lý ô nhiễm thuốc trừ sâu đồng ruộng nơi lƣu trữ thuốc trừ sâu 66Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Ngun 57 http://www.lrc-tnu.edu.vn CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Lê Văn Sơn, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Nguyễn Mạnh Cƣờng (2012), “Thiết kế vector mang gen OPHC2 phục vụ tạo chuyển gen phân hủy thuốc trừ sâu”, Tạp chí Khoa học cơng nghệ, 90(02), 59-64 67Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 http://www.lrc-tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tài liệu tiếng Việt Lê Trần Bình (2008), Phát triển trồng chuyển gen Việt Nam, Bộ sách chuyên khảo, NXB Khoa học Công nghệ Lê Trần Bình (2003), Tài liệu thực hành cơng nghệ tế bào thực vật, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Bộ tài nguyên môi trƣờng (2010), Báo cáo môi trường quốc gia (2010), Tổng quan môi trường Việt Nam, Tạp chí Mơi trƣờng Việt nam Lê Thanh Hòa (2003), Sinh học phân tử virus Gumboro, nghiên cứu ứng dụng Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Đặng Đình Kim (2011), Xử lý nhiễm môi trường thực vật, Sách chuyên khảo, NXB Nông nghiệp Lê Đình Lƣơng, Quyền Đình Thi (2009), Kĩ thuật di truyền ứng dụng, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Chu Văn Mẫn (2003), Ứng dụng tin học sinh học, NXB Đại học Quốc Gia, Hà Nội Nguyễn Đức Thành (2003), Chuyển gen thực vật, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật - Nghiên cứu ứng dụng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 10 Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen nguyên lý ứng dụng, NXB Khoa học & Ký thuật 11 Khuất Hữu Thanh (2006), Cơ sở di truyền phân tử kĩ thuật gen, NXB Khoa học kĩ thuật, Hà Nội 12 Phan Tuấn Triều (2007), Giáo trình tài ngun đất mơi trường, NXB ĐH Quốc gia 68Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 http://www.lrc-tnu.edu.vn 13 Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khôi (1996), Xử lý thống kê kết nghiên cứu thực nghiệm nông, lâm, ngư nghiệp máy vi tính, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội B Tài liệu tiếng Anh 14 Amaya-Chavez A(2006), “Metyhyl parathion toxicity to and removal efficiency by Typha latifolia in water and artificial sediments”, Chemosphere, 63, pp.1124-1129 15 Atreatfild SJ (2007), “Approaches to achieve high-level heterologous protein production in plants”, Plant biotechnology journal, 5(1), pp.5 16 Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, and Lipman DJ (1990), “Basic local alignment search tool”, J Mol Biol, 215, pp.403-440 17 Bondarenko S, Gan J (2004), “Persistence of Selected organophosphorus and carbamate insecticides in waters from coastal watershed”, Environ Toxicol Chem, 23, pp.2649 - 2654 18 Brown SL, Chaney RL, Angle JS, Baker AJM (1995), “Zinc and cadmium uptake by hyperaccumulator Thlaspi caerulescens grown in nutrient solution”, Sci Soc Am J, 59, pp.125-133 19 Chu XY, Wu NF, Deng MJ, Tian J, Yao B, Fan YL (2006), “Expression of organophosphorus hydrolase OPHC2 in Pichia pasto-ris: purification and characterization”, Protein Expr Purif, 49, pp.9-14 20 Coleman JOD, Blake-Kalff MMA, Davies TGE (1997), “Detoxification of xenobiotics by plants: Chemicalmodification and vacuolar compartimentation”, Trends Plant Sci, 2, pp.144-151 21 Hannink N, Rosser SJ, French CE, Basran A., Murray JA, Nicklin S, Bruce NC (2001), “Phytodetoxification of TNT by transgenic plants expressing a bacterial nitroreductase”, Nat Biotechnol 19 pp.1168-1172 69Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 http://www.lrc-tnu.edu.vn 22 Kapouzas DG, Singh BK (2006), “Microbial degradation of organophosphorus xenobiotics: metabolic pathways and molecular basis”, Adv Microb Physiol, 51, pp.119-185 23 Kawahara J, Horikoshi R (2005), “Air pollution and young childrens’s inhalation exprosure to organophosphorus pesticide in agricultultural community in Japan Environ”, Int, 31, pp.1123-1132 24 Kawabe A, Miyashita NT (2003), “Patterns of codon usage bias in three dicot and four monocot plant species”, Genes Genet Syst, 78(5), pp 43-52 25 Kawahigashi H (2009), “Transgenic plants for phytoremediation of herbicides”, Curr Opin Biotechnol, 20(2), pp.225-30 26 Konstantinou IK, Hela DG (2006), “The status of pesticide pollution surface waters (rivers and lakes) of Greece Part I” Revew on occurrence and levels, Environ Pollut, 141, pp.555-570 27 McGrath SP, Zhao FJ (2003), “Phytoextraction of metals and metalloids from contaminated soils”, Curr Opin Biotechnol, 14, pp.277-282 28 Murashige T, Skoog F (1962), “A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures”, Physiol Plant , 15(3), pp.473-497 29 Pagliuca G, Serraino A (2006), “Organophosphorus pesticides residues in Intalian raw milk”, J Dairy Res, 73, pp.340-344 30 Qian L, He Y, Hu Y (2006), “Ditermination of organophosphorus pesticides residus in vegetables by electrokinetic sequential injection alanasis”, Spectrosc Lett 39, pp.581-592 31 Ruiz ON, Hussein HS, Terry N, Daniell H (2003), “Phytoremediation of organomercurial compounds via chloroplast genetic engineering”, Plant Physiol, 132, pp.1344-1352 32 Rylott EL, Jackson RG, Edwards J, Womack GL, Seth-Smith HM, Rathbone DA, Strand SE, Bruce NC (2006), “An explosive-degrading 70Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 http://www.lrc-tnu.edu.vn cytochrome P450 activity and its targeted application for the phytoremediation of RDX”, Nat Biotechnol, 24 pp.216-219 33 Salt DE, Smith RD, Raskin I (1998), “Phytoremediation”, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 49, pp.643 – 668 34 Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Mannul, 1st ed Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 35 Sandermann H (1994), “Higher plantmetabolismof xenobiotics: “The green liver concept”, Pharmacogenetics, 4, pp.225-241 36 Singh BK, Walker A (2006), “Microbial degradation of organophosphorus compounds”, FEMS Microbiol Rev, 30, pp.428-471 37 Singh OV, Labana S, Pandey G, Budhiraja R, Jain RK (2003) “Phytoremediation: an overview of metallic ion decontamination from soil”, Microbiol Biotechnol, pp.405-412 38 Topping JF (1988), “Tobacco transformation”, Methods of Molecular Biology, 81, pp.365 39 Wang X, Wu N (2008), “Phytodegradation of organophosphorus compounds by transgenic plant expressing a bacterial organophosphorus hydrolase” BBRC, 365, pp.453-458 40 Wang L, Samac DA, Wackett NS, Lawrence P, Vance CP, Olszewski NE, Sadowsky MJ (2005), “Biodegradation of atrazine in transgenic plants expressing a modified bacterial atrazine chlorohydrolase (atzA ) gene” Plant Biotechnol, 3, pp.475-486 41 Wouchope RD (1978), “The pesticide content of surface water draining from agricultural fields – A revew”, J Environ Qual, 7, pp.459-465 42 Wu NF, Deng MJ, (2004), “Isolation, purification and characterization of new organophosphorus hydrolase OPHC2”, Chin Sci Bull, 49, pp.268- 272 71Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 62 http://www.lrc-tnu.edu.vn C Website 43 http://www.agbiotech.com.vn 44 http://en.wikipedia.org 45 http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html 46 http://www.monre.gov.vn 47 http://news.uns.purdue.edu 48 http://nongnghiep.vn 49 http://vea.gov.vn 50 http://vietbao.vn 72Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 63 http://www.lrc-tnu.edu.vn PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần loại môi trƣờng Môi trƣờng Thành phần LB đặc g/l yeast extract + 10 g/l bacto tryptone + 10 g/l NaCl + 15 g/l bacto agar, pH = LB lỏng g/l yeast extract + 10 g/l bacto tryptone + 10 g/l NaCl, pH = MS I KNO3 1900mg/l + NH4NO3 1650mg/l + MgSO4.7H2O 370mg/l + K2HPO4 170mg/l MS II CaCl2 332mg/l MS III FeSO4.7H2O 27,84mg/l + Na2EDTA 37,24mg/l MS IV MS V MS đặc ZnSO4 8,6mg/l + H3BO3 6,2mg/l+ Na2MnO4 0,25mg/l + CuSO4 0,025mg/l + CoCl2 0,025mg/l + KI 0,83mg/l + MgSO4.H2O 16,9mg/l thiamin HCl 1mg/l + pyridoxyl HCl 0,5mg/l + nicotinic acid 0,5mg/l + glyxin 2mg/l + myo inositol 100mg/l 20ml/L MS I + 10ml/L MS II + 10 ml/L MS III + 10 ml/L MS IV + 10 ml/L MS V + 30 g đƣờng + g thạch, pH = 5,8 MS lỏng 20ml/L MS I + 10ml/L MS II + 10 ml/L MS III + 10 ml/L MS IV + 10 ml/L MS V + 30 g đƣờng, pH = 5,8 ½ MS 10 ml/L MS I + ml/L MS II + ml/L MS III + ml/L MS IV + ml/L MS V, pH = 5,8 GM 20ml/L MS I + 10ml/L MS II + 10 ml/L MS III + 10 ml/L MS IV + 10 ml/L MS V + mg/l BAP+ 30 g đƣờng + g thạch, pH = 5,8 RM 20ml/L MS I + 10ml/L MS II + 10 ml/L MS III + 10 ml/L MS IV + 10 ml/L MS V + 0,1 mg/l IBA + 30 g đƣờng + g thạch, pH = 5,8 73Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 64 http://www.lrc-tnu.edu.vn Phụ lục 2: Sơ đồ vector pBI121 Sơ đồ vector pBI121 Sơ đồ Ti-Plasmid thuộc vector pBI121 74Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 65 http://www.lrc-tnu.edu.vn Phụ lục 3: Sơ đồ vector pBluescript II SK/OPHC2opt 75Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 66 http://www.lrc-tnu.edu.vn ... tài: ? ?Thiết kế vector biểu gen organophosphorus hydrolase (OPHC2) phục vụ tạo chuyển gen phân hủy thuốc trừ sâu? ?? Mục tiêu nghiên cứu Thiết kế đƣợc cấu trúc mang gen OPHC2opt tối ƣu phù hợp với biểu. .. 3.2 THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN OPHC2opt 45 3.2.1 Thiết kế vector tái tổ hợp pBI121 mang gen OPHC2opt 45 3.2.2 Kết tạo dòng A tumefaciens 51 3.3 KẾT QUẢ TẠO CÂY THUỐC LÁ MANG GEN OPHC2opt... TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN MẠNH CƯỜNG THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN ORGANOPHOSPHORUS HYDROLASE (OPHC2) PHỤC VỤ TẠO CÂY CHUYỂN GEN PHÂN HỦY THUỐC TRỪ SÂU Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã