Nghiên cứu sản suất chế tạo bào tử nấm kí sinh côn trùng từ chủng nấm lecanicillium lecaiil439 và đánh giá nhược điểm sinh học của chế phẩm

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC _o0o _ CHU HỒNG QUẢNG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM BÀO TỬ NẤM KÍ SINH CƠN TRÙNG TỪ CHỦNG NẤM LECANICILLIUM LECANII L439 VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHẾ PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên – 2013 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC _o0o _ CHU HỒNG QUẢNG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM BÀO TỬ NẤM KÍ SINH CƠN TRÙNG TỪ CHỦNG NẤM LECANICILLIUM LECANII L439 VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHẾ PHẨM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS VŨ VĂN HẠNH Thái Nguyên – 2013 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài: Rệp (Aphidoidae) nhóm trùng chích hút nhựa phổ biến giới, phân bố rộng rãi vùng ôn đới, cận nhiệt đới nhiệt đới Chúng kí sinh 11000 loài thuộc 243 họ khác nhau, có nhiều trồng quan trọng nhƣ loại ngũ cốc, bông, khoai tây, cà chua, họ cải [48] Chúng vừa hút cạn nguồn dinh dƣỡng vừa làm cản trở q trình hơ hấp, quang hợp cây, đồng thời truyền virus gây bệnh từ bị bệnh sang khỏe mạnh đồng ruộng [72] Theo thống kê, rệp côn trùng khác làm thiệt hại khoảng 15% sản lƣợng trồng giới [31] Biện pháp phòng trừ rệp chủ yếu dùng thuốc hóa học, thuốc có phổ tác dụng rộng nhiều đối tƣợng hiệu tác dụng nhanh Tuy nhiên, thuốc hóa học có độc tính cao, khó phân hủy điều kiện bình thƣờng, tích tụ lại đất, nƣớc, khơng khí sản phẩm nông nghiệp, làm ô nhiễm môi trƣờng, ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe ngƣời sinh vật có ích Ngồi ra, tính độc cao thuốc trừ sâu hóa học gây tƣợng đột biến kháng thuốc rệp dẫn tới nguy bùng phát dịch rệp hại nhiều loại trồng Việc ứng dụng khống chế sinh học loài thiên địch kí sinh trùng gây bệnh dùng để thay phần cho thuốc hóa học bảo vệ thực vật trồng trọt có ƣu điểm vƣợt trội nhƣ an tồn ngƣời mơi trƣờng sinh thái, góp phần trì phát triển bền vững ngành nơng nghiệp Nấm kí sinh trùng Lecanicillium ssp chi nấm có khả kí sinh tự nhiên số lồi rệp trùng Từ năm 1960, giới có nhiều cơng trình nghiên cứu ứng dụng nấm Lecanicillium ssp để diệt rệp hại trồng, vài sản phẩm đƣợc thƣơng mại hóa nhiên kết đạt đƣợc cịn nhiều hạn chế Vì vậy, việc tăng cƣờng nghiên cứu phát triển chế phẩm diệt rệp từ Lecanicillium ssp cần thiết Việc tối ƣu môi trƣờng lên men, sản xuất, bảo quản chế phẩm bào tử thử nghiệm độc lực bào tử vấn đề cần đƣợc giải nghiên cứu Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Vì lí trên, tơi thực đề tài: “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm bào tử nấm kí sinh côn trùng từ chủng nấm Lecanicillium lecanii L439 đánh giá đặc điểm sinh học chế phẩm”, đề tài đƣợc thực Phòng chất Chức sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu: Sản xuất chế phẩm bào tử nấm diệt rệp hại trồng có hiệu cao, an tồn, dễ sử dụng chuyển giao kĩ thuật cho hộ nông dân sản xuất sử dụng Nội dung nghiên cứu: Tối ƣu môi trƣờng lên men Sản xuất bào tử, phối trộn với chất phụ gia tạo chế phẩm bảo quản Thử nghiệm độc lực chế phẩm rệp hại Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ NỘI DUNG Chƣơng TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu rệp hại trồng 1.1.1 Cấu tạo, phân loại rệp đặc điểm sinh thái Rệp (Aphidoidae) họ lớn thuộc lớp côn trùng thuộc ngành chân khớp – động vật không xƣơng sống, thể chia thành ba phần (đầu, ngực, bụng), có ba cặp chân phân đốt, mắt kép có cặp râu, thể đƣợc bao bọc xƣơng chitin, chiều dài từ – 10 mm (Hình 1.1) Rệp có lớp biểu bì mềm, có cánh (dạng màng) khơng cánh Phần lớn thân rệp có màu xanh cây, đen, nâu, hồng khơng màu Rệp nhóm trùng chích hút phổ biến nay, phân bố tập trung vùng ôn đới [72], số sống cận nhiệt đới nhiệt đới với số lƣợng khoảng 3700 loài rệp đƣợc biết giới [48] Hình 1.1 Cấu tạo ngồi rệp (University of Birmingham, England) [105] Rệp sinh sản theo hình thức đơn tính hữu tính Vào mùa thu, có thay đổi cƣờng độ chiếu sáng, nhiệt độ, giảm sút nguồn thức ăn chất lƣợng thức ăn, rệp sinh rệp đực rệp Đặc điểm di truyền rệp đực giống hệt rệp mẹ ngoại trừ việc nhiễm sắc thể giới tính Rệp hữu tính thiếu cánh, trí thiếu vịi chích hút [72] Khi trƣởng thành, rệp giao Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ phối với rệp đực đẻ trứng Trứng sống sót qua mùa đơng khắc nghiệt nở rệp có cánh khơng cánh (Hình 1.2) Các rệp sinh sản vơ tính rệp khơng cánh rệp có cánh (khi khan thức ăn) để bay đến kí chủ khác Tuy nhiên, môi trƣờng ấm áp nhƣ vùng nhiệt đới nhà kính, rệp sinh sản vơ tính nhiều năm Trong vịng đời, rệp sinh 31 đến 93 rệp theo hình thức sinh sản [12], [111], [115] Đặc biệt, số lồi có khả sinh sản lồng, rệp mẹ sinh rệp rệp chuẩn bị sinh hệ có sẵn thể Cách sinh sản ảnh hƣởng đến kích thƣớc rệp tốc độ sinh sản tăng lên [54], [81] Hình 1.2 Vịng đời rệp (BMC Developmental Biology) [99] Trong điều kiện thuận lợi, vòng đời trung bình cá thể rệp khoảng 30 ngày Rệp sinh phát triển khoảng đến 10 ngày để trƣởng thành bắt đầu sinh sản hệ [68] Phần lớn rệp có thân mềm nên chúng dễ dàng bị giết nhiều kẻ thù tự nhiên nhƣ bọ rùa, ong bắp cày kí sinh, ấu trùng muỗi kí sinh, nhện cua, vi khuẩn, virus, lồi nấm kí sinh trùng nhƣ Neozygites fresenii, Entomophthorales, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Lecanicillium lecanii,… Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Rệp (Aphididae) có khoảng 4700 lồi, chúng kí sinh nhiều loại trồng cỏ dại khác nhƣ ngô, lúa mì, khoai tây, bơng, ớt, hoa hồng, cam, qt,… thuộc họ lúa, họ dƣa, họ cà, họ có múi,… gây thiệt hại hàng tỷ đô la Mỹ năm cho ngành nơng nghiệp trồng trọt [48] Các lồi rệp phá hoại trồng mạnh nhƣ rệp đào Myzus persicae Sulzer, rệp Aphis gossypii Glover, rệp ngô Aphis maydis, rệp đậu đũa Aphis craccivora Koch,… chúng thƣờng ẩn phần mặt dƣới lá, thân non chích hút nhựa [106], vừa làm cạn nguồn dinh dƣỡng vừa tiết chất đƣờng mật không làm đóng khí khổng mà cịn góp phần tăng phát triển mốc đen, làm ngăn cản ánh sáng đến mô quang hợp, ảnh hƣởng nghiêm trọng tới trao đổi chất suất trồng Ngồi ra, việc chích hút nhựa loài rệp làm lây lan virus gây bệnh từ bệnh sang khỏe mạnh [72] Loài rệp ngô Aphis maydis loại sâu hại phổ biến tồn giới, chúng kí sinh nhiều loại trồng nhƣ lúa miến (Sorghum), ngơ lúa mì,… với mật độ cá thể cao làm giảm sản lƣợng hạt lây truyền virus gây bệnh Rệp chích hút nhựa, làm tổn thƣơng tất phận khác ngô nhƣng chúng phá hoại mạnh phận bắp non râu ngô gây mức độ khô cháy khác nhau, ảnh hƣởng tới trình thụ phấn, thụ tinh hình thành hạt, dẫn tới giảm suất, chất lƣợng hạt ngơ [28] 1.1.2 Tình hình rệp hại trồng giới Việt Nam Tình hình rệp hại giới: Rệp loài trùng có tác hại nguy hiểm giới Chúng không gây hại trực tiếp, hút cạn nguồn dinh dƣỡng mà vật trung gian truyền nhiều loại virus gây bệnh cho thực vật, đồng thời khó kiểm sốt chúng loại thuốc bảo vệ hóa học thực vật thơng thƣờng khả kháng thuốc mạnh rệp nên số lƣợng cá thể tăng nhanh [34] Đậu tƣơng loại hạt dầu đƣợc trồng nhiều giới nhƣng suất bị đe dọa nghiêm trọng rệp đậu tƣơng (A glycines) Sản lƣợng hạt bị thiệt hại ƣớc tính khoảng 34%, theo tính tốn Catangui cộng (2009), số thiệt hại Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ chí lên đến 48 – 72% Nguyên nhân rệp chích hút làm giảm 50% tốc độ quang hợp [29] Đậu đũa (Vigna unguiculata) loại đƣợc trồng nhiều châu Phi, ƣớc tính sản lƣợng hàng năm khu vực khoảng 3,36 triệu Không giống nhƣ vải bị phá hoại chủ yếu A gossypii, đậu đũa bị phá hoại nhiều loài rệp nhƣ A craccivora, A leguminosae, A labburni, A fabae, Myzus persica A gossypii Ở khu vực khơng có biện pháp bảo vệ, sản lƣợng thiệt hại lên đến 20 – 100% [83] Rệp đào (Myzus persicae Sulzer) loài rệp nguy hiểm với trồng Chúng đƣơc biết đến từ năm 1776, thể có hình lê dài mm với nhiều mầu sắc khác Rệp đào kí sinh hàng trăm loài thuộc 40 họ khác Các phân bố rộng khắp giới, nhiều phân bố vùng lạnh nhƣ Atiso, bắp cải, cà rốt, súp lơ, ngô, su hào, cải dầu, củ cải đƣờng, cà chua,…[75] chúng hút nhựa làm cho chồi non cong queo, xoăn, làm rụng hoa non gây ảnh hƣởng đến sinh trƣởng phát triển Kennedy cộng (1962) liệt kê 100 loại virus lây truyền qua loài rệp Một số bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng nhƣ virus khoai tây, cà chua, củ cải, súp lơ, dƣa hấu, dƣa chuột,…[27] Rệp đào truyền virus gây bệnh khảm làm thiệt hại 60% suất dƣa chuột [101] Chúng gây bệnh trầm trọng cải bắp từ giai đoạn – lá, chúng chích hút dịch cây, lá, bẹ lá, dẫn đến héo, thân ủ rũ chết [114] Rệp cải bắp (còn gọi rệp cải hay rệp muội) (Brevicoryne brassicae) loài rệp gây thiệt hại lớn cho ngƣời trồng rau cải sản xuất dầu hạt cải Tùy theo vùng địa lý mùa vụ mà thời điểm rệp xuất nhƣ gia tăng mật độ cá thể cao có khác Rệp thƣờng chích hút nhựa lá, cụm hoa thân đồng thời gián tiếp truyền virus gây bệnh cho cải Thiệt hại rệp cải bắp gây từ 35 – 75% suất rau cải 6% hàm lƣợng dầu hạt cải [20] Rệp ngô (Aphis maydis): Rệp ngô phân bố rộng rãi vùng nhiệt đới cận nhiệt đới, kí sinh nhiều lồi khác thuộc họ lúa nhƣ đại mạch, lúa mì, lúa miến (cao lƣơng – sorghum), ngô, loại cỏ làm thức ăn gia súc,… đồng thời vật Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ trung gian truyền virus gây bệnh khảm mía, đốm ngơ, Trong điều kiện thuận lợi, rệp ngơ có vịng đời khoảng 15 ngày có nhiều hệ liên tiếp năm Rệp non trƣởng thành hút nhựa nõn ngô, bẹ lá, phiến lá, cờ, bi, làm cho ngô hết dinh dƣỡng, quăn giảm khả quang hợp, ngô trở nên gầy yếu, bắp bé không hạt, chất lƣợng hạt Thƣờng phát dịch ruộng khô hạn cằn cỗi vào thời kì ngơ trổ cờ, kết bắp [28], [110] Theo thống kế năm 1965 – 1970 suất ngô cho thấy mức độ phá hoại rệp ngô phụ thuộc nhiều vào điều kiện nhiệt độ độ ẩm môi trƣờng Ngô bị nhiễm rệp mức độ nhẹ (mật độ khoảng 400 cá thể rệp chùm râu bắp ngơ) khiến cho suất bình qn giảm tới 8,3% bị thiếu nƣớc, đủ nƣớc mức độ thiệt hại rệp gây không đáng kể Nếu mức độ nhiễm rệp mức trung bình mức độ thiệt hại lên đến 34,8% điều kiện trồng thiếu nƣớc 11,8% điều kiện đủ nƣớc Nếu mức độ nhiễm rệp nặng (mật độ rệp lên đến hàng trăm cá thể hầu hết chùm râu bắp ngô) làm suất suy giảm nghiêm trọng, trung bình dao động từ 43,2 – 91,8% ngô bị thiếu nƣớc 58,9% ngô đủ nƣớc [39] Lipaphis erysimi (rệp cải dầu) kí sinh số loài nhƣng chủ yếu loại cải cải dầu, ngồi cịn kí sinh cà rốt, cà chua bí xanh Ở phía đơng miền Trung Ấn Độ, L erysimi với M persicae Brevicoryne brassicae ba loại rệp nguy hiểm cải dầu (Brassica juncea) Trong L erysimi phá hoại nhiều nhất, riêng gây thiệt hại 35,4 – 91,3% sản lƣợng [24] Theo nghiên cứu Patel cộng (2004), khơng có biện pháp bảo vệ, L erysimi gây thiệt hại 80,6 – 97,6% [87] Trong nghiên cứu khác, Razaq cộng (2011) rằng, M persicae Brevicoryne brassicae gây thiệt hại 75,1 – 81,9% sản lƣợng cải dầu Multan, Punjab, Pakistan [94] Aphis craccivora (rệp đậu lăng) lồi rệp kí sinh nhiều loại trồng khác nhƣ đậu đũa, vải, táo, cà rốt, lúa mì, đậu lăng Theo nghiên cứu Hossain cộng (2006), A craccivora gây thiệt hại tới 9% cho sản xuất đậu lăng Tuy nhiên, sản lƣợng đậu lăng tăng 0,91 – 9,89% áp dụng biện pháp Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ diệt rệp gieo trồng tránh rệp [50] A craccivora truyền virus gây bệnh rụng đậu lăng, đậu ngựa, đậu gà [56], [80] Diuraphis noxia (rệp lúa mì Nga) chuyên phá hoại lúa mì, lúa mạch đen, lúa mạch trắng, yến mạch Theo nghiên cứu Akhtar cộng (2010), suất lúa mì bị giảm 7,9 – 34,2% D noxia phá hoại [15] Tình hình rệp hại trồng Việt Nam Tại Việt Nam, theo nghiên cứu thống kê nhà khoa học, nƣớc ta chịu phá hoại 250 loài rệp khác Tại đồng sông Cửu Long, sầu riêng bị rệp sáp phá hoại Một số ăn thành phố Hồ Chí Minh vùng phụ cận bị ảnh hƣởng nhiều loài rệp làm giảm suất thiệt hại kinh tế Cây cà phê số vùng Tây Nguyên gặp phải vấn nạn rệp sáp rệp Tại tỉnh Đắc Lắc, rệp sáp kí sinh chùm hoa non gây thiệt hại từ – 25% Tại tỉnh Đắc Nông, rệp công gây hƣ hại 500 ha, gây thiệt hại nặng cho 200 [10] Trong năm gần đây, thống kê loài gây hại cho trồng nƣớc ta, rệp đào mối đe dọa cho ngành nông nghiệp với gia tăng nhanh chóng diện tích số lƣợng trồng bị hại Chúng gây hại 300 loại trồng khác nhau, thƣờng thấy nhƣ: loại rau họ cải nhƣ cải trắng, cải củ, cải xanh, cải bắp; số ăn nhƣ đào, hồng, lê, mận Trong điều kiện nƣớc ta, rệp đào xuất gây hại quanh năm, tập trung nhiều thời tiết dịu mát, độ ẩm cao vào tháng – (vụ đông xuân) tháng – 10 (vụ thu đông) Rệp ngô Việt Nam phổ biến, chúng có khắp vùng trồng ngô từ đồng đến miền núi, rệp thƣờng phát triển nhiều mùa xuân mùa thu, lúc độ ẩm khơng khí cao Rệp thƣờng phá hại ngô từ giai đoạn –10 ngơ chín hồn tồn Chỉ tính riêng huyện Trà Ơn, Tam Bình Vũng Liêm (Vĩnh Phúc), diện tích ngơ bị nhiễm rệp từ – 7%, nhƣ tính nƣớc thiệt hại gây rệp ngô lớn [110], [116] Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng 83 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Bảng 11 Sự thay đổi trọng lƣợng (g) hỗn hợp chất – bào tử sau thời gian làm khô Thời gian làm khô (giờ) Khối lƣợng (g) chất – bào tử sau làm khô điều kiện M1 M2 M3 10 10 10 15 8,33 5,39 5,12 24 7,66 3,40 3,54 48 5,18 3,26 3,45 72 3,60 3,20 3,38 96 3,51 3,12 3,35 126 3,45 3,07 3,26 (F= 23,27, P < 0,001) M1 khối lƣợng mẫu đƣợc làm khơ bình hút ẩm chứa vơi sống M2 khối lƣợng mẫu đƣợc hong khơ điều kiện phịng có thơng gió M3 khối lƣợng mẫu đƣợc hong khô tủ hút Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng 84 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Bảng 12.Tỉ lệ (%) độ ẩm hỗn hợp chất bào tử theo thời gian làm khô Thời gian làm khô (giờ) Độ ẩm (%) chế phẩm điều kiện M1 M2 M3 80,02 80,02 80,02 15 63,28 33,96 31,25 24 56,67 14,03 15,43 48 31,78 12,59 14,56 72 16,99 12,00 13,82 96 15,16 11,25 13,48 126 14,50 10,69 12,60 (F = 12,28, P < 0,001) M1: % độ ẩm hỗn hợp chất - bào tử đƣợc làm khơ bình hút ẩm chứa vôi sống M2: % độ ẩm hỗn hợp chất - bào tửđƣợc làm khơ điều kiện phịng M3: % độ ẩm hỗn hợp chất - bào tử đƣợc làm khô tủ hút Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng 85 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Bảng 13 Tỉ lệ sống sót bào tử nấm L lecanii L439 sau thời gian bảo quản khác Tỉ lệ bào tử sống sót Công thức phối trộn sau thời gian bảo quản (%) Bảo quản (⁰C) tháng tháng tháng tháng 95,92 90,48 73,47 53,74 26 85,03 71,43 50,34 19,05 97,28 93,88 75,51 55,10 26 93,88 83,67 62,59 38,78 87,07 61,22 26,53 6,94 Do Chất paraffin Skimmilk Glucose 26 42,86 19,73 2,72 0,03 97,28 91,84 76,87 63,27 26 93,20 74,83 57,14 25,17 97,96 92,52 80,95 68,71 26 93,88 76,87 55,78 30,61 97,96 94,56 87,76 74,15 26 94,56 81,63 67,35 49,66 98,64 96,94 92,86 85,37 26 91,84 86,39 76,53 60,20 Mo 72%Mo 8%AT50, 10%EFW Silica gel Phụ gia bột tan Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng 86 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Bảng 14 Mật độ rệp khả diệt rệp ngơ phịng thí nghiệm chế phẩm bào tử nấm L lecanii L439 nồng độ khác Cơng thức thí nghiệm NSP NSP NSP NSP NSP 10 NSP MĐ HQ MĐ HQ MĐ HQ MĐ HQ MĐ HQ MĐ HQ CT1 25,00 0,00 24,33 2,67 19,33 22,67 12,67 63,29 1,67 98,66 2,00 98,91 CT2 25,00 0,00 20,67 17,33 11,33 54,67 2,67 92,93 0,00 100,00 0,00 100,00 CT3 25,00 0,00 13,33 46,67 1,67 93,33 0,00 100,00 0,00 100,00 0,00 100,00 CT4 25,00 0,00 25,00 0,00 24,67 1,33 33,67 0,00 127,00 0,00 183,33 0,00 CT5 25,00 0,00 25,00 0,00 25,00 0,00 35,00 0,00 123,00 0,00 189,33 0,00 P < 0,001 Bảng 15 Khả diệt rệp ngô nhà lƣới chế phẩm bào tử chủng nấm L lecanii L439 liều phun khác Mật độ (con/cây) Công thức Hiệu diệt rệp (%) NSP Độ lệch NSP Độ lệch 7NSP Độ lệch 10 NSP Độ lệch CT1 27,75 1,25 36,30 2,39 46,35 2,60 67,19 2,46 CT2 32,13 1,68 39,83 2,60 56,22 1,92 78,47 2,24 CT3 36,25 2,41 44,89 2,22 63,84 1,76 83,23 3,82 CT4 31,88 2,23 0 0 0 P < 0,05 87 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Bảng 16 Hiệu (%) diệt rệp ngô chế phẩm L lecanii L439 nồng độ x 108 bào tử/ml sau lần phun khác Mật độ(con/cây) Hiệu diệt rệp (%) Công thức NSP Độ lệch NSP L1 Độ lệch 7NSP L1 Độ lệch NSP L2 Độ lệch NSP L2 Độ lệch NSP L3 Độ lệch NSP L3 Độ lệch CT1 14,10 1,06 35,92 3,63 56,22 0,90 74,44 1,87 43,89 1,48 39,23 3,13 27,05 1,45 CT2 13,00 0,42 28,88 1,09 58,13 3,47 70,27 1,55 72,96 2,93 57,38 1,14 34,44 1,67 CT3 16,90 0,56 30,13 2,74 55,43 3,64 75,31 1,48 71,50 3,09 78,89 1,30 85,16 3,41 CT4 10,90 1,01 0 0 0 0 0 0 P < 0,05 Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng 88 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Hình thí nghiệm phịng thí nghiệm, nhà lƣới: Ảnh ngô nhiễm rệp chuẩn bi phun thử nghiệm Nhà lƣới Viện Bảo vệ thực vật, Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn A Khu vực thử nghiệm chế phẩm bào tử nấm L lecanii L439 Viện Bảo vệ thực vật, Bộ Nông nghiệp Phát triển Nơng thơn B Hình ảnh rệp ngơ ni phịng thí nghiệm nhiệt độ từ 28 – 30oC, độ ẩm tƣơng tƣơng đối khoảng 85%; A Rệp bắt từ đồng ruộng; B Rệp nuôi ngày i Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn này, tơi xin chân thành cảm ơn TS Vũ Văn Hạnh, Trƣởng Phòng Các chất chức Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, định hƣớng nghiên cứu, hƣớng dẫn thí nghiệm, chỉnh sửa luận văn tạo điều kiện hóa chất thiết bị nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán nghiên cứu Phòng Các chất chức sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam; cán nghiên cứu thuộc Bộ môn Côn trùng, Viện Bảo vệ Thực vật, Bộ Nông nghiệp Phát triển nơng thơn tận tình giúp đỡ việc tiến hành thí nghiệm Tơi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh thầy cô Khoa Khoa học Sự sống, Phòng Đào tạo Trƣờng Đại học Khoa học, Đại Học Thái Nguyên; Thầy, Cô Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện, giúp đỡ tơi q trình học tập Tôi xin chân thành cảm ơn Ủy ban Nhân dân huyện Hàm Yên, tỉnh Tuyên Quang cử đào tạo sau đại học Tôi xin cảm ơn gia đình bạn bè ln ln động viên, ủng hộ tinh thần để tơi hồn thành luận văn Thái Nguyên, tháng năm 2013 Ngƣời hƣớng dẫn Học viên TS Vũ Văn Hạnh Chu Hồng Quảng ii Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố cơng trình khác Tác giả luận văn Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng iii Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ MỤC LỤC MỞ ĐẦU NỘI DUNG Chƣơng TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu rệp hại trồng 1.1.1 Cấu tạo, phân loại rệp đặc điểm sinh thái 1.1.2 Tình hình rệp hại trồng giới Việt Nam 1.2 Thuốc diệt côn trùng 1.2.1 Tình hình sản xuất sử dụng thuốc trừ sâu 1.2.2 Ƣu nhƣợc điểm thuốc trừ sâu hóa học thuốc trừ sâu sinh học 13 1.3 Nấm kí sinh trùng Lecanicillium lecanii ứng dụng 16 1.4 Sản xuất tạo chế phẩm bào tử nấm kí sinh trùng 19 1.4.1 Lên men lỏng (chuẩn bị giống cấp 1, cấp 2) 20 1.4.2 Ảnh hƣởng môi trƣờng lên men rắn đến khả sinh bào tử nấm 21 1.4.3 Tạo chế phẩm bào tử sử dụng 23 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 26 2.1 Vật liệu 26 2.1.1 Chủng giống 26 2.1.2 Dung dịch đệm 26 Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng iv Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 2.1.3 Nguyên liệu 26 2.1.4 Môi trƣờng nuôi cấy 27 2.1.5 Thiết bị 27 2.2 Phƣơng pháp 28 2.2.1 Phƣơng pháp sản xuất chế phẩm bào tử nấm 28 2.2.2 Phƣơng pháp xác định độ ẩm 30 2.2.3 Tối ƣu điều kiện lên men rắn 31 2.2.4 Phƣơng pháp xác định số lƣợng khả sống sót bào tử sau bảo quản 32 2.2.5 Nghiên cứu khả diệt rệp hại ngô A maydis chế phẩm bào tử nấm L lecanii L439 33 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Tối ƣu điều kiện lên men rắn sản xuất bào tử nấm kí sinh trùng L lecanii L439 36 3.1.1 Ảnh hƣởng nguồn chất 36 3.1.2 Ảnh hƣởng tỉ lệ thành phần chất 37 3.1.3 Ảnh hƣởng độ dày chất 38 3.1.4 Ảnh hƣởng độ ẩm 39 3.1.5 Ảnh hƣởng độ pH chất lên men 40 3.1.6 Ảnh hƣởng nhiệt độ 41 3.1.7 Ảnh hƣởng nguồn nitơ 42 Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng v Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 3.1.8 Ảnh hƣởng muối khoáng 43 3.1.9 Ảnh hƣởng thời gian lên men 44 3.1.10 Khả sinh bào tử nấm L lecanii L439 lên men khối lƣợng lớn điều kiện môi trƣờng tối ƣu 45 3.2 Sản xuất bào tử nấm kí sinh trùng L lecanii L439 46 3.2.1 Lên men rắn sản xuất bào tử 46 3.2.2 Làm khô bào tử 47 3.2.3 Tách thu bào tử 49 3.2.4 Khả sống sót bào tử nấm L lecanii L439 điều kiện bảo quản 50 3.3 Khả diệt rệp ngô chế phẩm bào tử nấm L lecanii L439 53 3.3.1 Trong phịng thí nghiệm 53 3.3.2 Trong nhà lƣới 55 KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ 60 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 61 TÀI THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC 75 Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng vi Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu tạo ngồi rệp Hình 1.2 Vịng đời rệp Hình 1.3 Nấm Lecanicillium lecanii; 17 Hình 1.4 Sơ đồ trình sản xuất bảo tử nấm kí sinh trùng 20 Hình 2.1 Phƣơng pháp pha loãng bào tử 32 Hình 2.2 Phƣơng pháp đếm bào tử buồng đếm hồng cầu 33 Hình 3.1 Ảnh hƣởng nguồn chất tới khả sinh bào tử chủng nấm L lecanii L439 366 Hình 3.2 Ảnh hƣởng tỉ lệ bột ngô, cám gạo chất lên men đến khả sản xuất bào tử nấm L lecanii L439 377 Hình 3.3 Ảnh hƣởng độ dày chất môi trƣờng lên men xốp tới khả sinh bào tử chủng nấm L lecanii L439 39 Hình 3.4 Ảnh hƣởng độ ẩm môi trƣờng đến khả sản xuất bào tử chủng nấm L lecanii L439 39 Hình 3.5 Ảnh hƣởng độ pH mơi trƣờng đến khả sản xuất bào tử chủng nấm L lecanii L439 400 Hình 3.6 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả sản xuất bào tử chủng nấm L lecanii L439 411 Hình 3.7 Ảnh hƣởng nguồn nitơ đến khả sản xuất bào tử chủng nấm L lecanii L439 422 Hình 3.8 Ảnh hƣởng nguồn muối khống đến khả sản xuất bào tử chủng nấm L lecanii L439 433 Hình 3.9 Ảnh hƣởng thời gian lên men đến khả sinh bào tử của L lecanii L439 444 Hình 3.10 Khả sinh bào tử nấm L lecanii L439 lên men sản xuất bào tử quy mô lớn điều kiện môi trƣờng tối ƣu 455 Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng vii Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Hình 3.11 Lên men rắn nấm kí sinh trùng L lecanii L439 môi trƣờng gạo luộc; 466 Hình 3.12 Tỉ lệ (%) độ ẩm hỗn hợp chất bào tử theo thời gian làm khô 488 Hình 3.13 Tỉ lệ sống sót bào tử nấm L lecanii L439 sau thời gian bảo quản khác nhau; 511 Hình 3.14 Khả diệt rệp ngơ phịng thí nghiệm chế phẩm bào tử nấm L lecanii L439 nồng độ khác 54 Hình 3.15 Rệp ngơ ni phịng thí nghiệm trƣớc sau phun chế phẩm bào tử chủng nấm L lecanii L439; 55 Hình 3.16 Khả diệt rệp ngô nhà lƣới chế phẩm bào tử chủng nấm L lecanii L439 liều phun khác 56 Hình 3.17 Hiệu (%) diệt rệp ngô chế phẩm L lecanii L439 nồng độ x 108 bào tử/ml sau lần phun khác 587 Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng viii Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các dung dịch hóa chất đệm 26 Bảng 2.2 Danh mục thiết bị sử dụng thí nghiệm 27 Bảng 3.1 Số lƣợng bào tử L lecanii L439 từ môi trƣờng gạo luộc sau lên men 47 Bảng 3.2 Hiệu phƣơng pháp tách thu bào tử nấm kí sinh côn trùng L lecanii L439 49 Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng ix Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ĐC Đối chứng PDA Potato dextrose agar PDB Potato dextrose broth v/v Volume/ Volume w/v Weight/Volume w/w Weight /Weight ssp subspecies Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng ... diệt côn trùng Do vậy, việc tăng cƣờng nghiên cứu phát triển chế phẩm diệt côn trùng từ nấm Lecanicillium cần thiết 1.4 Sản xuất tạo chế phẩm bào tử nấm kí sinh trùng Bào tử nấm kí sinh côn trùng. ..ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC _o0o _ CHU HỒNG QUẢNG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM BÀO TỬ NẤM KÍ SINH CƠN TRÙNG TỪ CHỦNG NẤM LECANICILLIUM LECANII L439 VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC... đánh giá đặc điểm sinh học chế phẩm? ??, đề tài đƣợc thực Phòng chất Chức sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu: Sản xuất chế phẩm bào tử