Phuong phap dieu che enzyme co dinh
III.CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU CHẾ ENZYME CỐ ĐỊNH Về nguyên tắc có 3 phương pháp điều chế : Hấp phụ vật lý. Gắn enzme bằng liên kết đồng hóa trị. Gói enzyme trong khuôn gel. 1.Gắn enzyme lên chất mang bằng phương pháp hấp phụ vật lý và liên kết ion 1.1 Nguyên tắc - Hấp phụ enzyme lên các chất mang nhờ các liên kết như Van_der_van, liên kết Hidro hay liên kết kỵ nước. - Khi chất mang không có lỗ xốp, enzyme sẽ bám trên bề mặt chất mang. - Khi enzyme có lỗ xốp enzyme sẽ chui vào trong các lỗ xốp của chất mang. Ví dụ: + β-D Fructofuranosidase trên hydroxit nhôm. + Glucoamylase trên DEAE-Cellulose( Dietylaminoetyl- cellulose) hoặc trên DEAE-Sephadex (Dietylaminoetyl-sephadex) sử dụng để sản xuất liên tục glucose. 1.2 Một số chất mang thường dùng - Chất mang hữu cơ: than hoạt tính,cellulose . - Chất mang vô cơ : Silic, thủy tinh xốp, oxit kim loại. - Chất trao đổi ion : Amberlit, CM-xenluloza (cacboxyl metyl- cellulose) . - Polyme tổng hợp : Polyamit, nilon, polyvinil 1.3 Một số yếu tố ảnh hưởng tới sự cố định enzyme - Nồng độ enzyme - Độ pH: - Nhiệt độ - Khối lượng phân tử và bản chất của chất mang. 1.4 Ưu và nhược điểm của phương pháp Ưu điểm: Điều chế dễ dàng trong điều kiện nhẹ nhàng nên giữ được hoạt tính enzyme. Có thể sử dụng cho tất cả các loại reactor sinh học. Có thể tái sử dụng chất mang. Nhược điểm : Do lực tương tác giữa chất mang và enzyme yếu nên khó áp dụng trong sản xuất thực phẩm và dược phẩm. 2.Gắn enzyme lên chất mang bằng liên kết đồng hóa trị 2.1 Các phương pháp gắn enzyme - Gắn một giai đoạn. - Gắn hai giai đoạn Giai đoạn một: Hoạt hóa chất mang. Gia đoạn hai: Kết hợp enzyme vào chất mang đã hoạt hóa. 2.2 Điều kiện của các chất mang Độ hòa tan thấp Không gây tác dụng kìm hãm enzyme. Hấp phụ chọn lọc. Chất mang phải có bản chất háo nước, tốt nhất là có chứa điện tích trái dấu với enzyme. 2.3 Các chất mang thường sử dụng Các polyme hữu cơ như Polypeptit, polysacarrit Các dẫn xuất của xenlullose như CM-Xenlullose Các polyme tổng hợp : Polyacrymit, polystirol . Các chất vô cơ :Silicagel, Bentinit, nhôm hydroxit . 2.4 Phương pháp hoạt hóa chất mang Các chất mang có chứa nhóm NH2 ( aminobenzoylxellulza ) có thể được hoạt hóa bằng phản ứng diazo. Ngoài ra ta có thể hoạt hóa bằng cách cho tác dụng với phosgen hoặc tiophossgen để tạo thành dẫn xuất izonianat hoặc izotioxxianat.Các nhóm izoxianat hay izotioxianat khi ở pH trung tính sẽ liên kết dễ dàng với nhóm ε-amin của enzym. Nếu chất mang chứa nhóm COOH như CM-xelluloza hay nhựa tổng hợp cần được hoạt hóa bằng các phương pháp azit, cacbodimit hoặc anhydrit kép. + Hoạt hóa bằng phương pháp azit ( Điều chế được các enzyme không tan :tripsin, DNAase, kimotripsin,fixin,bromelin): + Hoạt hóa bằng phương pháp cacbodimit ( Thuận lợi đối với enzyme có tính axit cao như pepsin, renin): Nếu chất mang là polysacarit : Được hoạt hóa sơ bộ bằng halogen xianua. Thường dùng BrCN trong môi trường kiềm. +Giai đoạn hoạt hóa: +Giai đoạn kết hợp: Đối với chất mang chứa nhóm thiol sẽ hoạt hóa bằng 2,2 –dipyridldisulfua: 2.5 Ưu nhược điểm của phương pháp Ưu điểm Liên kết tạo ra bền trước tác nhân nhiệt độ , pH. Nhược điểm - Lượng enzyme cố định thường thấp hơn so với các phương pháp khác. - Hoạt tính enzyme có thể bị giảm do sự biến đổi cấu trúc hình thể enzyme. - Chi phí cao, kém hiệu quả. 3. Phương pháp gói enzyme trong khuôn gel Nguyên tắc: khi cho dung dịch enzyme vào các monome, monome sẽ trùng hợp tạo các polyme, các phân tử enzyme được giữ trong mạng lưới khuôn gel của polyme. Các gel thường được sử dụng như : Polyacrylamide, hydroxyethyl 2 metacrylat, polyuretan, polyvinyl, Na-alginat ,caraghenan, chistosan . 3.1 Enzyme được gói vào khuôn gel dưới dang hạt - Enzyme được hòa tan trong một dung dịch monome.Sau đó đươc polyme hóa với sự có mặt của một hay nhiều tác nhân tạo mạng lưới (reticulation). - Nếu là gel Alginat và caraghehan hay chitosan thì có thể tạo dượ dạng viên ( đường kính khoang 0,5_4 mm)bằng cách nhỏ giọt dung dịch enzyme và Alginatnattri vào dung dịch CaCl2. 3.2 Enzyme bị nhốt trong các lỗ nhỏ dạng sợi - Enzyme được cho vào dung dịch phân tán sợi collagen( trong dung môi nước-metanol ) và có khuấy từ. - Ta có thể nhốt enzyme trong các lỗ nhỏ của sợi tổng hợp. Phương pháp này hạn chế được sự phân cực bề mặt và sự bịt lấp thường gặp ở phương pháp màng. 3.3 Gói enzyme trong bao vi thể Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng trùng hợp các monome xảy ra trên bề mặt liên pha giữa nước và dung môi hữu cơ trong nhũ tương và tạo màng. 3.4 Phương pháp tiền polyme Nguyên tắc:Tạo liên kết chéo giữa các tiền polyme bằng chiếu quang để gói enzyme. Khi chiếu tia cực tím gần (360nm )lên dung dịch có chứa chất tiền polyme, enzyme và chất nhạy quang( benzoin etylete, benzoin zobutytele ) trong khoảng 3_5 phút sẽ tạo ra liên kết chéo giữa các gốc của tiền polyme. • So sánh các phương pháp cố định enzyme