Đang tải... (xem toàn văn)
Recently, malolactic fermentation (MLF) was identified as a major system for alkali production by oral streptococci, including Streptococcus mutans. Malolactic fermenta[r]
(1)33(4): 92-96 T¹p chÝ Sinh häc 12-2011
L£N MEN MALOLACTIC CñA Streptococcus mutans
Và VAI TRò BảO Vệ VI KHUẩN KHỏI TổN THƯƠNG OXI Hóa
NGUYễN THị MAI PHƯƠNG Viện Công nghệ sinh học
ROBERT E MARQUIS Đại học Rochester, Hoa Kú
Lªn men malolactic (malolactic fermentation - MLF) vi khn Oenococcus oeni thùc hiƯn ®) đợc nghiên cứu chi tiết vai trò quan trọng công nghiệp sản xuất rợu [5] Đây trình lên men thứ cấp sau trình lên men rợu nấm men thực Trong trình lên men này, axit L-malic dicarboxylic đợc chuyển hóa thành axit monocarboxylic L-lactic giải phóng CO2,
giúp làm tăng h−ơng vị làm giảm độ axit r−ợu Sự lên men đ−ợc phát nhiều chủng vi khuẩn lactic (LAB) khác nh− thành viên chi Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus [1-3] Quá trình decarboxyl hóa L-malic đ−ợc thực nhờ enzim malolactic (MLE) với có mặt NAD+
Mn2+ [11] Sự lên men kèm với trình
sinh tổng hợp ATP đợc xúc tác enzim F(H+)-ATPase màng, trình lên men
dẫn đến kiềm hóa tế bào chất L-lactic hình thành có độ axit thấp L-malic Điều cho phép proton đ−ợc vận chuyển từ bên ngồi vào tế bào chất thơng qua hoạt động enzim F-ATPase theo chế synthetase Kết ATP đ−ợc hình thành Mặt khác, sinh tổng hợp ATP cịn liên quan đến hệ thống vận chuyển đối ng−ợc malate/lactate (antiport) có tham gia F(H+)-ATPase [9] Gần đây,
Sheng Marquis [10] đ) phát thấy chủng Streptococcus mutans UA159 có mang gene m) hố cho q trình lên men malolactic có SMu 0121 m) hóa cho MLE có trình tự base t−ơng tự nh− trình tự enzim chủng LAB [1, 4] Khi nghiên cứu sinh lý trình này, tác giả đ) phát thấy MLF có vai trị làm kiềm hóa mảng bám (dental plaque), làm tăng khả chịu stress axit vi khuẩn S mutans Bài báo
trình bày phát chúng tơi vai trị MLF vi khuẩn S mutans chủng vi khuẩn Streptococcus xoang miệng khác việc bảo vệ tế bào khỏi tổn th−ơng oxi hóa gây gốc oxi hoạt động (ROS) O2-, H2O2 v OH-
I PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 1. Chủng vi khuẩn điều kiện nuôi cấy
Streptococcus mutans UA159 đ−ợc nuôi giữ cấy chuyển hàng tuần môi tr−ờng thạch chứa bovine heart infusion - BHI agar (Difco Laboratories, Detroit, MI) Tế bào đ−ợc nuôi cấy môi tr−ờng TYM chứa 3% tryptone, 0,5% cao nấm men, 25 mM glucose 50 mM L-malic để cảm ứng hoạt tính enzim malolactic (MLE)
2. Đo lên men L-malic
T bo c thu hoạch giai đoạn đầu phase ổn định đ−ợc rửa lần cách ly tâm tốc độ 6000 g 15 phút 4oC với
dung dịch muối có chứa 50 mM KCl mM MgCl2 Tế bào sau đ−ợc hịa trở lại với dung
(2)3. T¸c dụng bảo vệ tế bào
Cỏc gc oxi hoạt động (ROS) đ−ợc nghiên cứu bao gồm H2O2 (Sigma), OH- (tạo thành
tõ ph¶n øng Fenton cđa H2O2 kÕt hỵp víi ion kim
loại có khả chuyển đổi Cu2+) O 2- (tạo
thành từ hệ thống xanthine-xanthine oxidase) Cụ thể, tế bào S mutans sau nuôi cấy môi tr−ờng TYM đ−ợc thu hoạch, rửa hòa lại dung dịch muối có chứa 50 mM KCl mM MgCl2 nồng độ 0,4 mg trọng l−ợng khô tế bào
L-malic pH 4,0 đ−ợc thêm vào dung dịch tế bào để đạt nồng độ cuối 30 mM Sau đó, H2O2, tổ hợp chất H2O2/CuCl2 (để tạo OH-) hay tổ
hợp chất xanthine/xanthine oxidase (để tạo O2 -)
đ−ợc tiếp tục thêm vào thời điểm định, 100 àL mẫu đ−ợc lấy ra, pha lo)ng 10 lần liên tiếp với dung dịch peptone 1% (Difco Laboratories, Detroit, MI) pH 7,0 đ−ợc cấy trải đĩa thạch BHI Các đĩa đ−ợc ủ tủ ấm 37oC vòng 48 khuẩn
lạc hình thành rõ rệt, đếm đ−ợc mắt th−ờng [8]
4. Xác định hàm l−ợng ATP có tế bào chất
Hàm l−ợng ATP tế bào chất S mutans đ−ợc xác định theo ph−ơng pháp đo ATP huỳnh quang (bioluminescence) đ) đ−ợc Sheng & Marquis mô tả (2006) ATP đ−ợc chiết từ tế bào đệm Tris-HCl 20 mM nóng có chứa EDTA mM, pH 7,75 Hàm l−ợng ATP dịch chiết sau đ−ợc xác định sử dụng kit Luciferase/Luciferin h)ng Promega (Madison, WI) máy đo huỳnh quang Luminometer Turner Designs (Sunnyvale, CA), Model DT-20/20
II KếT QUả Và THảO LUậN
1. MLF khả tiếp nhận L-malic vi khuẩn S mutans
Hệ thống lên men L-malolactic đ−ợc phát nghiên cứu S mutans gần [10] Hệ thống đ−ợc xem có vai trò bảo vệ tế bào S mutans khỏi tổn th−ơng stress axit gây MLF đ−ợc bắt đầu việc tiếp nhận L-malic nhờ enzim permease nằm màng (Smu 0125) sau chất đ−ợc chuyển hóa thành axit L-lactic CO2 nhờ MLE
nằm tế bào chất chủng vi khuẩn có MLF đ) biết nh− LAB, MLF xảy mạnh giá trị pH thấp 3,0 [5, 11] Để tìm hiểu khả tiếp nhận L-malic S mutans, đ) tiến hành xác định khả đồng hóa L-malic giá trị pH khác để tìm điều kiện pH tối thích cho q trình lên men S mutans Kết trình bày hình cho thấy, MLF S mutans có thể diễn giá trị pH khác từ 3,0 đến 7,0 Tuy nhiên, giá trị pH 4,0 thích hợp cho hoạt động MLF S mutans, đồng nghĩa với việc vi khuẩn có khả tiếp nhận L-malic tốt MLF pH 4,0 đạt tới 10,2 mmole/phút/mg trọng l−ợng khô (TLK) tế bào so với giá trị 3,2 pH 3,0; 7,8 pH 5,0; 4,0 pH 6,0 1,6 pH 7,0 Động học trình tiếp nhận L-malic pH 4,0 đ) đ−ợc xác định (hình 2) cho thấy, giá trị pH 4,0, trình tiếp nhận đạt mức độ tuyến tính khoảng thời gian 60 phút sau tiến dần đến giá trị b)o hòa Những kết thu đ−ợc sở để lựa chọn điều kiện thích hợp cho nghiên cứu MLF
3.0 3.5 4.0 5.0 6.0 7.0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
H×nh MLF cđa S mutans giá trị pH khác
0 40 80 120 160 200 0
1 2 3
Hình 2. Động học trình tiếp nhận L-malic S mutans giá trị pH 4,0
m m ol e L -m al at e đ ợ c ti Õp n h Ën /g iê /m gT L K m m ol e L -m al at e đ ợ c ti ếp n h ận /g iê /m gT L K Phót pH
(3)
Hình LMF bảo vệ S mutans khỏi tác dụng gây chết gốc tự A H2O2; B OH-; C O2-
2. MLF b¶o vệ S mutans khỏi tác dụng gây chết c¸c gèc tù
MLF đ−ợc phát có vai trị bảo vệ S mutans khỏi tổn th−ơng axit [10], nh−ng ch−a có cơng bố đề cập đến vai trị trình sinh lý khác tế bào có stress oxi hóa, với stress axit hai stress phổ biến mảng bám
Các vi khuẩn xoang miệng có S mutans mảng bám phải th−ờng xuyên tiếp xúc với gốc ROS [7] Các gốc
ROS có khả cơng đại phân tử sinh học tế bào nh− protein, ADN lipid, gây chết tế bào [6] Vậy hệ thống MLF có vai trò nh− việc bảo vệ tế bào khỏi tác dụng gây tổn th−ơng oxi hóa ROS gây ra? Để tìm hiểu vấn đề này, đ) tiến hành nghiên cứu tác dụng gây chết tế bào S mutans có mặt gốc tự L-malic (cơ chất trình lên men MLF) Kết thu đ−ợc hình 3A cho thấy rằng, khơng có mặt L-malic, H2O2 có tỏc dng
gây chết mạnh tế bào với giá trị D (thời gian gây chết 90% quần thể tế bào) khoảng 15 phút C
A
Đối chøng 58 mM H2O2
58 mM H2O2+ 30 mM L-malic
0 10 20 30 40 50 60 70
-5,5 -4,5 -3,5 -2,5 -1,5 -0,5 0,5
Phót
L
og
N
/N
o
§èi chøng
1,25 mM xanthine+ 50 mU/ml xanthine oxidase (XO) 30 mM L-malic +1,25 mM xanthine+ 50 mU/ml XO 1,25 mM xanthine
50 mU/ml XO
B §èi chøng
49 mM H2O2 + 29 mM CuCl2
30 mM L-malic +49 mM H2O2 + 29 mM CuCl2
49 mM H2O2 29 mM CuCl2
0 10 20 30 40 50 60 70
-10 -8 -6 -4 -2
Phót
L
og
N
/N
o
-6,5 -5,5 -4,5 -3,5 -2,5 -1,5 -0,5 0,5
Phót
L
og
N
/N
o
(4)Tuy nhiên, có mặt L-malic trình MLF diễn ra, giá trị D tăng lên đến 27 phút, đồng nghĩa với việc tế bào đ) đ−ợc bảo vệ phần khỏi tác dụng ROS Một tranh t−ơng tự đ−ợc tìm thấy tế bào đ−ợc xử lý với OH- (tạo từ phản ứng H
2O2
CuCl2) O2
-(tạora từ phản ứng xanthine
xanthine oxidase) Đặc biệt, trờng hợp có mặt OH-, tác dụng bảo vệ cđa MLF lµ rÊt râ
rệt với giá trị D lần l−ợt đạt 10 26 phút (hình 3B) T−ơng tự nh− vậy, tác dụng bảo vệ MLF rõ ràng tr−ờng hợp O2- vớigiá trị D = 13 phút (hình 3C) Nh−
vËy cã thĨ thÊy r»ng, MLF có tác dụng bảo vệ tế bào khỏi tác dụng công gốc ROS Đây phát mối liên quan MLF stress oxi hãa ë vi khuÈn nãi chung vµ ë S mutans nói riêng
3. Sinh tổng hợp ATP trình MLF
Hàm lợng ATP tế bào chất S mutans trình MLF pH 4,0 ®)
đ−ợc xác định để tìm hiểu mối liên quan tác dụng bảo vệ tế bào khỏi tổn th−ơng oxi hóa ROS MLF trình sinh tổng hợp ATP Kết trình bày hình cho thấy, hàm l−ợng ATP nội sinh đ) tăng lên rõ rệt trình lên men so với đối chứng Tế bào sinh tổng hợp ATP mạnh khoảng 10 phút đầu trình tiếp nhận L-malic trì hàm l−ợng ATP cao suốt thời gian 60 phút thí nghiệm Trong đó, hàm l−ợng ATP mẫu đối chứng lại bị giảm dần đ−ợc sử dụng vào hoạt động sống sinh lý tế bào môi tr−ờng bị đói chất gần nh− biến sau 60 phút Phát đ) đ−ợc Sheng Marquis [10] mô tả tế bào đ−ợc xử lý với stress axit điều kiện có mặt L-malic Nh− vậy, số liệu thu đ−ợc nghiên cứu đ) cho thấy tăng c−ờng sinh tổng hợp ATP MLF có vai trị bảo vệ tổn th−ơng oxi hóa vi khuẩn S mutans thành phần quan trọng đáp ứng với tổn th−ơng oxi hóa vi khuẩn
Hình Hàm lợng ATP trình MLF t¹i pH 4,0 III KÕT LUËN
Lên men malolactic vi khuẩn S mutans có vai trị việc bảo vệ vi khuẩn khỏi tác dụng gây chết gốc oxi hoạt động gây thông qua việc tăng c−ờng sinh tổng hợp ATP trình lờn men ny
TàI LIệU THAM KHảO
1 Ansanay V., Dequin S., Blondin B &
Barre P., 1993: Cloning, sequence and expression of the gene encoding the malolactic enzyme from Lactococcus lactis FEBS Lett, 332: 74-80
2 Arthurs C E & Lloyd D., 1999: Kinetics, steroespecificity, and expression of the malolactic enzyme Appl Environ Microbiol, 65: 3360-3363
3 Battermann G & Radler F., 1991: A comparative study of malolactic enzyme and malic enzyme of different lactic acid bacteria Can J Microbiol, 37: 211-217 Denayrolles M., Aigle M and
Lonvaud-Funel A., 1994: Cloning and sequence analysis of the gene encoding Lactobacillus lactis malolactic enzyme: relationships with malic enzymes FEMS Microbiol Lett, 116: 79-86
§èi chøng 25 mM L- malic
nm
ol
e
A
T
P
/
m
g
T
L
K
0 10 20 30 40 50 60 70
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
(5)5 Herrero M., GarcÝa L A and DÝaz M., 2003: Malolactic bioconversion using a Oenococcusoeni strain for cider production: effect of yeast extract supplementation J Ind Microbiol Biotechnol, 30: 699-704 Imlay J A., 2003: Pathways of oxidative
damage Annu Rev Microbiol, 57: 395-418
7 Marquis R E., 2004: Applied and ecological aspects of oxidative-stress damage to bacterial spores and to oral microbes Sci Prog,87: 153-177
8 Phan T N., Reidmiller J S and Marquis R E., 2000: Sensitization of Actinomyces naeslundii and Streptococcus sanguis biofilms and suspensons to acid damage by fluoride and other weak acids
Arch Microbiol, 174: 248-255
9 Poolman B., Molenaar D., Smid E D.,
Ubbink T., Abee T., Renault P P &
Konings W N., 1991: Malolactic fermentation: electrogenic malate uptake and malate/lactate antiport generate metabolic energy J Bacteriol, 173: 6030-6037
10.Sheng J & Marquis R E., 2006: Enhanced acid resistance of oral streptococci at lethal pH values associated with acid-tolerant catabolism and with ATP synthase activity FEMS Microbiol Lett, 262: 93-98
11.Strasser de Saad A M., Pesce de Ruiz Holgado A A and Oliver G., 1988: Malolactic enzyme in Lactobacillus murinus Biochimie, 70: 357-365
MALOLACTIC FERMENTATION BY Streptoccocus mutans
AND PROTECTION AGAINST OXIDATIVE DAMAGE
NGUYEN THI MAI PHUONG, ROBERT E MARQUIS
SUMMARY
Streptococcus mutans isthe primary etiological agent of human dental caries The extraordinary ability of S
mutans to adapt and survive the environmental stresses in human mouth, particularly oxidative stress even
though it does not have catalase, a key protective enzyme against oxidative damage, make it be an attractive subject for dental research In the oral cavity, S mutans isroutinely exposed to reactive oxygen species (ROS) such as hydrogen peroxide (H2O2), superoxide (O2•−) and hydroxyl radical (OH•) generated by aerobic respiration, by H2O2 net secretors in plaque dental such as Streptococcus sanguis and S gordonii, or by exposure to H2O2-containing dental care products Alkali production by oral streptococci is considered important for dental plaque ecology and caries moderation Recently, malolactic fermentation (MLF) was identified as a major system for alkali production by oral streptococci, including Streptococcus mutans Malolactic fermentation is inducible by L-malate, involving decarboxylation of L-malate to yield L-lactic acid and concomitant reduction in acidity Our major objectives in the work described in this paper were to further define the physiology of MLF of S mutans and its roles in protection against oxidative stress damage For the first time, L-malic, was found to enhance the protection of S mutans against oxidative damage by reactive oxygen species including O2•− generated by xanthine-xanthine oxidase system; H2O2 and OH• produced via Fenton reaction between H2O2 and metal cations at pH values of 4.0 Protection involved L-malic uptake with the significantly enhanced production of ATP from malate fermentation, to maintain ATP pool levels for physiological activities in the cells In general, oxidative protection by malolactic fermentation against ROS damage involving catabolism of L-malic and ATP production is likely to be an important virulent trait of S
mutans
Key words: Streptococcus mutans, malolactic fermentation (MLF), oxidative damage