Khi ủ với enzyme giới hạn ở dung d ịch đệm, pH, nhiệt độ v à th ời gian thích hợp, đoạn ADN sẽ bị enzyme giới hạn cắt ở vị trí đặc hi ệu để tạo ra những phân đoạn ADN với kích[r]
(1)114
JOURNAL OF SCIENCE OF HNUE DOI: 10.18173/2354-1059.2017-0014 Natural Sci 2017, Vol 62, No 3, pp 114-120
This paper is available online at http://stdb.hnue.edu.vn
XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH rs10811661 GEN CDKN2A TRÊN QUẦN THỂ NGƯỜI VIỆT NAM SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP AS-PCR VÀ RFLP-PCR
Nguyễn Thị Trung Thu1, Bùi Thị Nhung2 Trần Quang Bình3 1
Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khoa Dinh dưỡng học đường Ngành nghề, Viện Dinh dưỡng Quốc gia 3Khoa Miễn Dịch Sinh học phân tử, Viện sinh dịch tễTrung ương
Tóm tắt Gen CDKN2Acó liên quan đến bệnh tiền đái tháo đường đái tháo đường týp thông qua giảm khối lượng tế bào β suy giảm tiết insulin Phương pháp AS-PCR
RFLP-PCR sử dụng đểxác định kiểu gen đa hình rs10811661 gen CDKN2Atrên lượng mẫu lớn quần thểngười Việt Nam Phương pháp AS-PCR sử dụng mồi ngược phát alen C (Rc): 5’-GGTAATAGACTTACTGTCATCG-3’ alen T (Rt):5’-GGTAATAGAC TTACTGTCATCA-3’ mồi xuôi (F): 5’- TCAGTTAAGCAGATGAAATTC-3’, nhiệt độ
bắt mồi 52 oC với sự có mặt của alen C hoặc T sản phẩm có kích thước 208 bp Phương pháp RFLP-PCR sử dụng mồi xuôi (F): 5’-ACCTTCAGCCACCTCTCTGTCTTTC-3’ mồi ngược (R): 5’-CCCATCCTGGGTAGGAGGAGCC- 3’, nhiệt độ bắt mồi 62 oC, sản phẩm có kích thước 350 bp Sau sử dụng enzyme cắt giới hạn PagI kiểu genCC
có sản phẩm (350 bp), kiểu gen TT có sản phẩm (280 bp 70 bp), kiểu gen CT sản
phẩm (350 bp, 280 bp 70 bp)
Từ khóa: AS-PCR, RFLP-PCR, rs10811661, gen CDKN2A, xác định kiểu gen
1 Mởđầu
Gen CDKN2A nằm cánh ngắn NST số vị trí 21 từ vịtrí 21967751 bp đến vị trí 21994490 bp, với kích thước: 26739 kb [1] Cấu trúc CDKN2A gồm exon (exon 1α, exon 1β, exon 2, exon 3) intron Exon exon ghép vào với exon thay thế1α, 1β tạo thành khung đọc khác Điều dẫn đến tạo sản phẩm protein P16INK$ P14ARF- chất ức chế khối u ảnh hưởng đến tuyến tụy tăng sinh tế bào β [2]
Gen CDKN2A tăng tính nhạy cảm tiền đái tháo đường bệnh đái tháo đường týp thông qua giảm khối lượng tế bào β sau suy giảm tiết insulin cần thiết thể với nhu cầu insulin tăng lên [3] Một chức quan trọng ảnh hưởng trực tiếp tới bệnh đái tháo đường týp nghiên cứu gen CDKN2A có vai trị ung thư tuyến tụy [4] xác định đột biến CDKN2A ở6/28 người (chiếm 21%) gia đình xác định chắn mắc bệnh ung thư tuyến tụy [5] Vì vậy, việc xác định đặc điểm đa hình CDKN2A có vai trị quan trọng nghiên cứu ảnh hưởng gen đến bệnh liên quan
(2)Xác định đa hình rs10811661 gen CDKN2A quần thể người việt nam sử dụng phương pháp…
115 Trong nghiên cứu trước sử dụng phương pháp RFLP-PCR để xác định đa hình rs10811661 gen CDKN2A [6, 7] Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu vềxác định kiểu gen đa hình rs10811661 gen CDKN2A Đểđáp ứng việc nghiên cứu đa hình rs10811661 gen CDKN2A quần thể người Việt Nam với thiết bị có nhu cầu mẫu lớn, tiến hành phương pháp AS-PCR đểxác định kiểu gen rs10811661 gen CDKN2Atrên lượng mẫu lớn sử dụng phương pháp RFLP-PCR để kiểm tra độ xác phương pháp
2 Nội dung nghiên cứu
2.1 Đối tượng phương pháp nghiên cứu * Đối tượng nghiên cứu
Mẫu máu sử dụng nghiên cứu lấy từ141 đối tượng thành phố Phủ Lý, tỉnh Hà Nam Mẫu ADN tách chiết từ 300 µL máu tồn phần lấy từ tĩnh mạch, chống đơng ETDA với bộkít Wizard Genomic DNA purification Kit (Promega Cat.#A1125, USA) theo hướng dẫn nhà sản xuất Độ tinh nồng độADN đo máy NanoDrop Nội dung nghiên cứu Hội đồng đạo đức nghiên cứu Y sinh học - Viện Vệ sinh dịch tễTrung ương thông qua Các đối tượng giải thích nghiên cứu kí vào giấy đồng ý tham gia nghiên cứu
* Thiết kế quy trình AS-PCR cho xác định kiểu gen rs10811661 gen CDKN2A - Thiết kế mồi
+ Bước Xác định trình tự trước sau rs10811661 gen CDKN2A genebank từ NCBI [1]
+ Bước Nhận biết trình tự nucleotide mismatch thiết kế mồi xuôi (ngược) để xác định alen C T rs10811661 gen CDKN2A dựa theo Wangkuhang cộng [8]
+ Bước Thiết kế mồi ngược sử dụng phần mềm Oligo Primer Analyse [9] UCSC In-Silico PCR trực tuyến [10] để chọn cặp mồi thích hợp đồng nhiệt độ bắt mồi (Ta) hai mồi không bắt cặp
- Thiết kế quy trình PCR
Để thực phản ứng AS-PCR phát kiểu gen đa hình rs10811661 gen CDKN2A, kiểu gen xác định nhờ hai phản ứng độc lập phát alen C alen T Mỗi phản ứng gồm thành phần: 0,8 µL nước (khơng nucleotide); 2,5 µL PCR master mix; 0,35 µL mồi xi, 0,35 µL mồi ngược 1,5 µL ADN mẫu Cần xác định chu trình nhiệt cho phản ứng PCR, đặc biệt phản ứng bắt mồi dựa cặp mồi sử dụng
Sản phẩm PCR xác định nhuộm với Redsafe, điện di gel agarose 30 phút 100 V, 0,5 X đệm TBE, so sánh với marker ΦX174 DNA HaeIII Digest Băng ADN phát sử dụng máy ảnh Geldoc-ItTM gel Băng ADN kiểm tra liệu có phù hợp với ngân hàng gen
* Thiết kế quy trình RFLP-PCR cho xác định kiểu gen rs10811661 gen CDKN2A Phương pháp RFLP-PCR thiết kếđể kiểm tra độ xác phương pháp AS-PCR - Thiết kế mồi:
+ Bước Xác định trình tự trước sau rs10811661 gen CDKN2A genebank từ NCBI [1]
+ Bước Xác định enzyme cắt giới hạn phù hợp để nhận biết alen C alen T sử dụng phần mềm: restrictionmapper.org [11]
(3)Nguyễn Thị Trung Thu, Bùi Thị Nhung Trần Quang Bình
116
Mỗi phản ứng RFLP-PCR phát kiểu gen đa hình rs10811661 gen CDKN2A chứa 15 µL gồm thành phần: µL nước (không nucleotide); 7,5 µL PCR master mix; µL mồi xi; µL mồi ngược 1,5 µL ADN mẫu Cần xác định nhiệt độ thích hợp cho phản ứng gắn mồi chu trình nhiệt cho phản ứng Sản phẩm PCR xác định nhuộm với Redsafe, điện di gel agarose 30 phút 100 V, 0,5 X đệm TBE, so sánh kết với marker ΦX174 DNA HaeIII Digest Băng ADN phát sử dụng máy ảnh Geldoc-ItTM gel Băng ADN kiểm tra liệu có phù hợp với ngân hàng gen
- Ủ enzyme cắt giới hạn xác định kết quả
Một phản ứng ủ enzyme gồm: µL sản phẩm PCR chất lượng tốt, 0,7 µL 10X đệm, 0,15 µL enzyme cắt giới hạn lựa chọn, 6,0 µL nước tinh Ủ sản phẩm PCR với enzyme cắt giới hạn nhiệt độ thời gian thích hợp theo khuyến cáo nhà sản xuất
Điện di 11,85 µL sản phẩm sau ủ thạch agarose 2,5% đệm TBE 0,5 X 30 phút 100 V nhuộm RedSafe, có marker PhiX174HaeIII Và chụp hình sản phẩm điện di sau ủ enzyme cắt giới hạn máy GelDoc Băng sản phẩm kiểm tra liệu có phù hợp với ngân hàng gen
2.2 Kết nghiên cứu thảo luận
2.1.1 Xác định quy trình AS-PCR * Thiết kế mồi
- Bước Xác định trình tự mồi trước sau rs10811661 gen CDKN2A
Từ liệu NCBI, trình tựđoạn gen chứa SNP rs10811661 gen CDKN2A nhận [1]: AATAATCCTGTTAACAGACTTGAAAGCACTTATCAGTTCTGTCTAATGAAGACAT TAGAACACCATAACCTTTCCGGCCCATTTTCTTTGTCAATAAGCGTTCTTGCCCTGTCA GCAGCTCACCTCCAGCTTTAGTTTTC(C/T)CATGACAGTAAGTCTATTACCCTCCTGAT CTGTCTTCTGGCTCCTCCTACCCAGGATGGGGAAGGTTTTTGACTTTACTGATATTCTC AGAACAAATTTTGGGAAGTAAATATAAGGTTT
Dựa vào trình tựđoạn gen chứa SNP, tiến hành chọn 20 - 25 nucleotide trước sau SNP để thiết kế mồi phù hợp cho phương pháp AS-PCR
- Bước Chọn trình tựnucleotide để thiết kế mồi
Dựa theo nguyên tắc chiều dài mồi, tỷ lệ GC mồi, không bắt cặp nucleotide mồi, nghiên cứu chọn trình tự sau SNP 5’-AGGGTAATAGACTTACTGTCATG-3’ để thiết kế mồi Nhiệt độ bắt mồi mồi xuôi 52,3 oC mồi ngược 51oC theo khuyến cáo phần mềm Oligo [9]
Mức nhiệt độ phù hợp cho phản ứng bắt cặp mồi với trình tự nucleotide mạch - Bước Xác định nucleotide mismatch thiết kế mồi nhận biết alen C/T
Nucleotide thứ tính từ đầu 3’ mồi sử dụng để thiết kế mismatch theo Wangkumhang cộng [8] Kết mồi ngược để phát SNP là:
Mồi phát alen C (Rc): 5’- GGTAATAGACTTACTGTCATCG - 3’ Mồi phát alen T (Rt): 5’-GGTAATAGACTTACTGTCATCA - 3’
Điểm mismatch nucleotide khác với nucleotide mạch gốc, có tác dụng làm tăng bắt cặp mồi tính đặc hiệu enzyme phản ứng [12]
- Bước Thiết kế mồi xuôi
Sử dụng phần mềm Oligo [9] UCSC In-Silico PCR (trực tuyến) [10] để thiết kế mồi xuôi cho mồi xuôi mồi ngược có tương đồng nhiệt độ bắt mồi khơng bắt cặp kích thước sản phẩm PCR khoảng 200 bp Kết mồi xuôi chọn là:
(4)Xác định đa hình rs10811661 gen CDKN2A quần thể người việt nam sử dụng phương pháp…
117 Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi xi mồi ngược ởtrên có kích thước 208 bp theo liệu NCBI [1]:
TCAGTTAAGCAGATGAAATTCTAAGAGTTAAGCTGGGATTTTCCAAAATAATCCT GTTAACAGACTTGAAAGCACTTATCAGTTCTGTCTAATGAAGACATTAGAACACCAT AACCTTTCCGGCCCATTTTCTTTGTCAATAAGCGTTCTTGCCCTGTCAGCAGCTCACCT CCAGCTTTAGTTTTC(C/T)GATGACAGTAAGTCTATTAC
* Thiết kế chu trình PCR
Với cặp mồi sử dụng, sử dụng phần mềm Oligo [9] UCSC In-Silicon PCR (trưc tuyến) [10] đểxác định nhiệt độ mồi xuôi 52,3 oC mồi ngược 51,0 oC Vì vậy, để chọn nhiệt độ gắn mồi (Ta) thích hợp cho phản ứng PCR, chúng tơi thực kiểm tra nhiệt độ bắt mồi nhiệt độ: 48 oC, 50 oC, 52oC 54 oC 31 chu kì (kết khơng hiển thị) Trong đó, nhiệt độ 52 oC cho kết rõ nét Kết điện di sản phẩm theo phương pháp AS-PCR nhiệt độ gắn mồi 52 oC thể Hình Các mẫu có alen C T cho băng 208 bp phù hợp với liệu từ NCBI
Hình Kết xác định kiểu gen SNP rs10811661 gen CDKN2A bằng phương pháp AS-PCR
M: Marker ΦX174 HAE III, 1 (TT), (CC), (CT), (TT), (CT), (TT), (CC) Vì vậy, chu trình phản ứng gồm biến tính ADN 94 oC phút, 32 chu kì gồm biến tính 94 oC 30 giây, gắn mồi 52 oC 30 giây, kéo dài mồi 72 oC 30 giây kéo dài 72 oC phút, cuối giữ hỗn hợp 15 oC sử dụng máy máy PCR mastercycle epgradient (hãng Eppendorf) Sử dụng phương pháp AS-PCR để xác định kiểu gen 100 mẫu nghiên cứu cho thấy tỷ lệđọc cao 99% (99/100)
Phương pháp AS-PCR tiến hành dựa hai phản ứng khuếch đại PCR song song riêng biệt, phản ứng sử dụng cặp mồi đặc hiệu đầu 3’ để nhận biết ADN [8] Điều dựa kéo dài mồi chỉkhi đầu 3’ mồi bắt cặp với alen mẫu Như vậy, có đa hình đơn nucleotide xảy ra, kết có thểxác định cách nhận biết chiều dài sản phẩm PCR Đây pháp đơn giản, nhanh chóng đáng tin cậy, mà khơng địi hỏi nhiều thiết bị máy móc đắt tiền nên khả áp dụng phịng thí nghiệm Việt Nam cao Đặc biệt, nghiên cứu có thểứng dụng xác định kiểu gen sốlượng lớn mẫu
2.1.2 Xác định quy trình RFLP-PCR
Để kiểm tra độ xác phương pháp AS-PCR, tiến hành sử dụng phương pháp RFLP-PCR thông qua enzyme cắt giới hạn
* Thiết kế mồi
- Bước Xác định trình tự mồi trước sau rs10811661 gen CDKN2A Kết quảđã trình bày mục 2.1.1
(5)Nguyễn Thị Trung Thu, Bùi Thị Nhung Trần Quang Bình
118
Sử dụng phần mềm restrictionmapper.org [11] nhận thấy, enzyme BspHI Eam1105I có khả cắt vị trí alen T, cịn enzyme Eam1105I có khả cắt vị trí C Vì vậy, chúng tơi lựa chọn enzyme cắt giới hạn PagIđể phân biệt alen C alen T
- Bước Chọn trình tựnucleotide để thiết kế mồi
Thiết kế mồi xuôi mồi ngược sử dụng phần mềm Oligo [9] UCSC In-Silico PCR (trực tuyến) [10] để chọn cặp mồi thích hợp đồng nhiệt độ nóng chảy (Tm), không bắt cặp, chiều dài mồi khoảng 20 nucleotide, tỉ lệ GC không 60% Chúng lựa chọn cặp mồi là:
Mồi xuôi: 5’-ACCTTCAGCCACCTCTCTGTCTTTC-3’
Mồi ngược: 5’-CCCATCCTGGGTAGGAGGAGCC-3’
Sản phẩm PCR từ liệu UCSC In-Silicon PCR (trưc tuyến) [10] gồm 350 bp:
ACCTTCAGCCACCTCTCTGTCTTTCATATTACTTATTGGCAGGGTTTCAAAAGGTT TTAGTCCTTACTTAATATAAACAAAAATGTACAATATTGACAAAGTTTCAGTTAAGCA GATGAAATTCTAAGAGTTAAGCTGGGATTTTCCAAAATAATCCTGTTAACAGACTTGA AAGCACTTATCAGTTCTGTCTAATGAAGACATTAGAACACCATAACCTTTCCGGCCCA TTTTCTTTGTCAATAAGCGTTCTTGCCCTGTCAGCAGCTCACCTCCAGCTTTAGTTTTC( C/T)CATGACAGTAAGTCTATTACCCTCCTGATCTGTCTTCTGGCTCCTCCTACCCAGGA TGGG
* Thiết kế quy trình PCR
Nhiệt độ nóng chảy mồi xuôi 65,4 oC mồi ngược 69,2 oC theo UCSC In-Silicon PCR (trực tuyến) [10] Vì nhiệt độ bắt mồi cao, để đảm bảo độ nhạy độ đặc hiệu nhiệt độ bắt mồi, kiểm tra nhiệt độ bắt mồi: 58 oC, 60 oC, 62 oC 64 oC (kết không hiểu thị) Kết cho thấy, nhiệt độ bắt mồi thích hợp 62 oC (Hình 2A) Vì vậy, chu trình nhiệt phản ứng PCR gồm biến tính ADN 94 oC phút; 32 chu kì gồm biến tính 94 oC 30 giây, gắn mồi 62 oC 30 giây, kéo dài mồi 72 oC 30 giây; kéo dài 72 oC 10 phút; cuối giữ hỗn hợp 15 oC sử dụng máy máy PCR mastercycle epgradient (hãng Eppendorf)
* Ủ enzyme cắt giới hạn điện di
Sau đó, - 10 µL mẫu có kết PCR tốt sẽđược sử dụng để tiến hành ủ với enzyme cắt giới hạn PagIở 37 oC 16 theo khuyến cáo nhà sản xuất Vị trí cắt enzyme:
5’…T↓CATGA…3’
3’…AGTAC↑T…5’
Hình Kết xác định kiểu gen SNP rs10811661 trên gen CDKN2A bằng phương pháp RFLP-PCR một số mẫu
(6)Xác định đa hình rs10811661 gen CDKN2A quần thể người việt nam sử dụng phương pháp…
119 Do đó, enzyme có khảnăng cắt vị trí SNP có alen T Nhận định kiểu gen từ sản phẩm: kiểu gen CC (350 bp), kiểu gen TT (280 bp 70 bp) kiểu gen CT (350 bp, 280 bp 70 bp) Băng sản phẩm 70 bp khơng xuất có kích thước nhỏ chạy khỏi thạch trình chạy điện di Kết điện di hình 2B cho thấy băng sản phẩm hồn tồn phù hợp xác định kiểu gen mẫu nghiên cứu
Như vậy, kết quảđiện di theo phương pháp RFLP hoàn toàn trùng lặp với phương pháp AS -PCR Sử dụng phương pháp AS-PCR đểxác định kiểu gen 100 mẫu nghiên cứu cho thấy tỉ lệđọc cao 99% (99/100) Kết quảđiện di sốlượng lớn mẫu chứng tỏ kết quảphương pháp RFLP-PCR xác việc xác định kiểu gen
Phương pháp RFLP-PCR cứu tính đa hình chiều dài phân đoạn ADN dựa điểm cắt enzyme giới hạn Nguyên tắc kĩ thuật dựa độ đặc hiệu enzyme cắt giới hạn vị trí nhận biết chúng ADN gen Khi ủ với enzyme giới hạn dung dịch đệm, pH, nhiệt độ thời gian thích hợp, đoạn ADN bị enzyme giới hạn cắt vị trí đặc hiệu để tạo phân đoạn ADN với kích thước khác Dựa vào kích thước đoạn cắt để xác định alen kiểu gen Trong nghiên cứu trước sử dụng enzyme PagIđể nhận biết alen C T Tuy nhiên, cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR khác Theo nghiên cứu Hubácek cs năm 2013 cặp mồi sử dụng cho RFLP-PCR 5’-GAAGACATTAGAACACC ATAACCTTTCC-3’ 5’-AGGAGGAGCCAGAAGACAGATCAGG-3’, sản phẩm tạo có kích thước 143 bp, tạo đoạn cắt enzyme 94 bp 49 bp [6] Và nghiên cứu Singh cs năm 2012 sử dụng cặp mồi: 5’-ATAAGCGTTCTTGCCCTGTC-3’ mồi ngược: 5’-GTCA AAAACCTTCCCCATCC-3’, sản phẩm tạo có kích thước 121 bp, tạo đoạn cắt enzyme 85 bp 36 bp [7] Sản phẩm PCR nghiên cứu chúng tơi có kích thước 350 bp (khá lớn) Khi sử dụng enzyme cắt giới hạn PagI tạo đoạn cắt 280 bp 70 bp, dễ dàng nhận biết sử dụng gel agarose
3 Kết luận
Phương pháp AS-PCR sử dụng mồi ngược phát alen C (Rc): 5’-GGTAATAGACTT ACTGTCATCG-3’ alen T (Rt): 5’-GGTAATAGACTTACTGTCATCA-3’ mồi xuôi (F): 5’-TCAGTTAAGCAGATGAAATTC-3’, nhiệt độ bắt mồi 52 oC với có mặt alen C T sản phẩm có kích thước 208 bp Phương pháp RFLP-PCR sử dụng mồi xuôi (F): 5’-ACCTTCAGCCACCTCTCTGTCTTTC-3’ mồi ngược (R): 5’-CCCATCC TG GGTAGGAGGAGCC-3’, nhiệt độ bắt mồi 62 oC, sản phẩm có kích thước 350 bp Sử dụng enzyme cắt giới hạn PagIở 37 oC 16 giờđể cắt mẫu có kiểu gen TT CT Kết sản phẩm PCR kiểu genCC (350 bp), kiểu gen TT (280 bp 70 bp), kiểu gen CT (350 bp, 280 bp 70 bp) Các kết nghiên cứu xác nhận, phương pháp AS-PCR RFLP-PCR sử dụng để xác định kiểu gen đa hình rs10811661 gen CDKN2A quần thể người Việt Nam
Lời cảm ơn Đề tài tài trợ Quỹ phát triển khoa học công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) cho Nghiên cứu tập năm bệnh đái tháo đường týp hội chứng chuyển hoá ởngười Việt Nam: vai trò yếu tố di truyền lối sống, mã số 106-YS.01-2015.10
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=10811661 tra cứu ngày 1/4/2014 [2] http://atlasgeneticsoncology.org/ Tra cứu ngày 1/4/2014
(7)Nguyễn Thị Trung Thu, Bùi Thị Nhung Trần Quang Bình
120
[4] D.K Bartsch, M Sina-Frey, S Lang, A Wild, B Gerdes, P Bart, R Kress, R Grutzmann, M Colombo-Benkmann, A Ziegler, S.A Hahn, M Rothmund, H Rieder, 002 CDKN2A germline mutations in familial pancreatic cancer., Annals of surgery, 236, No 6, pp 730-737 [5] F Harinck, L Kluijt, N Van Der Stoep, R.A Oldenburg, A Wagner, C.M Aalfs, R.H
Sijmons, J Poley, E.J Kuipers, P Fockén, T.A.M Os, 2012 Indication for CDKN2A-mutation analysis in familial pancreatic cancer families without melanomas. Journal of medical genetics, 49, No 6, pp 362-365
[6] J.Hubácek, T.Neskudla, M Klementová, V Adámková, T Pelikánová, 2013 Tagging rs10811661 variant at CDKN2A locus is not associated with type diabetes mellitus in Czech population Folia Biologica, 59, No 4, pp 168-171
[7] S Singh, S.B Prasad, S.S Yadav, N.K Agrawal, G Narayan, 2012 Association of common variants of CDKN2A rs10811661 (C/T) and WFS1 rs6446482 (C/G) to type diabetes mellitus in the Indian population of eastern Uttar Pradesh Journal of Diabetes and Metabolism, 3, pp 9-13
[8] P Wangkumhang, K Chaichoompu, C Ngamphiw, U Ruangrit, J Chanprasert, A Assawamakin, S Tongsima, 2007 WASP: a Web-based Allele-Specific PCR assay designing tool for detecting SNPs and mutations BMC genomics, 8, No 1, pp 275
[9] http://oligo.net/ Tra cứu ngày 1/8/2014
[10] http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr?command=start Tra cứu ngày 1/8/2014 [11] http://www.restrictionmapper.org/ Tra cứu ngày 1/8/2014
[12] S Little, 1995 Amplification-Refractory mutation system (ARMS): analysis of point mutations Curr Prot Hum Genet, 9, No 8, pp 1-12
ABTRACT
Determination of rs10811661 gene CDKN2A polymorphism in Vietnamese population using AS-PCR and RFLP-PCR methods
Nguyen Thi Trung Thu1, Bui Thi Nhung2 and Tran Quang Binh3 1
Faculty of Biology, Hanoi National University of Education 2
Department of School and Occupational Nutrition, National Institute of Nutrition 3