Các yếu tố độc lực đóng vai trò rất quan trọng trong việc giúp vi khuẩn tồn tại trong môi trường, chống lại các tác nhân tẩy rửa và quá trình vệ sinh, cũng như giúp vi khuẩn xâm nhập và gây bệnh trên vật chủ. Ngày nay, với sự phát triển của khoa học và kỹ thuật, ngày càng nhiều các yếu tố độc lực và gene độc lực tương ứng của vi khuẩn được tìm ra. Bên cạnh đó, các phương pháp chẩn đoán hiện đại, áp dụng công nghệ phân tử được sử dụng rộng rãi để phát hiện và tầm soát các mầm bệnh. Trong báo cáo này, các thông tin về yếu tố độc lực và gene độc lực của các mầm bệnh Campylobacter jejuni và L. monocytogenes cùng với cơ chế tác dụng và các phương pháp phân tử dùng để chẩn đoán sẽ được trình bày nhằm hiểu rõ hơn về những mầm bệnh này và cách kiểm soát chúng.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM - - BÁO CÁO AN TOÀN THỰC PHẨM Chủ đề: CÁC GENE ĐỘC LỰC CỦA CAMPYLOBACTER JEJUNI VÀ LISTERIA MONOCYTOGENES GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM, CƠ CHẾ TÁC DỤNG, VÀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TỬ ĐỂ PHÁT HIỆN LỚP: CAO HỌC THÚ Y 2020 – 2021 TP Hồ Chí Minh, tháng 03 năm 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH - - BÁO CÁO AN TỒN THỰC PHẨM Chủ đề: CÁC GENE ĐỘC LỰC CỦA CAMPYLOBACTER JEJUNI VÀ LISTERIA MONOCYTOGENES GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM, CƠ CHẾ TÁC DỤNG, VÀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TỬ ĐỂ PHÁT HIỆN LỚP: CAO HỌC THÚ Y 2020 – 2021 Hướng dẫn khoa học: PGS TS NGUYỄN NGỌC TUÂN TP Hồ Chí Minh, tháng 03 năm 2021 MỤC LỤC MỤC LỤC I CHƯƠNG GIỚI THIỆU CHƯƠNG ĐẶC ĐIỂM CHUNG VÀ CÁC GENE ĐỘC LỰC CỦA CAMPYLOBACTER JEJUNI VÀ LISTERIA MONOCYTOGENES 2.1 Camplycobacter jejuni 2.1.1 Đặc điểm chung C jejuni 2.1.2 Các yếu tố độc lực C jejuni 2.1.2.1 Sự di động hóa hướng động 2.1.2.2 Bám dính xâm nhập 2.1.2.3 Độc tố Cytolethal distending toxin (CDT) 2.1.2.4 Thu nhận sắt 2.1.2.5 Cấu trúc polysaccharide bề mặt 2.1.2.6 Hệ thống chống stress oxy hóa 2.1.2.7 Protein đáp ứng shock nhiệt 2.2 Listeria monocytogenes 2.2.1 Đặc điểm chung L monocytogenes 2.2.2 Sinh bệnh học L monocytogenes 2.2.3 Sự lưu hành dai dẳng L monocytogenes 2.2.4 Các yếu tố độc lực L monocytogenes CHƯƠNG CHẨN ĐOÁN BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TỬ 12 3.1 Chẩn đoán Campylobacter spp 12 3.1.1 PCR 12 3.1.2 Multiplex PCR 13 3.1.3 Real-time PCR 13 3.2 Chẩn đoán L monocytogenes 14 3.2.1 PCR 14 3.2.2 Giải trình tự toàn bộ gene (Whole-genome sequencing – WGS) 14 CHƯƠNG KẾT LUẬN 16 TÀI LIỆU THAM KHẢO 17 PHỤ LỤC 20 PHỤ LỤC 23 i Chương Giới thiệu Bệnh Campylobacter spp bệnh Listeria spp bệnh truyền lây người động vật quan trọng Trong số ca nhiễm trùng Campylobacter spp dẫn đầu danh sách bệnh truyền lây người động vật châu Âu kể từ năm 2005 nhiễm trùng Listeria spp dẫn đầu danh sách số ca tử vong Hằng năm, số ca nhiễm Campylobacter spp rơi vào khoảng 200 nghìn ca châu Âu Tuy nhiên, số ca nhiễm thực tế lên đến triệu ca Chi phí bệnh Campylobacter spp gây lên hệ thống sức khoẻ cộng đồng thiệt hại suất ước tính vào khoảng 2,4 tỉ euro năm (EFSA ECDC, 2021) Thịt gà xem nguồn lây nhiễm cho bệnh Campylobacter spp gây người (EFSA BIOHAZ Panel, 2010) Bên cạnh đó, nhiễm trùng Listeria vấn đề đáng lo ngại châu Âu có khoảng 2,000 ca mắc năm ghi nhận giai đoạn 2015 – 2019 Tỉ lệ nhập viện tỉ lệ chết bệnh cao, 92% 17,6% Các chun gia ước tính có khoảng phần ba ca bệnh Listeria spp có liên quan đến diện Listeria monocytogenes đồ ăn chế biến sẵn trữ tủ lạnh gia đình (EFSA ECDC, 2021) Điều nhấn mạnh tầm quan trọng việc tuân theo phương pháp thực hành vệ sinh tốt, chẳng hạn bảo đảm nhiệt độ thời gian bảo quản thực phẩm khuyến nghị Việc tầm soát vấy nhiễm mầm bệnh thực phẩm góp phần quan trọng việc ngăn chặn bệnh xảy người Các yếu tố độc lực đóng vai trị quan trọng việc giúp vi khuẩn tồn môi trường, chống lại tác nhân tẩy rửa trình vệ sinh, giúp vi khuẩn xâm nhập gây bệnh vật chủ Ngày nay, với phát triển khoa học kỹ thuật, ngày nhiều yếu tố độc lực gene độc lực tương ứng vi khuẩn tìm Bên cạnh đó, phương pháp chẩn đốn đại, áp dụng cơng nghệ phân tử sử dụng rộng rãi để phát tầm soát mầm bệnh Trong báo cáo này, thông tin yếu tố độc lực gene độc lực mầm bệnh Campylobacter jejuni L monocytogenes với chế tác dụng phương pháp phân tử dùng để chẩn đốn trình bày nhằm hiểu rõ mầm bệnh cách kiểm soát chúng Chương Đặc điểm chung gene độc lực Campylobacter jejuni Listeria monocytogenes 2.1 Camplycobacter jejuni 2.1.1 Đặc điểm chung C jejuni Họ vi khuẩn Camplycobacteraceae bao gồm hai chi Camplycobacter Arcobacter, chúng xuất gây bệnh chủ yếu người vật nuôi (Vandamme, 2000) Chi Camplycobacter vi khuẩn Gram âm, hình dạng que nhỏ (kích thước 0.2 – 0.8 μm × 0.5 – μm), mảnh mai có dạng xoắn Hơn 90% trường hợp nhiễm Campylobacter spp C jejuni C coli Đối với lây nhiễm người, C jejuni lây trực tiếp thông qua đường nước uống tiêu thụ sản phẩm động vật bị vấy nhiễm mầm bệnh, chẳng hạn sữa thịt chưa tiệt trùng, đặc biệt thịt gia cầm 2.1.2 Các yếu tố độc lực C jejuni Có nhiều yếu tố độc lực liên quan đến khả gây bệnh C jejuni (Phụ lục 1) Sự di chuyển, bám dính xâm nhập điều kiện cần thiết để vi khuẩn xâm nhiễm vào đường tiêu hoá gây bệnh vật chủ (Backert cs., 2013) Bên cạnh đó, để nhiễm vào đường tiêu hố, C jejuni phải có khả chống lại điều kiện bất lợi pH dày, hạn chế oxy manh tràng, stress tác nhân oxy hoá, gia tăng áp suất thẩm thấu diện dịch tiêu hoá muối mật (Louis O’Byrne, 2010) Khả hóa hướng động chịu nhiệt độ yếu tố gây bệnh quan trọng C jejuni (Konkel cs., 1999) Ngoài ra, vai trò gây độc cytolethal distending toxin (CDT) C jejuni sản sinh chứng thực 2.1.2.1 Sự di động hóa hướng động Sự cư trú C jejuni đường ruột yêu cầu di chuyển đến lớp nhày bao phủ tế bào ruột Sự vận động C jejuni thực tiên mao có phân cực kết hợp với hình dạng “xoắn ốc” cho phép chúng xâm nhập hiệu xuyên qua hàng rào chất nhày (Szymanski cs., 1995; Lee cs., 1986; Newell cs., 1985) Tiên mao C jejuni bao gồm lớp polyme khơng có vỏ bọc tiểu phần tiên mao, mã hóa gởi hai đoạn gene kế cận flaA flaB (Nuijten cs., 1990) Các nghiên cứu cho thấy đột biến gene flaA- flaB+ C jejuni cho tiên mao ngắn hơn, bị cắt bớt, dẫn đến số kiểu hình dạng “không di động” C jejuni (Wassenaar cs., 1994; Wassenaar cs., 1991) Tiên mao C jejuni nghiên cứu đánh giá khả thành công việc sử dụng chúng làm vaccine tiểu phần chuột Điều cho thấy tầm quan trọng tiên mao sinh bệnh học C jejuni (Lee cs., 1999) Hóa hướng động khả phát di chuyển dựa vào nồng độ chất hóa học Cả di động hóa hướng động cần thiết cho cư trú C jejuni Các đột biến làm cho C jejuni khả hố hướng động kết chúng khơng thể cư trú đường ruột động vật (Takata cs., 1992) C jejuni bị thu hút chất nhày, L – serine đường L – fucose, acid mật lại chất “xua đuổi” C jejuni (Hugdahl cs., 1988) Gene điều hòa cheY cho có liên quan đến khả điều hòa tổng thể gene độc lực C jejuni Nhiều thành phần khác hệ thống hóa hướng động C jejuni xác định trình tự gene, bao gồm gene cheY, cheV cheW 2.1.2.2 Bám dính xâm nhập Khi nhiễm trùng, C jejuni xuyên qua lớp nhày bao phủ lớp tế bào biểu mô ruột bám dính vào tế bào sau xâm nhập vào bên dẫn đến tổn thương lớp niêm mạc gây viêm nhiễm C jejuni liên quan đến việc kích hoạt viêm nhiễm, chẳng hạn sản sinh chất tiền gây viêm IL-8 (Hickey cs., 1999) Yếu tố đầu tiêu xác định có liên quan đến khả bám dính xâm nhập vào tế bào vật chủ C jejuni tiên mao (Grant cs., 1993; Wassenaar cs., 1991) Sự bám dính xâm nhập phụ thuộc vào khả di động biểu tiên mao, số đột biến C jejuni làm giảm di động tiên mao bị “liệt” làm giảm bám dính giảm khả xâm nhập (Yao cs., 1994) Các chất kết dính khác xác định protein PEB1 – mã hóa locus peb1A CadF (Ziprin cs., 1999; Pei cs., 1998) 2.1.2.3 Độc tố cytolethal distending toxin (CDT) Hầu hết chủng C jejuni có lượng độc tố CDT cao chủng C coli lại có lượng CDT thấp (Pickett cs., 1996) Độc tố CDT làm ngưng chu kỳ tế bào pha G2 tế bào vật chủ thơng qua khóa enzyme CDC2 kinase liên quan đến trình nguyên phân (Whitehouse cs., 1998) Độc tố CDT C jejuni mã hóa operon chứa ba gene (cdtA, B, C) Độc tố CDT liên quan đến tiêu chảy làm xáo trộn trật tự tăng trưởng trưởng thành tế bào khe ruột (crypt cells) trở thành tế bào biểu mô nhung mao đầy đủ chức năng, gây mòn chức hấp thu tạm thời lông nhung (Whitehouse cs., 1998) 2.1.2.4 Thu nhận sắt Nồng độ sắt tự mô bào vật chủ thấp để hỗ trợ cho phát triển vi khuẩn, sắt sử dụng để tạo thành phức hợp hợp chất haem, transferin (trong huyết thanh) lactoferin (bề mặt niêm mạc) Sự hạn chế sắt ngoại bào tạo thành hàng rào bảo vệ không đặc hiệu cho vật chủ C jejuni sử dụng lượng tương đối thấp phức hợp sắt (Field cs., 1986) thông qua sử dụng siderophores ferrichrome enterochelin sản sinh vi khuẩn khác (Pickett cs., 1992) Chúng sử dụng phức haem, phức hợp giải phóng q trình viêm nhiễm (Pickett cs., 1992; Field cs., 1986) C jejuni biểu nhiều hệ thống thu nhận sắt để phát triển điều kiện môi trường thiếu hụt sắt thông qua hệ thống thu nhận haemin/haemoglobin (chuABCD) (Rock cs., 1999) hệ thống vận chuyển enterochelin màng (ceuBCDE) (Richardson Park, 1995) C jejuni có gene mã hóa cho hệ thống vận chuyển sắt tương tự protein FeoB Escherichia coli 2.1.2.5 Cấu trúc polysaccharide bề mặt C jejuni sản sinh kháng nguyên lipooligosaccharide (LOS) có chuỗi O liên kết với phospholipid (Fry cs., 2000) Cấu trúc bề mặt polysaccharide tiên mao C jejuni có sialic hóa, tạo chất có cấu trúc giống với ganglioside dẫn đến tình trạng bệnh lý gọi hội chứng Guillain – Barre (GBS) (Nachamkin cs., 1998) Khi nhiễm trùng serotype C jejuni chịu nhiệt, thể hình thành kháng thể tự miễn cho nguyên nhân gây tổn thương bao myelin dẫn đến GBS (Bersudsky cs., 2000; Endtz cs., 2000; Kuroki cs., 1993) Có ba gene đặc trưng mã hóa protein tương đồng với NeuB enzyme quan trọng sản xuất acid polysialic (Linton cs., 2000): gene (neuB1) có liên quan đến sialic hóa phân tử LOS, hai gene lại (neuB2 neuB3) có liên quan đến sialic hóa protein tiên mao Chủng C jejuni serotype O:19, gây GBS, có hai gene mã hóa enzyme sialyltransferases, chủng NCTC 11168 (serotype O:2) có gene, đồng nghĩa với hoạt động sialyltransferases yếu (Gilbert cs., 2000) Một gene độc lực giả định khác ceuE, mã hóa cho lipoprotein (một thành phần hệ thống vận chuyển phụ thuộc vào kết bám với protein) enterochelin C jejuni Đây đoạn gene sử dụng phương pháp phân tử để phát C jejuni (Nayak cs., 2004) 2.1.2.6 Hệ thống chống stress oxy hóa Campylobacter spp vi khuẩn hiếu khí, nghĩa chúng phải đối phó với chất chuyển hóa oxy độc hại tạo trình trao đổi chất bình thường tiếp xúc với quan bảo vệ miễn dịch vật chủ C jejuni C coli chia sẻ hệ thống chống stress oxy hóa với nhau, chia thành hệ thống chống stress superoxide chống stress peroxide (Storz and Imlay, 1999) Thành phần hệ thống chống stress superoxide C jejuni protein superoxide dismutase (SOD) SodB (Pesci cs., 1994; Purdy Park, 1994) mã hóa gene sodB, hệ thống chống stress peroxide bao gồm protein: protein catalase (katA) protein alkyl hydroperoxide reductase (AhpC, tên khác Tsa hay TsaA) (Grant Park, 1995; Baillon cs., 1999) 2.1.2.7 Protein đáp ứng shock nhiệt Hình 2.1 Cơ chế gây bệnh C jejuni (Kopecko cs., 2001) C jejuni C coli có khả đáp ứng với thay đổi nhiệt độ lớn, chúng tìm thấy ruột gia cầm, nơi có nhiệt độ lên đến 42oC người (37oC) trình truyền lây nước, sữa hay thịt (4oC nhiều mức nhiệt độ khác) Các đáp ứng với stress nhiệt vi khuẩn hầu hết thực biểu protein shock nhiệt (heat shock proteins – HSPs) Nhiều HSPs xác định C jejuni, bao gồm protein GroESL, DnaJ, DnaK ClpB (Thies cs., 1999; Konkel cs., 1998) Bộ gene C jejuni cịn mã hóa protein điều hịa đáp ứng với nhiệt tương đồng với HSPs số loài: protein HcrA tương đồng với HSPs Bacillus subtilis (Thies cs., 1999), protein HspR tương đồng với HSPs Helicobacter pylori (Spohn Scarlato, 1999) Các protein hỗ trợ cho khả đáp ứng tốt C jejuni với thay đổi môi trường nhiệt độ khác 2.2 Listeria monocytogenes 2.2.1 Đặc điểm chung L monocytogenes Các loài Listeria trực khuẩn gram dương, có kích thước nhỏ, yếm khí tuỳ nghi hoạt động ký sinh nội bào động vật hữu nhũ Đến năm 2020, có 21 lồi Listeria xác định (Quereda cs., 2020) Trong có lồi L monocytogenes L ivanovii xem tác nhân gây bệnh Mặc dù vậy, L ivanovii gây bệnh cho người động vật, trái lại L monocytogenes gây bệnh phổ biến người động vật, xem mầm bệnh truyền lây người động vật quan trọng L monocytogenes phân bố rộng rãi nông nghiệp (đất, thực vật, thức ăn gia súc ủ silo, phân, nước thải nước), môi trường nuôi trồng thủy sản môi trường chế biến thực phẩm L monocytogenes loại vi khuẩn lưu trú tạm thời đường ruột người, có khoảng từ % đến 10 % dân số mang mầm bệnh vi sinh vật mà khơng có biểu ảnh hưởng đến sức khỏe rõ ràng (TCVN 9778:2013) Tuy nhiên, nhiễm trùng L monocytogenes có nguy hiểm cao dẫn đến tử vong, đặc biệt người có hệ miễn dịch yếu phụ nữ có thai, trẻ sơ sinh người già yếu (Markey cs., 2013) 2.2.2 Sinh bệnh học L monocytogenes Nhiễm trùng L monocytogenes thường liên quan đến việc tiêu thụ thực phẩm bị vấy nhiễm mầm bệnh, dẫn đến nhiễm trùng máu, viêm màng não hay sảy thai Mầm bệnh có khả thâm nhập vào tế bào M mảng Payer đường ruột (Hình 2.2.1), sau mầm bệnh lan rộng khắp đến mơ thơng qua hệ thống tuần hồn bạch huyết (Quinn cs., 2011) Nhờ vào hỗ trợ yếu tố độc lực internalin, mầm bệnh L monocytogenes xâm nhập qua thai hàng rào máu não (Lecuit, 2005) Mầm bệnh có khả lẫn tránh tế bào thực bào tế bào không thực bào nhờ vào tồn nhân lên nội bào (Hình 2.2.5) Việc tryền trực tiếp từ tế bào sang tế bào lân cận (Hình 2.2.6 – 7) mà khơng phải tiếp xúc với hệ thống miễn Hệ thống/Cơ quan Đường tiêu hố dịch dịch thể góp phần vào trình lẩn tránh (Quinn cs, 2011) Hình 2.2 Cơ chế xâm nhiễm L monocytogenes: (1) vi khuẩn xâm nhập qua đường tiêu hoá, (2) vi khuẩn xâm nhiễm qua ruột để vào hệ tuần hoàn, (3) vi khuẩn xâm nhập vào tế bào đích đại thực bào, (4) vi khuẩn chứa khơng bào nội bào, (5) vi khuẩn khỏi khơng bào, nhân lên tế bào chất hình thành đuôi sợi actin giúp vi khuẩn di chuyển, (6) cách đẩy qua khỏi màng tế bào, vi khuẩn hình thành cấu trúc giả gậy, (7) cấu trúc giả gậy thực bào tế bào lân cận, (8) tế bào thực bào, vi khuẩn hình thành khơng bào có màng kép (Liu cs., 2008) 2.2.3 Sự lưu hành dai dẳng L monocytogenes Sự lưu hành dai dẳng L monocytogenes điều kiện mà hầu hết vi khuẩn khác phát triển liên quan đến nhiều yếu tố bao gồm: (1) tồn ổ chứa không làm sát trùng mức, (2) khả số chủng sinh trưởng khoảng nhiệt độ rộng, đặc biệt điều kiện trữ lạnh, kháng lại ức chế acid, sấy khơ chất sát trùng, hình thành màng sinh học (biofilm) phản ứng miễn dịch bình thường tế bào thúc đẩy nhiễm trùng LLO gây phân mảnh ti thể để tiếp tục thay đổi hành vi tự nhiên tế bào (Stavru cs., 2011) Ở số tế bào, LLO hoạt động không hiệu vi khuẩn cần ly giải khơng bào có màng kép, protein PC-PLC (là mơt loại phospholipase) mã hố gene plcA tham gia vào q trình ly giải khơng bào (Schlüter cs., 1998) Listeriolysin S (LLS) phát gần có vai trị làm tăng độc lực L monocytogenes LLS xuất số chủng L monocytogenes dịng tiến hóa 1, serotype 1/2b 4b (Cotter cs., 2008) Serotype 4b kiểu huyết thường gặp liên quan đến nhiễm khuẩn Listeria việc kiểm tra chủng khả độc lực dựa diện khơng có LLS cách để phân biệt chủng có khả gây bệnh khác tương lai (Clayton cs., 2011) Gen actA mã hóa cho protein actA yếu tố định độc lực L monocytogenes Ở nhiệt độ 30°C, L monocytogenes di chuyển tiên mao Tuy nhiên, nhiệt độ thể động vật hữu nhũ, ActA giúp vi khuẩn điều động polyme hoá actin tế bào vật chủ (Jacquet cs., 2002) Sự xếp lại actin cho phép vi khuẩn di chuyển tự bên tế bào chất lây lan từ tế bào sang tế bào khác ActA góp phần quan trọng việc kết dính vi khuẩn tương tác ActA-ActA trực tiếp giúp tập hợp vi khuẩn hỗ trợ chúng tồn ruột (Travier cs., 2013) L monocytogenes thích nghi để xâm nhập phát triển mạnh thể động vật hữu nhũ Độ pH thấp độ thẩm thấu cao dày diện muối mật đường tiêu hóa thường rào cản lây nhiễm vi khuẩn Tuy nhiên, L monocytogenes sống sót sau tác nhân stress để xâm nhập vào tế bào vật chủ gây bệnh SigB yếu tố điều tiết coi quan trọng việc chống lại tác nhân gây stress, đặc biệt khả chịu đựng stress muối mật (Zhang cs., 2011) Một giả thuyết cho SigB tăng cường biểu gene mã hoá cho protein bề mặt InlA InlB vi khuẩn di chuyển đến đường ruột (Cossart ToledoArana, 2008) PrfA yếu tố quan trọng điều hoà thể gene độc lực vi khuẩn Protein PrfA biểu điều kiện nhiệt độ cao nên gọi protein cảm biến nhiệt (Scortti cs., 2007; Renzoni cs., 1997) PrfA cho chịu trách nhiệm việc điều hồ gene độc lực môi trường vật chủ động vật hữu nhũ (Bruno Freitag, 2010) Cụ thể, gene hly mã hoá cho LLO gene actA mã hóa 10 cho ActA liên kết vật lý tiểu đảo gây bệnh vi khuẩn điều hoà PrfA (Jacquet cs., 2002) 11 Chương Chẩn đoán phương pháp phân tử 3.1 Chẩn đoán Campylobacter spp Do cần phải có điều kiện nhiệt độ độ ẩm đặc trưng phù hợp với khả sinh trưởng, nên lồi vi khuẩn Campylobacter khơng có khả sinh sôi phát triển điều kiện bảo quản thức ăn thông thường Tuy nhiên, số lượng lây nhiễm chúng lại thấp (khoảng 500 – 1000 đơn vị tế bào) với tính lây bệnh cao, điều có nghĩa với lượng tế bào nhỏ đủ để gây bệnh Các tiêu chuẩn vi sinh Campylobacter quy định vi khuẩn khơng nên có mặt mẫu 25g thực phẩm sẵn sàng để sử dụng Có hai cách để phát diện Campylobacter mẫu thức ăn, thực phẩm: sử dụng phương pháp nuôi cấy (các phương pháp dựa nuôi cấy để phân lập phát Campylobacter từ thực phẩm miêu tả hướng dẫn Tổ chức Tiêu chuẩn Thế giới: Tiêu chuẩn ISO 10272-1:2006 hướng dẫn trình phát hiện, cịn ISO/TS 10272-2:2006 phương pháp định lượng Tuy nhiên phải tốn nhiều công sức tốn kém; hai phương pháp phát nhanh kỹ thuật miễn dịch học phân tử Các kỹ thuật sử dụng phổ biến để phân loại Campylobacter PCR, MPCR Real time – PCR Hiện thị trường có nhiều đơn vị cung cấp kit có sẵn để phát nhanh diện C jejuni thực phẩm thông qua phương pháp sinh học phân tử, bao gồm kit phát đơn (singleplex detection) kit phát đồng thời nhiều gene mục tiêu (multiplex detection) 3.1.1 PCR Thành phần cho phản ứng PCR bao gồm: MgCl2, dNTPs, cặp primer, Taq polymerase DNA mẫu Các đoạn mồi (Phụ lục 2) từ 18 đến 35 bp thường khuếch đại đoạn DNA từ 200 đến 800 bp Hỗn hợp đặt máy luân nhiệt, lập trình cho loạt chu kỳ tùy thuộc vào vi sinh vật loại mồi sử dụng Đối với Campylobacter, nhiệt độ xấp xỉ 94°C áp dụng để biến tính, ủ 52 đến 54°C kéo dài 72°C (Raja cs., 2017; Zang cs., 2017; Frasao cs., 2015) 12 3.1.2 Multiplex PCR Multiplex PCR, cho phép phát nhiều loài mẫu Trong thí nghiệm cần xác định lồi Campylobacter khác nhau, chi khác nhau, việc áp dụng multiplex PCR có lợi lớn Phương pháp dễ dàng áp dụng cho Campylobacter spp., C jejuni (Frasao cs., 2015b) C coli Raja Rao (2016) sử dụng kỹ thuật để phát mầm bệnh khác nhau, C jejuni L monocytogenes, thịt gà trình chế biến Trước việc sử dụng phương pháp cịn khó khăn giới hạn mặt kỹ thuật, nhiên với phát triển công nghệ sinh học phân tử thời gian gần với đời kit có sẵn giúp cho việc sử dụng phương pháp ngày đơn giản nhanh chóng 3.1.3 Real-time PCR Trong số phương pháp phân tử dựa PCR, realtime PCR cho tốc độ xử lý nhanh, độ nhạy độ đặc hiệu cao để phân tích Kết phản ứng khuếch đại ghi nhận trình khuếch đại DNA từ mẫu Kỹ thuật realtime PCR cho phép giảm thời gian xét nghiệm thực công đoạn chạy gel để phát sản phẩm khuếch đại, từ kết khuếch đại ước lượng hàm lượng RNA DNA từ mẫu ban đầu Hình 3.1 Bộ kit phát C jejuni PCR/Realtime – PCR KogeneBiotech – Hàn Quốc (trái) NorgenBiotech – Canada (phải) C jejuni C coli phân loại thông qua việc xác định vùng gen đặc trưng cho loài kỹ thuật PCR/Real-time PCR với cặp mồi chuyên biệt Đối với loài C 13 jejuni, phân loại cách khuếch đại gene mục tiêu với mồi chuyên biệt Jejuni-hipO F/ Jejuni-hipO R dựa trình tự gene hipO (344bp) mã hóa cho Hippuricase (Persson cs, 2005) phân loại lồi C coli dựa trình tự gene asp (500 bp) mã hóa cho Aspartokinase với cặp mồi chuyên biệt Coli-asp F/ Coli-asp R (Linton cs., 1997) 3.2 Chẩn đoán L monocytogenes Trong thực tế, nhiều chủng L monocytogenes phân lập từ động vật, thực phẩm mơi trường chủng độc lực thấp, số hồn tồn khơng gây bệnh Do đó, điều địi hỏi phải có kỹ thuật chẩn đốn phù hợp phịng thí nghiệm để phân biệt nhanh chóng xác chủng L monocytogenes gây bệnh không gây bệnh Yêu cầu yếu tố quan trọng chiến dịch kiểm soát chống lại bệnh nhiễm trùng L monocytogenes, đồng thời giúp kiểm soát vấy nhiễm thực phẩm tốt giảm bớt mối lo ngại người tiêu dùng (Liu cs., 2008) Một số phương pháp tiêu chuẩn phát triển để phân lập xác định L monocytogenes mẫu thực phẩm Phương pháp tiêu chuẩn để phân lập L monocytogenes bao gồm: xét nghiệm dựa kháng thể, phản ứng ELISA, phương pháp nuôi cấy kỹ thuật bắt giữ miễn dịch (Välimaa cs., 2015) 3.2.1 PCR Phương pháp PCR sử dụng rộng rãi để phát L monocytogenes PCR thông thường nhắm mục tiêu vào gene đặc hiệu phổ biến L monocytogenes hly, inlA, inlB, iap, plcA, plcB (Phụ lục 2), gene mã hoá rRNA 16S 23S protein mẫn dth-18 (Jadhav, 2015) Các kỹ thuật PCR sử dụng thường xuyên phương pháp nuôi cấy chúng đơn giản cung cấp kết nhanh chóng (Jeyaletchumi cs., 2012) Tuy nhiên, thực PCR từ mẫu trực tiếp mà không qua q trình tiền tăng sinh cho kết không đáng tin cậy (Aznar cs., 2003) 3.2.2 Giải trình tự tồn bộ gene (Whole-genome sequencing – WGS) Mặc dù phương pháp nuôi cấy thông thường phương pháp phân tử sử dụng để phân lập phát L monocytogenes có nhiều ưu điểm, nhiên, kỹ thuật gặp hạn chế việc phân biệt chủng vi sinh vật gây bệnh (Lekkas, 2016) WGS có khả phân biệt nhóm chủng vi sinh vật thành nhóm phù hợp 14 mặt dịch tễ học WGS khuyến nghị tiêu chuẩn vàng cho việc phân nhóm chủng L monocytogenes liên quan đến bùng phát dịch bệnh (Fox et al 2016) Ngoài việc sử dụng liệu dịch tễ học, WGS cịn có hiệu việc tạo nhanh liệu trình tự tồn bộ gen, giúp xác định gen mục tiêu, hỗ trợ cho việc phát triển xét nghiệm (Lekkas, 2016) 15 Chương Kết luận Ngày nay, vấn đề an toàn thực phẩm ngày quan tâm kiểm soát chặt chẽ Campylobacter jejuni L monocytogenes số nguyên nhân phổ biến gây nhiễm trùng vi khuẩn người toàn giới Các mầm bệnh truyền lây người động vật thông qua môi trường, đặc biệt liên quan trực tiếp đến thực phẩm Cụ thể, C jejuni thường vấy nhiễm thịt gà, L monocytogenes xuất chủ yếu đồ hộp làm sẵn Sử dụng loại thực phẩm bị vấy nhiễm vi khuẩn nhiễm trực tiếp từ môi trường gây tình trạng bệnh lý nghiêm trọng hội chứng Guillain-Barré nhiễm trùng C jejuni; nhiễm trùng máu, viêm màng não hay sảy thai nhiễm trùng L monocytogenes Việc nắm rõ yếu tố độc lực gene mã hố chúng góp phần lớn vào phân biệt chủng vi khuẩn có độc lực vi khuẩn khơng độc lực Các phương pháp nuôi cấy vi khuẩn truyền thống để kiểm tra mầm bệnh có nhiều mặt hạn chế thời gian kiểm tra lâu, cần điều kiện riêng biệt để ni cấy loại vi khuẩn, khó khăn khía cạnh xác định chủng hay xác định yếu tố độc lực, v.v Do đó, phát triển phương pháp phân tử PCR/real-time PCR để phát nhanh, xác diện vi khuẩn có độc lực vấy nhiễm thực phẩm góp phần quan trọng việc tầm soát mầm bệnh hiệu Bên cạnh đó, phương pháp giải trình tự gene bước tiến lớn kỹ thuật việc nghiên cứu điều tra dịch tễ mầm bệnh nói 16 TÀI LIỆU THAM KHẢO Ayllón, N., Jiménez-Marín, Á., Argüello, H., Zaldívar-López, S., Villar, M., Aguilar, C., Garrido, J J (2017) Comparative Proteomics Reveals Differences in Host-Pathogen Interaction between Infectious and Commensal Relationship with Campylobacter jejuni Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, Aznar, R Alarcon, B (2003) PCR detection of Listeria monocytogenes: a study of multiple factors affecting sensitivity Journal of Applied Microbiology 95, 958–966 Backert S., Boehm M., Wessler S cs (2013) Transmigration route of Campylobacter jejuni across polarized intestinal epithelial cells: paracellular, transcellular or both? Cell Commun Signal, 11(1), 72 Bremer P.J., Fillery S., McQuillan A.J (2006) Laboratory scale Clean-In-Place (CIP) studies on the effectiveness of different caustic and acid wash steps on the removal of dairy biofilms International Journal of Food Microbiology, 106(3), 254–262 Bruno J.C Freitag N.E (2010) Constitutive Activation of PrfA Tilts the Balance of Listeria monocytogenes Fitness Towards Life within the Host versus Environmental Survival PLoS ONE, 5(12), e15138 Camplycobacter prevention https://www.cdc.gov/campylobacter/prevention.html Chae M.S., Schraft H., Truelstrup Hansen L cs (2006) Effects of physicochemical surface characteristics of Listeria monocytogenes strains on attachment to glass Food Microbiology, 23(3), 250–259 Chen Y., Ross W.H., Whiting R.C cs (2011) Variation in Listeria monocytogenes Dose Responses in Relation to Subtypes Encoding a Full-Length or Truncated Internalin A Appl Environ Microbiol, 77(4), 1171–1180 Clayton E.M., Hill C., Cotter P.D cs (2011) Real-Time PCR Assay To Differentiate Listeriolysin S-Positive and -Negative Strains of Listeria monocytogenes Appl Environ Microbiol, 77(1), 163–171 10 Cossart P Toledo-Arana A (2008) Listeria monocytogenes, a unique model in infection biology: an overview Microbes and Infection, 10(9), 1041–1050 11 Dasti, J I., Tareen, A M., Lugert, R., Zautner, A E., & Groß, U (2010) Campylobacter jejuni: A brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms International Journal of Medical Microbiology, 300(4), 205–211 12 EFSA BIOHAZ Panel (EFSA Panel on Biological Hazards) (2011) Scientific Opinion on Quantification of the risk posed by broiler meat to human campylobacteriosis in the EU EFSA Journal, (2010; 8(1):1437) 17 13 European Food Safety Authority (EFSA) and European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC) (2021) The European Union One Health 2019 Zoonoses Report EFS2, 19(2) 14 Galvão N.N., Chiarini E., Destro M.T cs (2012) PFGE characterisation and adhesion ability of Listeria monocytogenes isolates obtained from bovine carcasses and beef processing facilities Meat Science, 92(4), 635–643 15 Gekara N.O., Zietara N., Geffers R cs (2010) Listeria monocytogenes Induces T Cell Receptor Unresponsiveness through Pore‐Forming Toxin Listeriolysin O J INFECT DIS, 202(11), 1698– 1707 16 Harvey J., Keenan K.P., Gilmour A (2007) Assessing biofilm formation by Listeria monocytogenes strains Food Microbiology, 24(4), 380–392 17 ISO 10272-1:2006 (2006) Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp — Part 1: Detection method 18 ISO/TS 10272-2:2006 (2006) Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp — Part 2: Colony-count technique 19 Jacquet C., Gouin E., Jeannel D cs (2002) Expression of ActA, Ami, InlB, and Listeriolysin O in Listeria monocytogenes of Human and Food Origin Appl Environ Microbiol, 68(2), 616– 622 20 Jordan K., Leong D., Álvarez Ordóđez A (2015), Listeria monocytogenes in the Food Processing Environment, Springer International Publishing, Cham 21 Kaakoush N.O., Casto-Rodríguez N., Mitchell H.M cs (2015) Global Epidemiology of Campylobacter Infection Clin Microbiol Rev, 28(3), 687–720 22 Konkel M.E., Kim B.J., Rivera-Amill V cs (1999) Bacterial secreted proteins are required for the internalization of Campylobacter jejuni into cultured mammalian cells Mol Microbiol, 32(4), 691–701 23 Linton, D., A J Lawson, R J Owen, J Stanley (1997) PCR detection, identification to species level, and fingerprinting of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli direct from diarrheic samples, J Clin Microbiol, 35, 2568-72 24 Liu D., btv (2008), Handbook of Listeria monocytogenes, Taylor & Francis, Boca Raton 25 Louis P O’Byrne C.P (2010) Life in the Gut: Microbial responses to Stress in the Gastrointestinal Tract Science Progress, 93(1), 7–36 26 Meyer-Morse N., Robbins J.R., Rae C.S cs (2010) Listeriolysin O Is Necessary and Sufficient to Induce Autophagy during Listeria monocytogenes Infection PLoS ONE, 5(1), e8610 27 Moorhead S.M Dykes G.A (2004) Influence of the sigB gene on the cold stress survival and subsequent recovery of two Listeria monocytogenes serotypes International Journal of Food Microbiology, 91(1), 63–72 18 28 Pizarro-Cerdá J., Sousa S., Cossart P (2004) Exploitation of host cell cytoskeleton and signalling during Listeria monocytogenes entry into mammalian cells Comptes Rendus Biologies, 327(6), 523–531 29 Quereda J.J., Leclercq A., Moura A cs (2020) Listeria valentina sp nov., isolated from a water trough and the faeces of healthy sheep International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 70(11), 5868–5879 30 Quinn P.J., btv (2011), Veterinary microbiology and microbial disease, Wiley-Blackwell, Chichester, West Sussex 31 Renzoni A., Klarsfeld A., Dramsi S cs (1997) Evidence that PrfA, the pleiotropic activator of virulence genes in Listeria monocytogenes, can be present but inactive Infection and immunity, 65(4), 1515–1518 32 S Persson, K.E Olsen (2005) Multiplex PCR for identification of Campylobacter coli and Campylobacter jejuni from pure cultures and directly on stool samples, J Med Microbiol, 54,10437 33 Schlüter D., Domann E., Buck C cs (1998) Phosphatidylcholine-Specific Phospholipase C from Listeria monocytogenes Is an Important Virulence Factor in Murine Cerebral Listeriosis Infect Immun, 66(12), 5930–5938 34 Schnitger A.K.D., Machova A., Mueller R.U cs (2011) Listeria monocytogenes Infection in Macrophages Induces Vacuolar-Dependent Host miRNA Response PLoS ONE, 6(11), e27435 35 Scortti M., Monzó H.J., Lacharme-Lora L cs (2007) The PrfA virulence regulon Microbes and Infection, 9(10), 1196–1207 36 Silva, J., Leite, D., Fernandes, M., Mena, C., Gibbs, P A., & Teixeira, P (2011) Campylobacter spp as a Foodborne Pathogen: A Review Frontiers in Microbiology, 37 Stavru F., Bouillaud F., Sartori A cs (2011) Listeria monocytogenes transiently alters mitochondrial dynamics during infection Proc Natl Acad Sci USA, 108(9), 3612–3617 38 Takahashi H., Kuramoto S., Miya S cs (2011) Desiccation survival of Listeria monocytogenes and other potential foodborne pathogens on stainless steel surfaces is affected by different food soils Food Control, 22(3–4), 633–637 39 TCVN 9778:2013 (2013) Tiêu chuẩn Việt Nam Hướng dẫn áp dụng nguyên tắc chung vệ sinh thực phẩm để kiểm soát Listeria monocytogenes thực phẩm 40 Travier L., Guadagnini S., Gouin E cs (2013) ActA Promotes Listeria monocytogenes Aggregation, Intestinal Colonization and Carriage PLoS Pathog, 9(1), e1003131 41 Young, K T., Davis, L M., DiRita, V J (2007) Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis Nature Reviews Microbiology, 5(9), 665–679 42 Zhang Q., Feng Y., Deng L cs (2011) SigB plays a major role in Listeria monocytogenes tolerance to bile stress International Journal of Food Microbiology, 145(1), 238–243 19 Phụ lục Tổng hợp yếu tố độc lực C jejuni L monocytogenes Bảng Tổng hợp yếu tố độc lực gene độc lực xác định C jejuni gây nhiễm tế bào INT-407 IPEC-1 (Ayllón cs, 2017) Protein Gene Chức Adhesin pebA PebA Bám dính Chaperonin GroEL groL Bám dính Methyl-accepting chemotaxis protein CstIII Cstlll Bám dính Flagellin FlaA flaA,B Di chuyển Chaperone protein DnaK dnaK Đáp ứng shock nhiệt Chemotaxis histidine kinase cheA cheA Đáp ứng shock nhiệt Chaperone protein HtpG htpG Đáp ứng shock nhiệt Chemotaxis protein N218_03105 Đáp ứng shock nhiệt Peroxidase ahpC Stress oxy hóa Periplasmic protein p19 P19 Gắn kết với sắt Iron deficiency-induced protein A cfbpA Gắn kết với sắt Ferric enterobactin receptor cfrA cfrA Gắn kết với sắt Superoxide dismutase sodB Stress oxy hóa Thiol peroxidase tpx tpX Stress oxy hóa Two-component regulator Cj0355c Cj0355c Stress oxy hóa Putative membrane protein CjaE cjaE Stress oxy hóa Type VI secretion system protein hcP Yếu tố độc lực Peptidoglycan-associated essential protein cjaD cjaD Yếu tố độc lực Thioredoxin trxB Stress oxy hóa Hydrogenase large subunit M635_02020 Quá trình khử oxy Lytic transglycosylase mttE Tổng hợp murein thành tế bào 20 Bảng Tổng hợp protein liên quan đến độc lực xác nhận giả định L monocytogenes (Liu cs., 2008) Protein Vai trò chức Điều hoà PrfA Yếu tố điều hoà độc lực chủ yếu SigmaB Yếu tố phiên mã stress chung VirS/VirR Hệ thống hai yếu tố liên quan đến độc lực xâm nhiễm; VirR xuất để kiểm soát yếu tố độc lực điều hoà thay đổi yếu tố bề mặt Bám dính xâm nhập FbpA Protein liên kết Fibronectin cần thiết cho xâm nhập hiệu vào gan và/hoặc ruột chuột; có vai trò bảo vệ cho InlB LLO Ami Amidan tự phân giải cần thiết cho hoạt động liên kết tế bào InlA Xâm nhập vào tế bào có biểu thụ thể E-cadherin InlB Xâm nhập vào tế bào có biểu thụ thể gC1qR, HGF-SF, Met thụ thể glycosaminoglycanes (GAGs) LpeA Lipoprotein làm tăng cường khả xâm nhập vào thực bào không chuyên biệt, trừ đại thực bào Vip Cố định vào thành tế bào Listeria sortase A cần thiết để xâm nhập vào số tế bào động vật hữu nhũ IspC Autolysin nhắm vào đáp ứng miễn dịch dịch thể Ly giải không bào LLO (hly) Cần thiết cho khỏi khơng bào cách ly giải màng không bào LLS Chức tương tự LLO PC-PLC Được kích hoạt phân cắt protein liên quan đến Mpl (plcA) protease tế bào; cần thiết cho ly giải khơng bào có màng kép Mpl Cần thiết cho trưởng thành PC-PLC 21 Nhân lên nội bào LplA1 Cần thiết cho tăng trưởng tế bào chất vật chủ Lây truyền giữ tế bào với tế bào ActA Protein bề mặt cần thiết cho trình lắp ráp actin, tham gia vào trình lây lan từ tế bào sang tế bào khác Các chức khác HtrA Bsh Hfq ClpC ClpE ClpP MogR SOD Liên quan đến đáp ứng stress (pH thấp penicillin G) Liên quan đến xâm nhập đường tiêu hoá gan nhiễm trùng Listeria Cần thiết cho chịu đựng stress áp suất thẩm thấu ethanol, quan trọng cho việc tồn lâu dài điều kiện axit amin bị hạn chế Protein stress thúc đẩy thoát khỏi phagosome vi khuẩn bên đại thực bào Liên quan đến phân chia tế bào độc lực; cần thiết cho tồn lâu dài 42°C Liên quan đến ly giải protein cần thiết cho tăng trưởng điều kiện strss Ức chế chặt chẽ biểu tiên mao Superoxide dismutases 22 Phụ lục Tổng hợp đoạn mồi thường sử dụng phương pháp PCR để chẩn đoán C jejuni L monocytogenes Bảng Các đoạn mồi sử dụng nghiên cứu trước để phát (PCR multiplex PCR) Campylobacter spp thực phẩm có nguồn gốc động vật đoạn gene mục tiêu tương ứng khuếch đại Phương pháp Đoạn mồi (5’-3’) Campylobacter F: GAC TAC CNG GGT ATC TAA TCC R: AGA GTT TGA TCC TGG CTN AG spp C jejuni C coli F: CTA TTT TAT TTT TGA GTG CTT GTG R: GCT TTA TTT GCC ATT TGT TTT ATT A F: AAT TGA AAA TTG CTC CAA CTA TG R: TGA TTT TAT TAT TTG TAG CAG CG Đoạn gene khuếch đại Chiều dài sản phẩm 16S rRNA 800 bp mapA 589 bp ceuE 462 bp Bảng Quy trình phản ứng multiplex PCR phân loại Campylobacter spp Quy trình luân nhiệt 94oC 10 phút Biến tính 94oC 30 giây Bắt cặp 59oC 90 giây Kéo dài 72oC 60 giây 72oC 10 phút 23 30 chu kỳ Hình 1: Multiplex PCR phân biệt C.jejuni C.coli 1: Thang đo; 2: Campylobacter jejuni; 3: Campylobacter coli Bảng Trình tự số đoạn mồi tương ứng với gene mục tiêu sử dụng để phát L monocytogenes kỹ thuật PCR (Tao cs., 2015) Gene Trình tự (5’-3’) Kích thước sản phẩm PCR (bp) hlyA F: GCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAA R: GCAACGTATCCTCCAGAGTGATCG 456 actA F: CGCCGCGGAAATTAAAAAAAG R: ACGAAGGAACCGGGCTGCTAG 839 mpl F: TGATGAAATAAAGGTCCACG R: CAAGCCATAATGAACAAACG 679 sigB F: ACCTGATAAAGAGGCGAAAG R: CCGTGACACCGATGAAAT 419 inlA F: AGCCACTTAAGGCAAT R: AGTTGATGTTGTGTTAGA 760 inlB F: AAAGCACAACCCAAGAAGGA R: GGAGTAACAAGCGACCCATC 798 24 ... GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH - - BÁO CÁO AN TOÀN THỰC PHẨM Chủ đề: CÁC GENE ĐỘC LỰC CỦA CAMPYLOBACTER JEJUNI VÀ LISTERIA MONOCYTOGENES GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM, CƠ... nhiệt độ thời gian bảo quản thực phẩm khuyến nghị Việc tầm soát vấy nhiễm mầm bệnh thực phẩm góp phần quan trọng việc ngăn chặn bệnh xảy người Các yếu tố độc lực đóng vai trị quan trọng việc giúp... Kết luận Ngày nay, vấn đề an toàn thực phẩm ngày quan tâm kiểm soát chặt chẽ Campylobacter jejuni L monocytogenes số nguyên nhân phổ biến gây nhiễm trùng vi khuẩn người toàn giới Các mầm bệnh truyền