Nghiên cứu sản xuất khối tiểu cầu đơn từ lớp buffy

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ********** Nguyễn Thị Lan NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHỐI TIỂU CẦU ĐƠN TỪ LỚP BUFFY LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ********** Nguyễn Thị Lan NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHỐI TIỂU CẦU ĐƠN TỪ LỚP BUFFY Chuyên ngành:Sinh học thực nghiệm Mã số:8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Trần Văn Tính TS Lưu Thị Thu Phương Hà Nội -2020 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Lưu Thị Thu Phương TS Trần Văn Tính giao đề tài tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn thạc sĩ Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới tập thể khoa Huyết học – Truyền máu, Ban lãnh đạo bệnh viện Nhi Trung ương Bệnh viện 19-8 cho phép tạo điều kiện để tơi hồn thành đề tài nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cơ, bạn bè tồn người thân gia đình ln giúp đỡ nhiệt tình động viên tơi suốt q trình thực đề tài Hà Nội, ngày 08 tháng 11 năm 2020 HỌC VIÊN Nguyễn Thị Lan MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN 1.1 Tiểu cầu .7 1.1.1 Cơ chế sinh tiểu cầu 1.1.2 Số lượng, đời sống hình thái tiểu cầu 1.1.3 Cấu trúc tiểu cầu .8 1.1.4 Đặc tính tiểu cầu 11 1.1.5 Vai trò tiểu cầu q trình đơng máu huyết tương 13 1.1.6 Một số bệnh lý bất thường chức tiểu cầu .14 1.1.7 Các xét nghiệm chẩn đoán bất thường chức tiểu cầu 15 1.2 Điều chế khối tiểu cầu 15 1.2.1 Các loại chế phẩm tiểu cầu .15 1.2.2 Các phương pháp điều chế khối tiểu cầu 16 1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu điều chế khối tiểu cầu 19 1.3 Bảo quản tiểu cầu .20 1.3.1 Nhiệt độ bảo quản 20 1.3.2 Chế độ lắc .21 1.3.3 Chất lượng túi bảo quản 22 1.4 Đánh giá chất lượng khối tiểu cầu 23 1.5 Nhuộm huỳnh quang đặc hiệu ty thể tiểu cầu .23 1.6 Tình hình sản xuất sử dụng khối tiểu cầu 25 1.6.1 Tại Việt Nam 25 1.6.2 Tại bệnh viện Nhi Trung ương 25 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .27 2.1 Đối tượng nghiên cứu .27 2.2 Phương pháp nghiên cứu .27 2.2.1 Các tiêu chuẩn áp dụng nghiên cứu 27 2.2.2 Các phương tiện, dụng cụ hóa chất dùng nghiên cứu 27 2.2.3 Các kỹ thuật dùng nghiên cứu .29 2.2.4 Xử lý liệu: 36 2.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu 36 2.4 Đạo đức nghiên cứu 36 Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 37 3.1 Đặc điểm chung người hiến máu .37 3.2 Tối ưu quy trình điều chế khối tiểu cầu đơn từ buffy coat 38 3.2.1 Kết tối ưu hóa quy trình điều chế khối tiểu cầu phương pháp buffy coat 38 3.2.2 Quy trình điều chế khối tiểu cầu đơn phương pháp buffy coat 41 3.3 Kết điều chế khối tiểu cầu 42 3.3.1 Kết điều chế khối tiểu cầu đơn phương pháp huyết tương giàu tiểu cầu .42 3.3.2 Kết điều chế khối tiểu cầu đơn từ phương pháp buffy coat .45 3.3.3 So sánh chất lượng khối tiểu cầu đơn sản xuất phương pháp huyết tương giàu tiểu cầu buffy coat 46 3.3.4 Kết điều chế khối tiểu cầu pool từ lớp buffy coat máu toàn phần 50 3.4 Kết đánh giá chất lượng khối tiểu cầu theo thời gian bảo quản 51 3.4.1 Sự thay đổi số lượng tiểu cầu .51 3.4.2 Sự thay đổi hàm lượng glucose .54 3.4.3 Sự thay đổi pH thời gian bảo quản .57 3.4.4 Sự thay đổi LDH thời gian bảo quản 60 3.4.5 Kết cấy tìm vi khuẩn khối tiểu cầu thời gian bảo quản 62 3.5 Kết nhuộm huỳnh quang tiểu cầu 62 KẾT LUẬN 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 PHỤ LỤC 75 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các receptor bề mặt tiểu cầu .9 Bảng 1.2 Kích thước tỷ trọng số thành phần máu 17 Bảng 1.3 Đánh giá chất lượng khối tiểu cầu 23 Bảng 1.4 Tình hình sử dụng chế phẩm tiểu cầu năm 2014-2019 bệnh viện Nhi Trung ương 26 Bảng 2.1 Danh mục thiết bị dùng nghiên cứu 28 Bảng 2.2 Danh mục hóa chất dùng nghiên cứu 28 Bảng 3.1 Một số đặc điểm người hiến máu .37 Bảng 3.2 Các số huyết học trung bình người hiến máu .38 Bảng 3.3 Kết điều chế khối tiểu cầu đơn từ huyết tương giàu tiểu cầu 42 Bảng 3.4 Số lượng tiểu cầu q trình tối ưu hóa li tâm lần .39 Bảng 3.5 Số lượng tiểu cầu q trình tối ưu hóa li tâm lần .40 Bảng 3.6 Kết điều chế khối tiểu cầu đơn từ lớp buffy coat .45 Bảng 3.7: So sánh số khối tiểu cầu điều chếbằng phương pháp huyết tương giàu tiểu cầu buffy coat 46 Bảng 3.8 Kết số khối tiểu cầu điều chế phương pháp pool từ lớp buffy coat 50 Bảng 3.9 So sánh tốc độ giảm tiểu cầu khối tiểu cầu điều chếbằng ba phương pháp ngày bảo quản 52 Bảng 3.10 So sánh tốc độ giảm glucose khối tiểu cầu điều chếbằng ba phương pháp ngày bảo quản 55 Bảng 3.11 So sánh tốc độ giảm pH khối tiểu cầu điều chếbằng ba phương pháp ngày bảo quản 57 Bảng 3.12 So sánh thay đổi hoạt độ LDHcủa khối tiểu cầu điều chếbằng ba phương pháp ngày bảo quản 60 Bảng 3.13 Kết nhuộm huỳnh quang đặc hiệu ty thể tiểu cầu 63 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ sinh tiểu cầu Hình 1.2 Bề mặt tiểu cầu kính hiển vi điện tử quét Hình 1.3 Cấu trúc tiểu cầu Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 27 Hình 2.2 Sơ đồ quy trình điều chế khối tiểu cầu đơn từ huyết tương giàu tiểu cầu 29 Hình 2.3 Nhuộm huỳnh quang đặc hiệu ty thể tiểu cầu 36 Hình 3.1 Hình ảnh điều chế khối tiểu cầu hai phương pháp 48 Hình 3.2 Sự suy giảm số lượng tiểu cầu khối tiểu cầu so với ngày 53 Hình 3.3 Sự thay đổi hàm lượng glucose khối tiểu cầu bảo quản 56 Hình 3.4 Sự thay đổi pH thời gian bảo quản 58 Hình 3.5 Sự thay đổi LDH thời gian bảo quản 62 Hình 3.6 Tiểu cầu soi kính hiển vi đồng tiêu quét laser 63 Hình 3.7 Sự thay đổi tỷ lệ sống tiểu cầu theo thời gian 64 Hình 3.8 Sự thay đổi cường độ huỳnh quang theo thời gian bảo quản 65 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ đầy đủ Chữ viết tắt AABB American Association of Blood Banks (Hiệp hội ngân hàng máu Hoa Kỳ) ADP Adenosin Diphosphate ATP Adenosin Triphosphate AU Auxilary unit BC Bạch cầu CPD Citrate – Phosphate-Dextrose ECGF Endothelial cell growth factor (Yếu tố tăng trưởng tế bào nội mô) PFA Pletelet Function Analyser DEHP Di-2 ethlhexl-phthalate GP Glycoprotein HBV Hepatitis B virus (Vi rút viêm gan B) HCV Hepatitis C virus (Vi rút viêm gan C) HIV Human Immunodeficienal virus (Vi rút gây suy giảm miễn dịch người) HLA Human Leukocyte Antigen (Kháng nguyên bạch cầu người) HMWK High molecular weight kininogen HTGTC Huyết tương giàu tiểu cầu TF Tissue factor – Yếu tố mô PDGF Platelet derived growth factor (Yếu tố tăng trưởng từ tiểu cầu) TGF-β Transforming growth factor (Yếu tố tăng trưởng chuyển dạng β) EGF Epidermal growth factor (Yếu tố tăng trưởng tế bào biểu bì) TC Tiểu cầu PVC Polyvinyl clorua IL Interleukin KTC Khối tiểu cầu KTBT Kháng thể bất thường LDH Lactate de hydrogenase RCF Relative Centrifugal Force (lực ly tâm) SLBC Số lượng bạch cầu SLHC Số lượng hồng cầu MỞ ĐẦU Tiểu cầu thành phần máu đóng vai trị quan trọng q trình đơng cầm máu Số lượng tiểu cầu thấp gây chảy máu hay gặp bệnh lý huyết học số bệnh lý nội khoa, dẫn đến biến chứng nặng tử vong Để điều trị phòng ngừa chảy máu, điều trị thường sử dụng khối tiểu cầu liệu pháp quan trọng góp phần cứu sống bệnh nhân Khối tiểu cầu có ba loại [2]: Tiểu cầu đơn điều chế từ đơn vị máu toàn phần, khối tiểu cầu pool tách từ nhiều đơn vị máu toàn phần, tiểu cầu máy gạn tách trực tiếp từ người hiến tiểu cầu Khối tiểu cầu pool có số lượng tiểu cầu thấp so với khối tiểu cầu máy Ưu điểm khối tiểu cầu pool dễ sản xuất, số lượng tiểu cầu thể tích lớn khối tiểu cầu đơn làm gia tăng hiệu công tác truyền máu Tuy vậy, nhược điểm phải lựa chọn đơn vị máu có nhóm máu, dễ nhiễm khuẩn trình điều chế khả gây bất đồng miễn dịch cho người nhận Đối với bệnh nhân nhi thể tích tổng số tiểu cầu cần truyền thấp nên thường sử dụng khối tiểu cầu đơn Việc điều chế khôi tiểu cầu đơn từ người cho có khối tiểu cầu đậm đặc vừa đủ số lượng vừa an toàn mặt miễn dịch tiết kiệm cho người bệnh Tại Bệnh viện Nhi Trung ương thực phương pháp truyền thống điều chế khối tiểu cầu đơn phương pháp huyết tương giàu tiểu cầu Tuy nhiên, với phương pháp hiệu suất thu hoạch tiểu cầu chưa cao, số lượng hồng cầu bạch cầu tồn dư cịn nhiều Nhằm cải tiến quy trình điều chế chế phẩm máu, nâng cao chất lượng chế phẩm máu hiệu truyền máu Bệnh viện Nhi Trung ương, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sản xuất khối tiểu cầu đơn từ lớp buffy” với ba mục tiêu: Tối ưu quy trình điều chế khối tiểu cầu đơn từ buffy coat, áp dụng bệnh viện Nhi Trung Ương Đánh giá chất lượng khối tiểu cầu điều chế Bệnh viện Nhi Trung ương Đánh giá thay đổi số xét nghiệm bảo quản khối tiểu cầu Chương TỔNG QUAN 1.1 Tiểu cầu 1.1.1 Cơ chế sinh tiểu cầu Tiểu cầu (TC) mảnh tế bào sinh nguyên mẫu TC Các nguyên mẫu TC biệt hóa từ tế bào gốc vạn theo sơ đồ sau: Hình 1.1 Sơ đồ sinh tiểu cầu [5] (HSC: hemopoietic stem cells, MTC: mẫu tiểu cầu, TC: tiểu cầu) Quá trình diễn tủy xương Mẫu tiểu cầu biệt hóa từ tế bào gốc vạn sau qua giai đoạn: Nguyên mẫu TC, mẫu TC ưa base, mẫu tiểu cầu chưa sinh tiểu cầu mẫu tiểu cầu sinh tiểu cầu [5] 1.1.2 Số lượng, đời sống hình thái tiểu cầu Bình thường số lượng tiểu cầu máu nằm khoảng 150 - 500 x 109/l Lượng tiểu cầu 2/3 tổng số tiểu cầu khoảng 1/3 lưu trữ lách [13] Đời sống tiểu cầu khoảng 8-10 ngày [52] Về hình thái tiểu cầu: Tiểu cầu mảnh tế bào có kích thước từ 2,0- 5,0µm Dưới kính hiển vi quang học, tiểu cầu có dạng đĩa, hai mặt lồi, khơng có nhân [65] Dưới kính hiển vi điện tử, tiểu cầu xù xì, bề mặt xuất nụ sùi kéo dài khoảng từ 14-20 nm Các nụ cấu tạo glycoprotein, glycolipid, mucopolysaccharide protein huyết tương Ngồi ra, cịn số hình cưa ... phần, tiểu cầu máy gạn tách trực tiếp từ người hiến tiểu cầu Khối tiểu cầu pool có số lượng tiểu cầu thấp so với khối tiểu cầu máy Ưu điểm khối tiểu cầu pool dễ sản xuất, số lượng tiểu cầu thể... đơn: - Điều chế từ huyết tương giàu tiểu cầu - Điều chế từ buffy coat b) Khối tiểu cầu pool Khối tiểu cầu pool khối tiểu cầu tiếp nhận từ 4-6 người hiến máu toàn phần Khối tiểu cầu điều chế từ. .. tài: ? ?Nghiên cứu sản xuất khối tiểu cầu đơn từ lớp buffy? ?? với ba mục tiêu: Tối ưu quy trình điều chế khối tiểu cầu đơn từ buffy coat, áp dụng bệnh viện Nhi Trung Ương Đánh giá chất lượng khối tiểu