HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM PHÙNG ĐÌNH LƯƠNG NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP PHẢN ỨNG ELISA PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ CHẨN ĐỐN SỚM BỆNH GIUN MĨC Ở CHĨ Chun ngành: Thú Y Mã ngành: 8640101 Người hướng dan khoa học: TS Bù i Khánh Linh NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 10 tháng 11 năm 2019 Tác giả luận văn Phùng Đình Lương i LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập thực đề tài tốt nghiệp, nỗ lực thân, tơi cịn nhận nhiều giúp đỡ tập thể, cá nhân trường Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám đốc Học Viện Nơng Nghiệp Việt Nam, tồn thể Thầy giáo, Cô giáo nhân viên Khoa Thú y, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam dạy bảo tận tình hồn thành khóa học Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc TS Bùi Khánh Linh, người trực tiếp hướng dẫn bảo tơi tận tình suốt thời gian học tập hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn anh chị em phịng thí nghiệm Viện Nghiên cứu Bảo tồn Đa dạng Sinh học bệnh Nhiệt Đới (BioD), Bộ môn Ký Sinh Trùng – Khoa Thú y – Học Viện Nơng Nghiệp Việt Nam, phịng khám thú y GAIA, nhóm sinh viên nghiên cứu khoa học Thú cưng tập vừa qua giúp tơi góp ý, bảo để luận văn tơi hồn thành Để hồn thành khóa luận này, tơi cịn nhận động viên khích lệ người thân bạn bè Tơi xin chân thành cảm ơn tình cảm cao q Trong q trình thực tập chưa có nhiều kinh nghiệm thực tế, dựa vào kiến thức học với thời gian hạn hẹp nên báo cáo khơng tránh khỏi sai sót Kính mong góp ý nhận xét q thầy để giúp cho kiến thức tơi ngày hồn thiện có thêm nhiều kinh nghiệm bổ ích cho việc phát triển thân sau Hà Nội, ngày 10 tháng 11 năm 2019 Tác giả luận văn Phùng Đình Lương ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract x Phần Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cúu 1.3 Ý nghĩa đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Lịch sử tình hình nghiên cứu giun móc chó 2.2 Bệnh giun móc chó 2.3 Phản ứng elisa 16 Phần Đối tượng, nội dung phương pháp nghiên cứu 26 3.1 Đối tượng nghiên cứu 26 3.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 26 3.3 Vật liệu nghiên cứu 26 3.4 Nội dung nghiên cứu 28 3.5 Phương pháp nghiên cứu 28 Phần Kết thảo luận 34 4.1 Kết điều tra phòng khám chăm sóc thú cưng gaia 34 4.1.1 Tình hình nhiễm giun móc chó phịng khám chăm sóc thú cưng gaia 34 4.1.2 Phân tích thành phần protein kháng nguyên giun móc 35 4.1.3 Kết thẩm tách miễn dịch western blot màng lai pvdf 37 4.2 Thiết lập phương pháp elisa 39 4.2.1 Lựa chọn nồng độ kháng nguyên, độ pha loãng kháng thể 39 iii 4.2.2 Tính giá trị ngưỡng, độ nhạy độ đặc hiệu 42 4.3 Ứng dụng phương pháp elisa 44 Phần Kết luận kiến nghị 46 5.1 Kết luận 46 5.2 Kiến nghị 46 Tài liệu tham khảo 47 Phụ lục 57 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt A Caninum Ancylostoma caninum A Ceylanicum Ancylostoma ceylanicum A Ceylanicum Ancylostoma braziliense U Stenocephala Uncinaria stenocephala N Americanus Necator americanus ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay Cs Cộng ES Excretory-secretory G Gram µl Microliter RIA radioimmunoassay BioD Biodiversity Conservation and Tropical Disease Research Institute PVDF Polyvinylidene Fluoride WHO World Health Organization PCR-RFLP PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism kDa kiloDalton Ag Antigen Ab Antibody AB Antibody (different specics donor than Ab) Anti-Ab Antispecies antiserun against species from donor Ab Anti-AB Antispecies antiserun against species from donor AB S Substrate WASH Washing step O Incubation C v READ Read color in spectrophotometer ID Identification SDS-PAGE Điện di polyacrylamide với SDS M Thang khối lượng protein SA Kháng nguyên thân ES Kháng nguyên chất tiết NC Đối chứng âm PC Đối chứng dương Ml Mililit KT Kháng thể KN Kháng nguyên vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Công thức thống kê 32 Bảng 4.1 Kết chẩn đoán phương pháp ELISA 43 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Phân biệt lồi giun móc chó Hình 2.2 Vịng đời giun móc chó 10 Hình 2.3 Bệnh tích đường ruột giun móc chó gây 14 Hình 2.4 Trứng giun móc chó 15 Hình 2.5 Sơ đồ tiến trình thực phản ứng ELISA trực tiếp 17 Hình 2.6 Sơ đồ tiến trình thực phản ứng ELISA gián tiếp 18 Hình 2.7 Sơ đồ tiến trình thực ELISA Sandwich trực tiếp 20 Hình 2.8 Sơ đồ tiến trình thực phản ứng ELISA Sandwich gián tiếp 20 Hình 2.9 Sơ đồ Direct C-ELISA kiểm tra kháng nguyên 22 Hình 2.10 Sơ đồ Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể 23 Hình 4.1 Kết xác định thành phần kháng nguyên thân chất tiết giun móc chó trưởng thành phương pháp điện di SDS-PAGE 36 Hình 4.2 Kết thẩm tách miễn dịch Western Blot màng lai PVDF 38 Hình 4.3 Biểu đồ nồng độ pha loãng kháng thể 1/100 40 Hình 4.4 Biểu đồ nồng độ pha lỗng kháng thể 1/200 40 Hình 4.5 Biểu đồ nồng độ pha loãng kháng thể 1/400 41 Hình 4.6 Biểu đồ nồng độ pha loãng kháng thể 1/800 41 Hình 4.7 Biểu đồ đường giá trị OD 20 mẫu âm 20 mẫu dương 42 Hình 4.8 Biểu đồ kết chẩn đốn dương tính giun móc 44 Hình 5.1 Dụng cụ thực phương pháp phù 57 Hình 5.2 Máy đọc kết ELISA 57 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Phùng Đình Lương Tên Luận văn: Nghiên cứu thiết lập phản ứng Elisa phát kháng thể chẩn đốn sớm bệnh giun móc chó Ngành: Thú y Mã số: 8640101 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu thực trạng nhiễm bệnh giun móc, thiết lập phản ứng ELISA ứng dụng chẩn đốn sớm bệnh giun móc chó Qua đề biện pháp phịng tránh bệnh giun móc chó người Nội dung, phương pháp nghiên cứu Điều chế hai loại kháng nguyên giun móc kháng nguyên thân kháng nguyên chất tiết để phân tích thành phần protein đánh giá đáp ứng miễn dịch với kháng thể hai loại kháng nguyên Sử dụng phương pháp ELISA 40 mẫu huyết chó, có 20 mẫu huyết dương tính với giun móc 20 mẫu huyết âm tính với giun móc, đồng thời kết hợp với phương pháp Willis tìm trứng giun móc phân, qua tìm nồng độ kháng nguyên độ pha loãng kháng thể phù hợp cho phản ứng ELISA, tính độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng Sau thiết lập phản ứng ELISA tiến hành áp dụng vào thực tế với 39 ca bệnh so sánh với phương pháp Willis Kết kết luận Tỷ lệ nhiễm giun móc chó phịng khám chăm sóc Thú cưng GAIA 26.11% Protein giun móc dải protein kháng nguyên thân có khối lượng dao dộng từ 12 kDa đến 180 kDa dải kháng nguyên chất tiết giun móc chó có khối lượng từ 11 kDa đến 63 kDa Bằng phương pháp Western Blot, xác định thành phần protein có đáp ứng miễn dịch với kháng thể bệnh giun móc chó bao gồm kháng nguyên thân có 10 vạch protein có khối lượng phân tử 12, 15, 28, 32, 40, 43, 50, 70, 95, 250 kDa kháng nguyên chất tiết có vạch protein 95, 70, 50 kDa Nồng độ kháng ngun 0,005 µg/ml, nồng độ pha lỗng kháng thể 1/800 phản ứng ELISA đạt giá trị ngưỡng 0,536, có độ nhạy đạt 85% độ đặc hiệu đạt 80% Ứng dụng phương pháp ELISA chẩn đoán giun móc chó cho thấy kết dương tính đạt 69,23% cao nhiều so với phương pháp xét nghiệm phân thơng thường ix Hình 4.2: Kết thẩm tách miễn dịch Western Blot màng lai PVDF Ghi chú: M: Thang khối lượng protein (10-250kDa); ES: Kháng nguyên chất tiết; SA: kháng nguyên thân; PC: Đối chứng dương; NC: Đối chứng âm 38 Các thành phần protein có kháng nguyên thân kháng nguyên chất tiết giun móc sử dụng nhiều nghiên cứu miễn dịch bệnh Ngày nay, nhiễm giun móc vấn đề sức khoẻ lớn mà phương pháp chẩn đoán giúp cải thiện nghiên cứu dịch tễ học nỗ lực kiểm soát bệnh Theo nghiên cứu Bungiro RD Jr et al., 2002 ni cấy in vivo, giun trưởng thành A ceylanicum tạo nhiều kháng nguyên chất tiết (protein ES) 18 thành phần protein có khả miễn dịch cao Bin et al.(2005) sau thẩm tách miễn dịch màng lai PVDF với kháng nguyên chất tiết giun móc A Caninum thấy protein rõ nét khối lượng khoảng 30 kDa Với mẫu huyết chó nhiễm bệnh phát protein chất tiết lồi Unicaria stenocephala có khối lượng phân tử dao động 4367 kDa (Postigo et al., 2003) Andew et al.(1986) xác định phân tử kháng nguyên thân chất tiết có khối lượng phân tử 33 kDa có đáp ứng đặc hiệu với huyết người nhiễm giun móc N americanus So với kết chúng tơi có khác nhau, lồi giun móc nghiên cứu tác giả nêu khác với nghiên cứu chúng tơi Nhưng nhận protein có khối lượng phân tử dao động 30 kDa tìm thấy nhiều lồi Nên protein có khối lượng phân tử 28 kDa 32 kDa kháng ngun có ý nghĩa chẩn đoán 4.2 THIẾT LẬP PHƯƠNG PHÁP ELISA 4.2.1 Lựa chọn nồng độ kháng nguyên, độ pha loãng kháng thể Sau tiến hành phản ứng ELISA với nồng độ kháng nguyên độ pha loãng kháng thể khác kết trình bày biểu đồ Hình 4.3, 4.4, 4.5 4.6 39 Hình 4.3 Biểu đồ nồng độ pha lỗng kháng thể 1/100 Hình 4.4 Biểu đồ nồng độ pha loãng kháng thể 1/200 40 Hình 4.5 Biểu đồ nồng độ pha lỗng kháng thể 1/400 Hình 4.6 Biểu đồ nồng độ pha lỗng kháng thể 1/800 Kết kiểm tra máy đọc ELISA Qua kết nồng độ pha lỗng thu từ Hình 4.3 tới Hình 4.6 cho thấy nhiều giá trị có tiềm việc ứng dụng vào thí nghiệm Khả đáp ứng miến dịch nồng độ pha loãng đánh giá hiệu số huyết dương huyết âm nồng độ kháng nguyên, hiệu số cao hợp lý cho khả 41 chẩn đốn xác tiết kiệm kháng ngun, kháng thể Ở nồng độ kháng nguyên 0,015 µg/ml, độ pha loãng kháng thể 1/100, hiệu số đo 1,258 Tuy vậy, giá trị OD huyết âm vị trí lại cao, đạt 0,635 chưa phù hợp với việc thiết kế thí nghiệm Xét vị trí khác, với nồng độ kháng nguyên 0,00375 µg/ml độ pha loãng kháng thể 1/200 hiệu số đạt giá trị 0,713 Tại vị trí nồng độ kháng ngun 0,005 µg/ml độ pha lỗng kháng thể 1/800 giá trị OD đo 1,182, vị trí mà đáp ứng miễn dịch mẫu huyết dương tốt (OD cao nhất) mẫu dương thấp (OD thấp nhất) nên định chọn nồng độ kháng nguyên 0,005 µg/ml, độ pha loãng kháng thể 1/800 để tiến hành xác định độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng ELISA 4.2.2 Tính giá trị ngưỡng, độ nhạy độ đặc hiệu Giá trị ngưỡng Sau lựa chọn nồng độ pha loãng kháng nguyên độ pha loãng kháng thể 0,005 µg/ml 1/800, tiến hành phản ứng ELISA với 40 mẫu huyết kết thể Hình 4.7 0,536 Hình 4.7 Biểu đồ đường giá trị OD 20 mẫu âm 20 mẫu dương Sử dụng cơng thức tính giá trị ngưỡng (cut-off) cho giá trị OD 20 mẫu huyết âm xác định giá trị ngưỡng phản ứng ELISA 0,536 42 Tuy nhiên theo thiết kế phản ứng ELISA John Croese et al (1996) mẫu kháng thể coi dương tính với A caninum có giá trị OD vượt điểm ngưỡng có giá trị 0,146 OD ngược lại, mẫu cho giá trị OD nhỏ 0,146 mẫu âm Không vậy, vào năm 2017, David A Elsemore cộng qua thí nghiệm đưa giá trị điểm ngưỡng tìm 0,100 Đó hai tác giả sử dụng kháng nguyên kháng thể dạng tinh khiết mà thí nghiệm điều kiện khơng cho phép nên thực mức thơ, OD hai tác giả nêu thấp so với kết thí nghiệm Độ nhạy độ đặc hiệu Sau thực soi phân tìm trứng với phản ứng ELISA, kết trình bày Bảng 4.1 Bảng 4.1 Kết chẩn đoán phương pháp ELISA Xét nghiệm chuẩn (Xét nghiệm tìm trứng phân) ELISA Tổng Dương tính Âm tính Dương tính 17 20 Âm tính 16 20 21 19 40 Tổng Dựa vào kết thu tìm giá trị độ nhạy đạt 85% độ đặc hiệu đạt 80% Rajul Parikh et al.(2008) độ nhạy độ đặc hiệu có vai trị lớn việc khẳng định độ xác thí nghiệm Hiệu lực thí nghiệm đo giá trị độ nhạy độ đặc hiệu Với bệnh khác có thí nghiệm khác nhằm chẩn đoán bệnh tất bệnh có tiêu chuẩn vàng khác việc chẩn đốn xác, nhanh chóng tiện lợi Các tiêu chuẩn vàng khơng cố định thay đổi theo tiến khoa học kĩ thuật Những phương pháp thiết kế thí nghiệm làm thay đổi tiêu chuẩn có, đồng thời trước hết chúng phải so sánh, đánh giá với tiêu chuẩn sẵn có Với độ nhạy độ đặc hiệu 85 80% cho thấy phản ứng ELISA phát kháng thể giun móc cho độ xác cao, nhiên qua thấy phản ứng cho kết âm tính hay dương tính giả nhược điểm phản ứng ELISA phản ứng chéo 43 4.3 Ứng dụng phương pháp ELISA Chúng tơi chẩn đốn giun móc cho 39 trường hợp phịng khám chăm sóc Thú cưng GAIA, sử dụng đồng thời hai phương pháp phù Fülleborn phương pháp ELISA với nồng độ kháng nguyên 0,005 µg/ml, nồng độ pha lỗng kháng thể 1/800 Kết chẩn đốn trình bày Hình 4.8 p< 0,05 Hình 4.8 Biểu đồ kết chẩn đốn dương tính giun móc Kết thí nghiệm cho thấy có chênh lệch rõ ràng kết chẩn đoán phương pháp ELISA phương pháp phù Qua chẩn đoán phương pháp ELISA, tỉ lệ dương tính với giun móc chó 39 cá thể đạt 69,23% Đối với phương pháp phù nổi, tỉ lệ dương tính đạt 25,64% Như vậy, tỉ lệ chẩn đốn mắc bệnh phương pháp ELISA cao nhiều so với phương pháp xét nghiệm phân Các tác giả O R McCoy (1930) Richard D Bungiro et al.(2005) khẳng định cần từ 12 tới 17 ngày sau nhiễm ấu trùng phát trứng giun móc phân Điều cho thấy trường hợp chẩn đoán, số cá thể nhiễm giun móc chưa tới giai đoạn thải trứng thể Như phương pháp phát trứng có độ nhạy so với phương pháp huyết học Tuy nhiên, phương pháp ELISA phát kháng thể giun móc, khơng thể đưa kết luận cá thể có bị nhiễm hay khơng vào thời điểm chẩn đốn kháng thể tồn thể vật chủ thời gian sau khỏi bệnh Mặc dù vậy, 44 phương pháp ELISA có ý nghĩa lớn việc hỗ trợ chẩn đoán điều tra dịch tễ học Theo nghiên cứu Richard D Bungiro, JR et al., 2005 tiến hành nghiên cứu sơ ELISA phân cung cấp phương tiện để hỗ trợ chẩn đốn nhiễm giun móc với cường độ thấp mà khơng thể phát xét nghiệm phân thông thường, thay vào ước tính xác tỷ lệ nhiễm giun móc Trong số trường hợp nhiễm trùng thực nghiệm với giun móc A caninum phương pháp ELISA có kết dương tính 100% so với xét nghiệm phân thông thường dựa phát trứng phân Ngồi ra, ELISA có khả phát nhiễm giun móc giai đoạn trước, thực tế phản ứng ELISA cho loài A caninum phát nhiễm giun từ tuần trước quan sát thấy trứng, điều cho thấy phản ứng ELISA có khả phát giai đoạn giun chưa phát triển đến dạng trường thành ruột (Elsemore et al., 2014) Trong nghiên cứu khác Schad et al., 1982, phản ứng ELISA loài A caninum phát số người nhiễm bệnh cao so với phương pháp phù thơng thường (19 mẫu kháng ngun dương tính 13 mẫu dương tính với phương pháp phù nổi) Do đó, việc phát kháng ngun A caninum mà khơng có trứng phân coi đặc hiệu Nếu mẫu dương tính với phương pháp phù tiếp tục kiểm tra phương pháp ELISA rõ ràng có tập hợp mẫu dương tính với phương pháp phù lại âm tính với phương pháp ELISA Điều hữu ích việc giảm chẩn đoán nhầm bệnh Trong nhiều trường hợp, vật chủ có nguy bị nhiễm bệnh giun móc chó lúc từ xâm nhập qua da ấu trùng giun móc hay nuốt phải trứng ấu trùng giun móc giai đoạn gây nhiễm Do đó, vật chủ thường xuyên phòng ngừa (sử dụng thuốc tẩy giun định kì) giun có hội nhỏ để phát triển đến giai đoạn trưởng thành tiếp tục kí sinh ruột Do phải tiến hành kiểm tra phân thường xuyên sử dụng phương pháp ELISA để chẩn đốn xác bệnh để điều trị kịp thời 45 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Kết xét nghiệm 180 mẫu phân thu phịng khám chăm sóc Thú cưng Gaia phương pháp phù cho thấy có 47 mẫu dương tính với giun móc tổng số 180 mẫu kiểm tra (chiếm 26.11%) Thành phần kháng nguyên gun móc chó phương pháp điện di SDS-PAGE phát 16 dải protein kháng nguyên thân giun móc chó có khối lượng dao dộng từ 12kDa đến 180kDa Thẩm tách miễn dịch Western Blot sử dụng màng polyvinylidene Fluoride kháng nguyên thân giun móc xác định 10 vạch protein có đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với kháng thể có khối lượng phân tử 12, 15, 28, 32, 40, 43, 50, 70, 95, 250kDa, Kháng nguyên chất tiết có vạch protein 50, 70, 95kDa Giá trị ngưỡng phản ứng ELISA 0,536 Độ nhạy, độ đặc hiệu phản ứng đạt 85% 80% Kết ứng dụng phương pháp ELISA việc chẩn đốn giun móc chó cho thấy kết dương tính đạt 69,23% 5.2 KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu sâu phương pháp ELISA chấn đoán bệnh giun móc chó, sử dụng nồng độ kháng nguyên độ pha loãng kháng thể khác để cải tiến thí nghiệm - Thực phản ứng ELISA cá thể bị nhiễm ấu trùng giun móc thể ngồi da để đánh giá khả chẩn đốn - Tiến hành gây nhiễm ấu trùng giun móc lên chuột hai thể nhiễm đường tiêu hóa ngồi da Sử dụng phương pháp ELISA để chẩn đốn từ ngày sau gây nhiễm để tìm khoảng thời gian thể bắt đầu sản sinh kháng thể chống lại kháng nguyên giun móc, từ giúp tăng cao khả chẩn đốn bệnh sớm - Thiết lập phản ứng ELISA tạo kit chẩn đốn bệnh giun móc chó người 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt: Bùi Khánh Linh, Nguyễn Văn Thọ, Nguyễn Thị Hoàng Yến, Dương Đức Hiếu, Lê Thị Lan Anh, Nguyễn Văn Tú, Công Hà My Nonaka Nariaka (2018) “Đánh giá thực trạng nhiễm số lồi giun trịn truyền lây từ chó sang người” Tạp chí bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng (2) tr.102 Dương Đức Hiếu, Nguyễn Văn Thọ, Nguyễn Quang An, Nguyễn Việt Linh, Trần Lê Thu Hằng , Bùi Khánh Linh Phạm Ngọc Doanh (2016) “Khẳng định lưu hành giun móc chó (Ancylostoma ceylanicum)” Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y XXIII (4) Đỗ Dương Thái Trịnh Văn Thịnh (1978) “Cơng trình nghiên cứu ký sinh trùng Việt Nam, tập 2” NXB Khoa học Kỹ Thuật, Hà Nội Đỗ Hài (1972) “Vài nhận xét giun trịn (Nematoda) chó săn ni Việt Nam” Tạp chí Khoa học & kỹ thuật nơng nghiệp Đỗ Hài (1975) “Quan sát dịch bênh chó Berger” Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nơng nghiệp (8) Lê Hữu Khương Lương Văn Huấn (1998) “Giun móc ký sinh đàn chó thành phố Hồ Chí Minh” Tạp chí KHKT thú y V (4) Ngơ Huyền Thúy (1996) “Giun sán đường tiêu hóa chó Hà Nội số đặc điểm giun thực quản Spirocerca lupi” Luận án phó tiến sỹ Nông nghiệp, Viện thú y quốc gia Nguyễn Hữu Hưng Lê Trung Hồng (2012) “Tình hình nhiễm giun trịn ký sinh chó thành phố Cần Thơ” Tạp chí y dược học quân số chuyên đề kc.10 năm 2012 Nguyễn Thị Lê, Phạm Văn Lực, Hà Duy Ngọ, Nguyễn Văn Đức Nguyễn Thị Minh (1996) “Giun sán ký sinh gia súc Việt Nam.” NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 10 Nguyễn Văn Đức, Nguyễn Thị Lê, Phạm Văn Đức, Nguyễn Thị Minh Hà Duy Ngọ (1996) “Giun sán ký sinh gia súc Việt Nam” NXB Khoa học & Kỹ thuật, Hà Nội 11 Phạm Sỹ Lăng, Lê Thanh Hải Nguyễn Thị Rật (1990) “Bệnh giun móc chó Việt Nam” Cơng trình nghiên cứu khoa học kỹ thuật (1990 – 1991) NXB Nông Nghiệp, Hà Nội 47 12 Phạm Sỹ Lăng, Lê Thanh Hải Phạm Thị Rật (1993) “Một số nhận xét loài giun tròn ký sinh thú ăn thịt vườn thú Thủ Lệ chó cảnh, Kỹ thuật phịng trị” (Cơng trình nghiên cứu Khoa học Kỹ thuật 1990 - 1991) Viện thú y quốc gia 13 Phạm Văn Khuê, Trần Văn Quyên Đoàn Văn Phúc (1993) “Nhận xét giun sán ký sinh chó Hà Nội” (Cơng trình nghiên cứu Đại học Nơng nghiệp I) NXB Nông nghiệp, Hà Nội 14 Phan Thế Việt, Nguyễn Thị Kỳ Nguyễn Thị Lê (1977) “Giun sán ký sinh động vật Việt Nam” NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội 15 Skrjabin, KI and Petrov, AM (1963) Ngun lý mơn giun trịn tập 1, (do Bùi Lập, Đoàn Thị Băng Tâm, Tạ Thị Vịnh dịch) NXB Khoa học & Kỹ thuật, Hà Nội 16 Trịnh Văn Thịnh (1963) “Ký sinh trùng Thú y” NXB Nông thôn, Hà Nội 17 Trịnh Văn Thịnh (1963) “Những nhận xét sinh thái học số loài ký sinh gia súc nước ta” Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp (4) 18 Trịnh Văn Thịnh (1966) “Một số bệnh giun sán gia súc” NXB Nông thôn, Hà Nội 19 Trịnh Văn Thinh, Phạm Trọng Cưng, Phạm Văn Khuê Phan Lục (1982) “Giáo trình Ký sinh trùng học Thú y” NXB Nông nghiệp, Hà Nội 20 Trương Văn Hội, Thân Trọng Quang, Thái Phương Dương, Lê Vũ Chương, Lê Trọng Lưu, Phạm Văn Ký, Trần Văn Hương, Nguyễn Văn Hùng, Đỗ Thùy Dung Nguyễn Hoàng Diệu (2017) “Thực trạng số yếu tố liên quan đến nhiễm giun móc/mỏ xã Vĩnh Hải, Huyện Ninh Hải, Tỉnh Ninh Thuận năm 2015” Tạp chí phịng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng.(2) tr 98 21 Võ Thị Hải Lê Nguyễn Văn Thọ (2011) “Tình hình nhiễm giun trịn đường tiêu hóa chó số địa phương tỉnh Thanh Hóa” Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y XVIII (6) 22 Võ Thị Hải Lê “Tổng quan tình hình nghiên cứu Ancylostoma caninum chó nước giới” TP Khoa học HTQT 23 Nguyễn QD “Tình hình nhiễm giun đàn chó ni Hà Nội” Tạp chí Khoa Học Kỹ Thuật Thú y XIX (4) 24 Lê H Lương V (1998) “Giun móc ký sinh chó thành phố Hồ Chí Minh” Tạp chí Khoa Học Kỹ Thuật Thú y V (4) 48 25 Dương Đức Hiếu, Bùi Khánh Linh, Nguyễn Việt Linh, Vương Tuấn Phong, Lê Thị Lan Anh, Võ Văn Hải Sử Thanh Long “Một số đặc điểm hình thái học phân biệt lồi giun móc Ancyclostoma ceylanicum lưu hành chó Hà Nội quan sát kính hiển vi điện tử quét” Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y XXIII (8) 26 Võ Thị Hải Lê (2009) “Tình hình nhiễm giun trịn đường tiêu hố chó số địa điểm thuộc tỉnh Nghệ An” Tạp chí Khoa học Phát triển (5) 27 http://case.vn/vi-VN/34/96/114/details.case II Tài liệu tiếng Anh: Arundel H.J (2000) “Veterinary anthelmintic” Pubished by the University of Sydney Bethony J, Brooker S, Albonico M, Geiger SM, Loukas A, Diemert D., (2006) “Soil-transmitted helminth infections: ascariasis, trichuriasis, and hookworm” Bruni A and Passalacqua A., (1954) “Presence of mesomucinase (hyaluronidase) in Ancylostoma duodenale” Boll Soc Ital Biol Sper Dagmawi Paulos, Mekonnen Addis, Abebe Fromsa and Berhanu Mekibib (2012) “Prevalence of gastrointestinal helminthes among dogs and owners perception about zoonotic dog parasites in Hawassa Town, Ethiopia” Journal of Public Health and Epidemiology Dinh Ng-Nguyen, Sze Fui Hii, Van-Anh T Nguyen, Trong Van Nguyen, Dien Van Nguyen and Rebecca J Traub (2015) “Re-evaluation of the species of hookworms infecting dogs in Central Vietnam” Parasite and Vectors Elliott, D E., Summers, R W., and Weinstock, J V (2007) “Helminths as governors of immune-mediated inflammation” Int J Parasitol Haffner, A., Guilavogui, A Z., Tischendorf, F W., and Brattig, N W (1998) “Onchocerca volvulus: microfilariae secrete elastinolytic and males nonelastinolytic matrix-degrading serine and metalloproteases” M.A Taylor, R.L Coop and R.L Wall (2016), Veterinary parasitology, Aptara Inc., New Delhi, India Mohammed AK Mahdy (2012) “Prevalence and zoonotic potential of canine hookworms in Malaysia” 10 Ngui R, Lim YA, Traub R, Mahmud R, Mistam MS (2012) “Epidemiological and Genetic Data Supporting the Transmission of Ancylostoma ceylanicum among Human and Domestic Animals” 49 11 P J Hotez, S Narasimhan, J Haggerty, L Milstone, V Bhopale, G A Schad and F F Richards., (1992) “Hyaluronidase from infective Ancylostoma hookworm larvae and its possible function as a virulence factor in tissue invasion and in cutaneous larva migrans” 12 Tawin Inpankaew, Fabian Schär, Anders Dalsgaard, Virak Khieu, Wissanuwat Chimnoi, Chamnan Chhoun, Daream Sok, Hanspeter Marti, Sinuon Muth, Peter Odermatt, and Rebecca J Traub (2014) “High Prevalence of Ancylostoma ceylanicum Hookworm Infections in Humans, Cambodia, 2012” 13 O R McCOY (1931) “The egg production of two physiological strains of the dog hookworm, Ancylostoma caninum” 14 Loukas A, Hotez PJ, Diemert D, Yazdanbakhsh M, McCarthy JS, Correa-Oliveira R, Croese J, Bethony JM., (2016) “Hookworm infection” 15 John Croese, Stephen Fairley, Alex Loukas, John Hack, Pam Stronach., (1996) “A distinctive aphthous ileitis linked to Ancylostoma caninum” 16 David A Elsemore,1 Jinming Geng, Jennifer Cote, Rita Hanna, Araceli LucioForster, Dwight D Bowman., (2017) “Enzyme-linked immunosorbent assays for coproantigen detection of Ancylostoma caninum and Toxocara canis in dogs and Toxocara cati in cats” 17 Alex Loukas, John Croese, Joan Opdebeeck and Paul Prociv., (1992) “Detection of antibodies to secretions of Ancylostoma caninum in human eosinophilic enteritis” 18 John Croese, Alex Loukas, Joan Opdebeeck and Paul Prociv., (1994) “Occult Enteric Infection by Ancylostoma caninum: A previously unrecognized zoonosis” 19 Richard D Bungiro Jr and Michael Cappello., (2005) “Detection of excretory/ secretory coproantigens in experimental hookworm infection” 20 Kun-Yan Wei, Qiong Yan, Bo Tang, Shi-Ming Yang, Peng-Bing Zhang, MingMing Deng and Mu-Han Lü., (2017) “Hookworm Infection: A Neglected Cause of Overt Obscure Gastrointestinal Bleeding 21 Rebecca J Traub, Ian D Robertson, Peter Irwin, Norbert Mencke and R.C Andrew Thompson., (2004) “Application of a species-specific PCR-RFLP to identify Ancylostoma eggs directly from canine faeces” 22 In-Ho Kwon, Hyung-Su Kim, Jong-Hee Lee, Min-Ho Choi, Jong-Yil Chai, Fukumi Nakamura-Uchiyama, Yukifumi Nawa, and Kwang-Hyun Cho., (2003) “A serologically diagnosed human case of cutaneous larva migrans caused by Ancylostoma caninum” 50 23 Celia Maxwell, Rabia Hussain, T B Nutman, R W Poindexter, M D Little, G A Schad, E A Ottesen (1 Jul 1987) “The Clinical and Immunologic Responses of Normal Human Volunteers to Low Dose Hookworm (Necator americanus) Infection” The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 37 (1) 24 Jelinek T, Maiwald H, Nothdurft HD, Löscher T “Cutaneous larva migrans in travelers: synopsis of histories, symptoms, and treatment of 98 patients” The Infectious Diseases of America 1994 December 25 Van Riet E, Hartgers FC and Yazdanbakhsh M “Chronic helminth infections induce immunomodulation: consequences and mechanisms.” 2007 26 © 2007 IDEXX Laboratories, Inc “ELISA Technical Guide” 51 PHỤ LỤC Hình 5.1 Dụng cụ thực phương pháp phù Hình 5.2 Máy đọc kết ELISA 52 ... ELISA phát kháng chẩn đoán sớm bệnh giun móc chó? ?? 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CÚU Nghiên cứu thực trạng nhiễm bệnh giun móc, thiết lập phản ứng ELISA ứng dụng chẩn đoán sớm bệnh giun móc chó Qua đề biện... nhiễm bệnh giun móc, thiết lập phản ứng ELISA ứng dụng chẩn đoán sớm bệnh giun móc chó Qua đề biện pháp phịng tránh bệnh giun móc chó người Nội dung, phương pháp nghiên cứu Điều chế hai loại kháng. .. văn: Nghiên cứu thiết lập phản ứng Elisa phát kháng thể chẩn đốn sớm bệnh giun móc chó Ngành: Thú y Mã số: 8640101 Tên sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu