Phân lập và thiết kế vector ức chế biểu hiện gen mã hóa enzyme invertase nhằm tăn trữ lượng sucrose ở cây mía

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM - LƢU THỊ CƢ PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME INVERTASE (-FRUCTOFURANOSIDASE) NHẰM TĂNG TRỮ LƢỢNG SUCROSE Ở CÂY MÍA LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Thái Nguyên – 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM - LƢU THỊ CƢ PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME INVERTASE (-FRUCTOFURANOSIDASE) NHẰM TĂNG TRỮ LƢỢNG SUCROSE Ở CÂY MÍA LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ QUỲNH LIÊN Thái Nguyên – 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chƣa có cơng bố cơng trình khác Tác giả Lưu Thị Cư Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Lời tơi xin đƣợc bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Quỳnh Liên, Phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, ngƣời thầy tận tình hƣớng dẫn, bảo, dìu dắt giúp đỡ suốt thời gian thực hồn thành luận văn Tơi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Lê Trần Bình, TS Chu Hồng Hà, KS Đỗ Tiến Phát Phịng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, ngƣời tận tình bảo, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu giúp đỡ suốt thời gian thực tập hoàn thành luận văn Trong thời gian thực tập nghiên cứu nhận đƣợc hỗ trợ nhiệt tình ý kiến đóng góp bổ ích chú, anh chị, bạn Phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô giáo khoa SinhKTNN khoa Sau đại học, trƣờng Đại học Sƣ phạm Thái Nguyên hƣớng dẫn, truyền đạt kiến thức cho suốt trình học tập nghiên cứu Tơi vơ cảm ơn tình cảm tốt đẹp ngƣời thân gia đình, đồng nghiệp bạn bè dành cho tôi, động viên tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian học tập, nghiên cứu Thái Nguyên, ngày 25 tháng 09 năm 2009 Học viên Lưu Thị Cư Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 VAI TRÒ VÀ TẦM QUAN TRỌNG CỦA CÂY MÍA 1.1.1 Sơ lƣợc mía 1.1.2 Tình hình sản xuất mía Việt Nam 1.2 SINH TỔNG HỢP SUCROSE 1.3 VẬN CHUYỂN SUCROSE TRONG TẾ BÀO 1.5 ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN BẰNG PHƢƠNG PHÁP RNAi (RNA INTERFERENCE) 10 1.5.1 Nguồn gốc RNAi 10 1.5.2 Cơ chế gây bất hoạt gen 10 1.6 KỸ THUẬT GATEWAY ® 12 1.7 NGHIÊN CỨU VỀ TÁI SINH VÀ CHUYỂN GEN Ở CÂY MÍA 14 Chƣơng NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 NGUYÊN LIỆU 16 2.1.1 Nguyên liệu thực vật 16 2.1.2 Các chủng plasmid enzyme 16 2.1.3 Hóa chất khác 16 2.1.3 Các thiết bị máy móc 17 2.2 PHƢƠNG PHÁP 17 2.2.1 Thiết kế mồi 17 2.2.2 Tách RNA tổng số 18 2.2.3 RT-PCR 18 2.2.4 Tách dịng xác định trình tự gen 19 2.2.5 Thiết kế vector tái tổ hợp INV-RNAi 20 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 2.2.6 Tái sinh mía thông qua mô sẹo 21 2.2.7 Thử nghiệm chuyển gen gus-intron vào mía 22 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 THIẾT KẾ MỒI 24 3.2 TÁCH RNA TỔNG SỐ 25 3.3 NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN MÃ HĨA ENZYME INVERTASE 27 3.4 TÁCH DỊNG GEN VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN 28 3.4.1 Tạo plasmid tái tổ hợp INV-pENTR 28 3.4.2 Biến nạp plasmid tái tổ hợp INV_pENTR vào tế bào khả biến E.coli TOP 10 28 3.4.3 Chọn lọc plasmide tái tổ hợp INV_pENTR PCR 29 3.4.4 Kết xác định trình tự nucleotit 31 3.5 THIẾT KẾ VECTOR TÁI TỔ HỢP INV-RNAi 31 3.5.1 Tạo vector tái tổ hợp INV_RNAi kỹ thuật Gateway 31 3.5.2 Biến nạp vector INV_RNAi vào tế bào khả biến E.coli 32 3.6 BIẾN NẠP VECTOR CHUYỂN GEN INV_RNAi VÀO CHỦNG VI KHUẨN A.TUMEFACIENS CV58C1 34 3.7 TÁI SINH VÀ BƢỚC ĐẦU BIỂU HIỆN GEN GUS Ở MÍA 35 3.7.1 Quy trình tái sinh mía thơng qua mơ sẹo 35 3.7.3 Chọn lọc mô sẹo tái sinh chuyển gen 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT AS Acetosyringone A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6-Benzyl Amino Purine (Benzyladeninpurin) bp Cặp base cDNA Complementary DNA = DNA bổ sung đƣợc tổng hợp khuôn mRNA cs Cộng DEPC Diethyl pyrocarbonat DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP deoxynucleosit triphotphat (deoxynucleoside triphosphate) EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid EtBr đEtBrEthiium bromide E.coli Escherichia coli gus β-glucuronidase IBA Indole-3-Butyric Acid kb kilo base LB Luria and Bertani MS Môi trƣờng nuôi cấy theo Murashige Skoog NAA Naphthalene Acetic Acid OD Giá trị mật độ quang (optical density) PCR Polymerase Chaine Reaction = Phản ứng chuỗi Polymerase RNA Ribonucleic Acid RNase Ribonuclease RT-PCR Reverse Transcriptase-PCR SDS Sodium dodecylsulfat TAE Tris-acetate-EDTA Taq Thermus aquaticus DNA (polymerase) 2,4D 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 2.1 Các plasmid sử dụng thí nghiệm 16 Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR bƣớc 18 Bảng 2.3 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 19 Bảng 2.4 Các mơi trƣờng tái sinh mía 21 Bảng 3.1 Trình tự thơng số cần thiết cặp mồi 3’INV 5’INV 25 Bảng 3.2 Mã số trình tự đoạn gen Invertase mía ngân hàng gen NCBI 25 Bảng 3.3 Khả tạo mô sẹo tái sinh giống mía ROC10 in vitro mơi trƣờng thử nghiệm M1 - M4 36 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Tên hình Hình 1.1: Chu trình sinh tổng hợp sucrose với tham gia enzyme Hình 1.2 Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi 11 Hình 1.3 Sơ đồ mô tả kỹ thuật Gateway 13 Hình 3.1 Kết điện di RNA tổng số tách từ bẹ thân non giống mía ROC1 ROC10 gel agarose 1% 26 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm RT-PCR gel agarose 0,8% 27 Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm PCR plasmid với cặp mồi M13 (For/Rev) nhằm kiểm tra có mặt đoạn Invertase vector pENTR/D 30 Hình 3.4 Kết so sánh trình tự đoạn gen Invertase phân lập đƣợc với trình tự Invertase ngân hàng gen có mã số AY302083 31 Hình 3.5 Mơ hình cấu trúc chuyển gen INV_RNAi 32 Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm cắt plasmid INV_RNAi tổ hợp với HindIII XbaI 34 Hình 3.7 Điện di sản phẩm PCR plasmid INV-RNAi A.tumefaciens với cặp mồi đặc hiệu 5’INV 3’INV 35 Hình 3.8 Quy trình tái sinh mía ROC10 in vitro từ mơ sẹo 37 Hình 3.9 Biến nạp gen gus-intron vào mía ROC10 in vitro thông qua trung gian A.tumefaciens 39 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Đƣờng nhu cầu cần thiết đời sống ngƣời Theo thống kê, nhu cầu tiêu thụ đƣờng giới trung bình tính theo đầu ngƣời 35 kg/1 ngƣời/1 năm Tại Việt Nam, năm 1994 kg/1 ngƣời/1 năm, 15 kg/1 ngƣời/1 năm dự kiến nhu cầu đƣờng tiếp tục tăng Tại nƣớc nhiệt đới cận nhiệt đới nhƣ Việt Nam, 75% sản lƣợng đƣờng đƣợc sản xuất từ mía Mía số lồi thực vật tích trữ chủ yếu đƣờng sucrose (α-D-glucopyranosyl-1, 2-D-fructofuranose), nguồn nguyên liệu ban đầu để sản xuất đƣờng Do đó, Việt Nam mía trở thành công nghiệp trọng yếu xóa đói giảm nghèo phủ Tuy nhiên, giống mía Việt Nam có suất đƣờng đạt mức trung bình giới Việc nhập giống mía cao sản giới kết hợp với phƣơng pháp lai tạo truyền thống chƣa thực có hiệu việc tạo giống mía có hàm lƣợng đƣờng cao lại phù hợp với điều kiện thổ nhƣỡng khí hậu nƣớc ta Chọn tạo giống mía có hàm lƣợng đƣờng cao cơng nghệ sinh học có tiềm giảm giá thành đƣờng mà không cần tăng diện tích trồng mía thúc đẩy phát triển cơng nghiệp mía đƣờng Việt Nam Sinh tổng hợp sucrose q trình phức hợp, enzyme Invertase đƣợc xem nhƣ chìa khóa điều chỉnh tích lũy lƣợng sucrose mía Nó có vai trị phân hủy sucrose tế bào Vì vậy, muốn tăng trữ lƣợng sucrose mía phải ức chế đƣợc biểu gen mã hóa Invertase Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi (RNA-interference) trở thành biện pháp công nghệ hữu hiệu ức chế hồn tồn biểu gen động vật, thực vật vi sinh vật [31] Ở thực vật, Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 32 nghiệm thực phản ứng LR với thành phần trình bày mục 2.2.2.1 để gắn vector INV_pENTR với vector pK7GWIWG2(II) nhằm thu đƣợc vector chuyển gen INV_RNAi gen mã hóa Invertase Phản ứng đƣợc tiến hành với xúc tác enzyme LR-clonase Proteinase K nhiệt độ phòng pK7GWIWG2(II) vector chuyển gen đƣợc cấu trúc hai vùng gắn đặc biệt là: attR1-ccdB-attR2 có chiều ngƣợc đƣợc nối với nhờ đoạn intron Do đó, thực phản ứng lai LR tạo sản phẩm plasmid INV_RNAi có hai vị trí gắn mang đoạn gen Invertase có chiều ngƣợc nhau: sense-intron-antisense (Invertase-intron-antiInvertase) Đoạn intron vector pK7 có vai trò quan trọng việc tạo đoạn thắt nút (vịng) để RNA sợi đơi dễ đƣợc hình thành (Invertase-intronantiInvertase) hoạt động cách ổn định genome vật chủ đƣợc chuyển vào Đây cấu trúc RNAi cần thiết kế để chuyển gen vào mía nhằm tăng trữ lƣợng đƣờng mía cao cách ổn định Hình 3.5 Mơ hình cấu trúc chuyển gen INV_RNAi 3.5.2 Biến nạp vector INV_RNAi vào tế bào khả biến E.coli Vector tái tổ hợp INV_RNAi đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli TOP 10 phƣơng pháp sốc nhiệt 42 oC với khoảng thời gian phút 30 giây Sau đó, khuẩn đƣợc nuôi phục hồi với 250 μl LB lỏng 37oC tủ lắc khoảng 60 phút Tiếp theo khuẩn đƣợc nuôi cấy môi trƣờng chọn lọc Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 33 có kháng sinh 100 mg/l spectinomycin, 40 mg/l streptomycin 50 mg/l chloramphenicol Kết thu đƣợc lƣợng lớn khuẩn lạc màu trắng mọc môi trƣờng chọn lọc Vector pK7GWIWG2(II) vector có cấu trúc mang gen kháng kháng sinh spectinomycin, streptomycin, chloramphenicol gen ccdB mã hóa cho plasmid F gây ức chế sinh trƣởng tế bào E.coli, vector INV_RNAi khơng có gen ccdB gen Invertase chèn vào thay Vì vậy, khuẩn lạc mọc đĩa mơi trƣờng chọn lọc khuẩn lạc có mang plasmid pK7GWIWG2(II) nhƣng vị trí chứa đoạn gen ccdB bị đột biến khuẩn lạc có mang plasmid INV_RNAi Chọn ngẫu nhiên khuẩn lạc đƣợc đánh số từ đến nuôi mơi trƣờng lỏng có kháng sinh chọn lọc tƣơng tự tiến hành tách plasmid từ dòng khuẩn Để kiểm tra plasmid thu đƣợc có xác INV_RNAi pK7GWIWG2(II) nhƣng vị trí chứa đoạn gen ccdB bị đột biến Chúng thực phản ứng cắt enzyme giới hạn đặc hiệu XbaI HindIII plasmid từ khuẩn lạc số 1, Theo tính tốn lý thuyết sản phẩm phản ứng cắt enzyme cho đoạn có kích thƣớc là: Đoạn dài 978 bp mang đoạn Invertase chiều xuôi, đoạn dài 2825 bp mang đoạn Invertase chiều ngƣợc cuối phần lại vector nhận pK7GWIWG(II) dài 8114 bp Hình 3.6 cho thấy sản phẩm phản ứng cắt enzyme thu đƣợc phân đoạn có kích thƣớc tƣơng ứng với dự tính plasmid 1, và có khác biệt rõ rệt so với đối chứng vector không biến nạp pK7GWIWG(II), chứng tỏ cấu trúc INV_RNAi đƣợc thiết kế Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 34 Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm cắt plasmid INV_RNAi tổ hợp với HindIII XbaI (M): Marker 1kb; (1), (2), (3): dòng plasmid tái tổ hợp; (-): đối chứng vector pK7GWIWG(II) 3.6 BIẾN NẠP VECTOR CHUYỂN GEN INV_RNAi VÀO CHỦNG VI KHUẨN A.TUMEFACIENS CV58C1 Để kiểm tra hoạt động cấu trúc INV_RNAi vector tái tổ hợp trồng nhƣ tạo nguyên liệu cho trình chuyển gen ức chế biểu gen mã hóa Invertase mía, cấu trúc INV_RNAi phải đƣợc biến nạp vào vi khuẩn A.tumefaciens CV58C1 phƣơng pháp xung điện Đây phƣơng pháp biến nạp có hiệu cao thời gian ngắn Plasmid tái tổ hợp INV_RNAi số đƣợc biến nạp vào A.tumefaciens xung điện với thành phần bƣớc tiến hành biến nạp đƣợc trình bày mục 2.2.2.3 Kết cho thấy đĩa môi trƣờng có bổ sung kháng sinh chọn lọc 100 mg/l streptomycin, 100 mg/l spectinomycin 50 mg/l rifamycin thu đƣợc khuẩn lạc màu trắng Sau chọn ngẫu nhiên dịng khuẩn lạc nhân ni mơi trƣờng lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc 100 mg/l streptomycin, 100 mg/l spectinomycin 50 mg/l rifamycin để tách plasmid Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 35 Hình 3.7 Điện di sản phẩm PCR plasmid INV-RNAi A.tumefaciens với cặp mồi đặc hiệu 5’INV 3’INV (M): Marker 1kb; (1), (2): dòng plasmid tái tổ hợp; (-): đối chứng âm Tách plasmid theo Sambroock kiểm tra có mặt INV_RNAi A.tumefaciens CV58C1 phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu 5’INV 3’INV Kết kiểm tra hình 3.7 cho thấy dòng khuẩn lạc cho kết dƣơng tính kích thƣớc khoảng 450 bp mong muốn Nhƣ vậy, chứng tỏ tạo đƣợc vector chuyển gen INV_RNAi chủng vi khuẩn A.tumefaciens CV58C1 Đây nguồn nguyên liệu phục vụ cho thí nghiệm chuyển gen nhằm tạo dịng mía bất hoạt gen mã hố Invertase, tăng lƣợng sucrose tích trữ 3.7 TÁI SINH VÀ BƢỚC ĐẦU BIỂU HIỆN GEN GUS Ở MÍA 3.7.1 Quy trình tái sinh mía thơng qua mơ sẹo Từ nghiên cứu tái sinh chuyển gen thành cơng mía cho thấy tỉ lệ tái sinh thu đƣợc cao hiệu thông qua nguyên liệu ban đầu mơ sẹo Trong thí nghiệm này, tiến hành thử nghiệm tạo mô sẹo với giống mía ROC10 in vitro mơi trƣờng MS đối chứng khơng có 2,4D mơi trƣờng cảm ứng tạo mô sẹo M1-M4 (Bảng 2.4) Kết thu đƣợc cho thấy mơi trƣờng đối chứng MS (khơng có 2,4D) hồn tồn khơng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 36 tạo đƣợc mơ sẹo Cịn mẫu mơi trƣờng cảm ứng có bổ sung hàm lƣợng chất kích thích sinh trƣởng 2,4D tạo đƣợc mô sẹo cho hiệu tái sinh mía đƣợc thể thơng qua bảng sau: Bảng 3.3 Khả tạo mô sẹo tái sinh giống mía ROC10 in vitro mơi trƣờng thử nghiệm M1 - M4 Môi 2,4-D Tổng mẫu trƣờng (mg/l) cấy Tỉ lệ tạo mô sẹo (%) Tỉ lệ mẫu tạo Số chồi / chồi khối mô sẹo (%) M1 3x130 83,07 ± 0,44 67,95 ± 1,36 42,66 ± 1,45 M2 3x130 86,15 ± 3,11 46,41 ± 3,33 20,66 ± 2,96 M3 3x130 71,79 ± 0,68 63,08 ± 1,33 32,33 ± 1,45 M4 3x130 83,33 ± 2,89 37,95 ± 1,12 17,66 ± 4,33 Bảng 3.3 cho thấy, mẫu mơi trƣờng M1 có bổ sung mg/l 2,4D cho tỉ lệ tạo mô sẹo hiệu suất tái sinh cao hẳn so với mơi trƣờng M2 - M4 có bổ sung 4, 5, mg/l 2,4D; tỉ lệ tạo chồi đạt 67,95% số chồi khối mô sẹo đạt khoảng 42,66 Nhƣ vậy, mơi trƣờng M1 có bổ sung mg/l 2,4D cho kết tạo mô sẹo tái sinh mía ROC10 in vitro tốt thí nghiệm Do đó, chúng tơi chọn mơi trƣờng M1 có bổ sung mg/l 2,4D làm môi trƣờng cảm ứng tạo mô sẹo cho việc tái sinh chuyển gen mía thí nghiệm Q trình tái sinh từ mơ sẹo đến hồn chỉnh đƣợc minh họa hình 3.8 Mặt khác, tiếp tục nhân nuôi mô sẹo mơi trƣờng lỏng lắc M1 có bổ sung mg/l 2,4D vòng tuần, 27oC, lắc 90 vòng/phút, điều kiện tối để phục vụ cho việc biến nạp thử nghiệm gen gus-intron Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 37 Cây mía ROC10 in vitro Đoạn thân sát gốc dài 0,5 cm môi trƣờng cảm ứng tạo mô sẹo Mơ sẹo Tạo hồn chỉnh Mơ sẹo lên mầm xanh Mơ sẹo nhú mầm Hình 3.8 Quy trình tái sinh mía ROC10 in vitro từ mơ sẹo 3.7.3 Chọn lọc mô sẹo tái sinh chuyển gen Quy trình chuyển gen có hiệu yếu tố quan trọng việc chuyển gen vào thực vật Sau thử nghiệm đƣợc môi trƣờng tái sinh mía thơng qua mơ sẹo, chúng tơi tiến hành thử nghiệm việc chuyển gen vào mía thơng qua việc sử dụng gen thị gus-intron Trong nghiên cứu này, thử nghiệm hai chủng vi khuẩn A.tumefaciens khác EHA1300 CV58C1 mang vector chuyển gen pPTN289, ngƣỡng thời gian nhiễm khuẩn 10 30 phút Chúng thử nghiệm lây nhiễm khuẩn với mô sẹo theo phƣơng pháp thổi khô sau nhân nuôi môi trƣờng lỏng lắc M1 Song không thu đƣợc kết chuyển gen mong muốn kiểm tra biểu gen thị gus-intron với dung dịch X-gluc Do đó, chúng tơi tiến hành hƣớng nghiên cứu thứ hai chuyển mô sẹo sau nhân nuôi sang môi trƣờng cảm ứng tạo chồi Mc sau tiến hành lây nhiễm khuẩn Ở thời gian biến nạp 10 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 38 phút mô sẹo hai chủng vi khuẩn không thu đƣợc mẫu có biểu gen gus Trong thời gian nhiễm khuẩn 30 phút, mẫu có biểu gen gus xuất hai công thức với hai chủng khuẩn nghiên cứu Tỉ lệ biểu gen gus mô sẹo đạt 31,67% với chủng CV58C1 11,67% sử dụng chủng EHA1300 Khi sử dụng hai chủng vi khuẩn với ngƣỡng thời gian nhiễm khuẩn 30 phút, thu đƣợc chồi mía sống sót mơi trƣờng chọn lọc (với CV58C1 18,57% EHA1300 7,14%) Bảng 3.4 Kết biến nạp gen gus-intron vào mía Thời gian Tỉ lệ biểu Chủng vi khuẩn biến nạp gen gus A.tumefaciens (phút) (%) Tỉ lệ mẫu tái sinh (%) Tỉ lệ mẫu sống sót mơi trƣờng có bổ sung mg/l ppt (%) CV58C1 30 31,67 ± 0,65 81,43 ± 1,56 18,57 ± 1,28 EHA1300 30 11,67 ± 0,89 92,85 ± 0,31 7,14 ± 0,69 Nhƣ vậy, bƣớc đầu thu đƣợc kết tiến hành chuyển gen gus vào mía thơng qua mơ sẹo theo phƣơng pháp cảm ứng tạo chồi Tuy nhiên thời gian có hạn, yếu tố ảnh hƣởng đến kết chuyển gen chƣa hoàn toàn đƣợc tối ƣu Mặc dù vậy, việc thu đƣợc mô sẹo tái sinh có biểu gen thị gus cho thấy việc sử dụng công nghệ RNAi để tạo mía chuyển gen làm tăng khả tích trữ đƣờng mía hƣớng triển vọng tƣơng lai Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 39 Mô sẹo biến nạp môi trƣờng đồng nuôi cấy Mc Chồi mơi trƣờng chọn lọc Mr có bổ sung 500 mg/l cefotaxime mg/l ppt Mô sẹo biểu gus nhuộm với dung dịch X-gluc Mô sẹo tạo chồi Mc có bổ sung 500 mg/l cefotaxime Hình 3.9 Biến nạp gen gus-intron vào mía ROC10 in vitro thơng qua trung gian A.tumefaciens Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 40 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN: Phân lập đƣợc đoạn gen mã hố Invertase có kích thƣớc khoảng 435 bp từ giống mía ROC1 in vitro xúc tác trình phân huỷ sucrose Thiết kế đƣợc vector chuyển gen INV-RNAi ức chế biểu Invertase biến nạp thành công chủng vi khuẩn A.tumefaciens CV58C1 Chọn lọc số mơi trƣờng thích hợp tái sinh mía thơng qua mơ sẹo (mơi trƣờng tạo mô sẹo M1, môi trƣờng tạo chồi Mc, môi trƣờng tạo rễ Mr) bƣớc đầu chuyển gen thị gus-intron vào mía ĐỀ NGHỊ: Tiến hành chuyển vector ức chế biểu mã hóa Invertase (INVRNAi) mía nhằm tăng trữ lƣợng đƣờng giống mía Việt Nam Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn BÀI BÁO CỦA TÁC GIẢ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN ĐÃ ĐƢỢC CÔNG BỐ Lƣu Thị Cƣ, Đỗ Tiến Phát, Chu Hồng Hà, Lê Trần Bình, Lê Quỳnh Liên (2009) Phân lập thiết kế vector ức chế biểu gen mã hố Invertase (-fructofuranosidase) mía Hội nghị Cơng nghệ Sinh học toàn quốc_Thái Nguyên, tháng 11 năm 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Quyết định số 26/2007/QĐ-TTg, việc phê duyệt “Quy hoạch phát triển mía đường đến năm 2010 định hướng đến năm 2020” Hoàng Thị Sản (2003) Phân loại học thực vật Nxb Giáo dục Trần Văn Sỏi (2003) Cây mía Nhà xuất Nghệ An Đỗ Năng Vịnh (2007) Công nghệ can thiệp RNA (RNAi) gây bất hoạt gen tiềm ứng dụng to lớn Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 5(3): 265-275 Vũ Văn Vụ (1999) Sinh lí thực vật ứng dụng Nxb Giáo dục TÀI LIỆU TIẾNG ANH Avigad G and Dey PM (1997) Carbohydrate metabolism: storage carbohydrates Plant biochemistry Acedemic Press Ltd, pp: 143-204 Balibrea ME, Rus-Alvarez AM, Bolarin MC, Perez-Alfocea F (1997) Fast changes in soluble carbohydrates and proline content in tomato seedlings in response to ionic and nonionic iso-osmostic stress, J Plant physiol (151): 222-226 Baulcomble D (2004) RNA silencing in plants Nature 431 (7006): 356-63 Chen S, Hajirezaei M, Bornke F (2008) Differential expression of sucrose phosphate synthase isoenzymes in tobaco reflects their functional specialization during dark governed starch mobilization in source leaves Plant Cell Environ 31(1): 165-76 elegans Nature 391: 806-811 10 Geigenberger P, Reimholz R, Deiting U, Sonnewald U and Stitt M (1999) Decreased expression of sucrose phosphate Synthase Strongly inhibits the water stress-induced synthesis of sucrose in growing potato tubers The plant Journal 19: 119-129 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 11 Groenewald J, Botha FC (2007) Down-regulation of pyrophosphate: fructose 6-phosphate 1-phosphotransferase (PFP) activity in Sugarcane enhances sucrose accumulation in immature internoods Transgenic Res 12 Guy CL (1990) Cold acclimation and freezing stress tolerance: role of protein metabolism Annu Rev Plant physiol Plant Mol Biol 41: 187223 13 Haigler CH, Singh B, Zhang D, Hwang S, Wu C, Cai WX, Hozain M, Kang W, Kiedaisch B, Strauss RE, Hequet EF, Wyatt BG, Jwiden GM, Holaday AS (2007) Transgenic cotton over-producing spinach sucrose phosphate synthase showed enhanced leaf sucrose synthesis and improved fiber quality under controlled environmental conditions Plant Mol Biol 63 (6): 815-32 14 Hesse H, Sonnewald U, Willmitzer L (1995) Cloning and expression analysis of sucrose phosphate synthase from sugar beet (Beta vulgaris L.) Mol Gen Genet 247 (4): 515-20 15 Huber SC and Huber JL (1992) Role of sucrose-phosphate Synthase in Sucrose Metabolism in leaves Plant physiol 99: 1275-1278 16 Huber SC, and Huber JL(1996) Role and regulation of Sucrose phosphate synthase in higher plants Annu Rew Plant physiol Plant Mol.Biol 47: 431-444 17 Ingram J, Chadler JW, Gallagher L, Salamini F, Bartels D (1997) Analysis of cDNA clones encoding sucrose-phosphate synthase in relation to sugar interconversions associated with dehydration in the resurrection plant, Craterostigma plantagineum Hochst Plant Physiol 115:113-121 18 Klann EM, Hall B, Bennett AB (1996) Antisense acid invertase (TIV1) gene alters soluble sugar composition and size in transgenic tomato fruit Plant Physiol 112 (3): 1321-30 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 19 Le QL, Mahler V, Lorenz Y, Scheurer S, Biemelt S, Vieths S, Sonnewald U (2006b) Reduced allergenicity of tomato fruits harvested from Lyc e silenced transgenic tomato plants J Aller Clin Immunol 118(5):1176-83 20 Liu Q, Singh SP, Green AG (2002) High-stearic and High-oleic cottonseed oils produced by hairpin RNA-mediated post-transcriptional gene silencing Plant Physiol 129(4): 1732-43 21 Lunn JE, Gillespie VJ, Furbank RT (2003) Expression of a cyanobacterial sucrose-phosphate synthase from Synechocystis sp PCC 6803 in transgenic plants J Exp Bot 54 (381): 223-37 22 Manickavasagam M, Ganapathi A, Anbazhagan VR, Sudhakar B, Selvaraj N, Vasudevan A, Kasthurirengan S (2004) Agrobacterium-mediated genetic transformation and development of herbicide-resistant sugarcane (Saccharum species bybrids) using axillary buds Plant Cell Rep 23: 134-143 23 Morgan JM (1984) Osmoregulation and water stress in higher plant, Ann Rev Plant physiol 35: 299-319 24 Nguyen-Quoc B, Foyer CH (2001) A role for ‘futile cycles’ involving invertase and sucrose synthase in sucrose metabolism of tomato fruit J Exp Bot 52 (358): 881-9 25 Ogita S, Uefuji H, Yamaguchi Y, Koizumi N, Sano H (2003) Producing decaffeinated coffee plants Nature 423(6942): 823 26 Quick P, Siegl G, Neuhaus E, Feil R, Stitt M (1989) Sort term water stress leads to stimulation of sucrose synthesis by activating sucrose-phosphate synthase Planta 177: 535–546 27 Salerno GL, Pagnussat GC, Pontis HG (1998) Studies on sucrose phosphate synthase from rice leaves Cell Mol Biol 44(3): 407-16 28 Santosa DA, Hendroko R, Farouk A Greiner R (2004) A rapid and highly efficient method for transformation of sugarcane callus Molecular Biotechnology 28: 113-119 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 29 Snyman SJ, Meyer GM., Richards JM, Haricharan N, Ramgareeb S, Huckett BI (2006) Refining the application of direct embryogenesis in sugarcane: effect of the developmental phase of leaf disc explants and the timing of DNA transfer on transformation efficiency Plant Cell Rep 25: 1016–1023 30 Stitt M (1989) Product inhibition of potato tuber pyrophosphate, Fructose 6-phosphate phosphotransferase by phosphate and pyrophosphate Plant physiol 89: 628-633 31 Sugihartor B, Sakakibara H, Sumadi and Sugiyama T (1997) Differential Expression of Two Genes for Sucrose-phosphate-Synthase in Sugarcane: Molecular Cloning of the cDNAs and Comparative Analysis of Gene Expression Plant cell physiol 38: 961-965 32 Wesley SV, Helliwell CA, Smith NA, Wang MB, Rouse DT, Liu Q, Gooding PS, Singh SP, Abbott D, Stoutjesdijk PA, Robinson SP, Gleave AP, Green AG, Waterhouse PM (2001) Construct design for efficient, eddective and high-throughput gene silencing in plants Plant J 27(6): 581-90 33 Worrell AC, Bruneau JM, Summerfelt K, Boersig M, Voelker TA (1991) Expression of a maize sucrose phosphate synthase in tomato alters leaf carbohydrate partitioning Plant Cell 3(10): 1121-30 34 Zhangsun D, Luo S, Chen R, Tang K (2007) Improved Agrobacteriummediated genetic transformation of GNA transgenic sugarcane Section Cellular and Molecular Biology 62 (4): 386-393 35 Zhu YJ, Komor E, and Moore PH (1997) Sucrose Accumulation in the Sugarcane Stem 1s Regulated by the Difference between the Activities of Soluble Acid Invertase and Sucrose Phosphate Synthase Plant Physiol 115(2): 609-616 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn PHỤ LỤC Môi trƣờng MS bản: - MS I: KNO3:1900 mg/l; NH4NO3:1650 mg/l; MgSO4.7H2O:370 mg/l; KH2PO4:170 mg/l - MS II: CaCl2.2H2O mg/l - MS III: H3BO3:6,2 mg/l; MnSO4: 22,3 mg/l; ZnSO4: 8,6 mg/l; KI: 0,83 mg/l; Na2MoO4: 0,25 mg/l; CuSO4: 0,025 mg/l; CoCl2: 0,025 mg/l - MS IV:Na2EDTA: 37,3 mg/l; FeSO4.7H2O: 27,8 mg/l - MS V: Glycin: mg/l; Nicotinic: 0,5 mg/l; B1: 0,5 mg/l; B6: 0,5 mg/l Môi trƣờng LB: - LB lỏng: Môi trƣờng LB lỏng: 0,5% (5 g/l) dịch chiết nấm men (Yeast extract), 1% (10 g/l) bacto-Tryptone, 1% (10 g/l) NaCl Hoặc dùng 25g LB bột LB pha sẵn cho 1l LB lỏng - LB đặc: LB lỏng bổ sung 1,5% (15g/l) Bactor-aga Dung dịch đệm tách plasmid: - Sol I: 50 mM glucose, 25 mM Tris HCl pH 8, 10 mM ETDA pH8 - Sol II: 0.2 NaOH, SDS 1% - Sol III: 60 ml CH3COOK 5M; 11,5 ml CH3COOH; 28,5 ml H20 Các môi trƣờng đƣợc khử áp suất atmotphe 117oC 15 phút Đệm điện di gel agarose: - TAE 50 X (100 ml) : Tris -base 24.2 g, axit axetic 5.71g , EDTA 0.1M pH8 50ml thêm nƣớc đến 100 ml - Đệm tra mẫu (loading buffer): 0,1 ml bromophenol blue 10%; 0,3 ml glycerol 100%, thêm nƣớc cất cho đủ ml Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn ... CƢ PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME INVERTASE (-FRUCTOFURANOSIDASE) NHẰM TĂNG TRỮ LƢỢNG SUCROSE Ở CÂY MÍA LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Chuyên ngành: Di truyền học Mã. .. tăng trữ lượng sucrose mía? ?? MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU: Ức chế biểu Invertase dạng hịa tan nhằm tăng trữ lƣợng sucrose mía NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: Phân lập đoạn gen mã hóa cho enzyme Invertase mía in vitro... với gen đích Với mục tiêu nghiên cứu chọn tạo giống mía có hàm lƣợng đƣờng cao, chọn đề tài ? ?Phân lập thiết kế vector ức chế biểu gen mã hóa enzyme Invertase (β-fructofuranosidase) nhằm tăng trữ