Nghiên cứu ứng dụng kháng thể đơn chuỗi chế tạo kit phát hiện nhanh virus cúm a h5n1

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT  - LÊ HOÀNG ĐỨC NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KHÁNG THỂ ĐƠN CHUỖI CHẾ TẠO KIT PHÁT HIỆN NHANH VIRUS CÚM A/H5N1 CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM MÃ SỐ: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội, Tháng 11-2013 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT  LÊ HOÀNG ĐỨC NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KHÁNG THỂ ĐƠN CHUỖI CHẾ TẠO KIT PHÁT HIỆN NHANH VIRUS CÚM A/H5N1 CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM MÃ SỐ: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS CHU HỒNG HÀ Hà Nội, Tháng 11-2013 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Chu Hồng Hà – Trưởng phịng Cơng nghệ Tế bào thực vật, Phó viện trưởng Viện Cơng nghệ sinh học định hướng nghiên cứu, đồng thời tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Tôi xin cảm ơn TS Lê Văn Sơn, Phó trưởng phịng Cơng nghệ ADN ứng dụng TS Phạm Bích Ngọc, Phó trưởng phịng Cơng nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện cho tơi q trình thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới giúp đỡ ThS Hoàng Hà tập thể cán phịng Cơng nghệ Tế bào thực vật phịng Cơng nghệ ADN ứng dụng, Viện Cơng nghệ sinh học dành cho suốt trình làm luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Phòng Đào tạo, Ban lãnh đạo Viện Sinh thái & Tài nguyên sinh vật, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, thầy cô giáo công tác Viện Công nghệ sinh học Viện Sinh thái & Tài nguyên sinh vật tạo điều kiện tận tình giảng dạy cho tơi suốt khóa học Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc gửi lời cảm ơn chân thành tới người thân gia đình bạn bè – người động viên, giúp đỡ suốt trình học tập Hà Nội, ngày tháng năm 2013 Lê Hồng Đức Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả Lê Hồng Đức Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan virus cúm A 1.1.1 Giới thiệu bệnh cúm 1.1.2 Cấu trúc chung virus cúm A 1.1.3 Cấu trúc hệ gen virus cúm A 1.1.4 Lịch sử bệnh cúm A 1.1.5 Tình hình bệnh cúm A/H5N1 giới Việt Nam 1.1.6 Các phương pháp chẩn đoán virus cúm A/H5N1 10 1.2 Kháng thể đơn chuỗi kỹ thuật phage display 11 1.2.1 Kháng thể 11 1.2.2 Kháng thể đơn chuỗi 12 1.2.3 Một số nghiên cứu ứng dụng kháng thể đơn chuỗi 13 1.2.4 Kỹ thuật phage display 14 1.2.4.1 Giới thiệu chung kỹ thuật phage display 14 1.2.4.2 Filamentous phage M13 14 1.2.4.3 Tạo thư viện phage display 16 1.3 Kỹ thuật ngƣng kết ứng dụng chẩn đoán 18 1.3.1 Hạt latex 19 1.3.2 Một số nghiên cứu ứng dụng hạt latex chẩn đoán 20 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Vật liệu 21 2.2 Hóa chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu 23 2.2.1 Hóa chất 23 2.2.2 Thiết bị máy móc 27 2.2.3 Địa điểm nghiên cứu 27 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2.3.1 Phương pháp biến nạp vào vi khuẩn E coli chủng HB 2151 sốc nhiệt 27 2.3.2 Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony PCR) 28 2.3.5 Phương pháp tinh kháng thể đơn chuỗi sử dụng sắc ký lực 30 2.3.6 Phương pháp điện di gel polyacrylamide 31 2.3.5 Phương pháp lai Western blot 32 2.3.6 Phương pháp đo nồng độ protein máy đo quang phổ 33 2.3.7 Phương pháp chế tạo kit phát nhanh virus cúm A/H5N1 dựa tính ngưng kết hạt latex gắn protein lên bề mặt 34 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Biểu tinh kháng thể đơn chuỗi VH10 38 3.1.1 Tạo chủng E coli HB2151 biểu kháng thể VH10 tái tổ hợp 38 3.1.2 Tối ưu điều kiện biểu kháng thể đơn chuỗi VH10 43 3.1.3 Tinh kháng thể đơn chuỗi VH10 46 3.2 Thử nghiệm tạo kit phát nhanh cúm A/H5N1 theo nguyên lý ngƣng kết miễn dịch 47 3.2.1 Chuẩn hóa lượng kháng thể gắn lên bề mặt hạt latex 47 3.2.2 Xây dựng phương pháp chẩn đoán virus cúm A/H5N1 phán ứng ngưng kết hạt latex 49 3.3 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu thử nghiệm kit latex 52 3.3.1 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu kit latex 52 3.3.2 Đánh hoạt động kit latex với mẫu thực địa 55 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 KẾT LUẬN 57 KIẾN NGHỊ 58 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ bp DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT : base pair cDNA : Complementary DNA DNA : Deoxirybonucleotide acid E coli : Escherichia coli EDAC : 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) carbodiimide EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid IPTG : Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Kb : Kilo base kDa : Kilo Dalton LB : Luria-Bertani OD : Optical Density PBS : Phosphate buffered saline PCR : Polymerase Chain Reaction PVDF : Polyvinylidene difluoride RNA : Ribonucleotide acid scFv : Single-chain variable fragment SDS : Sodium Dodecyl Sulfate SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis TAE : Tris-acetate-EDTA TBS : Tris Buffered Saline TEMED : N,N,N´,N´-tetramethylethylenediamine WHO : World Health Organization Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 (A) Các dạng hình thái virus cúm A nhuộm âm tính kính hiển vi điện từ truyền qua (B) Cấu trúc vủa virus cúm A Hình 1.2 Các vật chủ tự nhiên khả lây nhiễm loài vật chủ virus cúm A Hình 1.3 Sơ đồ chuỗi kháng thể 11 Hình 1.4 Các protein cấu thành virion M13 15 Hình 1.5 Chu kỳ sống phage M13 E coli 15 Hình 2.1 Sơ đồ vector pTI2+/VH10 21 Hình 2.2 Quy trình gắn protein lên bề mặt hạt latex 33 Hình 3.1 Kết biến nạp vào tế bào E.coli HB 2151 38 Hình 3.2 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR dùng mồi đặc hiệu (pTI-NcoI-F pTI- NotI-R) từ dòng khuẩn lạc mọc môi trường chọn lọc 38 Hình 3.3 Hình ảnh điện di protein tổng số tế bào E coli HB2151 mang gen mã hóa cho cấu trúc kháng thể đơn chuỗi VH10 40 Hình 3.4 Kết lai Western blot kiểm tra protein tổng số tế bào E coli HB2151 mang vector pTI2+/VH10 với kháng thể anti polyhistidin 41 Hình 3.5 Hình ảnh điện di protein VH10 biểu nhiệt độ khác 42 Hình 3.6 Hình ảnh điện di protein VH10 cảm ứng biểu nồng độ IPTG khác 43 Hình 3.7 Hình ảnh điện di protein VH10 cảm ứng biểu thời gian khác 44 Hình 3.8 Hình ảnh điện di kiểm tra tính tan protein VH10 45 Hình 3.9 Hình ảnh điện di protein VH10 sau tinh cột sắc ký lực His-tag 45 Hình 3.10 Phản ứng ngưng kết kháng nguyên H5 với hạt latex gắn với 100, 200 400 g kháng thể đơn chuỗi VH10 46 Hình 3.11 Mơ hình kiểm tra tính ngưng kết hạt latex gắn protein lên bề mặt 48 Hình 3.12 Kết phản ứng ngưng kết soi kính hiển vi có độ phóng đại 10×10 49 Hình 3.13 Hình ảnh kit latex chẩn đốn virus cúm gia cầm H5N1 50 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thống kê số lượng người bị nhiễm chết cúm A/H5N1 từ năm 2003-2013 Bảng 2.1 Danh sách mẫu bệnh phẩm sử dụng nghiên cứu 22 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng colony PCR 23 Bảng 2.3 Công thức pha gel cô gel tách 25 Bảng 2.4 Công thức tính độ nhạy độ đặc hiệu 33 Bảng 3.1 Kết thử nghiệm kit latex với mẫu nước trứng 50 Bảng 3.2 Kết đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu kit latex 52 Bảng 3.3 Kết đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu phương pháp ngưng kết hồng cầu 52 Bảng 3.4 Kết kiểm tra tính đặc hiệu với kháng nguyên H5 kit latex 53 Bảng 3.5 Kết thử nghiệm kit latex phát virus cúm A/H5N1 với mẫu thực địa 54 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẶT VẤN ĐỀ Cúm gia cầm (Avian influenza) bệnh truyền nhiễm cấp tính lồi chim, kể gia cầm thủy cầm, phân type (subtype) nhóm virus cúm A (Influenza virus A) thuộc họ Orthomyxoviridae gây nên Virus cúm A chia thành phân nhóm dựa hai glycoprotein bề mặt hemagglutinin (HA) neuraminidase (NA) HA chia thành 16 phân nhóm (từ H1 đến H16) NA chia thành phân nhóm (từ N1 đến N9) Trong số 16 phân nhóm virus cúm A, chủng phân nhóm H5 H7 gây thể cúm gia cầm độc lực cao, có khả lây lan mạnh, tử vong nhanh lồi lơng vũ cảm nhiễm Hầu hết virus cúm gia cầm có ảnh hưởng đến người thường gây triệu chứng đường hô hấp nhẹ viêm kết mạc mắt, trừ ngoại lệ chủng H5N1 Virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao (HPAI, highly pathogenic avian influenza) gây bệnh nặng với tỷ lệ tử vong cao người vụ dịch diễn vào năm 1997 năm 2003 Theo số liệu Tổ chức y tế giới (WHO), từ năm 2003 đến tháng năm 2013 có 375 người tử vong cúm gia cầm số 630 ca nhiễm H5N1 15 nước Tại Việt Nam, dịch cúm gia cầm virus cúm A/H5N1 bắt đầu xuất từ tháng cuối năm 2003, có 62 ca tử vong số 125 người nhiễm cúm gia cầm Đồng thời, bệnh cúm gia cầm nguyên nhân làm hàng chục triệu gia cầm bị chết bị tiêu huỷ gây thiệt hại kinh tế nặng nề cho ngành chăn nuôi Hệ gen virus cúm A/H5N1 có cấu trúc đặc trưng hệ gen virus cúm A RNA sợi đơn âm (ss(-)RNA) có độ dài tổng số khoảng 13.500 ribonucleotide, bao gồm phân đoạn gen riêng biệt mã hóa cho 11 protein khác virus Trong đó, tên gọi virus H5N1 dựa protein định tính kháng nguyên hemagglutinin nhóm (H5) neuraminidase nhóm (N1) Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 18 GS4-10 Allantoic fluid - - 19 GS4-170 Allantoic fluid - - 20 GS4-346 Allantoic fluid - - Ghi chú: Các mẫu có số thứ tự từ 16 đến 20 mẫu nước trứng không lây nhiễm virus H5N1, mẫu từ đến 15 mẫu nước trứng lây nhiễm virus H5N1 lấy từ thực địa Ký hiệu (-) mẫu âm tính, (+) mẫu dương tính, (++) mức độ ngưng kết cao quan sát dễ dàng kính hiển vi có độ phóng đại 10×10, (+++) mức độ ngưng kết mạnh quan sát tủa dễ dàng mắt thường Kết thực phản ứng ngưng kết với 20 mẫu thử dạng nước trứng bảng 3.1 cho thấy, kit ngưng kết latex hoạt động ổn định với mẫu dương tính khơng có tương dương tính giả Các mẫu dương tính có số thứ tự từ đến 15 cho kết ngưng kết với mức độ khác Đáng ý mẫu có số thứ tự từ đến cho kết ngưng kết mạnh dễ dàng quan sát mắt thường tượng kết tủa sau phút ngưng kết Độ nhạy độ đặc hiệu kit latex thể bảng 3.2 Bảng 3.2 Kết đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu kit latex Sinh phẩm Kit latex Mẫu nước trứng Cộng Dương tính Âm tính Dương tính 15 15 Âm tính 5 15 20 Cộng Các kết bảng 3.2 cho thấy, kit latex có độ nhạy 15/15 (100%), độ đặc hiệu 5/5 (100%) Bảng 3.3 Kết đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu phương pháp ngưng kết hồng cầu Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Sinh phẩm Ngưng kết hồng cầu Mẫu nước trứng Cộng Dương tính Âm tính Dương tính 14 15 Âm tính 15 20 Cộng Trong 15 mẫu nước trứng có lây nhiễm virus H5N1, phương pháp ngưng kết hồng cầu khả phát 14/15 dương tính Do đó, độ nhạy phương pháp 14/15 (93,33%) độ đặc hiệu 4/5 (80%) Từ kết thấy, kit ngưng kết latex có độ nhạy độ đặc hiệu cao so với phương pháp ngưng kết hồng cầu Bộ kit latex chẩn đốn virus cúm A/H5N1 chúng tơi tạo có độ nhạy độ đặc hiệu cao so với kit latex chẩn đoán virus cúm A/H5N1 Xu cộng tạo năm 2005, với độ nhạy 88,8% độ đặc hiệu 97,6% [66] Độ nhạy độ đặc hiệu kit latex chẩn đoán virus cúm A/H5N1 Xu cộng đánh giá lượng mẫu thử lớn (830 mẫu) kết cho thấy phương pháp ngưng kết hạt latex có độ nhạy độ đặc hiệu cao so với phương pháp ngưng kết hồng cầu [66] Để đánh giá tính đặc hiệu với kháng nguyên H5 virus H5N1, kit latex kiểm tra với ba mẫu virus khác gồm: virus H9N2, virus Newcastle virus H5N1 Trong đó, virus Newcastle virus gây bệnh gây dịch tả gà nhóm Paramyxovirus gây nên, có triệu chứng biểu bệnh giống với cúm A/H5N1 Virus H9N2 thuộc nhóm Influenza A virus gây bệnh cúm chim Mẫu A1538 có chứa virus H5N1 dùng làm đối chứng Kết thu bảng 3.5 Bảng 3.4 Kết kiểm tra tính đặc hiệu với kháng nguyên H5 kit latex STT Ký hiệu Virus Kit latex 1301 H9N2 Âm tính Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1102 Newcastle Âm tính A1538 H5N1 Dương tính Từ bảng 3.4 cho thấy, ba loại virus dùng cho phản ứng ngưng kết latex kit latex cho kết âm tính với hai mẫu virus Newcastle H9N2, mẫu virus H5N1 cho kết dương tính Do thấy kit ngưng kết latex đặc hiệu với kháng nguyên H5 virus cúm A/H5N1 3.3.2 Đánh hoạt động kit latex với mẫu thực địa Để đánh giá khả hoạt động kit latex, sử dụng mẫu chứa virus H5N1 thu thực địa Đây mẫu chứa virus có chứa chất tạp nhiễm từ môi trường xung quanh nên lượng virus thường thấp, đánh giá trước có mặt virus phản ứng Real time PCR Trung tâm chẩn đoán thú y Trung ương Các mẫu sử dụng gồm loại: Loại mẫu thứ dịch nghiền mô não (Homo) gia cầm nghi nhiễm cúm, gồm mẫu (A1538, A1544, A1546, A1547, A1548, A1549, A1567, A1586) mẫu A1567 cho phản ứng âm tính với phản ứng Real time PCR Loại mẫu thứ hai mẫu dịch ngoáy hầu họng gia cầm nghi nhiễm cúm (Swab), gồm 12 mẫu (A1562, A1563, A1564, A1565, A1566, N156, N157, N158, N160, V187, V544, V550), có mẫu (A1562, A1563, A1564, A1565) cho kết âm tính với phản ứng Real time PCR Kết thử nghiệm thu bảng 3.5 Bảng 3.5 Kết thử nghiệm kit latex phát virus cúm A/H5N1 với mẫu thực địa ST T Ký hiệu Loại mẫu Phƣơng pháp Real time PCR Phƣơng pháp Kit latex ngƣng kết hồng cầu A1538 Homo + ++ - A1544 Homo + ++ - Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ A1546 Homo + + - A1547 Homo + + - A1548 Homo + ++ - A1549 Homo + + - A1586 Homo + ++ + A1567 Homo - - - A1562 Swab - - - 10 A1563 Swab - - - 11 A1564 Swab - - - 12 A1565 Swab - - - 13 A1566 Swab + + + 14 N156 Swab + + + 15 N157 Swab + ++ + 16 N158 Swab + ++ + 17 N160 Swab + ++ - 18 V187 Swab + + + 19 V544 Swab + + + 20 V550 Swab + + - Ghi chú: Các mẫu có số thứ tự từ đến 12 mẫu âm tính kiểm tra phản ứng Real Time PCR Ký hiệu (-) mẫu âm tính, (+) mẫu dương tính, (++) mức độ ngưng kết cao quan sát dễ dàng kính hiển vi có độ phóng đại 10×10, Homo: Mẫu dịch nghiền tổ chức dịch nghiền não phổi gia cầm nghi mắc cúm, Swab: Mẫu dịch ngoáy dịch ngoáy họng gia cầm nghi mắc cúm, bảo quản dung dịch PBS Phản ứng ngưng kết thực với 20 mẫu thực địa, kết bảng 3.5 cho thấy kit latex không phát cụm tủa mẫu âm tính với phản ứng Real time PCR Ở mẫu cho kết dương tính với phản ứng Real time PCR thử với phản ứng ngưng kết latex xuất cụm tủa Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Đặc biệt mẫu A1538, A1544 A1548, A1586, N157, N158, N160 cho thấy cụm tủa rõ ràng soi lên kinh hiển vi có độ phóng đại 10×10 Kết bảng 3.5 cho thấy, khả phát virus với mẫu thực địa phương pháp ngưng kết ngưng kết hồng cầu nhiều so với phương pháp ngưng kết latex Trong 15 mẫu dương tính với phản ứng Real time PCR, phương pháp ngưng kết hồng cầu cho kết dương tính với mẫu Điều giải thích mẫu thực địa có độ tinh không cao lẫn nhiều tạp chất gây ảnh hưởng tới phản ứng ngưng kết hồng cầu Như vậy, kit latex cho kết chẩn đoán virus cúm A/H5N1 tương tự với phương pháp Real time PCR, dùng kit latex để phát virus cúm A/H5N1 mẫu thu thực địa CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN - Đã biểu thành công kháng thể đơn chuỗi VH10 vi khuẩn E coli HB2151 tối ưu hóa biểu kháng thể đơn chuỗi VH10 với điều kiện: nhiệt độ nuôi cấy 30oC, chất cảm ứng IPTG mM, thời gian cảm ứng 5h Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Sau tinh qua cột sắc ký lực, lượng protein VH10 thu 1,43 mg/ml - Đã gắn thành công kháng thể đơn chuỗi VH10 lên bề mặt hạt latex lượng tối ưu 0,4 mg kháng thể/12,5 mg hạt latex xây dựng thành cơng mơ hình thử nghiệm tạo kit phát nhanh cúm A/H5N1 theo nguyên lý ngưng kết miễn dịch - Bộ kit latex có độ nhạy 100% tính đặc hiệu 100% với virus H5N1 mẫu nước trứng Đồng thời, kit latex có khả phát virus cúm A/H5N1 mẫu thực địa KIẾN NGHỊ - Đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu kit phát nhanh virus cúm A/H5N1 với số lượng lớn mẫu thử - Ứng kit latex phát nhanh virus cúm A/H5N1 vào thực tế sản xuất Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lê Trần Bình (2007), Báo cáo tổng kết đề tài độc lập cấp nhà nước: “Nghiên cứu xây dựng qui trình sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho gia cầm” (2006-2007), Trung tâm Thông tin Tư liệu Quốc gia Bộ Khoa học Công nghệ, Hà Nội Lê Trần Bình, Lê Thanh Hịa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nơng Văn Hải, Nguyễn Thị Bích Nga, Trương Nam Hải (2006), “Phân tích mối tương đồng kháng nguyên miễn dịch virus cúm A chủng cường độc đương nhiễm chủng vaccine cúm A/H5N1”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 4(3): 291-296 Lê Đình Chắc, Nguyễn Thị Thu Thủy, Lê Quang Huấn (2010), “Tạo kháng thể scFv đặc hiệu kháng nguyên Cyfra21-1”, Tạp chí Y học Việt Nam, 372(2): 163-167 Nguyễn Tiến Dũng (2008), “Vài nét virut cúm gia cầm H5N1”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, XV(4): 80-86 Nguyễn Tiến Dũng, Malik Peiris, Robert Webster, Đào Thanh Vân, Bùi Ngọc Anh, Nguyễn Thế Vinh, Kent Inui, Bùi Nghĩa Vượng, Nguyễn Viết Không Ngô Thanh Long (2004), “Nguồn gốc virus cúm gia cầm H5N1 Việt Nam năm 2003-2004”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, XI(3): 6-14 Chu Hoàng Hà, Phạm Minh Tuấn, Đồng Văn Quyền, Phan Trọng Hồng, Lê Trần Bình, Đinh Duy Kháng (2007), “Nghiên cứu tạo hạt Latex gắn HBcAg để phát kháng thể kháng HBcAg huyết bệnh nhân viêm gan B”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 5(3): 285-290 Lê Thanh Hoà, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Phạm Việt Cường, Nguyễn Thị Bích Nga, Lê Trần Bình (2008), “Virus cúm A/H5N1: Vấn đề dịch tễ học, tiến hố, hình thành genotype tương đồng kháng nguyên - miễn dịch-vaccine”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 6(4A): 529-553 Lê Thanh Hòa (2006), Y-Sinh học phân tử, Nhà xuất Y học, I, 29-48 Lê Thanh Hòa (2006a), “Chiến lược nghiên cứu ứng dụng virus vector tái tổ hợp sản xuất vaccine hệ mới”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 4(4): 397-416 10 Lê Thanh Hịa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, cộng (2005), “Nghiên cứu sinh học phân tử chủng virus cúm A/H5N1 phân lập Việt Nam Viện công nghệ sinh học”, Hội nghị khoa học kỉ niệm 30 năm Viện Khoa học Công nghệ sinh học (19/05/2005): 75-82 11 Lê Quang Huấn, Lã Thị Huyền (2009), Kháng thể tái tổ hợp ứng dụng, NXB Khoa học tự nhiên công nghệ, Hà Nội 12 Lê Quang Huấn, Nguyễn Thị Thu Thủy, Lã Thị Huyền (2010), “Sử dụng kháng thể phage kết hợp Real-time pCR để định lượng kháng nguyên epca ung thư tiền liệt tuyến”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 8(3B): 11211126 13 Lê Quỳnh Mai (2011), “Sự khác kiểu hình HA virus cúm gia cầm độc lực cao A/H5N1 gây bệnh cho người Việt Nam”, Tạp chí Y học thực hành, 5(764): 73-75 14 Một số tư liệu dịch cúm gia cầm vừa qua Việt Nam (2004), “Báo cáo tổng kết công tác phịng chống dịch cúm gia cầm Bộ Nơng nghiệp phát triển nơng thơn”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, XI(3): 99-100 15 Nguyễn Thị Kim Tiến (2005), “Dịch tễ học, virus học bệnh cúm A(H5N1) người khu vực phía Nam”, Tạp chí Y học thực hành, 517: 46-49 16 Phạm Văn Ty (2004), Miễn dịch học, NXB Ðại học Quốc gia, Hà Nội 17 Trần Quang Vui, Lê Thanh Hòa (2008), “Nghiên cứu thành phần gen H5 virus H5N1 phân lập từ vịt Thừa Thiên Huế”, Tạp chí khoa học, Đại học Huế, 12(46): 137-144 18 Cao Bảo Vân, Võ Hồ Hồng Hải, Ngô Thanh Long, Lê Hà Tầm Dương (2005), “Đánh giá độc tính khả lây cho người virus cúm A/H5N1 qua vụ dịch 2004-2005 miền Nam Việt Nam qua giám sát đột biến gen”, Tạp chí Y học dự phịng, 16(6): 5-10 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 19 Alexander DJ (2007), “Summary of avian influenza activity in Europe, Asia, Africa, and Australasia, 2002-2006”, Avian Dis, 51: 161-6 20 Andris WJ, Steinberger P, Barbas CF (2001), “Bacteriophage display of combinatorial antibody libraries”, Encyclopedida of Life Sciences 1-6 21 Basler C (2007), “ Influenza viruses: basic biology and potential drug targets”, Infect Disord Drug Targets, 7(4): 282-93 22 Berlioz AA, Marfel M, Durand A M, Ogawa T (2005), “Evaluation of a New Anti-Dengue Virus IgM Particle Agglutination Kit in the Context of the Pacific Islands”, Dengue Bulletin, (29): 70-78 23 Bender C, Hall H, Huang J, Klimov A, Cox N, Hay A, Gregory V, Cameron K, Lim W, Subbarao K (1999), “Characterization of the surface proteins of influenza A (H5N1) viruses isolated from humans in 1997- 1998”, Virology, 254: 115-123 24 Biswas SK, Nayak DP (1996), “Influenza virus polymerase basic protein interacts with influenza virus polymerase basic protein at multiple sites”, J Virol, 70(10): 6716-6722 25 Brichta J, Vesela H, Franek M (2003), “Production of scFv recombinant fragments against 2,4-dichlorophenoxyacetic acid hapten using naïve phage library”, Vet Med – Czech, 48(9): 237–247 26 Castrucci MR, Kawaoka Y (1993), “ Biologic importance of neuraminidase stalk length in influenza A virus”, J Virol, 67(2): 759-764 27 Chen JM, Ma HC, Chan JW, Sun YX, Li JM, Wang ZL (2007), “A preliminary panorama of the diversity of N1 subtype influenza viruses”, Virus Genes, 35(1): 33-40 28 Cheng X, Zhang Y, Kotani N, Tae W, Seungho L, Xiangchun W, Ikuo K, Tadashi T, Naoyuki T, Koichi H (2005), “Production of a recombinant single-chain variable-Fragment (scFv) antibody against Sulfoglycolipid”, J Biochem, 137: 415-421 29 de Kruif J, Terstappen L, Boel E, Logtenberg T (1995), “Rapid selection of cell subpopulation-specific human monoclonal antibodies from a synthetic phage antibody library”, Proc Natl Acad Sci USA, 92(9): 3938–3942 30 Fuh G, Sidhu S S (2000), “Efficient phage display of polypeptides fused to the carboxy-terminus of the M13 gene-3 minor coat protein”, FEBS Lett, 480: 231-234 31 Gao C, Mao S, Lo CH, Wirsching P, Lerner RA, Janda KD (1999), “Making artificial antibodies: a format for phage display of combinatorial heterodimeric arrays”, Proc Natl Acad Sci USA, 96(11): 6025-6030 32 Gao C, Mao S, Kaufmann G, Wirsching P, Lerner RA, Janda KD (2002), “A method for the generation of combinatorial antibody libraries using pIX phage display”, Proc Natl Acad Sci USA, 99(20): 12612-12616 33 Gambotto A, Barratt-Boyes S, Jong Md, Neumann G, and Kawaoka Y (2008), “Human infection with highly pathogenic H5N1 influenza virus”, Lancet, 371(9622):1464-1475 34 Griffiths AD, Malmqvist M, Marks JD, Bye JM, Embleton MJ, McCafferty J, Baier M, Holliger KP, Gorick BD, Hughes-Jones NC (1993), “Human anti-self antibodies with high specificity from phage display libraries”, EMBO J, 12(2): 725–734 35 Guan Y, Zhang H, Wang AH (1995), “Electrostatic potential distribution of the gene V protein from Ff phage facilitates cooperative DNA binding: a model of the GVP-ssDNA complex”, Protein Sci, 4:187 36 Harper K, Toth RL, Mayo MA, Torrance L (1999), “Properties of a panel of single chain variable fragments against Potato leafroll virus obtained from two phage display libraties”, J Virol, 81: 159-168 37 Hannah GL, Jianhua S, Harald F, Theodore O, Tian W, Michel L, Akikazu M, Krisstin N, Cassandra L, Kalipada K, John FA, Aravinda M, Michael SD, Raymond AK, Wayne AM, Erol F (2005), “Protective and therapeutic capacity of human single-chain Fv-Fc fusion proteins against west nile virrus”, J Virol, 79(23):14606-14613 38 Hay AJ, Gregory V, Douglas AR, Lin YP (2001), “The evolution of human influenza viruses” Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 356 (1416): 1861– 70 39 Holsinger LJ, Nichani D, Pinto LH, Lamb RA (1994), “ Influenza A virus M2 ion channel protein: a structure-function analysis”, J Virol, 68: 1551-1563 40 Horimoto T, Kawaoka Y (2006), “Strategies for developing vaccines against H5N1 influenza A viruses”, Trends Mol Med, 12(11): 506-514 41 Hufton SE, Moerkerk PT, Meulemans EV, de Bruïne A, Arends JW, Hoogenboom HR (1999), “Phage display of cDNA repertoires: the pVI display system and its applications for the selection of immunogenic ligands”, J Immunol Methods, 231(1-2): 39-51 42 Hulse-Post DJ, Sturm-Ramirez KM, Humberd J, Seiler P, Govorkova EA, Krauss S, Scholtissek C, Puthavathana P, Buranathai C, Nguyen T.D, Long HT, Naipospos TS, Chen H, Ellis TM, Guan Y, Peiris JS, Webster RG (2005), “Role of domestic ducks in the propagation and biological evolution of highly pathogenic H5N1 influenza viruses in Asia”, Proc Natl Acad Sci USA, 102(30): 10682-10687 43 Ito T, Couceiro JN, Kelm S, Baum LG, Krauss S, Castrucci MR, Donatelli I, Kida H, Paulson JC, Webster RG, Kawaoka Y (1998), “Molecular basis for the generation in pigs of influenza A viruses with pandemic potential”, J Virol, 72(9): 7367-7373 44 Kay BK, Winter J, McCafferty J (1996), Phage display of peptides and proteins Academic Press, San Diego, Calif, 227–253 45 Kehoe JW, Kay BK (2005), “Filamentous Phage Display in the New Millennium”, Chem Rev, 105: 4056–4072 46 Konings RN, Folmer RH, Folkers PJ, Nilges M, Hilbers CW (1995), “Threedimensional structure of the single-stranded DNA-binding protein encoded by gene V of the filamentous bacteriophage M13 and a model of its complex with single-stranded DNA”, FEMS Microbiol Rev, 17:57-72 47 Le QM, Kiso M, Someya K, Sakai YT, Nguyen TH, Nguyen KH, Pham ND, Nguyen HH, Yamada S, Muramoto Y, Horimoto T, Takada A, Goto H, Suzuki T, Suzuki Y, Kawaoka Y (2005), “Avian flu: isolation of drug-resistant H5N1 virus”, Nature, 438(7069): 754 48 Li Y, Lin Z, Shi J, Qi Q, Deng G, Li Z, Wang X, Tian G, Chen H (2006), “Detection of Hong Kong 97-like H5N1 influenza viruses from eggs of Vietnamese waterfowl”, Arch Virol, 151: 1615–1624 49 Li KS, Guan Y, Wang J, Smith GJ, Xu KM, Duan L, Rahardjo AP, Puthavathana P, Buranathai C, Nguyen TD, Estoepangestie AT, Chaisingh A, Auewarakul P, Long HT, Hanh NT, Webby RJ, Poon LL, Chen H, Shortridge KF, Yuen KY, Webster RG, Peiris JS (2004), “Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia”, Nature, 430(6996): 209-213 50 Linke S, Neubauer K, Dorner MB, Dorner BG, Pauli G, Schweiger B (2011), “Generation and characterisation of monoclonal antibodies against influenza virus A, subtype H5N1”, J Virol Methods, 175(1): 85-94 51 Liu Q, Ma J, Kou Z, Pu J, Lei F, Li T, Liu J (2010), “Characterization of a highly pathogenic avian influenza H5N1 clade 2.3.4 virus isolated from a tree sparrow”, Virus Res, 147(1): 25-29 52 Luo G, Palese P (1992), “Genetic analysis of influenza virus”, Curr Opin Genet Dev, 2(1): 77-81 53 Miyagawa E, Kogaki H, Uchida Y, Fujii N, Shirakawa T, Sakoda Y, Kida H (2011), “Development of a novel rapid immunochromatographic test specific for the H5 influenza virus”, J Virol Methods, 173(2): 213-9 54 Murphy BR, Webster RG (1996), Orthomyxoviruses, in: Fields Virology, Lippincott-Raven Publishers; Philadelphia, 1397-1445 55 Riechmann L, Holliger P (1997), “The C-terminal domain of TolA is the coreceptor for filamentous phage infection of E coli”, Cell, 90: 351-360 56 Singer JM, Plotz CM (1956), “The latex fixation test I Application to the serologic diagnosis of rheumatoid arthritis”, Am J Med, (21): 888 – 892 57 Smith GJ, Naipospos TS, Nguyen TD, de Jong MD, Vijaykrishna D, Usman TB, Hassan SS, Nguyen TV, Dao TV, Bui NA, Leung YH, Cheung CL, Rayner JM, Zhang JX, Zhang LJ, Poon LL, Li KS, Nguyen VC, Hien TT, Farrar J, Webster RG, Chen H, Peiris JS, Guan Y (2006), “Evolution and adaptation of H5N1 influenza virus in avian and human hosts in Indonesia and Vietnam”, Virology, 350(2): 258-268 58 Smith GP (1985), “Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface”, Science, 228: 1315-1317 59 Steinhaure DA (1999), “Role of hemagglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza virus”, Virology, 258(1):1-20 60 Sukone P, Janya N (2005), “The use of latex agglutination for the diagnosis of acute human Leptospirosis”, J Med Assoc Thai, 88: 1395 – 1400 61 Tim C, Henry BL (2004), Phage Display - A Practical Approach, Oxford University Press 62 Webster RG (1998), “Influenza: an emerging disease”, Emerg Infect Dis, 4(3): 436-441 63 Weiss GA, Sidhu SS (2000), “Design and evolution of artificial M13 coat proteins”, J Mol Biol, 300: 213-219 64 Winter G, Griffiths AD, Hawkins RE, Hoogenboom HR (1994), “Making antibodies by phage display technology”, Annu Rev Immunol, 12:433–55 65 van Wezenbeek PM, Hulsebos TJ, Schoenmakers JG (1980), “Nucleotide sequence of the filamentous bacteriophage M13 DNA genome: comparison with phage fd”, Gene, 11(1-2): 129-48 66 Xu X, Jin M, Yu Z, Li H, Qiu D, Tan Y, Chen H (2005), “Latex agglutination test for monitoring antibodies to avian influenza virus subtype H5N1”, J Clin Microbiol, (43): 1953-1955 67 Yashushi M, Seiji H (2010), “The molecular virology and reverse genetics of Influenza C virus”, Jpn J Infect Dis, 63: 157-165 68 Yamamoto A, Nakayama M, Tashiro M, Ogawa T, Kurane I (2000), “Hydroxyapatite-coated nylon beads as a new reagent to develop a particle agglutination assay system for detecting Japanese encephalitis virusspecific human antibodies”, J Clin Virol, 19: 195 – 204 69 Yang M, Clavijo A, Graham J, Salo T, Hole K, Berhane Y (2009), “Production and diagnostic application of monoclonal antibodies against influenza virus H5”, J Virol Methods, 162(1-2):194-202 70 Zhao ZM, Shoridge KF, Garcia M, Guan Y, Wan XF (2008), “Genotypic diversity of H5N1 highly pathogenic avian influenza viruses”, J Gen Virol, 89 (9): 2182-2193 TÀI LIỆU INTERNET 71 http://www.abdesignlabs.com/technical-resources/scfv-cloning/ 72 http:///www.bangslabs.com 73 http://qdnd.vn/qdndsite/vi-vn/61/43/352/354/354/185164/Default.aspx 74.http://www.thanhnien.com.vn/pages/20130419/ninh-thuan-tieu-huy-danchim-yen-lon-nhat-dong-nam-a.aspx 76 http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/avian_labtests2.pdf 77 http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/EN_GIP_20130604 CumulativeNumberH5N1cases.pdf 78 http://www.medicalecology.org/diseases/influenza.html 79 http://thefutureofthings.com/news/6684/human-antibodies-neutralize-avianflu.html 80 http://wikipedia.org/wiki/Influenza_A_virus CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN Lê Hồng Đức, Hồng Hà, Phạm Thanh Tùng, Phạm Bích Ngọc, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2013), “Nghiên cứu sản xuất sinh phẩm phát nhanh virus H5N1 quy mơ phịng thí nghiệm”, Hội nghị khoa học Cơng nghệ sinh học tồn quốc 2013, 1: 34-39 ... fluid A1 548 Homo A1 440 Allantoic fluid A1 549 Homo A1 932 Allantoic fluid A1 586 Homo A1 416 Allantoic fluid A1 567 Homo A1 928 Allantoic fluid A1 562 Swab A1 974 Allantoic fluid 10 A1 563 Swab A1 938 Allantoic... 11 A1 564 Swab A1 833 Allantoic fluid 12 A1 565 Swab A1 832 Allantoic fluid 13 A1 566 Swab A1 747 Allantoic fluid 14 N156 Swab A1 813 Allantoic fluid 15 N157 Swab A1 814 Allantoic fluid 16 N158 Swab... kháng thể đơn chuỗi đặc hiệu với protein kháng nguyên Từ lý trên, tiến hành thực đề tài: ? ?Nghiên cứu ứng dụng kháng thể đơn chuỗi chế tạo kit phát nhanh virus cúm A/ H5N1? ?? Mục tiêu nghiên cứu: -