Nghiên cứu thiết kế vectơ pb2gw7 mang gen cryia c và đánh giá khả năng chuyển gen trên cây arabidopsis thaliana

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM —————————————— BÙI TRI THỨC NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR PB2GW7 MANG GEN CRYIA(C) VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN TRÊN CÂY ARABIDOPSIS THALIANA LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên – 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM —————————————— BÙI TRI THỨC NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR PB2GW7 MANG GEN CRYIA(C) VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN TRÊN CÂY ARABIDOPSIS THALIANA LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.46.30 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Ngơ Xn Bình Thái Ngun – 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập nghiên cứu để hồn thành khóa luận tơi nhận hướng dẫn, giúp đỡ, bảo động viên thầy cơ, bạn bè gia đình Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo: PGS TS Ngơ Xn Bình, giúp đỡ hướng dẫn suốt thời gian thực đề tài q trình hồn chỉnh luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo trường Đại học Sư phạm, khoa Sau đại học, môn Sinh học phân tử Công nghệ gen - Viện Khoa học Sự sống, Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN thầy cô giáo, cán khoa Sinh - KTNN tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập hồn thành luận văn Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân bạn bè động viên, chia sẻ giúp đỡ vượt qua khó khăn q trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Tác giả luận văn Bùi Tri Thức Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực,chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khuẩn A tumefaciens trình chuyển gen vào trồng 1.1.1 Đặc điểm vi khuẩn A tumefaciens 1.1.2 Cấu trúc chức Ti-plasmid 1.1.3 Cơ chế trình chuyển gen nhờ A tumefaciens 1.1.4 Một số hệ thống chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens 1.2 Vector chuyển gen dựa Ti-plasmid 10 1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens .13 1.4 Công nghệ Gateway vector sử dụng đề tài .16 1.4.1 Công nghệ Gateway 16 1.4.2 Vector nhân dòng pENTRTMD/TOPO cloning 20 1.4.3 Vector chuyển gen pB2GW7 .22 1.5 Vi khuẩn B thuringiensis gen cry 23 1.5.1 Những nghiên cứu chung vi khuẩn B thuringiensis .23 1.5.2 Những nghiên cứu gen cry 24 1.5.3 Những nghiên cứu gen cry1A 25 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.6 Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào A thaliana 25 1.6.1 Đặc điểm nông sinh học A thaliana .25 1.6.2 Những nghiên cứu A thaliana 26 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .28 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị 28 2.1.1 Vật liêu nghiên cứu 28 2.1.2 Hóa chất sử dụng đề tài 29 2.1.3 Thiết bị sử dụng đề tài 30 2.2 Phương pháp nghiên cứu 30 2.2.1 Nhân dòng gen cryIA(c) từ vector OB-Mutant#16-cryIA(c) .30 2.2.1.1 Nhân gen cryIA(c) từ vector OB-Mut-cryIA(c) 31 2.2.1.2 Gắn gen cryIA(c) lên vector tách dịng pENTR™/D-TOPO® 32 2.2.1.3 PCR kiểm tra dòng khuẩn lạc thu sau nhân dòng với cặp mồi đặc hiệu gen cryIA(c) 32 2.2.1.4 Xác định trình tự đoạn ADN nhân dịng 32 2.2.2 Tạo chủng vi khuẩn A tumefacien mang vector pB2GW7-cryIA(c) 33 2.2.2.1 Gắn gen cryIA(c) lên vector chuyển gen pB2GW7 34 2.2.2.2 Phân tích dịng tế bào E coli thu sau chọn lọc 35 2.2.2.3 Biến nạp vector pB2GW7- cryIA(c) vào tế bào vi khuẩn A tumefacicen .35 2.2.2.4 PCR kiểm tra dòng khuẩn lạc A tumefaciens thu sau biến nạp với cặp mồi đặc hiệu gen cryIA(c) .36 2.2.3 Đánh giá khả chuyển gen hệ thống vector pB2GW7-cryIA(c) A thaliana 36 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.3.1 Tạo A thaliana chuyển gen 36 2.2.3.2 Đánh giá A thaliana chuyển gen dựa khả kháng thuốc diệt cỏ 37 2.2.3.3 Đánh giá A thaliana chuyển gen dựa phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu gen bar 37 2.2.3.4 Đánh giá A thaliana chuyển gen dựa phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu gen cryIA(c) 38 2.2.3.5 Đánh giá khả sinh trưởng A thaliana chuyển gen 38 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 39 3.1 Kết nhân dòng gen cryIA(c) từ vector OB-Mutant#16-cryIA(c) 39 3.1.1 Kết nhân gen cryIA(c) từ vector OB-Mut-cryIA(c) 39 3.1.2 Kết gắn gen cryIA(c) lên vector tách dịng pENTR™/D-TOPO® 39 3.1.3 Kết PCR kiểm tra dòng khuẩn E coli thu với cặp mồi đặc hiệu gen cryIA(c) .40 3.1.4 Kết xác định trình tự đoạn ADN nhân dịng 41 3.2 Kết tạo chủng vi khuẩn A tumefacien mang vector pB2GW7cryIA(c) 45 3.2.1 Kết gắn gen cryIA(c) lên vector chuyển gen pB2GW7 45 3.2.2 Kết phân tích dịng tế bào E coli thu sau chọn lọc .46 3.2.3 Kết biến nạp vector pB2GW7- cryIA(c) vào tế bào vi khuẩn A tumefacicen 47 3.2.4 Kết PCR kiểm tra dòng khuẩn lạc A tumefaciens thu sau biến nạp với cặp mồi đặc hiệu gen cryIA(c) .48 3.3 Đánh giá khả chuyển gen hệ thống vector pB2GW7-cryIA(c) A thaliana 49 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.3.1 Kết đánh giá A thaliana chuyển gen dựa khả kháng thuốc diệt cỏ 49 3.3.2 Kết đánh giá A thaliana chuyển gen phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu gen bar 50 3.3.3 Kết đánh giá A thaliana chuyển gen phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu gen cryIA(c) 51 3.3.4 Đánh giá khả sinh trưởng A thaliana chuyển gen 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 Kết luận .53 Đề nghị .53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT Viết tắt A thaliana A tumefaciens A260 nm A280 nm ADN ADNaza Amp VAM ARN ARNaza AS BC BLAST Nội dung Arabidopsis thaliana Agrobacterium tumefaciens Giá trị mật độ quang bước sóng 260 nm Giá trị mật độ quang bước sóng 280 nm Axít deoxyribonucleic Deoxyribonuclease (enzyme phân hủy ADN) Ampicillin Anfa mosaic virus (virut khảm anfa) Axít ribonucleic Ribonuclease (enzyme phân hủy ARN) Asetoseringon Bacillus cereus Basic Local Alignment Search Tool Bp Base pair - Cặp bazơ nitơ BT cADN VCaM Cry CTAB ddNTP E.coli EDTA Gen GUS ISAAA Bacillus thuringiensis Complementary DNA (ngân hàng gen) Cauliflower mosaic virus (virut gây khảm súp lơ) Crystal Cetyl trimetyl amonium bromid Dideoxyribonucleotide triphosphate Escherichia coli Axít etylendiaminetetraacetic Gen mã hóa β-glucuronidase International Survice for the Acquisition of Agri-Biotech Application Kilobase Left border (trật tự biên trái đoạn T-ADN) Mol/lit Messenger RNA kb LB M mARN Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MS NCBI NPTII OD ori PCR rARN RB T-ADN TAE Taq polymeraza TE Ti-plasmid Vir YAC Murashige and Skoog National Center for Biotechnology Information-Trung tâm thông tin quốc gia thông tin công nghệ sinh học Neomycin phospho transferase gen Optical density Origin of replication Polymerase chain reaction Ribosomal RNA Right border (trật tự biên phải đoạn T-ADN) Transfer DNA (đoạn ADN chuyển sang tế bào thực vật) Tris-acetate-EDTA Thermostable DNA polymeraza Tris : EDTA (10:1) Tumor inducing plasmid (plasmid gây khối u) Virulence (vùng gen gây độc) Yeast artificial chromosome (NST nhân tạo nấm men) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 46 3.2.2 Kết phân tích dịng tế bào E coli thu sau chọn lọc Để kiểm tra tồn gen cryIA(c) tế bào vi khuẩn E coli sau chọn lọc, tiến hành chọn ngẫu nhiên dịng khuẩn lạc, ni riêng mơi trường LB có bổ sung spectinomycin 50 mg/l, thu sinh khối, tách plasmid thực phản ứng PCR với mồi đặc hiệu gen cryIA(c), điện di gel agarose 1% để kiểm tra Kết thể hình 3.7 M đ/c 1,6 kb A Hình 3.7 Kết PCR kiểm tra dòng khuẩn lạc với mồi đặc hiệu gen cryIA(c) M: Ladder kb; đ/c: vectơ pB2GW7 (đối chứng); 1- thứ tự dòng khuẩn lạc phân tích Qua hình 3.7 cho thấy: Các đường chạy số đến số có băng ADN có kích thước tương ứng với kích thước gen cryIA(c) (1,857 kb) đường chạy đ/c (đối chứng) không xuất băng đặc hiệu, kết luận dòng đem phân tích có chứa gen cryIA(c) Hình 3.8 Sơ đồ cấu tạo vectơ tái tổ hợp pB2GW7-cryIA(c) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 47 Theo lý thuyết: gen cryIA(c) vectơ pB2GW7 có vị trí nhận biết enzym SacI Do vậy, cắt vectơ tái tổ hợp enzyme SacI tạo băng ADN có kích thước 8,741 kb 2,547 kb Để chứng minh việc gắn gen cryIA(c) lên vectơ không làm thay đổi cấu trúc vectơ gen, tiến hành cắt vectơ enzym SacI điện di kiểm tra gel agarose 1% Kết thu hình 3.9 M đ/c kb Hình 3.9 Kết cắt kiểm tra plasmid dòng khuẩn lạc enzym SacI M: Ladder kb; đ/c: vectơ pB2GW7 (đối chứng); 1- thứ tự dịng khuẩn lạc phân tích Hình 3.9 cho thấy: Từ đường chạy số đến số 9, xuất băng ADN: băng lớn có kích thước 8,7 kb băng nhỏ có kích thước 2,5 kb, đường chạy đ/c (đối chứng) xuất băng kích thước khoảng 10,8 kb Vậy vectơ tái tổ hợp có chứa gen cryIA(c) 3.2.3 Kết biến nạp vectơ pB2GW7- cryIA(c) vào tế bào vi khuẩn A tumefaciens Sau chọn dòng tế bào vi khuẩn E coli chủng DH5α mang vectơ pB2GW7- cryIA(c), tiến hành nuôi riêng môi trường LB có bổ sung spectinomycin 50 mg/l, tách plasmid chuyển sang tế bào vi khuẩn A tumefaciens chủng EHA105 phương pháp sung điện Sau đó, dịng khuẩn lạc chứa vectơ pB2GW7-cryIA(c) chọn lọc môi trường YEP có bổ sung spectinomycin 50 mg/l rifampicin 25 mg/l Kết thu hình 3.10 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 48 Hình 3.10 Kết biến nạp vectơ pB2GW7-cryIA(c) vào vi khuẩn A tumefaciens Qua hình 3.10 cho thấy có 549 dịng khuẩn lạc có khả sống mơi trường chứa đồng thời hai kháng sinh spectinomycin rifampicin 3.2.4 Kết PCR kiểm tra dòng khuẩn lạc A tumefaciens thu sau biến nạp với cặp mồi đặc hiệu gen cryIA(c) Để kiểm tra tồn gen cryIA(c) dòng vi khuẩn A tumefaciens sau biến nạp Chúng tiến hành chọn thực phản ứng PCR 10 khuẩn lạc thu với cặp mồi đặc hiệu gen cryIA(c) Kết điện di sản phẩm gel agarose 1% thể hình 3.11 M đ/c 10 1,6 kb Hình 3.11 Kết PCR kiểm tra dòng khuẩn lạc A tumefaciens thu sau biến nạp M: Ladder kb; đ/c: vectơ pB2GW7 (đối chứng); 1- 10 thứ tự dịng khuẩn lạc phân tích Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 49 Qua hình 3.11 cho thấy : Từ đường chạy số đến đường chạy số 10 xuất băng ADN có kích thước 1,8 kb, tương đương kích thước gen cryIA(c) (1,857 kb) Trong đường chạy đ/c (đối chứng) khơng có băn ADN xuất Điều khẳng định: tất dịng khuẩn lạc phân tích chứa vectơ tái tổ hợp pB2GW7-cryIA(c) hay tạo thành công chủng vi khuẩn A tumefaciens mang vectơ pB2GW7-cryIA(c) 3.3 Đánh giá khả chuyển gen hệ thống vectơ pB2GW7-cryIA(c) A thaliana 3.3.1 Kết đánh giá A thaliana chuyển gen dựa khả kháng thuốc diệt cỏ Theo thiết kế, vùng T-DNA vectơ pB2GW7-cryIA(c) có chứa gen bar (gen kháng thuốc trừ cỏ phosphinothricin (PPT)) gen cryIA(c) Do vậy, để đánh giá khả chuyển gen hệ thống vectơ, thí nghiệm sử dụng phương pháp: (1) phương pháp sử dụng mơi trường có chứa chất chọn lọc PPT, (2) Phương pháp PCR gen bar gen cryIA(c) với mồi đặc hiệu Để đánh giá khả hoạt động gen bar A thaliana chuyển gen, tiến hành trồng môi trường chứa 3mg PPT/l Kết thu thể bảng 3.2 Bảng 3.2 Kết chọn lọc A thaliana môi trƣờng chọn lọc Chỉ tiêu Công thức Hạt không chuyển Số mẫu Số mẫu Tỷ lệ Số mẫu Tỷ lệ cấy chết chết sống sống (%) (mẫu) (mẫu) (%) (mẫu) 30 30 100,00 0,00 430 428 99,53 0,47 gen Hạt đươc chuyển gen Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 50 Qua bảng số liệu cho thấy 100% mẫu cơng thức đối chứng (khơng có gen bar) chết sau chọn lọc Ở công thức chuyển gen, thu đươc sinh trưởng tốt có hình thái bình thường Như xác định chuyển gen có chứa gen kháng PPT tỷ lệ chuyển gen vào A thaliana đạt 0,47 % Khi so sánh tỷ lệ chuyển gen với tỷ lệ chuyển gen tác giả Clough Cs [14] tiến hành phương pháp thấy: tỷ lệ chuyển gen thu thí nghiệm thấp tỷ lệ chuyển gen CloughS Nguyên nhân sai khác hóa chất sử dụng (hãng mua khác nhau) chất lượng thiết bị thí nghiêm 3.3.2 Kết đánh giá A thaliana chuyển gen dựa phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu gen bar Phân tích A thaliana chuyển gen phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen bar sau điện di kiểm tra gel agarose 1% Kết thu thể hình 3.12 M đ/c kb Hình 3.12 Kết đánh giá A thaliana chuyển gen dựa phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu gen bar M: Ladder kb; đường chạy 1, 2: sản phẩm PCR ADN từ A thaliana chuyển gen; đường chạy đ/c: sản phẩm PCR ADN từ khơng chuyển gen (đối chứng) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 51 Qua hình 3.12 cho thấy: đường chạy số xuất băng ADN kích thước khoảng 1,1 kb tương đương với kích thước gen bar (1,148 kb) đường chạy đ/c (đối chứng) không xuất băng đặc hiệu Kết luận hệ gen chuyển gen có chứa gen bar 3.3.3 Kết đánh giá A thaliana chuyển gen dựa phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu gen cryIA(c) Sau chọn lọc A thaliana có khả kháng thuốc trừ cỏ PPT, tiến hành tách ADN, thực phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu gen cryIA(c) điện di gel agarose 1% thu kết hình 3.13 M đ/c 1,6 kb Hình 3.13 Kết đánh giá A thaliana chuyển gen dựa phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu gen cryIA(c) M: Ladder kb; đường chạy 1, 2: sản phẩm PCR ADN từ A thaliana chuyển gen; đường chạy đ/c: sản phẩm PCR ADN từ không chuyển gen (đối chứng) Qua hình 3.13 cho thấy: đường chạy số xuất băng ADN kích thước khoảng 1,8 kb tương đương với kích thước gen cryIA(c) đường chạy đ/c (đối chứng) không xuất băng đặc hiệu Kết luận hệ gen chuyển gen có chứa gen cryIA(c) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 52 Từ hình 3.12 3.13 cho thấy toàn phần T-DNA vectơ pB2GW7cryIA(c) chuyển vào A thaliana hay tạo thành công A thaliana chuyển gen mang đồng thời gen cryIA(c) gen bar 3.3.4 Đánh giá khả sinh trưởng A thaliana chuyển gen Để đánh giá ảnh hưởng gen chuyển đến chuyển gen, tiến hành so sánh số tiêu nông sinh học chuyển gen với không chuyển gen Kết thu bảng 3.3 Bảng 3.3 Thống kê số tiêu nông sinh học chuyển gen so với đối chứng Chỉ tiêu Công thức Thời gian Số lá/cây Số Số Tỷ lệ Số sinh trưởng (lá) hoa/cây quả/cây đậu hạt/quả (ngày) (hoa) (quả) (%) (hạt) Cây không chuyển gen 35 18,4 56,2 12,2 21,0 8,4 Cây chuyển gen 35 18,5 55,8 12,6 22,0 8,6 Qua bảng số liệu cho thấy khơng có khác biệt chuyển gen không chuyển gen tiêu theo dõi Điều chứng tỏ gen chuyển không gây ảnh hưởng xấu đến trình sinh trưởng phát triển A thaliana chuyển gen, hệ thống vectơ sử dụng vào mục đích tạo trồng kháng sâu Tuy nhiên, xem xét đặc điểm nông sinh học A Thaliana (khơng chuyển gen) thí nghiệm tổng số trung bình/ cây, tổng số hạt/ quả, tiêu thấp so với thí nghiệm loại Fiona cộng [28] Sự sai khác giải thích điều kiện trồng chăm sóc khác tạo lên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Bằng phương pháp nhân gen với cặp mồi đặc hiệu gắn gen lên vectơ tách dịng, chúng tơi tách dịng thành cơng gen cryIA(c) kích thước 1,857 kb, gen đột biến, chưa công bố ngân hàng gen Đã tạo chủng vi khuẩn A tumefaciens mang vectơ pB2GW7cryIA(c) có khả chuyển gen vào thực vật Xác định tỷ lệ chuyển gen chủng vi khuẩn A tumefaciens EHA105 mang vectơ pB2GW7-cryIA(c) vào A thaliana 0,47% Đề nghị Tiếp tục đánh giá khả kháng loại sâu A thaliana chuyển gen Tiếp tục đánh giá khả chuyển gen chủng vi khuẩn A tumefaciens mang vectơ pB2GW7-cryIA(c) loại trồng khác Tiếp tục nghiên cứu tạo vectơ chuyển gen có khả chuyển gen tốt, gen có khả kháng sâu tốt để phục vụ công tác tạo trồng kháng sâu Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Quốc Dung (2006), Công nghệ chuyển gen động vật thực vật, Nhà xuất Đại học Huế, Huế Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hồ Nguyễn Văn Uyển (2003), "Tạo hông (Paulownia fortune) chuyển gen kháng sâu thông qua vi khuẩn Agrobacterium", Hội nghị Cơng ngệ sinh học tồn quốc 2003, tr 1088 1090 Lê Thị Thu Hiền, Nguyễn Thùy Dương, Đào Thị Hà, Huỳnh Thị Thu Huệ, Lê Trần Bình Nơng Văn Hải (2004), "Thiết kế vectơ hệ mang gen kháng côn trùng cryIA(c) để chuyển vào trồng", Tạp chí Cơng nghệ sinh học, (1), tr 85 - 92 Trần Thị Phương Liên Nông Văn Hải (1997), "Chuyển tổ hợp gen GUSBNG vào thuốc lá", Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 2, tr 23-27 Đặng Trọng Lương, Nguyễn Đức Doanh, Vũ Đức Quang, Nguyễn Hữu Đống vàTrần Duy Quý (2001), "Nghiên cứu chuyển gen cryIA(c) kháng sâu vào số giống cải bắp (Brassica oleracea var capitata) qua Agrobacterium", Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội, tr 120-128 Nguyễn Đức Thành (2003), Chuyển gen vào thực vật, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Tiếng Anh Aaron, J P (2000), Life technology introduces revolutionary GibcoBRL Gateway cloning technology, http://www.lifetech.com/gateway, ngày 20/02/2000 Aldemita, R R & Hodges, T K (1996), Agrobacterium tumefaciensmediated transformation of japonica and indica rice varieties, Heidelberg, ALLEMAGNE: Springer Andrian, S., Nigel, W S & Mark, R F (2003), Plant Biotechnology: The genetic manipulation of plants, Oxford University press Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 55 10 Bechtold, N & Pelletier (1998), "In planta Agrobacterium mediated transformation of adult Arabidopsis thaliana plant by vaccum infiltration", Methods Mol Biol, 82, pp 259 - 266 11 Bevan, M (1984), "Binary Agrobacterium vectơs transformation", Nucleic Acids Res, 12(22), pp 8711-8721 for plant 12 Bhattacharya, R C., Viswakarma, N., Bhat, S R., Kirti, P B & Chopra, V L (2002), "Development of insect-resistant transgenic cabbage plants expressing a synthetic cryIA(b) gene from Bacillus thuringiensis", Current Science, 83 (2), pp 146-150 13 Birch, R G (1997), PLANT TRANSFORMATION: "Problems and Strategies for Practical Application", Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 48, pp 297-326 14 CloughS, J & Bent, A F (1998), Floral dip: "A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana", Plant J, 16(6), pp 735-743 15 Chang, C & Meyerowitz, E M (1995), "The ethylene hormone response in Arabidopsis: a eukaryotic two-component signaling system", Proc Natl Acad Sci U S A, 92(10), pp 4129-4133 16 Cheng, C & Shuman, S (2000), "Recombinogenic flap ligation pathway for intrinsic repair of topoisomerase IB-induced double-strand breaks", Mol Cell Biol, 20(21), pp 8059-8068 17 Cheng, M H., Yao, Y M., Yao, S., Liang, H P., Li, H Y., Dong, N., Yu, Y & Sheng, Z Y (2004), "Effects of extracellular signal-regulated kinase inhibition by AG126 on tissue tumor necrosis factor-alpha expression and multiple organ dysfunction in rats with postburn Staphylococcus aureus sepsis", Zhonghua Wai Ke Za Zhi , 42(7), pp 391-395 18 Chu, C C., Wang, C C., S., S C., Hsu, C., Yin, K C., Chu, C Y & Bi, F Y (1975), "Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparative experiments on the nitrogen source, Sci Sin, 18, pp 659 - 668 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 56 19 Chumakov, M I., Rozhok, N A., Velikov, V A., Tyrnov, V S & Volokhina, I V (2006), "In planta transformation of maize through inoculation of Agrobacterium into the silks", Genetika, 42(8), pp 10831088 20 Dean, D H (1984), "Biochemical genetics of the bacterial insect-control agent Bacillus thuringiensis: basic principles and prospects for genetic engineering", Biotechnol Genet Eng Rev, 2, pp 341-363 21 Desfeux, C., Clough, S J & Bent, A F (2000), "Female reproductive tissues are the primary target of Agrobacterium-mediated transformation by the Arabidopsis floral-dip method", Plant Physiol, 123(3), pp 895-904 22 Dingman, D W & Stahly, D P (1984), "Protection of Bacillus larvae from Oxygen Toxicity with Emphasis on the Role of Catalase", Appl Environ Microbiol, 47(6), pp 1228-1237 23 Dubin, M., Bowler, C & Benvenuto, G (2008), "A modified Gateway cloning strategy for overexpressing tagged proteins in plants", Plant Methods, 4(1), pp 24 Earley, K W., Haag, J R., Pontes, O., Opper, K., Juehne, T., Song, K & Pikaard, C S (2006), "Gateway-compatible vectơs for plant functional genomics and proteomics", Plant J , 45(4), pp 616-629 25 Enriquez-Obregon, G A., Vazquez-Padron, R L., Prieto-Samsonov, D L & De La Riva, G A (1998), Herbicide-resistant sugarcane (Saccharum officinarum L.) plants by Agrobacterium-mediated transformation, Heidelberg, ALLEMAGNE: Springer 26 Ernst, H C., Beebe, W L., Moore, V A., Van Es, L & Arms, B L (1911), "Report of the Committee on Standard Methods for the Bacterial Diagnosis of Glanders", J Am Public Health Assoc, 1(7), pp 493-502 27 Fang, S., Wang, L., Guo, W., Zhang, X., Peng, D., Luo, C., Yu, Z & Sun, M (2009), "Bacillus thuringiensis bel protein enhances the toxicity of cryIA(c) protein to Helicoverpa armigera larvae by degrading insect intestinal mucin", Appl Environ Microbiol , 75 (16), pp 5237-5243 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 57 28 Fiona, R H., Andrew, M., Kirstine, M & Fiona, J W (2003), "One step analysis of seed storage data and the longevity of Arabidopsis thaliana seeds", J Exp Bot, 54(384), pp 993 - 1011 29 Frame, B R., Shou, H., Chikwamba, R K., Zhang, Z., Xiang, C., Fonger, T M., Pegg, S E K., Li, B., Nettleton, D S., Pei, D & Wang, K (2002), "Agrobacterium tumefaciens-Mediated Transformation of Maize Embryos Using a Standard Binary Vectơ System", Plant Physiology, 129(1), pp 1322 30 Froger, A & Hall, J E (2007), "Transformation of plasmid DNA into E coli using the heat shock method", J Vis Exp, (6), pp 253 31 Gordon-Kamm, W., Dilkes, B P., Lowe, K., Hoerster, G., Sun, X., Ross, M., Church, L., Bunde, C., Farrell, J., Hill, P., Maddock, S., Snyder, J., Sykes, L., Li, Z., Woo, Y M., Bidney, D & Larkins, B A (2002), "Stimulation of the cell cycle and maize transformation by disruption of the plant retinoblastoma pathway", Proc Natl Acad Sci U SA, 99(18), pp 11975-11980 32 Gulbitti-Onarici, S., Zaidi, M A., Taga, I., Ozcan, S & Altosaar, I (2009), "Expression of cryIAc in transgenic tobacco plants under the control of a wound-inducible promoter (AoPR1) isolated from Asparagus officinalis to control Heliothis virescens and Manduca sexta", Mol Biotechnol, 42(3), pp 341-349 33 Guo, S., Ye, S., Liu, Y., Wei, L., Xue, J., Wu, H., Song, F., Zhang, J., Wu, X., Huang, D & Rao, Z (2009), "Crytal structure of Bacillus thuringiensis Cry8Ea1: An insecticidal toxin toxic to underground pest, the larvae of Holotrichia parallela", J Struct Biol, 168 (2), pp 259 - 266 34 Hiei, Y., Komari, T & Kubo, T (1997), "Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens", Plant Mol Biol, 35(1-2), pp 205-218 35 Hooykaas, P J & Schilperoort, R A (1992), "Agrobacterium and plant genetic engineering", Plant Mol Biol, 19(1), pp 15-38 36 Invitrogen (2006), pENTRTM Directional TOPO cloning kits, http://pepcc.case.edu/manuals/pentr_dtopo_man.pdf, ngày 06/04/2006 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 58 37 Ishida, Y., Saito, H., Ohta, S., Hiei, Y., Komari, T & Kumashiro, T (1996), "High efficiency transformation of Maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens", Nature Biotechnol, 14, pp 745 - 750 38 Ishiwatari, S (1901), "The Discoverer of the Leprosy Bacillus", Br Med J, 2(2121), pp 494 39 James, C (2009), "Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2009", International service for the acquisition of Agri-Biotech applications, pp 41 40 Karimi, M., Inze, D & Depicker, A (2002), "GATEWAY vectơs for Agrobacterium-mediated plant transformation", Trends Plant Sci, 7(5), pp 193-195 41 Katavic, V., Haughn, G W., Reed, D., Martin, M & Kunst, L (1994), "In planta transformation of Arabidopsis thaliana", Mol Gen Genet, 245(3), pp 363-370 42 Kondo, T., Hasegawa, H & Suzuki, M (2000), "Transformation and regeneration of garlic (Allium sativum L.) by Agrobacterium-mediated gene transfer", Plant Cell Reports, 19(10), pp 989-993 43 Khanna, H., Becker, D., Kleidon, J & Dale, J (2004), "Centrifugation Assisted Agrobacterium tumefaciens mediated Transformation (CAAT) of embryogenic cell suspensions of banana Musa spp", Molecular Breeding, 14(3), pp 239-252 44 Landy, A (1989), "Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination", Annu Rev Biochem, 58, pp 913-949 45 Lee, L.-Y & Gelvin, S B (2008), "T-DNA Binary Vectơs and Systems", Plant Physiology, 146(2), pp 325-332 46 Li, P.-L., Everhart, D M & Farrand, S K (1998), "Genetic and Sequence Analysis of the pTiC58 trb Locus, Encoding a Mating-Pair Formation System Related to Members of the Type IV Secretion Family", J Bacteriol, 180(23), pp 6164-6172 47 Mayer, R., Propert, K J., Peters, K M., Payne, C K., Zhang, Y., Burks, D., Culkin, D J., Diokno, A., Hanno, P., Landis, J R., Madigan, R., Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 59 Messing, E M., Nickel, J C., Sant, G R., Warren, J., Wein, A J., Kusek, J W., Nyberg, L M & Foster, H E (2005), "A randomized controlled trial of intravesical bacillus calmette-guerin for treatment refractory interstitial cystitis", J Urol, 173(4), pp 1186-1191 48 Mullis, K B & Faloona, F A (1987), "Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction", Methods Enzymol, 155, pp 335350 49 Murashige, T & Skoog, F C (1962), "A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture", Physiologia Plantarum, 15, pp 473 - 497 50 Olsen, K M., Daly, J C., Finnegan, E J & Mahon, R J (2005), "Changes in cryIAc Bt transgenic cotton in response to two environmental factors: temperature and insect damage", J Econ Entomol, 98(4), pp 1382-1390 51 Pitzschke, A & Hirt, H (2010), "New insights into an old story: Agrobacterium-induced tumour formation in plants by plant transformation", EMBO J, 29(6), pp 1021-1032 52 Rohini, V K & Sankara Rao, K (2001), "Transformation of peanut (Arachis hypogaea L.) with tobacco chitinase gene: variable response of transformants to leaf spot disease" Plant Sci, 160(5), pp 889-898 53 Sanger, F., Nicklen, S & Coulson, A R (1977), "DNA sequencing with chain-terminating inhibitors", Proc Natl Acad Sci U SA, 74(12), pp 54635467 54 Sharma, H C., Sharma, K K., Seetherama, N & R., O (2000), "Prospects for using transgenic resistance to insect in crop improvement", Elect J Biotechnol, (2), pp - 20 55 Shuman, S (1991), "Recombination mediated by vaccinia virus DNA topoisomerase I in Escherichia coli is sequence specific", Proc Natl Acad Sci USA, 88(22), pp 10104-10108 56 Sunikumar, G & Rathore, K S (2001), "Transgenic cotton: factors influencing Agrobacterium-mediated transformation and regeneration", Mol Breed, 8, pp 37 - 52 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 60 57 Trick, H N & Finer, J J (1997), "SAAT: sonication - assisted Agrobacterium - mediated transformation", Transgenic Res, 6, pp 329 337 58 Trieu, A T., Burleigh, S H., Kardailsky, I V., Maldonado-Mendoza, I E., Versaw, W K., Blaylock, L A., Shin, H., Chiou, T J., Katagi, H., Dewbre, G R., Weigel, D & Harrison, M J (2000), "Transformation of Medicago truncatula via infiltration of seedlings or flowering plants with Agrobacterium", Plant J, 22(6), pp 531-541 59 Urushibara, S., Tozawa, Y., Kawagishi-Kobayashi, M & Wakasa, K (2001), "Efficient Transformation of Suspension-cultured Rice Cells Mediated by Agrobacterium tumefaciens", Breed Sci, 51, pp 33 - 38 60 Wu, C., Fan, Y., Zang, C., Oliva, N & Datta, S K (1997), "Transgenic tertile japonica rice plant expressing a modified cryIA(b) gene resistant to yellow stem borer", Plant Cell Rep, 17, pp 129 - 132 61 Zambryski, P., Joos, H., Genetello, C., Leemans, J., Montagu, M V & Schell, J (1983), "Ti plasmid vectơ for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity", EMBO J, 2(12), pp 2143-2150 62 Zhang, W., Subbarao, S., Addae, P., Shen, A., Armstrong, C., Peschke, V & Gilbertson, L (2003), "Cre/Iox mediated marker gene excision in transgenic maize (Zea mays L.) plants", Theor Appl Genet, 107, pp 1157 1168 63 Zhao, Z Y., Cai, T., Tagliani, L., Miller, M., Wang, N., Pang, H., Rudert, M., Schroeder, S., Hondred, D., Seltzer, J & Pierce, D (2000), "Agrobacterium-mediated sorghum transformation", Plant Mol Biol, 44(6), pp 789-798 64 Zhao, Z Y & Ranch, J (2006), "Transformation of maize via Agrobacterium tumefaciens using a binary co-integrate vectơ system", Methods Mol Biol 318, pp 315-323 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... riêng Chúng tơi tiến hành nghiên c? ??u đề tài: ? ?Nghiên c? ??u thiết kế vectơ pB2GW7 mang gen cryIA( c) đánh giá khả chuyển gen Arabidopsis thaliana? ?? M? ?c tiêu nghiên c? ??u Tạo vectơ pB2GW7 mang gen cryIA( c) ... tiếp c? ??n, đầu tư nghiên c? ??u với trọng đ? ?c biệt Từ năm 1997, số nghiên c? ??u chuyển gen tiến hành thu? ?c [4] Sau nghiên c? ??u thiết kế vectơ ph? ?c vụ chuyển gen vào th? ?c vật c? ? thiết kế vectơ mang gen cryIA( c) ... Lương thiết kế thành c? ?ng vectơ chuyển gen mang gen cryIA( c) đánh giá khả chuyển gen hệ thống vectơ bắp c? ??i [5] 1.6 Tình hình nghiên c? ??u chuyển gen vào A thaliana 1.6.1 Đ? ?c điểm nông sinh h? ?c A thaliana